Los genes son DNA

ESQUEMA DEL CAPITULO r-----------------------_/­..-

...

Introduccion

El acido desoxirribonucleico (DNA,deoxyribonucleic acid) es el material genetico delas bacterias• La transformacion bacteriana proporciono la primera prueba

de que el DNA es el material genetico de las bacterias. Laspropiedades genHicas pueden ser transferidas de una cepabacteriana a otra extrayendo el DNA de la primera cepa yafiadiendolo a La segunda.

El DNA es el material genetico de los virus• La infeccion por fagos demostro que el DNA es el

material genetico de los virus. Cuando el DNA y loscomponentes proteinicos de los bacteri6fagos sonmarcados con is6topos radioactivos diferentes, solo el DNAes transmitido a la progenie de fagos producida por lasbacterias infecciosas.

El DNA es el material genetico de las cHulasanimales• El DNA puede ser utilizado para introducir nuevas

caracteristicas geneticas en celulas ani males 0 en animalescompletos.

• En algunos virus, el material genetico es el RNA.

Los polinucleotidos tienen bases nitrogenadasligadas a un esqueleto de azucar-fosfato• Un nucleosido esta formado por una base purica 0

pirimidica ligada a una pentosa (azucar de cinco carbonos)en la posici6n 1.

• Las posiciones en eL anillo de ribosa se describen con elsimbolo matematico de primo ('), para distinguirlas.

• La diferencia entre el DNA y el RNA radica en el grupolocalizado en la posici6n 2' del azucar. El DNA tiene un azucardesoxirriboso (2'-H); el RNA tiene un azucar riboso (2'-OH).

• Un nucle6tido consiste en un nucleosido ligado a un grupofosfato en la posicion 5' 0 3' de la (desoxi)ribosa.

• Los residuos sucesivos de (desoxi)ribosa de una cadena depolinucleotidos estan unidos por un grupo fosfato entre Laposicion 3' de un azucar y la 5' del siguiente.

• Un extremo de La cadena (convencionalmente el izquierdo)tiene una punta 5' libre y, en el otro, la punta libre es 3'.

• El DNA contiene las cuatro bases, adenina, guanina,citosina y timina; el RNA posee uracilo en vez de timina.

El DNA es una helice dupLex• La forma Bdel DNA es una helice dupLex formada por dos

cadenas polinucleotidicas que corren de forma antiparalela.

• Las bases nitrogenadas de cada cadena son anillos planosde purina 0 de pirimidina orientados hacia el interior quese aparean uno a otro a traves de puentes de hidrogenopara formar unicamente pares de A-To G-c.

• El diametro de la helice duplex es de 20 A, ademas de unavuelta completa cada 34 A, con diez pares de bases por vuelta.

• La helice dupLex forma un surco profundo (ancho) y unsurco superficial (angosto).

_ La duplicacion del DNA es semiconservadora• En el experimento de Meselson-Stahl se utiliz6 marcaje de

densidad para demostrar que la cadena polinucleotidicaindividual es la unidad del DNA que se conserva durante laduplicaci6n.

• Cada cadena de un DNA duplex actua como molde parasintetizar a una cadena hija.

• Las secuencias de las cadenas hijas estan determinadas porapareamiento complementario de bases con las cadenasprogenitoras separadas.

lID Las cadenas de DNA se separan en la horquilla deduplicaci6n

• La duplicacion de DNA es emprendida por un complejode enzimas que separan a las cadenas progenitoras y quesintetizan a las cadenas hijas.

• La horquilla de duplicacion es el punto en el cuallascadenas progenitoras se separan.

• La enzimas que sintetizan DNA se denominan DNApolimerasas; las enzimas que sintetizan RNA son conocidascomo RNA polimerasas.

• Las nucleasas son enzimas que degradan a los acidosnucleicos; entre otras, DNAsas y RNAsas, que puedendividirse en endonucleasas y en exonucleasas.

.. La informacion genetica puede ser proporcionadapor el DNA 0 eL RNA• Los genes celulares son DNA, pero los virus y los viroides

pueden tener genomas de RNA.• El DNA se convierte en RNA por transcripcion, y el RNA

puede convertirse en DNA por transcripci6n inversa.• La traducci6n del RNA a proteinas es unidireccional.

aD Los acidos nucleicos se hibridan por apareamientode bases• El calentamiento provoca que las dos cadenas de un DNA

dLlplex se separen.• La Tro es el punto medio del rango de tem peratura para la

desnaturalizaci 6n.• Las cadenas complementarias Lmicas pueden renaturalizarse

cuando se reduce la temperatura.

Continua en la siguiente pagina

1

• La desnaturalizaci6n y La renaturaLizacion/hibridacionpueden ocurrir con combinaciones de DNA-DNA, deDNA-RNA 0 de RNA-RNA y pueden ser intermoLeculareso intramoleculares.

• La capacidad de dos preparaciones de acidos nucleicosde una soLa cadena para hibridarse es indicio de sucomplementariedad.

1m Las mutaciones cambian la secuencia del DNA• Todas las mutaciones consisten en cam bios de la

secuencia del DNA.• Las mutaciones pueden ser espontaneas 0 inducidas

por mutagenos.

... Las rnutaciones pueden afectar a pares debases individuales 0 a secuencias mas largas• Una mutaci6n puntual cambia a un solo par de bases.• Las mutaciones puntuales pueden ser provocadas

par la conversion qui mica de una base en otra a parerrores durante la duplicacion.

• Una transici6n rem plaza a un par de bases G-C par unpar de bases A-To viceversa.

