COLECCINTextos Universitarios

Libros de LUZ

El Vicerrectorado Acadmico de la Universidad del Zulia, consciente de la importancia que el libro tiene como herramienta para fortalecer tareas esenciales como la docencia y la investigacin, presenta su nueva coleccin de libros que, desde su Consejo de Publicaciones, salen a poner de manifiesto la diversidad intelectual que caracteriza nuestra institucin. Ms que un proyecto edito-rial hecho realidad, esta nueva coleccin le da forma tangible al conocimiento que tanto docentes como investigadores producen en sus mltiples actividades de pre y post grado, haciendo realidad la relacin acadmica entre profesores y estudiantes, como el pilar fundamental del quehacer uni-versitario.

La coleccin Textos Universitarios ampla sus dimensiones con el brillo de estos nuevos ttu-los, que a partir de este momento se sumarn a la inquebrantable tarea de iluminar los caminos del estudio, la indagacin y la reflexin, convertidos desde sus pginas en rutas de hallazgo, conoci-miento y placer, que son en definitiva las potencialidades de cualquier texto. Sabor y saber, como nos dijeran desde siempre los ms fervorosos amantes de los libros. Y es que estos nuevos ttulos vienen a impulsar lo que ya inicialmente se hiciera: enriquecer el patrimonio bibliogrfico de la academia universitaria, hacer tangible el conocimiento producido en nuestra alma mter, prestigiar a nuestro personal que incansablemente hace posible la expresin diversa del saber, transferir los grandes logros para consecucin del bien colectivo y, con la intensidad de una comunidad que existe hecha un referente de esplendor, irradiar nuestro quehacer a la regin y el pas que todos somos.

Los libros que desde hoy continan naciendo desde el Consejo de Publicaciones del Vicerrec-torado de LUZ, expresan un esfuerzo de trabajo conjunto con diversas instituciones pblicas y privadas que creyeron en nuestro proyecto editorial, y trascendieron las meras formalidades de alianzas - aportes, para identificarse con la trascendental labor de multiplicar el acervo biblio-grfico universitario. Con el crecimiento de la coleccin Textos Universitarios las posibilidades de crecer como creadores se hace imponderable y permite reencontrarnos perennemente en el trayecto infinito de la bsqueda del saber. Y es que como deca Oscar Wilde Leer un libro es leernos a nosotros mismos. Y es esta una noble y extraordinaria tarea.

Profa. Judith Aular de DurnVicerrectora Acadmica de la Universidad del Zulia

MANUAL PRCTICO DE BACTERIOLOGA GENERAL

Segunda Edicin

Universidad del ZuliaAutoridades Universitarias

Jorge Palencia PiaRector

Judith Aular de DurnVicerrectora Acadmica

Mara Guadalupe NezVicerrectora Administrativa

Marlene PrimeraSecretaria

Consejo de Publicaciones delVicerrectorado Acadmico

Judith Aular de DurnDirectora

ngel MadrizCoordinador

Universidad del ZUliaColeCCin TexTos UniversiTarios

ediCiones del viCerreCTorado aCadmiCo

MANUAL PRCTICO DE BACTERIOLOGA GENERAL

Segunda Edicin

maribel J. CasTellano G.messaria m. GinesTre P.

YeinY C. vila r.sonia C. romero a.

armindo J. PeroZo m.

Manual Prctico De Bacteriologa General; Segunda EdicinMaribel J. Castellano G.Messaria M. Ginestre P.Yeiny C. vila R.Sonia C. Romero A.Armindo J. Perozo M.

Coleccin Textos UniversitariosEdiciones del Vicerrectorado AcadmicoUniversidad del Zulia

Segunda Edicin, 2011.

Diseo y cuidado de edicin:Consejo de Publicaciones de la Universidad del Zulia - Jannieliz Leal

Impresin:

Hecho el Depsito de Ley:XXXXXXXXXXXXXXXXXXX

Reservados todos los derechos

Este libro ha sido arbitrado por las instancias correspondientes. de esta edicin Ediciones del Vicerrectorado Acadmico Universidad del Zulia

Impreso en Venezuela

ndice General Pgina

Introduccin 13UNIDAD I. INTRODUCCIN AL TRABAJO PRCTICO DE BACTERIOLOGA 15Objetivos terminales 15

Actividad Prctica 1.1: Introduccin al Trabajo Prctico de Bacteriologa 17Objetivos especficos 17Normas de bioseguridad en el Laboratorio de Bacteriologa 17Material y equipo de uso frecuente en el Laboratorio de Bacteriologa 18Actividad a realizar 23Ejercicios de auto-evaluacin 24

Actividad Prctica 1.2: Observacin de Bacterias y otros Microorganismos in vivo 25Objetivo especfico 25Observacin de bacterias y otros microorganismos vivos provenientes de diferentes ambientes naturales:agua, suelo, alimentos, otros 25Actividad a realizar 25Ejercicios de auto-evaluacin 25

Actividad Prctica 1.3: Examen al Fresco y tcnica de la Gota Pendiente 26Objetivos especficos 26Examen microscpico 26Examen al fresco 26Tcnica de la Gota Pendiente 26Actividad a realizar 27Ejercicios de auto-evaluacin 28

UNIDAD II: MORFOLOGA Y ULTRA-ESTRUCTURA DE LA CLULA BACTERIANA 29Objetivos terminales 29

Actividad Prctica 2.1: Tcnicas de Coloracin. Examen microscpico de Preparaciones Coloreadas 31Objetivos especficos 31Colorantes 31Coloraciones 31Etapas del proceso de coloracin 31Tcnicas de coloracin 34Coloracin de Gram 34Actividad a realizar 36Coloracin de Ziehl-Neelsen 37Actividad a realizar 38Coloracin de grnulos metacromticos 38Actividad a realizar 39Coloracin de cpsula 39Actividad a realizar 41Coloracin de flagelos 41Actividad a realizar 43Coloracin de esporas 43Actividad a realizar 45Ejercicios de auto-evaluacin 45Laminero Prctica 2.1: Coloraciones 47

Maribel J. Castellano G, Messaria M. Ginestre P, Yeiny C. vila R, Sonia C. Romero A, Armindo J. Perozo M

Unidad III: Nutricin y Crecimiento Bacteriano 53Objetivos terminales 53

Actividad Prctica 3.1: Tcnicas de Siembra y Morfologa Colonial 55Objetivos especficos 55Tcnicas de siembra o Inoculacin 55Tcnicas de inoculacin de medios lquidos 55Tcnicas de inoculacin de medios slidos y semi-slidos en tubo 56Tcnicas de inoculacin de medios slidos en placa 57Tcnicas de aislamiento de colonias en medios slidos 57Actividad a realizar 58Morfologa colonial 59Actividad a realizar 60Ejercicios de auto-evaluacin 60Laminero3.1:Morfologia colonial bacteriana en medios enriquecidos, selectivos y diferenciales 61

Actividad Prctica 3.2: Factores que afectan el Crecimiento Bacteriano 67Objetivo especfico 67Factores Fsicos 67Temperatura 67Actividad a realizar 67Concentracin de hidrogeniones (pH) 67Actividad a realizar 68Tensin de oxgeno y potencial de xido-reduccin 68Actividad a realizar 68Presin osmtica 70Actividad a realizar 70Ejercicios de auto-evaluacin 70

Actividad Prctica 3.3.: Medicin del Crecimiento Bacteriano 72Objetivos especficos 72Cuantificacin del crecimiento bacteriano 72Contaje en placas 72Turbidimetra 73Actividad a realizar 74Ejercicios de auto-evaluacin 76

UNIDAD IV: METABOLISMO BACTERIANO 79Objetivo terminal 79

Actividad Prctica 4.1: Pruebas Bioqumicas utilizadas en la Identificacin de Bacterias en el Laboratorio 81Objetivos especficos 81Generalidades 81Identificacin utilizando mtodos convencionales 112Actividad a realizar 112Ejercicios de auto-evaluacin 112Laminero 4.1: Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias en el laboratorio 115

UNIDAD V: GENTICA BACTERIANA 123Objetivo terminal 123

Manual prctico de bacteriologa general

Actividad Prctica 5.1: Transferencia de Material Gentico por Conjugacin Bacteriana 125Objetivo especfico 125Generalidades 125Actividad a realizar 125Ejercicios de auto-evaluacin 126

UNIDAD VI: CONTROL DEL CRECIMIENTO BACTERIANO 127Objetivo terminal 127

Actividad Prctica 6.1: Evaluacin de Mtodos Fsicos para el Control del Crecimiento Bacteriano 129Objetivo especfico 129Efecto del Calor sobre el Crecimiento Bacteriano 129Actividad a realizar 129Efecto de las Radiaciones sobre el Crecimiento Bacteriano 130Actividad a realizar 131Ejericicios de auto-evaluacin 131

