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INFORME TÉCNICO FINAL DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN (ENERO 2007-DICIEMBRE 2007)

CARACTERIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS QUE SE UNEN A REGIONES ACTIVADORAS DEL PROMOTOR DEL GEN EhPgp1 DE Entamoeba histolytica . RESUMEN

En este trabajo se estudiaron las interacciones DNA-proteína que corren en la región

comprendida entre –234 y –196 pb y específicamente en el repetido R9(2) del promotor del

gen EhPgp1, ya que como lo habíamos reportado anteriormente esta secuencia de 9 pb, en

la posición -226 a -218 pb, regula positivamente la actividad del promotor. En este trabajo

encontramos que los EN de trofozoítos de la clona C2 forman tres complejos DNA-proteína

con la secuencia de -234 a -196 pb y las proteínas que se unen a esta región, reconocen

DNA de cadena doble y sencilla; los EN de trofozoítos de la clona C2 forman tres

complejos DNA-proteína con el elemento R9(2). Además, se purificaron tres proteínas, de

64.4, 56.7 y 27.4 kDa, que se unen a la región de -234 a-196 pb, sin embargo el repetido

R9(2) es reconocido específicamente por tres proteínas de 122, 61 y 42 kDa. Finalmente, se

purificaron dos proteínas, de 63.9 y de 31 a 29 kDa, que se unen al repetido R9(2).

INTRODUCCIÓN.

Desde hace algunos años se ha documentado que Entamoeba histolytica, el protozoario

causante de la amibiasis, posee el fenotipo MDR que es la capacidad para desarrollar

resistencia a una droga que se usa como agente selectivo, y además presentar resistencia

cruzada a otras drogas. Este fenotipo está asociado con la sobreexpresión de una

glicoproteína de membrana llamada PGP, la cual es un transportador que expulsa las

drogas quimioterapeúticas fuera de la célula, evitando su acción. Uno de los genes que

codifican para estas PGPs es el gen EhPgp1, cuyo promotor minimo está siendo

caracterizado. Hasta el momento se han identificado dos secuencias C/EBPs que participan

activamente en la actividad del promotor, sin embargo recientemente hemos identificado

secuencias repetidas de 9 y 7 pb cada una, localizadas en la región de -234 a -196 pb de

este promotor, que también son importantes para la actividad del mismo. Particularmente

un repetido de 9 pb localizado en la posición de -226 a-218 es fundamental para la

actividad del promotor, ya que la incorporación de 4 o màs mutaciones en el mismo,

produjo una reducción del 70% en la actividad. Es muy probable que en este sitio esté

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interactuando algun factor proteico involucrado en la regulación transcripcional del gen

Ehpgp1. El conocimiento de las moleculas involucradas en la expresíon de los genes de

amiba nos permitirá contar con las herramientas indispendables para poder combatir el

problema de la amibiasis.

MÉTODOS Y MATERIALES

Cultivo de los trofozoítos de E. histolytica

Los trofozoítos de la clona C2 (resistente a emetina) se cultivaron axénicamente en

medio TYI-S-33 a 37º C.

Obtención de Extractos Nucleares

Se obtuvieron extractos nucleares (EN) de trofozoítos de la clona C2 usando el método de

Schreiber modificado (Gómez y col., 1998). Se cosecharon los trofozoítos de 6 cajas de

cultivo 225 cm2 (Corning) y se lavaron dos veces con PBS pH 6.8, centrifugando a 450 x

g por 10 min. El paquete se resuspendió en 8 volúmenes de buffer A (Hepes 10 mM pH

7.9, MgCl2 1.5 mM, KCl 10 mM, DTT 0.5 mM y PMSF 0.5 mM) y se incubaron

aproximadamente 20 min a 4º C, hasta que la mayoría de las células se mostraban

redondas. Se centrifugó a 2,809 x g por 10 min en un rotor Sorvall SS 34, el paquete se

resuspendió en 5 volúmenes de buffer A con 41 μg/ml de mezcla de inhibidores de

proteasas (PMSF 0.5 mM, benzamidina 2 mM, aprotinina 5μg/ml, pepstatina A 5 μg/ml y

leupeptina 5 μg/ml). Las células se lisaron usando un homogeneizador con pistilo, dando

25 golpes y observando al microscopio el grado de lisis. Los núcleos se recuperaron

centrifugando a 5,637 x g por 10 min. El paquete se resuspendió en 200 μl de buffer C

(Hepes 200 mM pH 7.9, NaCl 0.42 M, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM y DTT 0.5 mM)

adicionado con mezcla de inhibidores de proteasas, se incubaron 50 min a 4º C con

agitación rotatoria y se centrifugaron a 20,800 x g por 10 min a 4º C. El sobrenadante se

distribuyó en fracciones y se almacenó a -70º C.