• Una transversion rem pLaza a una purina par unapirimidina, par ejemplo, cambiando A-T aT-A.

• Las inserciones son el tipo mas comun de mutacion,y son resultado del movimiento de elementostransponibles.

IIID Los efectos de las mutaciones puedenser revertidos• Las mutaciones primarias desactivan a un gen,

mientras que las inversas (0 retromutaciones) reviertensus efectos.

III Introducci6nLa naturalez3. hereditaria de todo organismo vivientees definida por su genoma, el cual consiste en unasecuencia larga de acido nucleico que proporcionala informaci6n necesaria para construir el organismo.Se utiliza el termino "informacion" debido a que elgenoma por si mismo no desempefia ninguna fun­cion activa en la construccion del organismo, masbien es la secuencia de las subunidades individuales(bases) del acido nucleico la que determina las ca­racteristicas hereditarias. Por una compleja serie deinteracciones, esta secuencia se utiliza para producirtodas las proteinas del organismo en el momenta yellugar apropiados. Las protefnas forman parte dela estructura del organismo 0 tienen la capacidadde construir estructuras 0 llevar a ca bo las reaccio­nes metabolicas necesarias para la vida.

El genoma contiene el conjunto completo deinformacion hereditaria para cualquier organismo.Fisicamente, el genoma puede ser dividido en va­rias moleculas diferentes de acido nucleico y fun­cionalmente, en genes. Cada gen es una secuenciaque dentro del acido nucleico representa a una solaprotefna. Cada una de las moleculas de acido nu­cleico que componen el genoma puede contener

2 CAPITULO 1 Los genes son DNA

• Las inserciones pueden revertirse par deleci6n delmaterial insertado, pero las deleciones no puedenrevertirse.

• La supresion ocurre cuando una mutacion de unsegundo gen anula el efecto de la mutaci6n del primergen.

IIDI Las mutaciones se concentran en puntoscalientes• La frecuencia de la mutaci6n en cualquier par de bases

en particular depende de fluctuaciones estadisticas,excepto en los puntos calientes, en Los cuales lafrecuencia se incrementa cuando menos en un ordende magnitud.

_ Numerosos puntos calientes son resultadode bases modificadas• Una causa comun de los puntas calientes es La base

rnodificada 5-metilcitosina, la cual experimentadesarninacion espontanea y se convierte en tirnina.

1m Algunos agentes hereditariosson extremadamente pequenos• Algunos agentes hereditarios rnuy pequeiios no

codifican proteinas, sino que constan de RNA aproteinas que poseen propiedades hereditarias.

1m Resumen

gran numero de genes. Los genomas de los orga­nismos vivos pueden contener incluso <500 genes(como un micoplasma, que es un tipo de bacteria)0>25 000 en el ser humano.

En este capitulo se analizan las propiedades delgen en cuanto a su construccion molecular basica.En la iUkJ' se resumen las etapas de transiciondel concepto historico del gen a la definicion mo­derna del genoma.

Un genoma consiste en el conjunto completode cromosomas de cualquier organismo espedfico, demodo que comprende una serie de moleculas de aci­do desoxirribonucleico (DNA, deoxyribonucleic acid)(una para cada cromosoma), cada una de las cualescontiene numerosos genes. La principal definicionde un genoma es deterrninar la secuencia del DNA decada cromosoma.

La primera definicion del gen como unidad fun­cional se derivo del descubrimiento de que cada genes responsable de la produccion de proteinas espe­dficas. La diferencia en las caracteristicas qufmicasdel DNA del gen y su producto protefnico condujoal concepto de que un gen codifica a una protefna.A su vez, esto llevo al descubrimiento del aparatocomplejo que permite que la secuencia de DNA deun gen genere la secuencia de aminoacidos de unaprotefna.

•.. • ~ .••• ~ ~.[iJ.~.J!.ifiL=~1865 Los genes son lactores particulados

1871 Descubrimiento de los acidos nucleicos

1903 Los cromosomas son las unidades hereditarias

1910 Los genes residen en los cromosomas

1913 Los cromosomas son secuencias linealesde genes

1927 Las mutaciones son cam bios ffsicos enlos genes

1931 La recombinaci6n ocurre por entrecruzamiento

1944 EI DNA es el material genetico

1945 Un gen codilica a una protefna

1951 La primera secuencia protefnica

1953 EI DNA es una helice duplex

1958 EI DNA se replica de forma semiconservadora

1961 EI c6digo genetico esta determinado por tripletes

1977 Los genes de las eucariotas son interrumpidos

1977 Posible secuenciaci6n del DNA

1995 Secuenciaci6n de los genomas bacterianos

2001 Secuenciaci6n del genoma humano

Breve historia de la genHica.

un gen es una secuencia de DNA que codifica a un RNA;en los genes codificadores de proteinas, el RNA a su vezcodifica a una proteina.

A partir de la demostracion de que un gen con­siste en DNA y de que un cromosoma consiste enun tramo largo de DNA que representa a numerososgenes, se llega a la arganizacion global del genomaen funcion de su secuencia de DNA. En el Capitulo 3,El gen interrumpido, se retoma en mas detallela organizacion del gen y su representacion en pro­teinas. En el Capitulo 4, El contenido del genoma, seanaliza el numero total de genes, y en el Capitulo 6,Agrupamientos y repeticiones, se describen otroscomponentes del genoma y el mantenimiento desu organizacion.