Actividad Prctica 6.2: Evaluacin de Desinfectantes y Antispticos 132Objetivos especficos 132Generalidades 132Actividad a realizar 132Actividades de auto-evaluacin 132

Actividad Prctica 6.3: Pruebas de Susceptibilidad y Resistencia Bacteriana a los Antibiticos 133Objetivos especficos 133Generalidades 133Mtodos para determinar la susceptibilidad bacteriana a los antibiticos 133Mtodo de Dilucin en Caldo 134Actividad a realizar 136Mtodo de Dilucin en agar 136Mtodo de Difusin del Disco en Agar 137Actividad a realizar 139Mtodos de Gradiente de Antibiticos 139Actividad a realizar 140Otras pruebas 140Actividad a realizar 141Ejercicios de auto-evaluacin 141

UNIDAD VII: INTERACCIN BACTERIA-HOSPEDERO 143Objetivo terminal 143

Actividad Prctica 7.1: Flora Normal 145Objetivo especfico 145Generalidades 145Flora normal del cuerpo humano 145Actividad a realizar 147Ejercicios de auto-evaluacin 147

Maribel J. Castellano G, Messaria M. Ginestre P, Yeiny C. vila R, Sonia C. Romero A, Armindo J. Perozo M

UNIDAD VIII: CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO 149Objetivo Terminal 149

Actividad Prctica 8.1: Preparacin y Control de Calidad de Medios de Cultivo 151Objetivos Especficos 151Generalidades 151Medios de cultivo 151Tcnica de preparacin de medios de cultivo 152Control de calidad de medios de cultivo 153Actividad a realizar 155Ejercicios de auto-evaluacin 155Anexos 157Referencias Bibliogrficas 179

INTRODUCCIN

13

El Manual Prctico de Bacteriologa General, en su segunda edicin, est dirigido fundamentalmente a los estudiantes que se inician en el fascinante mundo de los microorganismos y contiene una serie de actividades destinadas a integrar y fortalecer los conocimientos tericos impartidos en el Programa de Bacteriologa General, asignatura obligatoria para los estudiantes de Bioanlisis de la Facultad de Medicina de la Universidad del Zulia.

Sin embargo, est concebido como libro de referencia para estudiantes de carreras afines y de post-grado que

necesiten profundizar nociones bsicas de bacteriologa; as como para cualquier persona que desee informacin

sobre la bacteriologa prctica.

Este manual proporciona una serie de normas y tcnicas necesarias para un adecuado desempeo en el laboratorio de Bacteriologa mediante ejercicios prcticos, cuya finalidad es el desarrollo de habilidades y

destrezas en el laboratorio. Con este propsito, los contenidos han sido organizados en ocho unidades, divididas

en un mximo de tres sesiones prcticas por unidad. Cada una de estas sesiones contiene los fundamentos tericos

bsicos, esquemas explicativos, figuras e ilustraciones que facilitan la comprensin de las actividades prcticas

contempladas.

La Unidad I est enfocada en los principios bsicos y las normas de bioseguridad que rigen el trabajo de laboratorio; presenta los materiales y equipos de uso rutinario en el rea de Bacteriologa e inicia al estudiante en

la observacin directa de microorganismos vivos en diferentes tipos de muestras.

La Unidad II comprende la exploracin de las tcnicas empleadas para la observacin de los microorganismos in vivo, las tcnicas de coloracin de las bacterias y la comprensin de los diferentes morfotipos bacterianos apreciables en una muestra biolgica.

En la Unidad III, se abordan las tcnicas de siembra y los mtodos de aislamiento y cuantificacin bacteriana. Tambin se enfoca la visualizacin de las colonias bacterianas en diversos medios de cultivo y el

reconocimiento de la influencia de los factores fsico-qumicos en el crecimiento bacteriano.

Los contenidos de la Unidad IV presentan las bases para la comprensin de diversidad de pruebas bioqumicas que reflejan los procesos metablicos que se llevan a cabo en la clula procariota; brindando las

herramientas bsicas para la correcta ejecucin, lectura e interpretacin de las pruebas bioqumicas utilizadas de

rutina para la identificacin bacteriana.

Por su parte, la Unidad V, estudia la gentica bacteriana, especficamente brinda algunos lineamientos relacionados con los posibles mecanismos de transferencia de material gentico entre bacterias, en especial, mediante la conjugacin bacteriana y su implicacin en la diseminacin de la resistencia bacteriana.

Los contenidos de la Unidad VI abarcan los mtodos fsicos para el control del crecimiento bacteriano; la evaluacin de desinfectantes y antispticos y las pruebas de susceptibilidad y resistencia de las bacterias a los antibiticos.

14

En la Unidad VII, los contenidos han sido organizados en una sesin prctica, relacionada con la observacin de las bacterias y otros microorganismos que forman parte de la flora normal de diferentes sitios del

cuerpo humano.

Finalmente, la Unidad VIII proporciona los principios generales sobre la preparacin y control de calidad de los medios de cultivo utilizados para el aislamiento e identificacin bacteriana.

Esperando que esta obra constituya un valioso aporte a la enseanza de la Bacteriologa General y que

sea de provecho para los estudiantes, a quienes va dirigido este trabajo.

Los Autores

UNIDAD IINTRODUCCIN AL TRABAJO PRCTICO DE

BACTERIOLOGA

Objetivos Terminales:

Al finalizar la Unidad, el participante estar en capacidad de:

Aplicar las normas de bioseguridad que rigen el trabajo en el Laboratorio de Bacteriologa.Diferenciar los materiales y equipos de uso frecuente en el Laboratorio de Bacteriologa. Verificar la presencia de bacterias y otros microorganismos vivos en diferentes tipos de muestras.Reconocer la movilidad bacteriana en preparaciones al fresco.

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ACTIVIDAD PRCTICA 1.1INTRODUCCIN AL TRABAJO PRCTICO DE BACTERIOLOGA

Objetivos Especficos:

Aplicar las normas de bioseguridad en el Laboratorio de Bacteriologa.1. Identificar los materiales y equipos de mayor utilidad en el Laboratorio de Bacteriologa.2.

Normas de Bioseguridad en el Laboratorio de BacteriologaLos laboratorios de Bacteriologa son ambientes especiales con respecto a la seguridad de las personas

que trabajan en los mismos. Las muestras recibidas para su estudio representan un riesgo potencial para el personal, debido a los agentes infecciosos que pueden contener. La educacin del personal que manipula a diario los agentes potencialmente infecciosos, as como de aqullos que slo tienen una exposicin limitada al ambiente del laboratorio, tales como: personal de mantenimiento, personal que entrega las muestras y visitantes, debe estar dirigida al conocimiento de las medidas para prevenir las infecciones adquiridas en el laboratorio. Los riesgos de un laboratorio de esta rea pueden extenderse a los laboratorios adyacentes y a las familias del personal.

Adems del riesgo por infeccin, los laboratorios de Bacteriologa tambin estn expuestos a todos los riesgos asociados con cualquier ambiente de laboratorio o institucional, como: incendios, riesgos elctricos, qumicos, situaciones ambientales, materiales radiactivos, mal funcionamiento de los equipos y peligros dependientes de desastres naturales.

Los riesgos biolgicos existentes en la seccin de bacteriologa del laboratorio clnico son los de inters en este caso. Las normas de bioseguridad son un conjunto de medidas preventivas, destinadas a proteger la salud de los trabajadores y la comunidad frente a riesgos por agentes biolgicos en el laboratorio.

A continuacin se indican las normas generales que deben cumplirse en el Laboratorio de Bacteriologa:

El Laboratorio de Bacteriologa representa un gran peligro para las personas no entrenadas, por 1. lo tanto, el acceso debe estar limitado al personal que labora en l. Deben evitarse las visitas, especialmente de nios. Ciertas reas de alto riesgo, como las secciones de Micobacteriologa, deben estar cerradas al pblico.

El estudiante, al igual que el resto del personal que all labora, debe usar una2. bata de laboratorio. La misma deber ser larga (que cubra la ropa de calle), manga larga y estar completamente cerrada. Debe quitrsela antes de abandonar el laboratorio.

Es indispensable usar guantes de goma o ltex cuando se manipulan materiales potencialmente patgenos. 3. Como el riesgo de contaminacin por aerosoles es grande, es necesario utilizar mascarilla.

Dentro de las reas de trabajo est absolutamente prohibido comer, beber, fumar y aplicarse cosmticos4. . Bajo ninguna circunstancia, utilice la cristalera o los envases del laboratorio para ingerir lquidos o sustancias alimenticias.

Se recomienda no llevarse los objetos o las manos, a la cara o la boca, durante su permanencia en el laboratorio; 5. sino despus de minucioso lavado con agua, jabn y cepillo.