La integridad de los extractos se visualizó mediante el corrimiento electroforético de

estos en geles de poliacrilamida-SDS al 12%.

Ensayos de retardamiento

Oligonucleótidos complementarios de doble cadena con las secuencias de -234 a -196

pb (5’ TATCTGATAAAAATGTTATCTGAAAAAATGTTATCTGA 3’) y de -226 a –218 pb

repetida tres veces y separada por 6 pb (5’

3

AAAAATGTTCCGATCAAAAATGTTCCGATCAAAA ATGTT 3’) fueron marcados

con [γ-32P]- ATP 10 mCi/ml, 3000 mCi/mmol, usando 10 unidades de cinasa T4 en un

volumen de reacción de 15 μl (In vitrogen), la reacción se incubó 45 min a 37º C, se

adicionaron 85 μl de agua bidestilada y la marca no incorporada se limpió utilizando una

columna de Sephadex G-50. La actividad se determinó en el contador de centelleo. Las

interacciones DNA-proteína se hicieron mezclando 20 μg de extractos nucleares,

(Amersham Pharmacia Biotech), 5 μl de DNA mix (Espermidina 4 mM, MgCl2 4 mM, 1

μg de poli [d(I-C)]), 4 μl de buffer de unión de proteínas (Hepes 12 mM pH 7.9, KCl 60

mM, DTT 1 mM, EDTA 1mM, Tris HCl 4 mM pH 7.9, 10% de glicerol) y oligonucleótido

competidor. Se incubó 10 min a 4º C, posteriormente se agregó 1 ng de la sonda marcada

(20,000 cpm) y se incubó 10 min más a 4º C. Para los ensayos de competencia se utilizó

un exceso molar de 150 veces del mismo oligonucleótido sin marca u oligonucleótidos de

doble cadena conteniendo las secuencias consenso para los factores de transcripción

C/EBP (5’-CTGATGAATTGGAAAAGAAA GA-3’), HOX (5’-GTAAGAGTTATTATT

GAT-3’) y GATA1 (5’-GTTGCAGATAAA CATT-3’). Como competidor inespecífico se

utilizó un exceso molar de 350 veces de poli [d(I-C)]. Los complejos se separaron en geles

de poliacrilamida al 6 % en TBE 0.5 X (Tris-HCl 44.5 mM pH 7.9, ácido bórico 44.5 mM,

EDTA 1 mM) a 120 V por 3 h. Los geles se secaron con vació y se visualizaron por

autoradiografía utilizando un equipo Storage Phosphor Imaging System (Bio Rad). La

intensidad de las bandas se comparó mediante un análisis densitométrico.

Purificación de proteínas de unión al DNA

Se utilizó el kit de purificación DNA-binding Protein Purification Kit (Roche) y EN de

trofozoítos de la clona C2. Este método consiste en la purificación de proteínas que se

unen específicamente a una secuencia blanco de DNA conocida y se basa en el uso de

partículas magnéticas cubiertas con un oligonucleótido de 16 pb, al cual se puede ligar un

concatámero del oligonucleótido conteniendo la secuencia blanco. Cuando se agregan a

este sistema los EN conteniendo la proteína de unión al DNA deseada, la proteína es

capturada por el complejo concatámero-partícula, mientras que las proteínas inespecíficas

no se unen. Finalmente, las proteínas que se unieron específicamente al DNA, se eluyen

utilizando un amortiguador de fuerza iónica alta.

Como primer paso, se diseñaron oligonucleótidos complementarios con la secuencias: -

234 a -196 pb y -226 a -218 pb, la última repetida tres veces y separadas por un numero

igual de bases que las presentes en la secuencia original. De cada par de oligonucleótidos

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se obtuvo un concatámero por la técnica de self-primed PCR en la cual se utilizó como

molde a los oligonucleótidos complementarios, las condiciones de la PCR se muestran en

la tabla 6.

Tabla 1. Reacción de PCR para la obtención de concatámeros. Se utilizaron 95º C como temperatura de desnaturalización, 55º C para alinear los oligonucleótidos y 72º C para amplificar.