.. El DNA es el material geneticode las bacterias

Concepto principal

• La transformaci6n bacteriana proporcion6 la primera

prueba de que el DNA es el material genetico de

las bacterias. Las propiedades genHicas pueden ser

transferidas de una cepa bacteriana a otra extrayendo

el DNA de la primera cepa y sumandolo a la segunda.

La idea de que el material genetico es acido nucleicotiene sus rakes en el descubrimiento de la transfor­macion, en 1928. La bacteria Pneumococcus mata deneumonia a los ratones. La virulencia de la bacteriadepende de su polisacarido capsular, componente dela superficie que permite que la bacteria escape de ladestruccion provocada par su hospedador. Diversostipos de Pneumococcus (1, II Yill) tienen polisacaridoscapsulares diferentes; su aspecto es lisa (5, smooth).

Todos los tipos de Pneumococcus lisos puede darlugar a variantes incapaces de producir el polisaca­rido capsular, en cuyo caso, la superficie de la bac­teria es rugosa (R, rough) ([armada por el materialque estaba debajo del polisacarido capsular). Estasbacterias son avirulentas, no matan a los ratonesporque la ausencia del polisacarido permite que elanimal destruya a la bacteria.

Cuando par medio de tratamiento calorico sematan bacterias lisas, pierden la capacidad de danaral animal, sin embargo, la combinacion de bacte­rias 5 desactivadas con calor y la variante ineficaz Rproduce un efecto considerablemente diferente delde cada bacteria por separado. En la • semuestra que cuando se inyectan conjuntamente enun animal, el raton muere como resultado de unainfeccion por Pneumococcus. Las bacterias 5 virulen­tas pueden ser recuperadas del raton muerto.

Secuencia de aminoacidosProteina e51.~~

RNA Secuencia de nucle6tidos

'IGUR 1" Un gen codifica una molecula de RNA, la cualcodifica una proteina.

Entendiendo el proceso par media del cual ungen se expresa, permite una definicion mas rigu­rosa de su naturaleza. En la FT U A 1. se ilustra eltema basico de esta obra. Un gen es una secuenciade DNA que produce otro acido nucleico, el acidoribonucleico (RNA, ribonucleic acid), que cuenta condos cadenas de acido nucleico, mientras que el RNAtiene una sola. La secuencia del RNA es determina­da par la secuencia del DNA. (De hecho, es identicaa una de las cadenas de DNA.) En muchos casos,pero no en todos, el RNA se utiliza a su vez paradirigir la produccion de una proteina. Por 10 tanto,

DNA'W~ Secuencia de nucle6tidos

l

Gen Naturaleza quimica

1.2 El DNA es el material genetico de las bacterias 3

Tipos de PneumococcusInyeccionde celulas Resultado

formante, se demostr6 que este es acido desoxirri­bonucleico (DNA, deoxyribonucleic acid).

Ni las bacterias tipo S asesinadas con calor ni lasbacterias tipo Rvivas pueden matar a los ratones, pero la inyec­cion simultanea de ambos tipos de bacterias puede matar a losratones de forma tan efectiva como la bacteria tipo S viva.

/Sin capsula,~ Bacteria S muertade aspecto~ y bacteria R viva

rugosa (R)

Muere~ • La infeccion por fagos demostro que el DNA es elmaterial genetico de los virus. Cuando el DNA y loscomponentes proteinicos de los bacteri6fagos sonmarcados con diferentes is6topos radioactivos, s6lo elDNA es transmitido a la progenie de fagos producidapor las bacterias infecciosas.

Concepto principal

.. El DNA es el material geneticode los virusa

aVive

Vive

Muere~Bacteria S viva

Bacteria S muerta

Bacteria R viva

Can capsula,de aspectolisa (S)

\

Bacterias S vivasrecuperadas del

\

raton muertoSe extraeel DNA

Wl\VJW/.......... )

Bacteria R Transformacion Bacteria S

El DNA de la bacteria de tipo S puede transformara la bacteria de tipo Ren el mismo tipo S.

En este experimento, las bacterias 5 muertasfueron de tipo III y las R vivas, de tipo II. La cu­bierta de las bacterias virulentas recuperadas de lainfeccion mixta era lisa, de tipo III, por 10 tanto,alguna propiedad de las bacterias 5 tipo III, muertas,puede transformar a las bacterias R, induciendo laformacion del polisacarido capsular tipo III, que lastorna virulentas.

En la se muestra la identificacion delcomponente de las bacterias muertas responsable dela transformacion, el cual se denomin6 principiotransformante, que se purific6 desarrollando unsistema libre de celulas, en donde los extractos delas bacterias 5 muertas podfan agregarse a las bac­terias R vivas antes de ser inyectadas al animal. En1994, mediante la purificacion del principio trans-

Una vez que se comprob6 que el DNA es e) mate­rial genetico de las bacterias, el siguiente paso fuedemostrar que el DNA proporciona el material ge­netico en un sistema bastante diferente. El fago T2es un virus que infecta a la bacteria Escherichia coli.Cuando las partfculas del fago (virus) se agregana las bacterias, estas se adsorben en la superficieexterior, parte del material entra en la bacteria y, alcabo de -20 min, cada bacteria explota (se lisa) paraliberar una numerosa progenie de fagos.