Todas las operaciones hechas con pipetas deben ser practicadas con el empleo de propipetas o gomas de 6. succin. Nunca pipetee con la boca. Est terminantemente prohibido utilizar telfonos celulares dentro del laboratorio para evitar distracciones que 7. puedan ocasionar accidentes y disminuir el riesgo de contaminacin.

Mantenga su mesn de trabajo despejado. Disponga nicamente, los materiales estrictamente necesarios para 8. realizar su trabajo. Todo artculo que no sea indispensable para la ejecucin de las actividades deber ser guardado fuera del rea para evitar su contaminacin.

En caso de cualquier accidente, por pequeo que ste sea, notifquelo de inmediato a su superior para tomar 9. las acciones pertinentes.

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Maribel J. Castellano G, Messaria M. Ginestre P, Yeiny C. vila R, Sonia C. Romero A, Armindo J. Perozo M

Muchos de los microorganismos estudiados en el laboratorio son patgenos para el hombre; por lo tanto, todas 10. las muestras y cultivos que se procesan deben ser considerados potencialmente patgenos y ser tratados como tales.

Rotule convenientemente todas las muestras procesadas. Nunca incube cultivos no identificados.11.

No realice experimentos o trabajos sin autorizacin de su superior.12.

Una vez terminado el trabajo, devuelva a su lugar todos los reactivos y equipos utilizados. Su rea de trabajo 13. debe quedar totalmente despejada. Descarte todos los cultivos, las muestras y la cristalera utilizados en el recipiente destinado a tal fin. Una vez depositado un objeto en el recipiente, nunca debe ser retirado del mismo.

Deposite las pipetas utilizadas en los recipientes correspondientes. Nunca coloque pipetas contaminadas sobre 14. su mesa de trabajo.

No desplazarse dentro del laboratorio con material contaminado, por ejemplo: pipetas que hayan sido utilizadas. 15. Asegurarse de tener disponible el recipiente de descarte antes de usar materiales como pipetas, hisopos u otros.

Los microorganismos desecados o fijados sobre lminas portaobjetos no necesariamente estn muertos; 16. maniplelos con cuidado y al descartarlos, hgalo en el recipiente correspondiente.

Nunca saque material contaminado (por ejemplo: cultivos bacteriolgicos) del laboratorio sin haber obtenido 17. las instrucciones pertinentes.

No interrumpa a quienes estn trabajando; pues se pueden ocasionar graves errores o accidentes.18.

Trabaje siempre cerca del mechero para evitar la contaminacin de los cultivos. De igual manera, no hable 19. mientras est inoculando las muestras en sus correspondientes medios de cultivo.

Las personas que tienen el cabello largo, deben recogrselo para prevenir accidentes.20.

Las sandalias o zapatos descubiertos no ofrecen proteccin adecuada a los pies; por lo tanto, se recomienda el 21. uso de calzados cerrados.

Lave cuidadosamente sus manos con agua y jabn al terminar cada sesin de trabajo y antes de salir del 22. laboratorio.

El laboratorio debe mantenerse limpio y ordenado, retirando del mismo cualquier material que no tenga 23. relacin con el trabajo.

Las superficies de trabajo se descontaminarn al terminar cada actividad especfica.24.

Todos los procedimientos tcnicos se practicarn de manera que se evite, en lo posible, la formacin de 25. aerosoles.

Durante el trabajo se mantendrn cerradas las puertas del laboratorio.26.

Cumpliendo a cabalidad las normas anteriormente descritas, el Laboratorio de Bacteriologa puede constituir un rea segura para trabajar y aprender.

Material y Equipo de uso frecuente en el Laboratorio de Bacteriologa

Con fines didcticos, el material de uso en el Laboratorio de Bacteriologa puede dividirse en dos clases:

A.- Material de vidrioB.- Instrumentos, equipos y otros materiales microbiolgicos.

A) Material de vidrio:Debe cumplir con ciertos requisitos especiales; como:

Ser resistente al calor seco y hmedo1. Resistir lavados frecuentes2. El vidrio debe ser neutro (que no altere el pH de los medios que contengan)3. Resistentes a los cidos y lcalis.4.

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Manual prctico de bacteriologa general

El material de vidrio utilizado en los Laboratorios de Bacteriologa est representado por:

Cilindros graduados: Tambin denominados Probetas graduadas, son recipientes de vidrio grueso, forma cilndrica y dimetro uniforme, provistos de una base o pie para darles estabilidad. No son aptos para calentar ni para efectuar reacciones qumicas. Poseen una escala graduada en mililitros (ml) y calibrada a 20C. Generalmente, tienen una capacidad entre 25 y 2.000 ml. Se usan para medir lquidos. En bacteriologa, se emplean durante la preparacin de medios de cultivo, colorantes y reactivos, entre otros.

Embudos: Son conos de vidrio o de material plstico con punta de longitud variable terminada en bisel. Se utilizan para filtrar reactivos, colorantes y medios de cultivo, para lo cual deben ser preparados, previamente, con papel de filtro. Otro de sus usos, es facilitar el trasvasado de lquidos y slidos hacia recipientes de cuello estrecho. Para obtener una buena filtracin, es mejor utilizar un embudo de buena calidad con un ngulo de 58 exactamente.

Esptulas en forma de L: Son varillas de vidrio que miden 22 x 25 mm. de largo, dobladas en uno de sus extremos en ngulo de 90. Se utilizan para la diseminacin de material sobre la superficie de los medios de cultivo.

Fiolas o Erlenmeyers: Son recipientes de vidrio de forma cnica, cuello corto y fondo plano. Su capacidad est entre 25 y 5.000 ml. Se utilizan para la preparacin de medios de cultivos y soluciones.

Frascos goteros: Son frascos de vidrio que poseen una ranura que al ser colocada de manera que coincida con otra presente en la tapa, permiten la salida del lquido en forma lenta (gota a gota). Adicionalmente, existen frascos de plstico o vidrio con un orificio o un dispositivo, que permite dispensar lquidos gota a gota. Por lo general, tienen una capacidad de 25 a 50 ml.

Frascos para hemocultivo: Son frascos redondeados o rectangulares, de vidrio transparente con tapa de baquelita, generalmente con una capacidad de 120 ml. Se utilizan para el cultivo de microorganismos a partir de muestras de sangre.

Lminas cubreobjeto (laminillas): Son laminillas delgadas de vidrio con forma cuadrada, rectangular o redonda que cubren las preparaciones microscpicas colocadas sobre los portaobjetos. Miden entre 15 y 22 mm de largo por 0,13; 0,17 a 0,20 mm de espesor.

Lminas excavadas: Son rectngulos de vidrio con tamaos variables, algunas veces iguales a los portaobjetos; otras veces, de mayor tamao (110 x 55; 15 x 40 mm) que presentan en su superficie una, dos, tres o ms excavaciones. Se utilizan para observar la movilidad de los microorganismos por el mtodo de la gota pendiente.

Lminas portaobjeto: Son rectngulos de vidrio utilizados para realizar extendidos a ser observados al microscopio. Las de uso frecuente miden 75 mm de largo por 25 mm de ancho con 1 mm de espesor. Pueden poseer o no, bordes esmerilados.

Matraces o balones: Son recipientes de forma esfrica con un cuello cilndrico, largo y de fondo plano. Su capacidad est entre 50 y 5.000 ml. Algunos son aforados; es decir, poseen una marca circular que indica que a ese nivel contiene un volumen exacto. Se utilizan para la preparacin de soluciones.

Mechero de alcohol: Consta de un envase de vidrio o metal, provisto de una mecha, la cual se encuentra en contacto con el alcohol contenido en el recipiente. Posee una tapa para evitar la evaporacin del alcohol cuando no se encuentra en uso. Se utiliza en algunos procedimientos de coloracin que requieren calentamiento y para crear un ambiente estril durante la toma de muestra de sangre para hemocultivos.

Pipetas: Son tubos de vidrio con longitud y capacidad variable que terminan en una extremidad afilada. Presentan una graduacin exterior que indica su capacidad a 20C; algunas veces, la graduacin llega hasta la punta (pipetas terminales) y en otras, termina por arriba de ella (pipetas no terminales). Las ms usadas tienen una capacidad de 0,1; 0,2; 1; 2; 5 y 10 ml. Las hay tambin de plstico (desechables). Se emplean para transferir un volumen determinado de lquido o solucin. Existen tambin las Pipetas volumtricas, calibradas para dispensar volmenes fijos de un lquido. Existen de diferentes capacidades que varan en un rango de 1 a 100 ml.