Mezcla de dNTPs 20 mM 2 μl

Oligonucleótido sentido 20 pM

Oligonucleótido antisentido 20 pM

Thermo Pol Buffer 10X 10 μl

Deep Vent Polimerasa 2 U

Agua para 100 μl

MgSO4 1 μl

BSA 1 μl

La formación de los concátameros y su variedad de tamaños se verificó corriendo 10 μl

del producto de la self-primed PCR en geles de agarosa al 1%, junto a los marcadores de

tamaño molecular lambda digerido con HindIII y PhiX digerido con HaeIII.

Una vez verificada la formación de los concatámeros, éstos se acoplaron a partículas

magnéticas cubiertas con un oligonucleótido de 16 pb, mediante la siguiente metodología:

se tomaron 50 μl de la suspensión de partículas magnéticas, se lavaron cuatro veces con 50

μl de buffer TEN 2000 (tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 1mM, NaCl 2 M) y dos veces con

50 μl de buffer de ligación 1X (tris-HCl 52.5 mM, DTT 10.5 mM, MgCl2 5.24 mM, ATP

0.104 mM), utilizando un separador magnético. Después de descartar el sobrenadante del

último lavado se agregaron 10 μl de buffer de ligación 5X (Tris-HCl 262.5 mM pH 7.5,

DTT 52.5 mM, MgCl2 26.2 mM, ATP 0.52 mM), 18.75 μl de PEG 6000 (40%), 4 μl de

KCl 2.5 M, 5 μl de la reacción de PCR para la obtención del concátamero y 9.75 μl de

agua. La mezcla se homogeneizó en un vortex y se adicionaron 2.5 μl de ligasa T4 (5

U/μl). Se incubó 30 min a temperatura ambiente, agitando el tubo ocasionalmente. Las

partículas se lavaron una vez en buffer de ligación IX, tres veces con buffer de unión de

proteínas (Hepes 20 mM pH 7.6, EDTA 1 mM, (NH4)2SO4 10 mM, DTT 1 mM, 0.2% de

tween 20, KCl 30 mM), tres veces con buffer de elusión (KCl 2 M, Hepes 20 mM pH 7.6,

5

EDTA 1 mM, (NH4)2SO4 10 mM, DTT 1 mM, 0.2% de tween 20, KCl 30 mM) y tres

veces más con buffer de unión de proteínas 1X.

Para la unión de las proteínas al complejo de perlas magnéticas-concatámero, se hizo la

siguiente reacción: el complejo se incubó con 50 μg de extractos nucleares (EN) de la

clona C2, 6.25 μg de poli [d(I-C)], 0.625 μg de poli L- lisina y 25 μl de buffer de unión de

proteínas 5X (Hepes 100 mM pH 7.6, EDTA 5 mM, (NH4)2SO4 50 mM, DTT 5 mM, 1%

de Tween 20 y KCl 150 mM) en un volumen final de 125 μl y se incubaron durante 1 h a

4º C. Las partículas se lavaron 6 veces con 50 μl de buffer de unión de proteínas 1X, para

eliminar las proteínas contaminantes. Las proteínas de unión al DNA se eluyeron dos veces

con 15 μl de buffer de elusión incubando 20 min a 4º C cada vez. Las fracciones colectadas

se analizaron por electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS al 10% (Laemmli, 1970) y

tinción con plata.

Ensayos de retardamiento con proteínas parcialmente purificadas

Se utilizó como sonda el oligonucleótido de doble cadena conteniendo la secuencia de -

226 a -218 repetida tres veces y separada por un numero igual de bases a las presentes en

la secuencia original

(5’AAAAATGTTCCGATCAAAAATGTTCCGATCAAAAATGTT 3’), se marcó con

[γ-32P]- ATP 10 mCi/ml, 3000 mCi/mmol, de la forma ya descrita. Las interacciones

DNA-proteína se hicieron incubando 1 ng de la sonda marcada, con 20 μg de EN de la

clona C2 o con 45 μl de la proteína eluída y se pusieron a interactuar bajo las condiciones

ya descritas. Los complejos se separaron en geles de poliacrilamida al 6% en TBE 0.5 X

(Tris-HCl 44.5 mM pH 7.9, ácido bórico 44.5 mM, EDTA 1 mM) a 120 V por 3 h. Los

geles se secaron con vació y se visualizaron por autoradiografía utilizando un equipo

Storage Phosphor Imaging System (Bio Rad).