En la se ilustran los resultados de unexperimento realizado en 1952 en el cual se infec­taron bacterias con fagos T2, los cuales habfan sidomarcados radioactivamente en su componente deDNA (con 32P) 0 en su componente protefnico (con355). Las bacterias infectadas se mezclaron en unalicuadora y dos fracciones se separaron por centrifu­gaci6n. Una de estas contenfa las cubiertas de fagosvadas liberadas de la superficial de la bacteria, entanto que la otra estaba formada por las bacteriasinfectadas. *

Gran parte del marcador 32p se encontro en lasbacterias infectadas. Las partfculas de la progenie defagos producidas por la infeccion contenfan - 30%del marcador 32p original. La progenie recibio unacantidad muy pequena, menos dell %, de la protef­na contenida en la poblaci6n original de fagos. Lascubiertas de fago estaban formadas por protefnas, ypor 10 tanto portaban el marcador radioactivo 355.Asf pues, con este experimento se demostr6 direc­tamente que s610 el DNA de los fagos progenitoresentra en las bacterias y que despues formara partede los fagos de la progenie, exactamente el patron deherencia que se espera del material genetico.

* N del T: este parrafo implica que los virus fueron marcados enun componente a en Olro (pero no en los dos). mientras que ladescripci6n de los resultados sugiere que tanto un componentecomo el Olro fueron marcados.

4 CAPiTULO 1 Los genes son DNA

. I •

DNA marcadocon 32p _

proteina'~• marcada con 35S

/~ Adici6n de DNA TK+

Las celulas que carecen del gen TK no puedenproducir timidina cinasa y mueren sin timidina

Coloniade celulas TK+

Algunas celulas incorporan al gen TK; los descendientesde una celula sometida a transfecci6n se agrupan en una colonia

Las bacteriasinlectadascontienen70% delmarcador 32p

Los fagos de laprogenietienen 30% delmarcador 32py <1% del

\. marcador 35S

ISe separan las cubiertas de loslagos de la bacteria infectada

J\J'l-A ~1 (~S

Las cubiertas delos lagos contienen I80% del marcador Se afslan las partlculas35S de la progenie de lagos

~

Se inlecta a la bacteria conlagos marcados.

t Lt

lGURA 1 5 El material genetico del fago T2 es el DNA. 1 f Las celulas eucariotas pueden adquirir un fenotiponuevo como resultada de la transfecci6n par adici6n de DNA.

Un fago se reproduce ordenando ala maquina­ria de una celula hospedadora infectada que pro­duzca mas copias de sf misma. El fago posee ma­terial genetico cuyo comportamiento es analogo alde los genomas celulares: sus rasgos son fielmentereproducidos y estan sujetos a las mismas reglas quegobiernan la herencia. El caso de los T2 refuerza laconclusion general de que el material genetico esel DNA, ya sea que forme parte del genoma de unacelula 0 de un virus.

III El DNA es el material geneticode las celulas animales

Conceptos principales

• El DNA puede ser utilizado para introducir nuevascaracteristicas genHicas en celulas ani males 0 enani males completos.

• En algunos virus, el material genetico es RNA.

Cuando se agrega DNA a poblaciones de celulas eu­cariotas individuales en cultivo, el acido nucleicoentra a las celulas, 10 cua!, en algunas, resulta en laproduccion de protefnas nuevas. Cuando se utilizaDNA purificado, su incorporacion da lugar a la pro­duccion de una protefna en particular. En la

se representa uno de los sistemas estandar.

Aunque por razones historicas estos experi­memos se describen como transfeccion cuandoson realizados con celulas eucariotas, constituyenuna contraparte directa de la transformacion baete­riana. El DNA introducido en la celula receptora seincorpora a su material genetico y es heredado en lamisma forma que cualquier otra parte. Su expresionconfiere un nuevo rasgo a las celulas (sfntesis detimidina-cinasa en el ejemplo de la Figura 1.6). Enun principio, estos experimentos solo tuvieron exitocon celulas individuales adaptadas para crecer en unmedia de cultivo, pero desde entonces, el DNA hasido introducido en ovulos de raton por microin­yeccion, y puede llegar a ser una parte estable delmaterial genetico del animal.

Dichos experimemos muestran directamenteno solo que el DNA es el material genetico de laseucariotas, sino tambien, que puede ser transferidoentre especies dlferentes y seguir siendo funcional.

El material genetico de todos los organismosconocidos y de numerosos virus es el DNA. Noobstante, algunos virus usan un tipo alternativo deacido nucleico, el ribonucleico (RNA, ribonucleic acid),como material genetico. El principia general de lanaturaleza del material genetico, par 10 tanto, esque siempre es acido nucleico; de hecho, es DNA,excepto en los virus de RNA.

1.4 El DNA es el material genHico de las celulas ani males 5

III Los polinucle6tidos tienenbases nitrogenadas ligadas aun esqueleto de azucar-fosfato

Conceptos principales

• Un nucle6sido esta formado por una base purica 0

pirimidica ligada a un azucar pentosa en la posici6n 1.

• las posiciones en el anillo de ribosa se describen conel simbolo (') para distinguirlas.

• la diferencia entre el DNA y el RNA radica en el grupolocalizado en la posici6n 2' del azucar. El DNA tiene unazucar desoxirribosa (2'-H) Y el RNA, un azucar ribosa(2'-OH).

• Un nucle6tido consta de un nucle6sido ligadoa un grupo fosfato en la posici6n 5' 0 3' de la(desoxi)ribosa.

• los residuos sucesivos de (desoxi)ribosa de unpolinucle6tido estan unidos por un grupo fosfatoentre la posici6n 3' de un azucar y la posici6n 5' de lasiguiente.

• Un extremo de la cadena (convencionalmente elIzquierdo) tiene una punta 5' libre y en el otro, unapunta 3' libre.

• El DNA contiene las cuatro bases, adenina, guanina,citosina y timina; el RNA posee uracHo en vez detimina.