Pipetas Pasteur: Se obtienen comercialmente, o pueden prepararse en el laboratorio. Poseen un extremo afilado que puede ser largo o corto. Presentan tambin, un estrechamiento en la parte superior para facilitar el taponamiento. Se utilizan para la inoculacin de medios de cultivo, separar sobrenadantes, aadir reactivos, entre otros usos.

Placas de Petri: Estn compuestas por dos platillos que difieren en su dimetro de manera que uno encaje perfectamente sobre el otro. Existen de varios tipos y tamaos. El dimetro de las ms utilizadas es de 100 x 15

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Maribel J. Castellano G, Messaria M. Ginestre P, Yeiny C. vila R, Sonia C. Romero A, Armindo J. Perozo M

mm y de 150 x 25 mm. Algunas estn divididas en secciones o cuadrantes que permiten estudiar varios cultivos simultneamente o efectuar contaje de colonias. Pueden ser de vidrio o de material plstico (desechables). Se utilizan para contener los medios de cultivo donde se inocularn los microorganismos a estudiar.

Tubos de centrfuga: Son tubos de ensayo, cuyo extremo cerrado termina en forma de cono. Se utilizan en los procesos de centrifugacin de muestras. Algunos poseen una escala graduada que permite medir, la cantidad de sedimento obtenido. Pueden ser de material plstico o vidrio y tener o no, tapa de baquelita. Los ms usados tienen 15 y 30 ml de capacidad.

Tubos de ensayo: Son tubos de vidrio, cerrados por un extremo, con reborde o sin l, de dimetro variable. Los ms utilizados son de: 160 x 15 mm; 150 x 15 mm; 125 x 15 mm y 100 x 13 mm. Algunos llevan tapa de baquelita. Se usan principalmente para contener medios de cultivo y reactivos, as como tambin para efectuar pruebas bioqumicas.

Tubos de fermentacin (Durham): Se usan para el estudio de los procesos de fermentacin de los carbohidratos por parte de las bacterias. Permiten detectar la produccin de gas a travs del desplazamiento del lquido en el interior del tubo. Generalmente miden 6 mm de dimetro x 50 mm de alto y suelen colocarse invertidos dentro de otro tubo de mayor dimetro.

Varillas de vidrio: Son cilindros de vidrio con extremos redondeados, de longitud y tamao variables (20-25 cm de longitud x 3-5 mm de ancho, respectivamente). Se utilizan para la siembra y aislamiento de colonias en placas. Tambin para trasvasar lquidos y mezclar sustancias.

Vasos de precipitado (beakers): Son recipientes de forma cilndrica, poseen una depresin en el borde que facilita el vaciamiento de los lquidos. La capacidad, por lo general, es entre 25 y 2.000 ml. Se utilizan para transferencia de lquidos.

B) Instrumentos, Equipos y otros Materiales usados en BacteriologaAgitador tipo vrtex: Es un aparato formado por una base de aluminio fundido que brinda durabilidad y estabilidad para su uso. Posee una copa de caucho suave para el mezclado de un tubo de ensayo nico. Presenta dos modos de operacin: operacin continua y encendido constante; y encendido al tacto, el cual se activa al tocar el accesorio de copa con un tubo de ensayo. Asas bacteriolgicas: Estn formadas por un mango de Kolle unido a un alambre de platino puro u otro metal que le permite flexibilidad y calentamiento o enfriamiento rpido. Por su flexibilidad, se le pueden dar las formas de aguja (asa en punta) o en aro (asa en argolla o aro). El elevado punto de fusin del metal con que se elabora el asa, le permite que sea esterilizado al calor directo de la llama sin que se funda, y su rpido enfriamiento evita la muerte del microorganismo cuando es tocado por el asa para ser inoculado a otro medio. Este alambre est sujeto a un mango o cuerpo que generalmente, es de material liviano (aluminio) y es un buen conductor del calor. Est protegido en su extremidad posterior por una cubierta de ebonita (aislante). Se emplean para la inoculacin de microorganismos en los medios de cultivo. En ocasiones, las asas suelen estar calibradas para dispensar un volumen determinado de inculo, por ejemplo 0,001 ml.

Autoclave: Aparato diseado para la esterilizacin de materiales por vapor de agua a presin. Est provisto de una llave y un manmetro para regular la presin, y por consiguiente, la temperatura a la que se desea someter los microorganismos. Formado por una cmara de vapor de doble pared equipada con dispositivos, que permiten que la cmara se llene a saturacin de vapor y se mantenga a la temperatura y presin deseada. El autoclave es una pieza indispensable en todo laboratorio de Bacteriologa. Se utiliza para la esterilizacin de la mayora de los medios de cultivo durante su preparacin; as como, para esterilizar material contaminado antes del lavado. Opera a una presin de 15 libras a 121C de temperatura por un tiempo de 15 minutos.

Balanza: Equipo que permite pesar cualquier compuesto necesario para el trabajo diario de un laboratorio. Existen en el mercado muchos modelos, algunos son de brazo, mecnicas, electrnicas o digitales.

Bandejas para esterilizar: Son recipientes, con o sin tapa, para descartar el material utilizado en el laboratorio para luego esterilizarlo en el autoclave. Pueden ser de acero inoxidable o de propileno y su capacidad es variable.

Baos de Mara: Son aparatos provistos de una doble pared de acero inoxidable, y una capa central de asbesto, poseen un termostato, un control del nivel de agua y un termmetro para regular la temperatura. El calor es suministrado por una resistencia elctrica. Se utilizan para verificar reacciones de los microorganismos a temperaturas controladas. Tambin se emplean en la estabilizacin de los medios de cultivo durante su preparacin.

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Manual prctico de bacteriologa general

Campana o jarra de microaerofilia: Son recipientes formados por un cuerpo y una tapa que cierra hermticamente. El cuerpo est constituido por material de vidrio o plstico de boca ancha; en cuyo interior se colocan las placas de Petri y tubos de ensayo contentivos de los microorganismos en cultivo para su incubacin en atmsferas especiales (5-10% de CO

2). Esta atmsfera especial se logra insertando una vela encendida en el interior del

recipiente o un sobre generador de la mezcla de gases deseada. Tambin puede crearse una atmsfera de este tipo por procedimientos mecnicos; es decir, extrayendo el aire del interior con una bomba de vaco y cargndolo con una mezcla que contenga una concentracin de 5-10% de CO

2.

Campana o jarra de anaerobiosis: Sistema usado para crear una atmsfera anaerbica. La que se emplea con mayor frecuencia es la Campana de Gaspak, la cual consiste en una campana de plstico transparente con una tapa hermtica, la cual es ajustada por una abrazadera. La introduccin de una mezcla de gases que contiene H

2 es seguida por la reaccin cataltica del oxgeno con el hidrgeno para formar agua, establecindose as, la

anaerobiosis. Se emplea preferiblemente un catalizador fro compuesto por partculas de almina recubiertas con paladio, ya que no tiene riesgo de explosin. Algunas estn provistas de una conexin para aplicar el mtodo de evacuacin/reposicin de gases en la creacin de un ambiente de anaerobiosis.

Campana de extraccin: Sistema de seguridad, compuesto por un extractor centrfugo con motor y protegido de los vapores por una ventana tipo guillotina con vidrio de seguridad, posee cuatro llaves de servicios localizadas a cada lado para suministrar gas, agua, aire y vaco, adems de toma-corrientes. Permite la manipulacin de cultivos bacteriolgicos y muestras clnicas evitando la propagacin de aerosoles.

Centrfugas: Son instrumentos metlicos de distintas capacidades, con envoltura de aluminio. Poseen un motor que opera generalmente con 110-115 voltios y un restato que regula las revoluciones por minuto. En su interior se encuentra un cabezal donde van colocados unos cilindros metlicos que sirven de receptores a los tubos de centrfuga. Existen tambin centrfugas refrigeradas con un compresor que controla la temperatura. Poseen un rango de temperatura de -20C a +40C. Son aparatos utilizados para la centrifugacin; es decir, la aplicacin de la fuerza centrfuga para separar partculas en suspensin. Se emplean generalmente, para concentrar o precipitar los elementos celulares contenidos en un lquido normal o patolgico.

Cestas: Son recipientes de tejido metlico o plstico resistente al calor, de diferentes formas y tamaos. Se usan para el almacenamiento de los tubos de ensayo y para su esterilizacin.

Contador de colonias: Aparato que consta de una fuente de luz, una lupa y un vidrio cuadriculado que facilita el contaje de las colonias presentes en un cultivo. Los contadores digitales estn provistos de un sensor que se activa cada vez que se enumera una colonia durante el contaje.

Destilador de agua: Es un equipo que permite obtener agua de alta calidad, libre de pirgenos e iones metlicos a partir de agua potable proveniente directamente de la tubera de suministro municipal. Est formado por resistencias, condensadores y una caldera, entre otras partes. Algunos presentan diferentes dispositivos que interrumpen la energa elctrica cuando el nivel de agua disminuye.

