Genes Quiméricos

7/26/2019 Genes Quimricos

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Manipulacin de la expresin

Genes Quimricos


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Manipulacin de la expresin gnica en bacterias

El objetivo principal de la ingeniera gentica con fines industriales es lograr la

correcta expresin a altos niveles del gen clonado en el microorganismo husped

elegido. Sin embargo, la clonacin directa (sin manipulacin adicional) de un gen

en un vector normal (como el pBR322) no suele asegurar que nuestro gen de

inters se vaya a expresar bien, sobre todo cuando procede de especies alejadas

filogenticamente.

Por esta razn hay que proceder al diseo de vectores especializados y a menudo

a modificaciones del gen de inters, con objeto de que este pueda transcribirse y

traducirse bien en el microorganismo husped.


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He aqu algunos de los elementos que convienemanipular para este fin:

Naturaleza de las secuencias de inicio y final de la

transcripcin

Eficiencia de la traduccin

Estabilidad de la protena en la clula husped

Localizacin celular de la protena a expresar

Nmero de copias del gen clonado.


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Protenas de fusin: una alternativa para mejorar

la expresin de protenas recombinantes

2 problemas principales con la expresin deprotenas forneas Degradacin Purificacin

Degradacin produce un nivel bajo de expresin es dificil la purificacin de la protena deseada

Una solucin para la degradacin Unir la protena target a una protena celular estable

(tag o carrier)


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Qu debe tener un vector de expresin en E. coli?(se citan los elementos genticos siguiendo el orden

desde el lado 5 al lado 3):

Un promotor eficiente, dotado de las regiones conservadas35 (TTGACAo parecida) y10 (TATAAT o parecida)

A corta distancia del promotor, una regin que al transcribirse suministre elsitio de entrada al ribosoma: la denominada secuencia de Shine-Dalgarno,que es complementaria del extremo 3 del ARNr 16S

A unos 3-11 pb aguas abajo de la secuencia de Shine-Dalgarno, deberasituarse el codn ATG que seala el comienzo de la traducccin del

ARNm. Este codn lo puede suministrar el gen a clonar, o bien el vectorpuede disponer de ese codn, seguido de alguna diana que permita la

insercin del gen a expresar Finalmente, y situado al lado 3 de todo lo anterior, una secuencia que

funcione como terminador de la transcripcin (que en su forma de ARNconstituye la tpica horquilla por emparejamiento intracatenario, donde la

ARN polimerasa se desliga del ARN recin formado).


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Protena de fusin (a nivel DNA o genes) Regin que codifica una protena celular

fusionada en marco de lectura a la regin quecodifica para la protena target

Cuando se transcribe y traduce genera unaprotena de fusin

Protenas de fusin: una alternativa para mejorar

la expresin de protenas recombinantes


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Qu es una protena de fusin?

Es la combinacin de una protena de inters fusionada a otraprotena o pptido conocidos, denominados Tags. Los Tagspueden estar en el NH2 o COOH.

- un dominio con actividad cataltica

- un dominio antignico- una seal peptdica

protege de protelisis a la protena de inters

mejora la solubilidad de la protena

estabiliza a la protena de inters

Tag Mi Protena

TagMi Protena


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Bsicamente, un mRNA con un marco abierto de lectura

(open reading frame, ORF) de codones cualquiera, sinSTOPs, puede ser traducido a protena. Las protenas defusin se basan en esta premisa.

Codn de inicio: ATG (Met)Codones STOP: TAG, TGA TAA

Qu herramienta biolgica de la sntesis de protenas

se utiliza para crear una protena de fusin?


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Fusin de secuencia del gende inters con secuencia del Tag Introduccin del ADN

recombinante enbacterias o lnea celular donde

se expresa la protena de fusin

Por qu son importantes las protenas de fusin?

Las tcnicas de ADN recombinante revolucionaron la produccin y purificacin deprotenas. Permite la purificacin de la protena en pocos pasos, y evita purificar

protenas endgenas.

Clonado de gen de inters enmarco con la secuencia del Tag

ADN recombinante bacterias mucha protena(o cel. eucariota)


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Qu sistema elegiran para expresar protenas recombinantes

y tener mucha protena?

Lo ms comn es usar Escherichia coli

Ventajas:

Se obtiene mucha cantidad de protena, es fcil de crecer, de inducir y depurificar la protena de fusin.