Ensayos de entrecruzamiento con luz UV

Se utilizó la misma sonda que en el ensayo anterior y se marco de la manera ya descrita.

Se mezclaron 70 μg de EN de la clona C2, 12 μl de buffer de unión de proteínas, 15 μl de

DNA mix y oligonucleótido competidor, en un volumen final de 60 μl y se incubaron 10

min a 4º C; se agregó la sonda (2 ng) y la reacción se incubó 10 min más a 4º C. Los tubos

se irradiaron con luz ultravioleta (UV) durante 5 min en un transiluminador Cole-Parmer

serie 97500, 115V, 60 Hz. Se agregó buffer de corrida de proteínas 6X a cada tubo (7 ml

de tris HCl 0.5M pH 6.8, 1g de SDS, 3 ml de glicerol, 1.2 mg de azul de bromofenol, agua

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para 10 ml) con β-mercaptoetanol y se colocaron en ebullición por 5 min. Para comprobar

la naturaleza de los complejos observados, se incluyeron dos testigos conteniendo 1 U de

DNasa I (In Vitrogene) y 20 μg de Proteinasa K (In Vitrogene), respectivamente, los

cuales se incubaron durante 30 min a 37º C. Las muestras se cargaron en un gel de

poliacrilamida al 8 % y se corrieron a 120 V durante 4 h, se incluyó un pozo con 15 μl del

marcador de peso molecular preteñido (Precision Plus Protein Dual Color Standards,

BioRad). Las competencias se hicieron utilizando un exceso molar de 150 veces del

oligonucleótido frío o de poli [d(I-C)]. Los geles se secaron con vació y se visualizaron

por autoradiografía utilizando un equipo Storage Phosphor Imaging System (Bio Rad).

RESULTADOS

Reconocimiento de la región de -234 a -196 pb por proteínas nucleares de E.

histolytica.

A fin de conocer las interacciones DNA-proteína que pudieran estar ocurriendo en esta

región del promotor se llevaron a cabo ensayos de retardamiento usando oligonucleótidos

conteniendo la región de -234 a -196 pb, que incluye todos los elementos identificados, y

la región de -226 a -218 pb que incluye el repetido R9 repetido tres veces y separado por

seis pb. La integridad de los EN de la clona C2 se visualizó mediante su migración

electroforética en un gel de poliacrilamida-SDS al 12 % (figura 1). Los extractos nucleares

incubados con el fragmento de -234 a -196 pb formaron tres complejos DNA-proteína

(Figura 2, carril 2), los cuales fueron competidos específicamente por un exceso molar de

150 veces de sonda fría (carril 4), pero no por el competidor inespecífico poli [d(I-C)]

(Figura 2, carril 3).

Se ha reportado que algunos factores de transcripción que reconocen DNA de doble

cadena, y en particular secuencias repetidas, también pueden reconocer DNA de cadena

sencilla (Schaenman y col., 2001), por lo cual decidimos investigar si las proteínas que

están formando los complejos observados poseen esta característica.

En los carriles 5 y 6 de la figura 2 se utilizaron como competidores los oligonucleótidos

fríos de cadena sencilla, sentido y antisentido, que conforman la sonda marcada,

respectivamente. Los resultados mostraron que estos oligonucleótidos compiten

completamente la formación de los complejos DNA-proteína, lo cual indica que estas

proteínas también reconocen DNA de cadena sencilla.

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Debido a que en diferentes organismos los promotores presentan características

estructurales similares, se han podido identificar secuencias conservadas de

reconocimiento para diferentes factores de transcripción. En E. histolytica se conoce muy

poco acerca de la presencia de dichas secuencias consenso y de las proteínas que pudieran

estar reconociéndolas. Para investigar la identidad de las proteínas que están formando

estos complejos se llevaron a cabo experimentos de competencia usando oligonucleótidos

de doble cadena conteniendo secuencias consenso para factores de transcripción,

previamente identificadas en esta región (C/EBP y GATA1), o de las que se ha sugerido

participan en la formación de un complejo multiproteíco (HOX) en está región (Gómez y

col., 1998). El análisis densitométrico de los complejos formados mostró que los

oligonucleótidos GATA1 y HOX compiten en un 49 y 26 % respectivamente en la

formación de estos complejos (figura 2, carriles 7 y 8 respectivamente), mientras que

C/EBP los compitió en un 68% (figura 2, carril 9). Estos resultados sugieren que los

complejos DNA-proteína obtenidos pueden estar formados por más de una proteína, y que

estas proteínas reconocen secuencias presentes en estos oligonucleótidos, teniendo mayor

afinidad por el oligonucleótido C/EBP. Aun cuando no se identificó alguna secuencia

consenso para el factor HOX en esta región, este oligonucleótido compitió parcialmente en

la formación de los tres complejos, lo cual sugiere que las proteínas que conforman el

complejo también pueden interactuar con éste.

