ORGANIZACIÓN DE VIAS METABOLICAS,

REGULACION Y CONTROL

Aproximación reduccionista:

*Destruyamos el sistema, purifiquemos sus componentes y estudiemos las propiedades de estos componentes.

Aproximación sistémica:

* El sistema es más que la suma de sus partes: luego para entender el sistema debemos estudiar el sistema (Kacser).

Aproximaciones matemáticas

•Modelamiento matemático

• Construcción de matrices estequiométricas

No consideran o incluyen

•Enzimas

•Estructura celular

•Procesos de señalización, regulación, control

Since all essential metabolic phenomena are bound to the cell structure, the tissue Brei, used so often in the past – in which the structure is destroyed – is unsuitable for metabolic investigations.

Krebs, H. A. and Henseleit, K. (1932)

Complejo multienzimático

David Green, 1958

Enzimas solubles o citosólicas

versus

Enzimas particuladas

Citosol: aquella porción de la célula que se obtiene en el sobrenadante después de centrifugar un homogeneizado celular durante 1 hora a 105.000 x g.

Lardy, 1965

(1968)

(1981, 1984)

Concentración de proteínas

•En soluciones experimentales < 1 mg/ml de prot. total

•En el citoplasma celular ~ 50-400 mg/ml de macromoléculas

Molecular crowding

Interacciones proteína-proteína (E. coli).

A network of protein-binding interactions in a yeast cell. Each line connecting a pair of dots (proteins)

indicates a protein-protein interaction.

Métodos para detectar interacciones proteína-proteína

1. Microscopía electrónica

2. Aislamiento de complejos

3. Método del doble híbrido

4. FRET (fluorescence resonance electron transport)

5. Purificación por cromatografía de afinidad

6. Inhibidores transdominantes

7. Uso de anticuerpos: inmunoprecipitación, estudios de colocalización a nivel de microscopía óptica

CURSO DE POSTGRADO

Interacciones proteína-proteína en sistemas bacterianos14 al 26 de septiembre de 2009.

Instituto de Investigaciones Biológicas Universidad Nacional de Mar del Plata-CONICET

Informes: studdert@mdp.edu.ar. Inscripción hasta el 20 de agosto 2009. Máximo 20 estudiantes.

Docente responsable: Claudia Studdert (IIB, UNMdP). Docentes colaboradores: Alejandro Buschiazzo (Instituto Pasteur de Montevideo, Uruguay); Eleonora García Véscovi (IBR, UNRosario); Arjen Ten Have (IIB, UNMdP); Eduardo Zabaleta (IIB, UNMdP), Mariela Sciara (IBR, UNRosario), Diego Massazza (IIB, UNMdP), Victoria Martín (IIB, UNMdP).

Contenidos teóricos

*Cristalografía de rayos X como aproximación para el estudio de complejos macromoleculares. *Aspectos bioinformáticos: plegamiento de proteínas, modelado en 3D, molecular docking.*Electroforesis tipo Blue Native en el estudio de complejos de proteínas. *Genética de supresión en el estudio de interacciones proteína-proteína.*Distintas técnicas de crosslinking. Análisis de FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in vivo; análisis PICM (Protein Interactions by Cysteine Modification) in vitro. *Biosensor. Anisotropía de fluorescencia. Co-localización de proteínas con tags fluorescentes.

Contenidos Prácticos

*Utilización de la técnica de FLAsH para marcar proteínas con fluorescencia. *Localización de fusiones a YFP.*Mutagénesis dirigida para introducir residuos de cisteína en receptores para quimiotaxis. Análisis de la función de los receptores modificados. Tratamiento con *PEG-maleimida para verificar la incorporación del residuo Cys y su exposición al solvente. Western blotting.*Diversas estrategias de crosslinking “in vivo” aplicadas a quimiorreceptores de E.coli y proteínas asociadas. Visualización de los productos de crosslinking por Western blotting.*Opcional: este TP puede ser reemplazado por alguna técnica de crosslinking aplicada a proteínas de interés de los estudiantes, previo análisis de los materiales disponibles.

*Ensayo de doble híbrido basado en la proteína represora LexA.

ORGANIZACIÓN DE VIAS METABOLICAS

¿Dónde están las enzimas?

Modelo estocástico (colisiones azarosas)

Modelo estructurado: enzimas multifuncionales

complejos multienzimáticos (transitorios

o estables)

Microcompartimentación

Metabolon (Paul Srere, 1985)

complejos supramoleculares formados por las enzimas secuenciales de una vía (total o parcial) y por componentes estructurales de la célula

.

Assembly mutations: ¿mutaciones de ensamblaje?

en la región interfaz

Afectan la operación de la vía pero no la actividad de la enzima, porque la mutación está en la zona de la proteína que interactúa con otra enzima de la vía.

Análisis de vías metabólicas basado en redes

•Se construyen redes de reacciones que incorporan conjuntos de datos aportados por el genoma, caracterizaciones bioquímicas y de fisiología celular.

•Las redes surgen por interacciones que se establecen entre múltiples enzimas y metabolitos.

•Se han desarrollado diferentes aproximaciones matemáticas para definir y caracterizar las redes (algoritmos, matrices, petri nets, etc.).

•Se intenta así describir matemáticamente las funciones sistémicas.

Substrate channeling. Substrate tunneling.

Canalización de sustratos.

Transferencia directa de un intermediario entre los sitios activos de una enzima polifuncional o entre dos enzimas que catalizan reacciones secuenciales en una vía metabólica.

Ventajas de la canalización

• Reducción del tiempo de tránsito de los intermediarios entre enzimas que catalizan reacciones secuenciales.

• Protección de intermediarios inestables que se estabilizan por unión a la enzima.

• Pérdida del intermediario por difusión.

• Mantención de gradientes de concentración, con concentraciones locales muy altas de metabolitos.

• Eliminación de la competencia por el intermediario por parte de otras enzimas.

E1 E2

S → [I] → P

E 1 E2

S* → [I*] → P* I → P

Estudios de dilución isotópica

Ejemplos

Síntesis de purinas y pirimidinas.Metabolismo de aminoácidos.Metabolismo de lípidos.Glicólisis.Ciclo de Krebs.Replicación de DNA.Síntesis de RNA.

Canalización de sustratos: mecanismos moleculares responsables

1. Tunneling: existencia de un túnel intramolecular (sitios activos cercanos).

2. Electrostatic channeling: existencia de una vía cargada eléctricamente a través de la cual se desplaza un intermediario de carga opuesta (sitios activos lejanos).

Carbamil-fosfato. Precursor de la síntesis de:

• urea

• arginina

• nucleótidos pirimidínicos