El componente basico de los acidos nucleicos es elnucle6tido, que tiene tres componentes:

• una base nitrogenada,• un azucar y• un fosfa to.

La base nitrogenada es un anillo de purina 0 depirimidina. La base esta ligada a la posici6n 1 en unapentosa por medio de un enlace glucosfdico del N

J

de las pirimidinas 0 el Ng de la purinas. Para evitarambiguedades entre los sistemas de numeraci6n delos anillos heterocfclicos y del azucar, a las posicio­nes de la pentosa se agrega un sfmbolo (').

Los acidos nucleicos son nombrados segun eltipo de azucar que eontienen; el DNA posee 2' -des­oxirribosa, mientras que el RNA tiene ribosa.La di­ferencia radica en que el azucar del RNA tiene ungrupo OR en la posiei6n 2' del anillo de pentosa. Elazuear puede ligarse en las posiciones 5' 0 3' a ungrupo fosfato.

Un aeido nucleico consiste en una cadena largade nucle6tidos. En la 'IGlJF: ~ se muestra que elesqueleto de la cadena polinucleotfdiea consta deseries alternas de residuos de fosfato y de pentosa(azuear) a traves de la uni6n de la posici6n 5' deun anillo de pentosa con la posici6n 3' del siguienteanillo de pentosa mediante un grupo fosfato. Por

6 CAPITULO 1 Los genes son DNA

eso se dice que el esqueleto de azucar-fosfato con­siste en enlaces 5'- 3' fosfodiester. Las bases nitro­genadas "sobresalen" del esqueleto.

Cada acido nucleico contiene cuatro tipos de ba­ses. Las mismas dos purinas, adenina y guanina, estanpresentes tanto en el DNA como en el RNA. Las dospiriruidinas del DNA son dtosina y timina; en el RNAse encuentra uracilo, en vez de timina. La unica dife­rencia entre el uracHo y la timina es un grupo metilosuplantador en la posicion C

5. Las bases suelen nom­

brarse par sus iniciales. El DNA contiene A, G, C YT;el RNA contiene A, G, C YU.

El nucleotido terminal de un extrema de la ca­dena tiene un grupo 5' libre; el nucleotido terminaldel otro extrema tiene un grupo 3' libre. Se ha con­venido en escribir las secuencias de acido nucleicoen direccion 5' a 3', es decir, del extremo 5' de laizquierda al extrema 3' de la derecha.

III El DNA es una helice duplex

Conceptos principales

• la forma Bdel DNA es una helice duplex formada pordos cadenas polinucleotidicas antiparalelas.

• las bases nitrogenadas de cada una son anillos planosde purina 0 pirimidina orientados hacia el interior yque se aparean mediante puentes de hidr6geno paraformar unicamente pares de A-TYG-c.

• El diametro de la helice duplex es de 20 A, y cada 34 Ahay una vuelta completa, con diez pares de bases porvuelta.

• La helice duplex forma un surco principal profundo(ancho) y uno menor (angosto).

La observacion de que las cantidades de bases pre­sentes en los DNA varfa segun la especie, condujoal concepto de que la secuencia de bases es la forma enque se porta la informacion genetica. Hacia la decada de1950, el concepto de informacion genetica era co­mun: el par de problemas que planteaba era determi­nar la estructura del acido nucleico y explicar comouna secuencia de bases del DNA podia representar lasecuencia de aminoacidos de una proteina.

Tres nociones convergieron en la construccionde un modelo de helice duplex del DNA, desarro­llado por Watson y Crick en 1953:

• Los datos de la difraccion de los rayos X de­mostraron que el DNA tiene la forma de unahelice regular que da un giro completo cada34 A (3.4 nm), can un diametro de -20 A(2 nm). Como la distancia entre nucleotidosadyacentes es de 3.4 A, debe haber 10 nu­cleotidos par vuelta.

Los !ostatostienen cargasnegativas

Base pirimfdica

Base puriea

DNA,

5~

Enlacesfosfodiester 5'-3'

Puentes de hidr6geno 3'. H I

/ 05' H3C 0-- H-N NyH'rl

~H~N-H--N~/~~o-1

N-{ )=N 0

o H

HJ-H"O N H d"o H-fC\N--H-~l- o'

N-{, rNo-·H-N

\H

H 0N=<, }-N

ESq~:leto ~0r-;:~N---H -~H .

_a_ZD_ca_r'_fO_Sf_at_or . H'" N ~N-H- -'0:-qC3 .

N-H--'O

0-:N=< }-N

o N-\.G!,-H--'~~C)-H 0

.h-~ K 5'o H N O--·H-N H\ "H3' EI interior es hidr6fobo

La helice duplex mantiene un grosor constante porque laspurinas siempre enfrentan a la pirimidinas en los pares de bases com­plementarios A-T YG-c. La secuencia que se ilustra en la figura es T-A,CoG, A-T, G-C.

Una cadena polinucleotidica esta formada por unaserie de enlaces azucar-fosfato 5'-3' que forman un esqueletocon las bases prominentes.

• La densidad del DNA sugiere que la helicedebe contener dos cadenas de polinuc1eo­tidos. EI diametro constante de la helicepuede explicarse si las bases de cada cadenaapuntan hacia adentro y son restringidas demanera que una purina siempre se opongaa una pirimidina, evitando asociaciones pu­rina-purina (demasiado ancha) 0 pirimidi­na-pirimidina (demasiado angosta).