Reconocimiento del repetido R9 por proteínas nucleares de E. histolytica.

Cuando los EN se incubaron con el oligonucleótido conteniendo el elemento R9 (-226

a -218 pb) repetido tres veces, observamos la formación de tres complejos específicos

DNA-proteína (figura 3, carril 2), los cuales no fueron competidos por el competidor

inespecífico poli [d(I-C)] (figura 3, carril 3). Así mismo, debido a que existe un segundo

elemento con la misma secuencia, denominado R9(1) en la posición de -211 a -203 pb,

decidimos realizar ensayos de competencia para determinar si este segundo elemento R9

también participa en la formación de los complejos observados. Para lo cual se utilizaron

como competidores oligonucleótidos conteniendo la secuencia R9 repetida tres (3R), dos

(2R) y una (1R) vez. El análisis densitométrico mostró que el oligonucleótido 3R, compitió

un 65 % con la formación de los complejos (figura 3, carril 4), el oligonucleótido 2R,

compitió un 31% (figura 3, carril 5) y cuando se utilizó como competidor el

oligonucleótido 1R, hubo una competencia del 22 % (figura 3, carril 6). Los resultados

muestran que es necesaria la presencia de más de un elemento R9 para que ocurra la

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interacción DNA-proteína, lo cual sugiere que el primer repetido R9 (R9(1)) también está

involucrado en la regulación transcripcional del gen EhPgp1.

Purificación de las proteínas nucleares que se unen a la región de -234 a -196 pb y a la

región R9 (-226 a -218 pb) del promotor del gen EhPgp1

Con el fin de identificar y caracterizar las proteínas que están formando estos complejos

se procedió a su purificación parcial. Los factores nucleares que se unen a las regiones -

234 a -196 pb y al oligonucleótido 3R, se purificaron parcialmente por cromatografía de

afinidad al DNA, usando el kit DNA binding protein purification (Roche), EN de la clona

C2 y los oligonucleótidos concatamerizados. Estos concatámeros se obtuvieron por la

técnica de self-primed PCR, los productos se muestran en la figura 4. El barrido observado

indica la variedad de los amplificados obtenidos de diferente tamaño molecular (figura 4,

A y B, carril 2).

Los eluídos obtenidos de la purificación se corrieron en geles de poliacrilamida al 10% y

éstos se tiñeron con plata. Cuando se utilizó como sonda el concatámero de 38 pb (-234 a -

196), conteniendo todos los repetidos que estamos estudiando, se observó el

enriquecimiento de tres bandas correspondientes a 64.4. 56.7 y 27.4 kDa (figura 5, carril

4), lo cual apoya la idea de que los complejos DNA-proteína que se forman en está región

están formados por más de una proteína. Por otro lado, cuando se utilizó como DNA sonda

el concatámero conteniendo tres veces la región R9, se detectaron tres bandas de mayor

intensidad de entre 29 y 31 kDa y una banda menos intensa de 63.6 kDa (figura 6, carril 7),

las cuales podrían corresponder con las bandas de 64.4 y 27.4 kDa obtenidas con el

oligonucleótido de 38 pb (figura 5). Esto sugiere que estas proteínas están interactuando en

los elementos R9 y que la proteína de 56.7 kDa probablemente esté reconociendo las

secuencias intermedias (R7).

Interacciones DNA-proteína con las proteínas parcialmente purificadas

Con la finalidad de determinar si las proteínas parcialmente purificadas eran capaces de

interactuar con el repetido R9, se llevaron a cabo ensayos de retardamiento utilizando la

fracción purificada de los EN y el repetido R9 sin concatamerizar. Los resultados

mostraron la formación de un complejo DNA-proteína (figura 7, carril 3), el cual tiene la

misma movilidad electroforetica que el complejo formado con EN de la clona C2 (figura 7,

carril 2), aunque la intensidad del primero es mayor. Este complejo además es competido

por la misma sonda fría (figura 7, carril 4), pero no por el competidor inespecífico poli d(I-

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C) (figura 7, carril 5). Este experimento demuestra la especificidad de las proteínas

parcialmente purificadas y la afinidad de estas por los repetidos R9.