Dispensador: Es un dispositivo que se utiliza para repartir volmenes pequeos de lquido a partir de frascos grandes. stos deben ser exactos y reproducibles en la dosificacin. Adems, no deben causar desperdicios de reactivos. Estn conformados por una vlvula de seguridad, tubo telescpico para adaptarse a frascos de diferente altura y controlador para ajustar el volumen de forma precisa y sencilla.

Encendedor para mecheros: Pieza metlica accionada por un resorte que lleva en un extremo un carbn reemplazable, el cual es friccionado sobre una superficie irregular, producindose chispas que hacen encender los mecheros.

Esptulas: Instrumentos planos, obtusos, semejantes a un cuchillo que se emplean para agregar sustancias. Son de material inoxidable con mango de madera u otro material de hoja flexible, resistente al calor y a los agentes qumicos.

Estufas o incubadoras: Son instrumentos metlicos que poseen una doble pared de aluminio revestida por una sustancia refractaria al calor proporcionado por una resistencia elctrica y la temperatura es graduada por medio de un termmetro que se maneja desde la parte externa. En la parte superior, posee un orificio donde se inserta el termmetro e indica la temperatura existente en el interior. La temperatura usada en estos aparatos est entre 5 y 50C. Se utilizan para proveer de manera constante, temperaturas apropiadas para favorecer el crecimiento de los microorganismos.

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Frascos lavadores o picetas: Son recipientes plsticos utilizados para dispersar agua u otras sustancias contenidas en ellos, permitiendo lavar o arrastrar cualquier material. Se usan para transvasar material slido y para lavar los recipientes, sin tocar las paredes. Tambin se emplean en el lavado de preparaciones coloreadas.

Gomas de succin: Son bulbos de goma que se utilizan, al igual que las propipetas, para pipetear lquidos y reactivos.

Guantes de ltex para laboratorio: Son prendas de tamao variable y ambidextros. Hechos de ltex y disponibles en forma estril y no estril, con polvo (almidn de maz) y sin polvo. Se emplean para proteger las manos cuando se trabaja con agentes infecciosos o qumicos peligrosos. En la actualidad existen tambin de nitrilo,libres de polvo, especiales para personas alrgicas al ltex y/o al polvo que contienen los guantes de ltex.

Guantes de seguridad: Son prendas utilizadas para manipular objetos calientes provenientes del autoclave u horno. Se fabrican de tejido de algodn puro o de asbesto. Son lavables y resistentes al calor hasta 232C.

Gradillas: Soportes especiales de madera, metal o plstico, empleados para colocar los tubos de ensayo. Horno de aire caliente: Es una cmara rectangular de doble pared, de tamao variable, con amianto para evitar la prdida de calor por radiacin, con un espacio areo entre ambas paredes. El calor es proporcionado por electricidad. No puede utilizarse para lquidos ya que se agotaran por ebullicin, ni para telas, ni gomas que se quemaran. Se utilizan para esterilizar cristalera. Este material debe estar limpio, completamente seco y debidamente envuelto antes de ser esterilizado al calor seco del horno. Opera generalmente a una temperatura de 170-180C durante 60-120 minutos para destruir todos los microorganismos. El ms utilizado es el Horno Pasteur.

Hisopos: Son aplicadores de madera que llevan algodn en uno de sus extremos. Son utilizados en forma estril para la toma de muestras bacteriolgicas y algunas veces, para efectuar siembras.

Lpiz con punta de diamante: Se usan para marcar vidrios y otras superficies. El diamante es montado en bronce y colocado al final de un mango de aluminio.

Lpices grasos: Son lpices especiales que sirven para escribir en vidrios o superficies muy pulidas. Los hay de diferentes tipos, colores y marcas. Poseen en su composicin, un porcentaje graso que permite la adhesin de ste en la superficie lisa. Para usarlos, es necesario que la superficie donde se va a escribir est completamente limpia y seca.

Lentes de seguridad: Son instrumentos pticos panormicos que tienen como funcin proteger los ojos del usuario ante cualquier accidente que pueda ocurrir en el laboratorio. Son de policarbonato claro y existen variados modelos en el mercado.

Mascarillas: Son caretas faciales compuestas por tres capas de propileno fundido poroso que contiene en su parte intermedia, un filtro del mismo material. Estas mascarillas aseguran la filtracin de bacterias.

Mecheros de Bunsen: Son tubos de metal que sirven para la combustin del gas natural. Antes de producir la llama para la oxidacin completa del gas, se requiere mezclar el gas con aire. Se componen de las siguientes partes: a) Pie: sirve de soporte, b) Vlvula para la regulacin de la mezcla aire-gas natural y c) Cuello del mechero. Se utilizan para la esterilizacin de las asas bacteriolgicas y para el flameado de la boca de los tubos que contienen cultivos, durante su manipulacin.

Medidor de pH (pHmetro): Instrumento que tiene como finalidad medir el pH de soluciones qumicas en el laboratorio. Est formado por un electrodo y su soporte, el cual es el sensor que produce la lectura. Este equipo debe calibrarse con el empleo de una solucin buffer o tampn. Existen muchos modelos en el mercado, algunos pueden presentar dispositivos para determinar otras caractersticas, tales como: temperatura, conductividad y concentracin.

Microincinerador: Es un aparato elctrico que cumple las funciones de un mechero de Bunsen. Adems, lleva adaptado lateralmente, una cmara tubular para incinerar los microorganismos, evitando de esta forma, el peligro de contaminacin de la atmsfera y del operador. Se les conoce popularmente como mecheros elctricos.

Microscopio: El microscopio compuesto de luz, ampliamente utilizado en la actualidad, es un instrumento ptico constituido por un conjunto de lentes y partes mecnicas, que permite la observacin de especmenes diminutos, invisibles al ojo humano, revelando detalles de su estructura. Existen otros tipos de microscopio, tales como: Campo Oscuro, Contraste de Fase, Inmunofluorescencia, Electrnico, entre otros.

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Manual prctico de bacteriologa general

Mortero con mazo: Es un recipiente que sirve para macerar cualquier compuesto qumico o material que se desea utilizar para la preparacin de una solucin y que se encuentre en estado slido. Existen de diferente capacidad, comnmente se fabrican de porcelana.

Papel de filtro: Material compuesto por microfibrilla de vidrio que se utiliza para la retencin de partculas finas con una alta velocidad de flujo, durante los procesos de filtracin.

Pinzas: Tenacillas de metal o acero inoxidable que sirven para varios usos. Por ejemplo: se utilizan para colocar los discos de antibiticos en las pruebas de susceptibilidad y resistencia a los antimicrobianos, para sujetar hisopos a fin de no tomarlos con la mano y para retirar el papel de filtro durante las coloraciones, entre otros.

Pipeta automtica: Es un dispensador de lquidos automtico, exacto y preciso. Presenta un eyector de punta para evitar el desprendimiento accidental de la puntilla. Existen en el mercado diversidad de modelos y capacidades.

Plancha de calentamiento: Es un instrumento que tiene como finalidad el calentamiento rpido de sustancias qumicas, para facilitar la preparacin de soluciones. Presentan una placa de calentamiento metlica, adems de controladores de temperatura. Algunos modelos traen incorporado un agitador con control ajustable.

Propipetas: Son dispositivos de goma que poseen tres vlvulas de presin que operan independientemente para controlar la entrada y salida de lquidos. Poseen un orifico inferior donde se inserta la pipeta que va a ser utilizada. Poseen tambin tres botones: uno superior (A) que se utiliza para extraer el aire contenido en el interior del bulbo; uno inferior (S) para succionar el lquido al interior de la pipeta y otro, lateral (E) que extrae el lquido de la pipeta. Se usan para pipetear lquidos peligrosos.

Puntillas para pipetas automticas: Son boquillas de propileno que se colocan en la parte inferior de las pipetas automticas y su funcin es tomar la cantidad de lquido a dispensar. Existen de diferentes capacidades adaptables a cada modelo de pipeta.

Rejilla metlica: De forma cuadrangular, es una red constituida por finos alambres entrecruzados que llevan en su centro un rea circular de amianto o asbesto. Este material dispersa el calor con uniformidad. Generalmente, se colocan sobre anillos o trpodes cuando van a calentarse instrumentos o material de vidrio que no deben recibir calor directo.

Reloj de laboratorio: Es un instrumento que se utiliza para medir el tiempo de todos los procesos y reacciones que se verifican en el laboratorio. Pueden ser mecnicos o digitales.

Soporte para coloracin: Dispositivo en forma de U hecho de metal u otro material resistente, sobre el cual se colocan las lminas portaobjetos que contienen extendidos fijados que van a ser sometidos a procesos de coloracin.