• Independientemente de las cantidades ab­solutas de cada base, la proporcion de G essiempre igual a la de C en el DNA, y la pro­porcion de A siempre es la misma que la deT, de manera que la composicion de cual­quier DNA puede describirse par la propor­cion de sus bases, es decir, G + C, que fluctuaentre 26 y 74% en diferentes especies.

Watson y Crick propusieron que las dos cadenaspolinucleotfdicas de la helice duplex se relacionanmediante puentes de hidr6geno entre las bases nitroge­nadas. La G puede formar puentes de hidrogenoespecfficamente solo con la C, y la A, solo can la T.Estas reacciones se describen como apareantientode bases, y se dice que las bases apareadas (G conC a A can T) 'son complementarias.

EI modelo proponfa que las dos cadenas polinu­cleotfdicas corren en direcciones opuestas (antipa­ralelas), como se ilustra en la ~l . Observan­do a 10 largo de la helice, una cadena va en direccion5' a 3', mientras que su pareja carre de 3' a 5'.

EI esqueleto de aZllcar-fosfato esta en la parteexterior y porta cargas negativas en los grupos fos­fato. En solucion in vitro, las cargas del DNA se neu­tralizan por la union de iones metalicos, tfpicamenteNa+. En la celula, las protefnas con carga positivaproporcionan parte de la fuerza neutralizante. Estasprotefnas desempefian una funcion importante enla determinacion de la organizacion del DNA en lacetula.

Las bases se encuentran en el interior; son es­tructuras planas, en pares perpendiculares al eje dela helice. Considerese la helice dllplex como unaescalera espiral: los pares de bases forman los es­calones, como se ilustra esquematicamente en laJ:IGUR 1 J. Al ir avanzando por la helice, las basesestan una sobre otra, como una pila de platos.

Cada par de bases gira - 36° en tomo al eje de lahelice, respecto del siguiente par de bases, de modoque -10 pares de bases forman una vuelta completade 360°. La torsion de las cadenas sabre sf mismasforma una helice duplex can un surco menor (-12A de ancho) y un surco mayor (-22 A de ancho),como puede observarse en el modelo a escala dela FICURA 1.10. La helice duplex es dextrogira, esdecir, que gira en la direccion de las manecillas del

1.6 El DNA es una helice duplex 7

Azucar Base Fosfato

reloj observada a 10 largo del eje helicoidal. Estascaracterfsticas representan el modelo aceptado para10 que se conoce como forma B del DNA.

Es importante percatarse de que la forma B re­presenta un promedio, no una estructura especifica­da con toda precision, pues la estructura del DNApuede cambiar localmente. Si tiene mas pares debases por vuelta se dice que esta sobregirada, de 10contrario, sera laxa. La torcion local puede ser afec­tada pOI la conformacion global de la helice duplexdel DNA en el espacio 0 por la union de proteinasen sitios especificos.

III La duplicaci6n del DNAes semiconservadora

, Los pares de bases planos yacen perpendicular-mente al esqueleto de azucar-fosfato.

Las dos cadenas del DNA forman una helice du­plex. Fotografia © Photodisc.

8 CAPITULO 1 Los genes son DNA

Conceptos principales

• En el experimento de Meselson-Stahl se utiliz6marcaje de densidad para demostrar que la cadenapolinucleotidica individual es la unidad del DNA que seconserva durante la duplicaci6n.

• Cada cadena de un DNA duplex (0 DNA duplohelicoidal,DNA de doble cadena a DNA de doble banda) hace lasveces de molde para sintetizar una cadena hija.

• Las secuencias de las cadenas hijas dependen delapareamiento complementario de las bases con lascadenas progenitoras separadas.

Es crucial que el material genetico se reproduzcacon exactitud. Las dos cadenas polinucleotidicas es­tan unidas solo por puentes de hidrogeno, de mo.doque pueden separarse sin necesidad de romper en­laces covalentes. La especificidad del apareamien­to de bases sugiere que cada una de las cadenasprogenitoras separadas puede hacer las veces decadena molde para la sfntesis de una cadena hijacomplementaria. En la A se representa elprincipio de que una nueva cadena hija es ensam­blada en cada cadena progenitora. La secuencia dela cadena hija es dictada por la cadena progenitora;una A en la cadena progenitora ocasiona la coloca­cion de una Ten la cadena hija, en tanto que una Gprogenitora provoca la incorporacion de una Chija,y asf sucesivamente.

En la parte superior de la Figura 1.11 se mues­tra un duplex progenitor (no replicado) formadopor las dos cadenas progenitoras originales. La parteinferior muestra las dos duplex hijas que estan sien­do producidas por el apareamiento complementariode bases. Cada una de las duplex hijas es identicaen secuencia original y contiene una cadena proge­nitora y una cadena recientemente sintetizada. La

- • to

La duplicaci6n del DNA es semiconservadora.IRA 1.

.1' I I .. I . .... . ...DNA progenitor Generaci6n 1 Generaci6n 2

Duplicaci6n W~

en media W~----<: HIBRIDOde densidad .Ii''''=<HIBRIDO \.'O'iDiU\/j\f,V/ L1GERO

PESADO ~~~~

'W't'O\Y/----<: L1GEROHIBRIDO ~

Analisis de densidad HIBRIDO.

- - - - .Ligero ••••. Ligero --_. Ligero- - - -. Hfbrido ._. Hfbrido • -_. H[brido--··Pesado - - - -. Pesado - - - -. Pesado

~ ....~

~::~~~;;;;~~~.... (C). I~~""'.~

~ Lascadenas~~~ - progenltoras _...- ('f)T,-{~~ se desenrollan ~

V:::::~ ~:::::~

v----©.C .~. -If.. ~ .'i' _.:..::~y y --.Q::~.. .