Desventajas:

No realizan modificaciones post-traduccionales, necesarias para el correctoplegamiento y/o actividad de ciertas protenas. Es posible que no haya uncorrecto plegamiento de la protena y haya que pasar a otro sistema (clulasde mamfero, de insecto, levaduras).


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Cuando se debe inducir la expresin de una protena en

bacterias?

Fase exponencial (o Log): mxima tasa de divisin celular; maquinaria transcripcionaly traduccional muy activa.


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En la prctica:

situaciones de

represin y

activacin de la

transcripcin del

gen de inters


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Sistema pET: doble sistema de induccin;

disminuye la expresin leaky


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pRSET Expression VectorThe pRSET vector is designed for high-level

prokaryotic expression controlled by the strong

bacteriophage T7 promoter. Expression is induced

by the production of T7 RNA polymerase in theBL21(DE3)pLysS hostE. coli cells. These cells also

produce T7 lysozyme to reduce basal expression of

target genes. The pRSETvector offers:

High-level expression from the bacteriophage T7

promoter

T7 gene 10 sequence to provide protein stability

N-terminal polyhistidine (6xHis) tag for rapid

purification with ProBond resin

N-terminal Xpress epitope for protein detection

with the Anti-Xpress Antibody

Enterokinase cleavage site for removal of fusion

tag


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Protenas de fusin

A veces la sobreexpresin puede reducirla cantidad de protena recuperada

La protena forma agregados insolubles:Cuerpos de inclusin

La formacin de agregados puede deberse a

un plegamiento incorrecto


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Cuerpos de inclusin: problema o ventaja?

Son agregados insolubles de protena desnaturalizada.Su formacin depende de la naturaleza de la protena y su nivel de expresin.Son fcilmente purificables (casi todo protena recombinante), pero para obtenerla protena hay que hacerlo en condiciones desnaturalizantes (urea 8M).

Cuerpos de inclusin de -

lactamasa en E. co li .

Soluciones a la formacinde cuerpos de inclusin:

Protena de fusin contioredoxina (soluble)

Protena de fusin con

pptido seal, por ej.de la fosfatasaalcalina (periplasma)

Tratamiento conagentes caotrpicos(urea, cloruro de

guanidinio)


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Las fusiones permiten:

Fcil y rpida purificacin de la protena expresada en bacterias,basada en las propiedades del Tag (cromatografa de afinidad, anticuerpos).

M: markerL: lisado de bacteriasF: percoladoE: eludo


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Localizacin de protenas en clulas eucariotas por fusin a protenas o Tagsfluorescentes (microscopa de fluorescencia) o Tags contra los que hayanticuerpos comerciales (inmunofluorescencia).

Las fusiones permiten:

Direccionar la localizacin de protenas de fusin en bacterias:

Periplasma: fcil purificacin, pocas protenas contaminantes, ambientefavorable para el buen plegamiento y la formacin de puentes disulfuro.

Secrecin al medio: pocas protenas contaminantes, fcil purificacin.

Aumentar la solubilidad de las protenas de fusin.

Caracterizacin de protenas (principalmente en interacciones protena:protena;ensayo de doble hibrido, GST-pull down, co-inmunoprecipitacin).


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Clasificacin de Tags (muchos Tags cumplen ms de una funcin)

De purificacin

Por afinidad a un ligando (GST)


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GST (Glutathio ne S-Transferase):26 kDa, originalmente clonada del parsito Schistosoma japonicum. Muy fcil

purificacin. GST aumenta la solubilidad de la protena.

Ventajas:Elucin suaveBuen rendimientonico paso de purificacin

La protena de fusinse purifica por

cromatografa deafinidad usando

glutation inmobilizadosobre agarosa.

De purificacin

Desventaja:solo puede realizarse encondiciones nativas


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Clasificacinde los Tags (muchos Tags cumplen ms de una funcin)

De purificacin


Por caractersticas qumicas del Tag (His-Tag).


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His-Tag:

Tag lineal que contiene 4, 6 o 10 Histidinas consecutivas.

Se purifican por IMAC

(Immobilized-metal affinity chromatography)El His-Tag se une a cationes divalentes(el ms usado es Ni2+) inmobilizados en la resina.Se eluye compitiendo las histidinas con Imidazol(residuo de la histidina )

Es muy pequeo (menor a 1kDa).

Permite la purificacin an en condiciones desnaturalizantes (Urea 8M).

Se obtiene buen rendimiento de purificacin. nico paso de purificacin.

El Tag no interfiere con el plegamiento ni con la funcin de la protena.