Termmetro: es un instrumento que permite el registro permanente de la temperatura. Existe una gran variedad de modelos, desde manuales hasta digitales.

Trpodes: Son instrumentos metlicos, hechos generalmente de hierro, provistos de un aro y tres patas que le sirven de soporte. Se usan para sostener recipientes que van a ser sometidos a ebullicin. Por lo comn, se coloca sobre el aro una rejilla metlica.

Actividad a RealizarProceda a identificar el material que se ha colocado sobre el mesn y relacinelo con su utilidad prctica.

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Ejercicios de Auto-evaluacin

Defina Normas de Bioseguridad.1.

Explique la importancia del cumplimiento de las normas de bioseguridad en el Laboratorio de Bacteriologa.2. Enumere diez normas de bioseguidad a cumplir en el Laboratorio de Bacteriologa.3. Aparee los siguientes materiales y equipos de laboratorio con su correspondiente utilidad prctica.4.

Material y Equipo Utilidad Prctica

Asa bacteriolgica _______ Estudio de los procesos de fermentacina) Placa de Petri ________ Preparacin de solucionesb) Estufa ______ Contener medios de cultivoc) Horno _______ Verificar reacciones qumicasd) Autoclave _______ Inoculacin de medios de cultivoe) Mechero de Bunsen _______ Esterilizacin de asas bacteriolgicasf)

Pipetas _______ Esterilizacin de materiales por vapor de agua a presing) Lminas excavadas _______ Esterilizacin de cristalerah)

Instrumento utilizado para el contaje de coloniasi)

Proveer temperaturas apropiadas para el crecimiento bacterianoj) Transferir lquidosk)

Pesar medios de cultivo y reactivos l) Observacin de la movilidad bacterianam)

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ACTIVIDAD PRCTICA 1.2OBSERVACIN DE BACTERIAS Y OTROS MICROORGANISMOS IN VIVO

Objetivo especfico:

Observar la presencia de bacterias y otros microorganismos en diferentes tipos de muestras biolgicas.1.

Observacin de bacterias y otros microorganismos vivos provenientes de diferentes ambientes naturales: agua, suelo, alimentos y otras muestras biolgicas

La Microbiologa se ocupa del estudio de organismos tan pequeos que no pueden observarse a simple vista. Debido a la naturaleza de esta disciplina, el microscopio tiene una importancia crucial, ya que la mayor parte de los conocimientos sobre los microorganismos han sido descubiertos con el uso del microscopio.

La primera persona que observ y describi los microorganismos fue el microscopista aficionado Anthony Van Leeuwenhoek, quien con sus lentes cre una forma de iluminacin (campo oscuro) que permiti observar claramente diferentes formas de vida microbiana.

Las bacterias fueron los primeros organismos vivos del planeta, viven prcticamente en cualquier lugar donde la vida sea posible, se encuentran en mayor cantidad que otra clase de organismos, y constituyen probablemente el componente mayoritario de la biomasa terrestre.

En este trabajo prctico, el estudiante examinar al microscopio, preparaciones realizadas con diversos tipos de muestras con la finalidad de observar la gran cantidad de organismos vivos existentes en la naturaleza.

MaterialesLminas portaobjetoLaminillas cubreobjetoPipetas PasteurAsa en aroAplicadores de maderaSolucin salina fisiolgica (SSF)Agua estril

MuestrasDiversos alimentos como: quesos no pasteurizados, jugos de frutas naturales, yogurt, entre otros.Suelo.Agua estancada.Muestras clnicas: heces, orina, hisopado de piel, entre otras.

Actividad a realizarA cada grupo de estudiantes, se les asignar una de las muestras seleccionadas para el ejercicio 1. prctico.Con la muestra a observar, preparar una suspensin en SSF estril.2. Colocar una gota de la suspensin en una lmina portaobjeto y cubrir con una laminilla. Alternativamente, la 3. suspensin de la muestra puede prepararse directamente sobre la lmina portaobjeto con ayuda del asa o un aplicador de madera.Observar la preparacin al microscopio4. , con objetivo seco de mayor aumento (40X).Realizar anotaciones sobre lo observado en cada muestra. Reporte segn los siguientes criterios: abundante, 5. moderado, escaso o ausente.Realice un dibujo de lo observado en cada muestra.6.

Ejercicios de Auto-evaluacinIndique cul muestra tiene mayor cantidad de microorganismos. Explique brevemente por qu.1.

De dnde provienen los microorganismos observados?2.

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ACTIVIDAD PRCTICA 1.3EXAMEN AL FRESCO Y TCNICA DE LA GOTA PENDIENTE

Objetivos Especficos:

Distinguir las bacterias de otros elementos presentes en un examen al fresco.1.

Ejecutar correctamente la tcnica de la gota pendiente para la observacin de la movilidad bacteriana.2.

Diferenciar entre movilidad verdadera y movimiento browniano en las bacterias.3.

Examen MicroscpicoEl examen microscpico es usualmente el primer paso para la identificacin de una bacteria desconocida.

Las bacterias pueden, tentativamente, ser colocadas en uno u otro grupo, cuando se han observado sus caractersticas morfolgicas y sus reacciones tintoriales. Las caractersticas morfolgicas de importancia son:

a) Tamaob) Formac) Agrupacind) Estructuras especiales:

Flagelos Endosporas Cpsula Grnulos metacromticos

Existen dos formas en las cuales los microorganismos pueden ser examinados bajo un microscopio: En estado vivo (in vivo) o en estado de fijacin (in vitro).Observacin in vivo:

Este tipo de observacin puede hacerse necesaria cuando el microorganismo no es fcil de colorear o cultivar o cuando se desea estudiar su morfologa no distorsionada por la fijacin.

Existen dos variantes:Examen al fresco (montaje hmedo con SSF)1.

Tcnica de la Gota Pendiente.2.

1. Examen al Fresco:Procedimiento

Colocar sobre una lmina portaobjeto limpia y libre de grasa, una asada de un cultivo puro en caldo 1. (utilizando para ello un asa en aro previamente esterilizada a la llama del mechero).

Cubrir con una laminilla y observar al microscopio ptico con objetivo de 40X, bajando el condensador para 2. disminuir la cantidad de luz permitida.

Si el examen al fresco se realiza a partir de un cultivo en medio slido, colocar una gota de SSF estril en una 3. lmina portaobjeto y resuspender en ella una colonia del cultivo, y repetir el procedimiento anterior.

Esta preparacin tambin puede ser examinada mediante microscopa de campo oscuro o de contraste de fase. Adems, puede hacerse un examen al fresco a partir de muestras clnicas, tales como: orina, secrecin vaginal, lquidos estriles entre otras; con la finalidad de observar si existen bacterias y otras estructuras (cilindros, leucocitos, glbulos rojos).

2. Tcnica de la Gota PendienteEste mtodo se utiliza para la observacin de la movilidad de las bacterias aerbicas estrictas, por ejemplo:

los Bacilos Gram negativos no fermentadores de la Glucosa (BGNNF). Tiene la ventaja de eliminar la distorsin ocasionada por el peso del cubreobjeto y se puede obtener un campo de foco ms profundo dentro de la gota.

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Manual prctico de bacteriologa general

Procedimiento:Colocar, con ayuda de un aplicador de madera, una pequea cantidad de vaselina alrededor de 1. una depresin de la lmina excavada. (Alternativamente, puede agregarse la vaselina a la lmina cubreobjeto).

Colocar una suspensin de una colonia en SSF o una gota de un cultivo en caldo (4 a 6 horas de incubacin) en 2. un cubreobjeto. No mover la preparacin.

Colocar la lmina excavada sobre la laminilla de manera que la gota del cultivo quede en el centro de la 3. cavidad. Presionar ligeramente; pero de manera firme para que se fije.

Invertir rpidamente la preparacin de manera que la gota penda del cubreobjeto en la 4. cmara.

Observar al microscopio ptico con objetivo seco de mayor aumento o con objetivo de 5. inmersin para evidenciar la movilidad; asegurndose de no confundir el movimiento browniano con la verdadera movilidad que es mostrada por las bacterias que se desplazan en direcciones opuestas y llegan a cruzarse. El movimiento browniano, es la constante vibracin de las bacterias en un punto fijo, comportamiento que se presenta por estar suspendidas en medio lquido y por su pequeo tamao. Es un movimiento aleatorio derivado del empuje de las molculas de agua alrededor de la bacteria.

Actividad a RealizarA cada grupo le ser suministrado un cultivo puro en caldo y agar. Realice un examen al fresco entre lmina

y laminilla y una movilidad por el mtodo de la gota pendiente. Observe detenidamente y registre los resultados.