~;;;n~ .nn ...

~:::::<C<d

...

1 1 El apareamiento de bases proporciona el meca­-~smo necesario para la duplicaci6n del DNA.

.~:TUctura del DNA porta fa informacion necesaria para~?TpetuaT su secuencia.

Las consecuencias de este modo de duplicacion5-e ilustran en la . El duplex progenitor~ replica para formar dos duplex hijos, cada uno de. ') cuales esta formado por una cadena progenitora.. una cadena hija (de sfntesis reciente). La unidad..;:.e se conserva de una generacion a fa siguiente es una de~- dos cadenas individuafes que forman ef duplex proge­':':"7. Este comportamiento se conoce como dupli-

;::adon semiconservadora.En la Figura 1.12 se Hustra una prediccion de

=-:e modelo. Si el DNA progenitor porta un mar­'~~e de densidad "pesada" porque el organismo ha_io cultivado en un medio que contiene un isotopo~':::ecuado (como 15N) (N del T: en otras bibliogra­.:::.=.- aparece como N15, el resto de los marcadores=z:lCionados en este capitulo tambien aparecen con= lllimero despues de la letra p. ej., p32 y S35), sus2denas pueden ser distinguidas de las sintetizadascando el organismo es transferido a un medio que- :::;~enga isotopos "ligeros" normales.

£1 DNA progenitor consiste en un duplex de dos2':::enas pesadas (rojas). Despues de una generacion_z crecimiento en medio ligero, el DNA duplex es'JUijrido" en cuanto densidad. 0 sea que esta forma­_ ' par una cadena progenitora pesada (roja) y por~ cadena hija ligera (azul). Despues de la segunda==-;::.eracion, las dos cadenas de cada duplex hfbrido

;: ~an separado. Cada una adquiere a una pareja=~:-d. de tal forma que la mitad de los DNA d{lplex

Cadena hija / \ Cadena hija siguen siendo hfbridos y la otra mitad es completa­mente ligera (ambas cadenas son azules).

Las cadenas individuales de estos duplex son comple­tamente pesadas a compfetamente ligeras. Este patron seconfirmo experimentalmente en la prueba de Me­selson-Stahl en 1958, que siguio a la duplicacionsemiconservadora del DNA a traves de tres genera­ciones de crecimiento de E. coli. Cuando el DNA fueextrafdo de las bacterias y su densidad se midio porcentrifugacion, el DNA forma bandas correspon'dientes a su densidad, pesada en las progenitoras,hfbrida en la primera generacion, y mitad hlbrida ymitad ligera en la segunda generacion.

III Las cadenas del DNA se separanen la horquilla de duplicaci6n

Conceptos principaLes

• La duplicaci6n del DI~A es llevada a cabo par uncomplejo de enzimas que separan las cadenasprogenitoras y sintetizan las cadenas hijas.

• La horquilla de duplicaci6n es el punta en que seseparan las cadenas progenitoras.

• Las enzimas que sintetizan el DNA se llaman DNA

pol.i merasas; las enzi mas que si ntetizan el RNA se

conacen como RNA polimerasas.

• Las nucleasas son enzimas que degradan a los acidosnucleicos; incluyen DNAsas y RNAsas, y pueden

dividirse en endonucleasas y en exonucleasas.

La duplicacion exige la separacion de las dos cade­nas de un d{lplex progenitor; sin embargo, el rom­pimiento de la estructura es transitorio, y se revierteconforme se forma el duplex hijo. En algun mo-

1.8 Las cadenas del DNA se separan en la horquilla de duplicaci6n 9

do sintetizada. Las enzimas se nombran segun eltipo de cadena que sintetizan: las DNA polimera­sas sintetizan DNA, las RNA polimerasas, RNA.

La degradacion de los acidos nucleicos tambien re­quiere de enzimas especfficas: las desoxirribo­nucleasas (DNAsas) degradan alDNA y las ribonu­cleasas (RNAsas) degradan al RNA. Las nucleasasse incluyen en las clases generales de exonuclea­sas y endonucleasas:

• Las endonucleasas cortan enlaces individua­les en el interior de las moleculas de DNA yde RNA y generan fragmentos discretos. Al­gunas DNAsas dividen ambas cadenas de unDNA duplex en el sitio diana, mientras queotras dividen solo una de ellas. Las endo­nucleasas participan en reacciones de corte,como se observa en la FIGURA 1 14.

• Las exonucleasas eliminan los residuos, unoa uno, a partir del extrema de la molecula, ygeneran mononucleotidos. Siempre actuanen una sola cadena de acido nucleico, y cadaexonucleasa avanza en una direccion especf­fica, es decir, empieza en un extrema 5' 0 3'para dirigirse hacia el otro. Estan involucra­das en reacciones de ajuste, como se muestraen la v

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Enlace roto

~I. Una endonucleasa divide a un enlace en un acido

nucleico. En este ejemplo se muestra una enzima que ataca auna cadena de un DNA duplex.

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La horquilla de duplicaci6n es la regi6n del DNAen la cual hay una transici6n del duplex progenitor desenrolla­do a los duplex hijos recientemente replicados.

..-...

Una exonucleasa elimina bases, una a la vez,dividiendo el ultimo enlace de una cadena polinucleotidica.

III La informacion genetica puedeser proporcionada por el DNAo el RNA

Conceptos principales

mento, solo un tramo pequeno del DNA duplex sesepara en cadenas individuales.