De purificacin


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Purificacin en condiciones desnaturalizantes:

La protena expresada se aglutina en cuerpos de inclusin. Son agregados

insolubles que mayormente contienen la protena de inters. Pueden ser

disueltos usando detergentes suaves y UREA 8M, con la consecuentedesnaturalizacin de las protenas.

Esto puede ocurrir por:

Expresin muy alta de la protena de inters y que esta no se llegue a plegarbien.

Protenas muy poco solubles, no solubles o que tengan pasos transmembranahidrofbicos.

Protenas que necesiten modificaciones post-traduccionales para su correctoplegamiento.


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His-Tag:

Esquema de purificacin:

Muy usado en expresin en bacterias.

Las resinas son reusables.

Alto rendimiento.

De purificacin


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De purificacin



Por anticuerpos comerciales (T7, FLAG, HA, C-Myc, etc)


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Purificacin por anticuerpos comerciales sobre tags cortos:

T7-Tag: derivado del gen 10 del fago T7 que es la protena ms abundante delfago. Secuencia: MASTGGQQMG

Todos estos Tags pueden usarse para purificar las protenas tanto de bacteriascomo de clulas eucariotas transfectadas, usando anticuerpos comerciales. Noes lo ms recomendable en bacterias en el caso de poder usar fusiones a GSTo HIS-Tag.

FLAG: pptido comercial muy inmunognico. Secuencia: DYKDDDDK

HA-Tag: residuos 98-106 del la hemaglutinina del virus de influenza humano.

Secuencia: YPYDVPDYAC-Myc: residuos 408-439 del producto del oncogen c-myc humano.


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De purificacin



Por anticuerpos comerciales (T7, FLAG, HA, C-Myc, etc)

De localizacin en bacterias

Secuencias de localizacin periplsmica

(mejora el plegamiento por favorecerformacin de S-S).Secuencias que permiten la secrecin almedio de cultivo (fcil purificacin).

De aumento de solubilidad NusA. Es una de las protenas ms solublesconocidas.

Localizacin de protenas GFP, DsRed.Anticuerpos comerciales contra Tags (FLAG, HA,c-Myc, T7) por inmunofluorescencia.


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GFP (Green Fluorescent Protein):

Proviene de la medusaAequorea victoria.

La fluorescencia de GFP es independiente de la especie que la expresa, nonecesita cofactores, sustratos u otros productos gnicos deA. victoria.

Hay variantes de GFP logradas por mutaciones puntuales.

GFP es una protena muy estable de 238 aa.Cuando se expresa en clulas eucariotas o procariotas,y es iluminada por luz azul o UV, emite fluorescencia verde brillante

(energa de una fuente lumnica es absorbida y reemitida).

Localizacin de protenas

Ampliamente usada como protena de fusin o gen reportero.


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GFP (Green Fluorescent Protein):

Puede usarse para taguear protenas individuales en clulas vivas, y hasta 2o ms protenas distintas en una misma clula con las variantes de GFP.

Usada en todos los organismos, desde levaduras hasta mamferos.

Protena de fusinexpresada en levaduras

Ratones que expresan GFPen todas sus clulas

No modifica la localizacin de su protena partner.



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DsRed (Protena Roja Fluorescente):

Proviene del coral de arrecife Discosoma sp.Muy usado ltimamente como marcador de clulas y como tag de fusin.Comparte las mismas caractersticas con GFP.A travs de mutaciones en la secuencia de AA se han podido crear variantesde absorcin y emisin muy tiles para usar ms de un tag por clula.

mHoneydew mBanana mOrange tdTomato mTangerine mStrawberry mCherry


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Tags cortos contra los que existen anticuerpos comerciales:

FLAG, HA,

c-Myc, T7

1. Anticuerpo primarios (mAb)

2. Anticuerpo secundarios conjugados a fluorforos

Permiten ver localizacin subcelular de protenas fusionadas a estos Tags(solo en clulas fijadas = MUERTAS); los anticuerpos deben ser introducidosdentro de las clulas).


Inmunofluorescencia indirecta:


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Volviendo a las protenas recombinantes...

Muchas veces se necesita eliminar el Tag de la protena de inters


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Corte de los Tags secuencia de clivaje por proteasas includa

Obtencin de la estructura primaria nativa de la protena por cortecon una proteasa. Secuencia de clivaje entre el Tag y la protena de inters.

TAG PDI


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Esquema de obtencin de protenas nativas clivadas del Tag

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