Figura 2: Inversin de la lmina excavada sobre la laminilla cubreobjetosFuente: Johnson T, Case J. 2001

Figura 1: Preparacin de la suspensin bacterianaFuente: Johnson T, Case J. 2001

Objetivo 40x

Lmina Excavada

Figura 3: Gota pendiente (Observacin al microscopio)Fuente: Johnson T, Case J. 2001

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Ejercicios de Auto-Evaluacin

Qu valor prctico tienen estas tcnicas?1.

Cmo puede distinguirse la movilidad verdadera del movimiento browniano de las bacterias?2.

Qu mtodos pueden utilizarse para determinar la movilidad de las bacterias en el laboratorio?3.

Cul es la ventaja que tiene el mtodo de la gota pendiente sobre el montaje hmedo?4.

Para qu se usa la vaselina en el mtodo de la gota pendiente?5.

Por qu son difciles de observar los microorganismos en montajes hmedos?6.

UNIDAD IIMORFOLOGA Y ULTRA-ESTRUCTURA DE LA CLULA

BACTERIANA

Objetivos Terminales:

Al finalizar la Unidad, el participante estar en capacidad de:

Reconocer la morfologa microscpica de las bacterias en preparaciones coloreadas.Explicar los fundamentos y procedimientos de diferentes coloraciones.

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ACTIVIDAD PRCTICA 2.1TCNICAS DE COLORACIN. EXAMEN MICROSCPICO DE PREPARACIONES COLOREADAS

Objetivos Especficos:

Interpretar los fundamentos de las coloraciones de uso ms frecuente en Bacteriologa.1. Practicar las tcnicas de coloracin de uso frecuente en Bacteriologa.2. Examinar al microscopio diversas preparaciones bacterianas.3. Interpretar los resultados del examen microscpico de las coloraciones realizadas.4.

ColorantesDebido a su elevada refringencia, la mayora de los microorganismos son visibles al microscopio ptico cuando

se examinan en vivo y en suspensin acuosa, pero este examen al fresco, importante para observar la movilidad de las bacterias, no permite apreciar los detalles de su estructura. En general, son necesarios procedimientos de tincin o coloracin para visualizar los microorganismos y demostrar los detalles finos de sus estructuras internas. A tal fin, es necesario el empleo de sustancias colorantes.

Los colorantes son sustancias que, por procedimientos apropiados, tienen la capacidad de transmitir su color a otros cuerpos. Generalmente, son sales de anilina que al disociarse originan iones cargados positiva y negativamente. Uno de estos iones es el que imparte la propiedad cromgena y se denomina, entonces, cromforo. El otro, se denomina auxocromo y es el que permite que el colorante se una a las fibras o tejidos.

En trminos amplios, de acuerdo con su comportamiento qumico, los colorantes se consideran cidos o bsicos; lo cual no necesariamente indica su reaccin en solucin (pH); sino ms bien, si una parte significativa de la molcula es aninica o catinica. Si el cromforo es el in positivo, el colorante se denomina bsico (catinico), y si es el negativo, cido (aninico).

Las bacterias, a un pH 7,0; tienen una carga ligeramente negativa por ser ricas en cidos nuclicos, los cuales poseen cargas negativas en forma de grupos fosfato, por lo tanto, cualquier colorante que vaya a ser utilizado para teir este tipo de microorganismos, debe ser un colorante bsico, los cuales incluyen: cristal violeta (tambin denominado violeta de genciana), azul de metileno, safranina, fucsina bsica y verde de malaquita, entre otros.

Los colorantes cidos, como la eosina, tinta china y nigrosina, son poco utilizados, debido a que su cromforo (in negativo) repele las cargas negativas de la superficie bacteriana. Se usan generalmente, cuando se desea teir estructuras citoplasmticas o efectuar tinciones negativas.

ColoracionesEl estudio de la forma y disposicin celular de los microorganismos se efecta a travs de preparaciones

coloreadas.

La introduccin de tinciones a mediados del siglo XIX representa, en gran medida, el fundamento de los principales avances que se han producido en la Microbiologa durante los ltimos siglos. Hoy en da, se emplean tanto, que es difcil comprender cmo pudo haber progresado el estudio de los microorganismos, antes de su aplicacin rutinaria en el laboratorio.

Las tinciones consisten en aplicar soluciones acuosas o alcohlicas de colorantes a los microorganismos, tejidos vegetales y animales, as como tambin otras sustancias de importancia biolgica. Colorear significa, simplemente, teir los microorganismos para enfatizar ciertas estructuras.

Etapas del Proceso de ColoracinEn el proceso de coloracin se cumplen siempre las siguientes etapas:

1.-Preparacin del frotis o extendido.2.-Fijacin del frotis o extendido.3.-Aplicacin de colorantes o coloracin propiamente dicha.

1. Preparacin del Frotis o ExtendidoConsiste en colocar el material a examinar sobre el portaobjeto. El extendido debe ser delgado, uniforme

y no llegar hasta los bordes de la lmina. Debe dejarse secar al aire.

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Tcnica de Preparacin: Colocar una gota de SSF (0,85%) estril en el centro de un portaobjetos limpio y libre de grasa.1. Con un asa, previamente esterilizada a la llama del mechero, tocar la superficie del crecimiento bacteriano 2. (colonia).Resuspender la pequea cantidad de material retirado del cultivo, en la solucin salina. Utilizar el asa para 3. esto. Con la ayuda del asa, extender la suspensin bacteriana sobre un rea pequea del portaobjeto (1 cm. aproximadamente).

Esterilizar nuevamente el asa a la llama del mechero.4. Permitir que el material se seque espontneamente al aire.5.

Si el frotis o extendido se va a preparar a partir de un cultivo en caldo: con asa en aro, colocar una o dos gotas del caldo que contiene el microorganismo en la lmina portaobjeto. Extender con la misma asa. Los otros pasos de la elaboracin son exactamente iguales al anterior.

2. Fijacin del Frotis o ExtendidoLa fijacin o segunda etapa de la coloracin se efecta con la finalidad de adherir los microorganismos al

portaobjeto de tal manera que no se desprendan durante los pasos subsiguientes de la coloracin. La fijacin del frotis hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfologa bacteriana y las posibles agrupaciones de clulas que pudiera haber. La fijacin puede hacerse por medio de agentes fsicos como el calor moderado, que es el ms frecuentemente usado; o por agentes qumicos, entre los que se encuentra el alcohol.

Tcnica de Fijacin por Calor: Una vez que el extendido se ha secado al aire, debe fijarse pasndolo ligeramente varias veces (3 4) sobre la zona azul de la llama del mechero, con la cara del frotis mirando hacia arriba evitando el sobrecalentamiento. Compruebe la temperatura alcanzada, colocando la cara limpia del portaobjeto sobre la eminencia tenar de la mano (base del pulgar).

La temperatura alcanzada no debe ser superior a los 45C, la cual es tolerada adecuadamente por la piel del operador. En la prctica, el frotis se debe calentar hasta que el vidrio est tan caliente que moleste al tacto pero sin quemar.

Figura 4: Preparacin de un frotis o extendidoFuente: Johnson T, Case J. 2001

Figura 5: Secado del frotisFuente: Johnson T, Case J. 2001

Figura 6: Fijacin del frotis a la llama del mecheroFuente: Johnson T, Case J. 2001; modificado por Castellano, 2011

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Alternativamente, puede calentarse la preparacin en un dispositivo adecuado (plancha de calentamiento) a 60C por diez minutos para inactivar cualquier patgeno que pudiera estar presente.

Tcnica de Fijacin por Mtodos Qumicos: Una vez que el frotis se ha secado al aire, se procede a aplicar alcohol (metanol al 95%), cubriendo completamente la lmina portaobjeto. Se deja actuar el alcohol por dos minutos. Luego se escurre el exceso de alcohol y se deja secar al aire antes de proseguir con la coloracin.

Coloracin Propiamente dicha4. Es la aplicacin del o los colorantes sobre el frotis ya fijado.

Al aplicar colorantes cidos o bsicos, los microbilogos, usualmente emplean tres tcnicas diferentes de coloracin:

Coloraciones simples.Coloraciones diferenciales.Coloraciones especiales.

Una coloracin simple es la que emplea nicamente un (1) colorante que se aplica al frotis en una sola operacin. Su uso revela la morfologa y disposicin celular de las bacterias; sin embargo, no muestra detalles finos de su estructura interna. El tiempo necesario para la coloracin vara con la dilucin del colorante. Una vez teidos, los extendidos son lavados brevemente con agua para eliminar el exceso de colorante, secados al aire o con papel secante y despus de ello, quedan listos para ser observados al microscopio ptico con objetivo de inmersin (100X).

Las coloraciones simples ms utilizadas en bacteriologa son: azul de metileno, safranina, fucsina y violeta de genciana.