Para determinar el peso molecular de las proteínas unidas a la sonda conteniendo el

elemento R9 repetido tres veces, se realizó una prueba de entrecruzamiento usando EN de

trofozoítos de la clona C2. Las proteínas entrecruzadas se separaron por electroforesis en

un gel de poliacrilamida al 8 % y fueron analizadas por autoradiografía. En la imagen se

observan tres bandas de alrededor de 146, 85 y 66 kDa (figura 8, carril 4). Debido a que el

peso molecular de la sonda de 38 pb es de 24.66 kDa, el peso molecular de los factores

entrecruzados con el oligonucleótido fue recalculado en alrededor de 122, 61 y 42 kDa.

Estas bandas no se detectaron cuando se utilizó, en la mezcla de unión, un exceso molar de

150 veces de sonda fría (figura 8, carril 6), pero no se afectaron por el competidor

inespecífico (figura 8, carril 5), indicando la especificidad de los complejos. Cuando la

sonda y EN no se irradiaron con luz UV, no se encontraron especies marcadas (figura 8,

carril 2). Cuando a los entrecruzados se les agregó DNasa I, no se observó alteración en la

migración de las bandas, sin embargo, al adicionar proteinasa K, los complejos

desaparecieron (figura 8, carriles 7 y 8), lo cual comprueba que las bandas observadas son

complejos DNA-proteína.

Los pesos moleculares encontrados para estas proteínas no nos proporcionan información

concluyente, aun cuando se ha reportado, para los factores de transcripción cuya secuencia

consenso está presente en esta región, que el gen C/EBPβ codifica para varias isoformas

cuyos pesos moleculares son de 40, 35, 20 y 8.5 kDa (Grigorov y col., 1998). Marchat y

col, 2002 demostraron la presencia de proteínas C/EBP en amiba las cuales son

reconocidas por anticuerpos heterólogos anti-C/EBP de humano cuyos pesos moleculares

son 25 y 65 kDa.

También se consideró la posibilidad de que alguna de estas proteínas pertenezca a la

familia de factores de transcripción GATA, debido a la presencia de secuencias consenso

para algunos de estos factores (GATA1-2, NIT2, GAL4). NIT2 es una proteína

regulatoria de N. crassa cuyos sitios de unión en el promotor de algunos genes, tienen al

menos dos secuencia mínimas GATA para formar un complejo fuerte DNA-proteína, la

distancia efectiva entre estos elementos puede variar entre 5-30 pb sin embargo el espació

óptimo es de 20 pb (Chiang y Marzluf, 1994). En la región de 38 pb que estamos

estudiando (-234 a -196 pb) se localizan tres secuencias GATA las cuales están separadas

por 12 pb, lo cual por lo anterior se consideraría como una distancia efectiva. Además en

nuestros ensayos de funcionalidad encontramos que cuando se elimina uno de estos

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repetidos (RCIII) la actividad del promotor se abate en un 58%, y en un 87% cuando se

eliminan dos de ellos (RCIII y RCII), estas observaciones nos sugieren que las proteínas

que estamos caracterizando pudieran pertenecer a la familia GATA, o bien que requieran

interactuar con regiones repetidas en el DNA para formar un complejo estable.

Actualmente se están obteniendo las proteínas purificadas y con ellas realizaremos

ensayos de retardamiento y entrecruzamiento. Así mismo, con la finalidad de determinar la

identidad de estas realizaremos ensayos de Western Blot utilizando anticuerpos

heterólogos anti C/EBP y anti GATA1 de humano.

Chiang y Marzluf en 1994, trabajando con el factor de transcripción NIT2 de N. crassa,

encontraron que los sitios de unión al DNA de alta afinidad para este factor son secuencias

repetidas las cuales contienen al menos dos secuencias centrales GATA, y que cuando

cambian un solo nucleótido de alguno de estos sitios se elimina la unión de NIT2,

demostrando así la importancia de estos repetidos. Interesantemente, nosotros

identificamos la secuencia GATA en los repetidos cortos RCIII, RCII y RCI, no obstante

necesitamos dilucidar la relevancia de estas secuencias en el control de la expresión del

gen EhPgp1.