Una coloracin diferencial es aquella que emplea dos ms colorantes juntos o separados, segn la tcnica que se trate. Permite distinguir entre dos clases diferentes de microorganismos o entre dos partes diferentes de un mismo organismo.

En frotis previamente elaborados y fijados, tpicamente, se utilizan cuatro componentes de manera progresiva: colorante primario, mordiente, solucin decolorante y colorante de contraste.

El colorante primario, usualmente, tie del mismo color, todos los componentes celulares y microorganismos presentes en el especimen. Ocasionalmente, se aade un qumico a la solucin para intensificar la tincin. Tal aditivo se conoce como mordiente y su funcin es incrementar la afinidad del colorante por la muestra biolgica. Otra funcin sera la de recubrir estructuras, por ejemplo, los flagelos, para hacerlos ms gruesos y fciles de visualizar despus de teidos. Son ejemplos de mordientes: calor, lugol y fenol. Los agentes decolorantes, tpicamente, son alcoholes y cidos. La remocin del colorante primario por accin del decolorante permite la tincin, con el colorante de contraste, de las clulas que fueron decoloradas; as como tambin del fondo.

Esta segunda tincin diferencia entre tipos de bacterias, como por ejemplo, organismos violeta intenso y rojizos vistos con la coloracin de Gram; o entre los microorganismos y el fondo, tales como los Bacilos cido Resistentes (BAR) que se tien de rojo sobre un fondo azul.

Las dos coloraciones diferenciales ms utilizadas en bacteriologa, son sin lugar a dudas, la coloracin de Gram y la coloracin de Ziehl-Neelsen.

Una coloracin especial o estructural es una coloracin diferencial que, como su nombre lo indica, permite colorear, de manera particular, estructuras especiales de la clula bacteriana, como por ejemplo: cpsula,

Figura 7: Aplicacin de colorantes (Tincin propiamente dicha)Fuente: Johnson T, Case J. 2001

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flagelos, endosporas, grnulos metacromticos y otros constituyentes intracelulares de las clulas bacterianas.

Tcnicas de ColoracinColoracin de Gram

La tincin de Gram, descrita en 1.884 por Hans Christian Gram, se usa con mucha frecuencia para el examen microscpico directo de muestras y subcultivos.

Fundamento: Aunque se han propuesto varias explicaciones sobre el fundamento de la coloracin de Gram, parece probable que las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares sea la causa de la distinta reaccin de las bacterias Gram positivas y Gram negativas a la coloracin.

La pared de la clula grampositiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglucano as como una pequea cantidad de cidos teicoicos. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula grampositiva es peptidoglucano. La pared de la clula gramnegativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglucano y una membrana externa compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10%-20% de la pared de la clula gramnegativa es peptidoglucano.

Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las grampositivas como las gramnegativas, quedarn teidas de violeta.

El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El ingrediente activo es aqu el I

2; el KI simplemente hace soluble el I

2 en agua. El I

2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en

agua con el cristal violeta. De nuevo, tanto las clulas grampositivas como las gramnegativas, se encuentran en la misma situacin y aparecen de color violeta.

Una vez eliminado el exceso de mordiente a travs del lavado con agua de chorro, se lleva a cabo la decoloracin, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I

2-cristal violeta.

Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen.

La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al hecho que en el caso de las bacterias gramnegativas, la mezcla de alcohol/acetona constituye un solvente lipdico y la solubilidad de los lpidos en el alcohol permite que el decolorante extraiga el complejo cristal violetayodo del interior celular sin que la pared celular constituya una barrera impermeable. La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el complejo cristal violeta-yodo, por tanto, en ese momento, sale el cristal violeta del interior de la bacteria y la clula se decolora.

Las clulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms peptidoglucano y menos lpidos), no son permeables al disolvente ya que ste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las molculas y provocando que el complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular; por lo que despus de la decoloracin permanecen de color violeta.

Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina; aunque tambin puede usarse la fucsina bsica, en algunas modificaciones de la tincin original. Despus de la coloracin de contraste las clulas gramnegativas son de color rojo-rosado; mientras que las grampositivas permanecen violetas (Lmina 1).

No obstante, ninguna composicin qumica exclusiva de la pared bacteriana parece explicar la coloracin con Gram; ya que las gruesas paredes de las clulas de levaduras, que tambin se tien como grampositivas, tienen una composicin qumica y una estructura diferente de las bacterias grampositivas.

Colorantes de Gram (Modificacin de Hucker)

1. Colorante primario: Cristal violeta Solucin Madre

Cristal violeta (85%) ....................................................................................20,00 g

Etanol (95%) ............................................................................................100,00 ml

Solucin Madre de Oxalato

Oxalato de Amonio ........................................................................................1,00 g

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Manual prctico de bacteriologa general

Agua Destilada ........................................................................................100,00 ml

Solucin de Trabajo: Diluir la solucin madre de cristal violeta 1:10 con agua destilada y mezclar con 4 volmenes de la solucin madre de oxalato. Conservar en una botella con tapn de vidrio.

2. Mordiente: Solucin de Iodo de Gram

Cristales de yodo ...........................................................................................1,00 g

Ioduro de Potasio ...........................................................................................2,00 g

Disolver completamente en 5 ml de agua destilada, luego agregar:

Agua destilada .........................................................................................240,00 ml

Bicarbonato de sodio, solucin acuosa al 5% ...........................................60,00 ml

Mezclar y conservar en una botella de vidrio color mbar.

3. Solucin Decolorante: AlcoholAcetona

Acetona ....................................................................................................250,00 ml

Etanol (95%) ............................................................................................250,00 ml

Mezclar y conservar en una botella con tapn de vidrio.

4. Colorante de Contraste: Safranina

Safranina O ....................................................................................................2,50 g

Etanol (95%) ............................................................................................100,00 ml

Solucin de Trabajo:

Diluir la solucin madre 1:5 1:10 con agua destilada. Conservar en una botella con tapn de vidrio.

Tcnica de la Coloracin de Gram Previamente, se debe elaborar un frotis y fjar al calor. Colocar la lmina que contiene el extendido sobre

un soporte para coloracin a fin de mantenerlo en posicin horizontal. Proceder entonces a:

Cubrir la lmina con cristal violeta. Dejar actuar por un minuto. Lavar con agua corriente.1.

Cubrir la lmina con lugol. Dejar actuar por un minuto. Lavar con agua corriente.2.

Sobre la lmina, dejar correr el decolorante orgnico (alcohol-acetona) hasta que la solucin de 3. lavado no salga teida con el colorante violeta. Si lo prefiere, puede mantener la lmina sujeta entre el dedo pulgar e ndice y colocarla de manera que se obtenga un ngulo de 45. Por lo general, el tiempo requerido para la decoloracin oscila entre 10-20 segundos. Lavar de nuevo con agua corriente.

Cubrir el frotis con una solucin de safranina. Dejar actuar por 30 segundos. Lavar con agua 4. corriente.

Colocar la lmina con el frotis en posicin vertical para escurrir el exceso de agua y permitir que 5. seque espontneamente al aire. En su defecto, se puede emplear papel secante, teniendo cuidado de no arrastrar la preparacin.

Colocar una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin y observar al microscopio con objetivo 6. de 100X y ocular de 10X, lo cual resulta en un aumento total de 1.000X.

InterpretacinEsta coloracin diferencial permite observar la morfologa, disposicin y afinidad tintorial de las clulas

bacterianas. Basados en la coloracin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grandes grupos: bacterias Gram positivas, que se tien con el cristal violeta y aparecen de color violeta intenso y, Gram negativas, las que se tien con la safranina y aparecen de color rojo-rosado (Lminas 2 a la 9).

Algunas bacterias no pueden clasificarse mediante la tincin de Gram; ya sea por su difcil tincin o porque carecen de pared celular. Los micoplasmas carecen de pared celular y por lo tanto, no son susceptibles a

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Maribel J. Castellano G, Messaria M. Ginestre P, Yeiny C. vila R, Sonia C. Romero A, Armindo J. Perozo M

la tincin por el procedimiento de Gram (no reactivas a la coloracin). Por otra parte, las micobacterias son muy difciles de teir porque sus envolturas celulares contienen grandes cantidades de ceras, por lo que requieren el uso de otras coloraciones diferenciales como la de Ziehl-Neelsen, por ejemplo. Existen microorganismos que se tien indiferentemente como Gram positivos o Gram negativos y son denominados Gram variables. Se cree que son bacterias que han perdido la habilidad de reaccionar en forma diferencial a esta coloracin. Esto generalmente sucede en cultivos viejos (con ms de 48 horas de incubacin). Se asume que este fenmeno ocurre debido a modificaciones en la pared celular provocadas por la edad del cultivo. En consecuencia, se recomienda que los frotis sean elaborados a partir de cultivos de no ms de 24 horas de i