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Figura 1. Integridad de los extractos nucleares (EN) de trofozoítos de la clona C2. Corrimiento electroforético en un gel de poliacrilamida-SDS al 12 %, de 80 μg de EN de dos diferentes extracciones. Las bandas de proteína se tiñeron con azul de Coomasie.

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EN - + + + + + + + +CE - - - + CS CA - - -CI - - + - - - - - -GATA1 - - - - - - + - -HOX - - - - - - - + -C/EBP - - - - - - - - +

Figura 2. Unión de proteínas nucleares a la región de -234 a -196 pb del promotor mínimo del gen EhPgp1. El ensayo de retardamiento se llevó a cabo usando 15 μg de extractos nucleares (EN) de trofozoítos de la clona C2, 1 ng del fragmento de -234 a -196 pb de doble cadena marcado con γ- 32P y diferentes competidores no marcados (en exceso molar de 150 veces). Carril 1, sonda libre; carril 2, sin competidor; carril 3, competidor inespecífico (CI, poli [d(I-C)] en exceso molar de 350 veces); carril 4, competidor especifico (CE); carril 5 y 6, competidor específico de cadena sencilla, sentido (CS) y antisentido (CA), respectivamente; y en los carriles 7 a 9, se utilizaron oligonucleótidos de doble cadena conteniendo las secuencias para GATA1, HOX y C/EBP respectivamente. Las flechas indican los complejos específicos DNA-proteína.

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EN - + + + + +CI - - + - - -CE (3R) - - - + - -CE (2R) - - - - + -CE (1R) - - - - - +

Figura 3. Unión de proteínas nucleares a la región R9(2) (-226 a –218 pb) del promotor mínimo del gen EhPgp1. El ensayo de retardamiento se llevó a cabo usando 15 μg EN de trofozoítos de la clona C2, 1 ng del fragmento de -226 a -218 pb de doble cadena marcado con γ- 32P y diferentes competidores no marcados (en exceso molar de 150 veces). Carril 1, sonda libre; carril 2, sin competidor; carril 3, competidor inespecífico (CI, poli [d(I-C)] en exceso molar de 350 veces); carril 4, competidor especifico (CE) 3R, conteniendo tres veces el elemento R9; carril 5, competidor específico 2R, conteniendo 2 veces el elemento R9; carril 6, competidor especifico 1R, conteniendo una vez el elemento R9. Las flechas indican los complejos específicos DNA-proteína.

1 2 3 4 5 6

CE(3R) AAAAATGTTCCGATCAAAAATGTTC CGATC AAAAATGTTCE(2R) AAAAATGTTCCGATCAAAAATGTTCCGATCCE(1R) AAAAATGTTCCGATC

14

Figura 4 . Formación de los concatámeros de la región de -234 a -196 pb y de -226 a -218 pb por la técnica self-primed PCR. Geles de agarosa al 1%, A) carril 1, marcador PhiX digerido con HaeIII; carril 2, 10 μl del producto de PCR de la región de 38 pb (-234 a -196 pb); carril 3, marcador Lambda digerido con HindIII. B) carril 1, marcador PhiX digerido con HaeIII; carriles 2, 10 μl de producto de PCR del fragmento correspondiente a la región -226 a -218 pb; carril 3, marcador Lambda digerido con HindIII.

1 2 3 1 2 3

A B

13531078

310

231309416

pb pb pb pb

1353872

31023130

6557

4361

1 2 3 1 2 3

A B

13531078

310

231309416

pb pb pb pb

1353872

31023130

6557

4361

15

Figura 5. Purificación parcial de las proteínas de unión a la región de -234 a -196 pb del promotor del gen EhPgp1 de E. histolytica. Las proteínas fueron separadas en un gelde poliacrilamida-SDS al 10 % y detectadas por tinción con plata. Carril 1, marcador de peso molecular, Broad Range (BioRad); carril 2, extracto nuclear crudo; carril 3, sobrenadante del procedimiento de purificación, carril 4, eluído.

97.2

64.456.7

27.4

66.4

55.6

42.7

36.526.6

1 2 3 4

kDa kDa

16

63.6

29-31

Figura 6. Purificación parcial de las proteínas nucleares que se unen a la región de-226 a –218 pb (R9), del promotor del gen EhPgp1 de E. histolytica. Las proteínas

fueron separadas en geles de poliacrilamida-SDS al 10% y detectadas por tinción con plata. Carril 1, marcador de peso molecular, Broad Range BioRad; carril 2, extracto nuclear crudo; carril 3, sobrenadante del procedimiento de purificación, carril 4-6, lavados del procedimiento de purificación; carril 7, eluído.

1 2 3 4 5 6 7

kDa

1169766

45

31

21

kDa

17

EN - + - - -Prot - - + + +CI - - - - + CE - - - + -

5’

1 2 3 4 5

Figura 7. Ensayo de retardamiento utilizando proteínas parcialmente purificadas y como sonda un oligonucleótido conteniendo la región de -226 a -218 (R9). El ensayo de retardamiento se llevó a cabo usando 15 μg de extractos nucleares (EN) de trofozoítosde la clona C2 o 45 μl de la proteína semipurificada, 1 ng de la sonda de doble cadena marcado con γ- 32P y marcados. Carril 1, sonda libre; carril 2, sonda y EN; carril 3, sonda y proteína parcialmente purificada; carril 4, sonda, proteína y competidor especifico (CE),en exceso molar de 150 veces.; carril 5, sonda, proteína y competidor inespecífico (CI, poli [d(I-C)] en exceso molar de 350 veces. La flecha señala el complejo específico DNA-proteína.

18

Figura 8. Autoradiografía de un gel de poliacrilamida al 8 % mostrando los entrecruzamiento con luz UV de EN de trofozoitos de la clona C2 y el oligonucleótidoconteniendo la región de -226 a-218 pb (R9) del promotor del gen EhPgp1 de E. histolytica. Se entrecruzaron 70 μg de EN con 2 ng de la sonda radiomarcada con [γ-32P] ATP por 5 min a temperatura ambiente. Carril 1, sonda sin irradiar; carril 2, sonda irradiada; carril 3, sonda y EN sin irradiar; carril 4, sonda y EN irradiados; carril 5, sonda, EN y poli d(I-C) (exceso molar de 150 veces) irradiados, carril 6, sonda, EN y sonda fría (exceso molar de 150 veces) irradiados; carril 7, sonda, EN y DNasa I; y carril 8, sonda. EN y Proteinasa K. Las flechas señalan los complejos DNA-proteína.

1 2 3 4 5 6 7 8

122

6142

kDa

19

Impacto.- Los estudios de la expresión de los genes en organismos eucariontes se ha

centrado principalmente en animales, plantas y hongos, mientras que poca información hay

disponible para protozoarios parásitos.

Entamoeba histolytica es un protozoario anaerobio responsable de la amibiasis humana. El

conocer la estructura de su DNA y los mecanismos que regulan la transcripción de sus

genes es un paso hacia el entendimiento de su virulencia. Además, nos permitirá ampliar

nuestro conocimiento respecto al fenómeno MDR en E. histolytica, el cual es un

mecanismo que el parásito ha desarrollado para sobrevivir en presencia de los fármacos que

se usan para combatir el problema de la amibiasis, y de esta forma poder contribuir a la

erradicación y prevención de esta enfermedad.

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amoebiasis: from molecules to disease. Clin. Microbiol. Rev. 13 (2): 318-331.

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chloramphenicol acetyltransferase gene expression. Biotechniques 5: 444-446.

21

México, D. F. a 11 de enero de 2008.

Secretaría de Investigación y Posgrado

Instituto Politécnico Nacional

A la comisión evaluadora de los proyectos de investigación SIP

Por medio de este documento quiero hacer de su conocimiento que en mi informe

técnico final del proyecto de investigación 2007 y en mi ficha de productividad no

reporto ningún tipo de producto en el rubro III, que corresponde a Formación de

Recursos Humanos, sin embargo en este momento cuento con un estudiante PIFI a nivel

licenciatura y una estudiante que esta haciendo su tesis de maestría y que se graduará en

el transcurso del presente año. Además quiero informarle que con los resultados hasta

ahora obtenidos hemos escrito un artículo y lo enviamos a una revista internacional, de

la cual estamos esperando una respuesta para su publicación.

Sin más por el momento, le agradezco la atención prestada al presente documento.

Atentamente,

_______________________________________

Dra. María Esther Ramírez Moreno Profesor Asociado ENMyH-IPN