La estructura helicoidal de una mol<.~cula deDNA dedicada a la duplicacion se ilustra en la

.\ . La region no replicada es el duplex proge-nitor que se abre hacia la region replicada, dondese han formado los dos duplex hijos. La estructurahelicoidal doble se rompe en la union entre las dosregiones, llamada horquilla de duplicacion. Laduplicacion implica el movimiento de la horqui­lla de duplicacion a 10 largo del DNA progenitor, demodo que hay un desenrollamiento continuo de lascadenas progenitoras y un enrollamiento de los du­plex hijos.

La sfntesis de acidos nucleicos es catalizada porenzimas especfficas, las cuales reconocen el moldey emprenden la tarea de catalizar la adicion de sub­unidades a la cadena polinucleotidica que esta sien-

• Los genes celulares son DNA, pero los virus y losviroides pueden tener genomas de RNA.

• El DNA se convierte en RNA por transcripci6n, y el RNApuede convertirse en DNA por transcripci6n inversa.

• La traducci6n del RNA a proteina es unidireccional.

El dogma central define el paradigma de la biologfamolecular. Los genes se perpetllan como seCl1enciasde acido nucleico, si bien actuan al ser expresadosen forma de proteinas. La duplicacion es respon­sable de la herencia de la informacion genetica. Latranscripcion y la traduccion son responsables de laconversion de una forma a otra.

En la 1\, 1 16 se ilustran las funciones de laduplicacion, la transcripcion y la traduccion desdela perspectiva del dogma central:

• La perpetuaci6n del dcido nucleico suele implicaral DNA 0 el RNA como el material genhico. Lascelulas utilizan unicamente DNA, en tantoque algunos virus usan RNA, y la duplica-

10 CAPITULO 1 Los genes son DNA/

Proteina

Molde de doblecadena --< J.(j~ Cadena antigua

~~ J- Cadenasnuevas

'YJy} Cadena antigua

La duplicaci6n genera dos duplex hijos, cada uno de loscuales contiene una cadena progenitora y una cadenafabricada recientemente

Molde de cadenaindividual

VV\---+ YRfR{'IVV --.VV\

Transcripci6ninversa

···..........

-<- ••••••• ".

@ RNA

Duplicaci6n

at ~DNADuplicaci6n

1 7 Los acidos nucleicos, tanto los de dobLe cadenacomo los de cadena individuaL, se replican por la sintesis decadenas compLementarias regida par las reg las del apareamien­to de bases.

GURA 1.16 El dogma centraL manifiesta que La informa­:ion deL acido nucleico puede ser perpetuada 0 transferida,-in embargo La transferencia de la informacion a proteinas es'rreversibLe.

La cadena progenitora individuales utilizada para sintetizar unacadena complementaria

La cadena complementaria esutilizada para sintetizar una copiade la cadena progenitora

cion del RNA vfrico ocurre en la celula in­fectada.

• La expresion de la informacion genetiea eelularsuele ser unidireeeionai. La transcripcion delDNA genera moleculas de RNA que uniea­mente pueden ser u tilizadas otra vez paragenerar secuencias de protefnas; en generalno pueden recuperarse para usarlas comofuente de informacion genetica. La traduc­cion del RNA a protefna siempre es irrever­sible.

Estos mecanismos son igualmente efectivos. ara la informacion genetica celular de procario­:35 0 eucariotas y para la informacion transportada;Jor los virus. Los genomas de todos los organismos-ivos estan formados por DNA duplex. Los virus. seen genomas de DNA 0 RNA, Yde cada tipo hayc~emplos de doble cadena (ds, double stranded) 0 de.::adena unica (ss, single stranded). Los detalles del=:Iecanismo de replicacion del acido nucleico varian=:::nre los diferentes sistemas vfricos, pero el princi­;-:0 de duplicacion por slntesis de cadenas comple­:::lentarias sigue siendo el mismo, seglll1 se ilustrae~ la FIGURA 1.1 .

Los genomas celulares reproducen el DNA por0:. mecanismo de duplicacion semiconservadora. Los~enomas vfricos de doble cadena, sean de DNA 0

::t: A, tambien se replican utilizando como molde-.as cadenas individuales del duplex para sintetizar.31 las cadenas complementarias.

Los virus con genomas de una sola cadena la_:ilizan como molde para sintetizar una cadena.:amplementaria, la cua!, a su vez, es utilizada para

sintetizar a su complemento, que, por supuesto, esidentico a la cadena original inicial. La duplicacionpuede implicar la formacion de intennediarios es­tables de doble cadena 0 uti}izar acido nucleico dedoble cadena solo como una fase transitoria.

La restriccion de la transferencia unidireccionalde DNA a RNA no es absoluta, ha sido superada porlos retrovirus, cuyos genomas estan formados pormoleculas de RNA de una sola cadena. Durante elciclo infeccioso, el RNA se convierte en una cadena{ll1ica de DNA por el proceso de transcripcion in­versa; dicha cadena, a su vez, es convertida en unDNA de doble banda. Este DNA duplex se convier­te en parte del genoma de la celula y es heredadocomo cualquier otro gen, de manera que la transerip­cion inversa permite que una seeueneia de RNA sea reeu­perada y utilizada como informacion genetiea.

La existenciC! de la duplicacion del RNA y de latranscripcion inversa establece el principia generalde que la informacion en eualquier tipo de seeuencia dedcido nucleieo puede eonvertirse en el otro tipo. Sin em­bargo, en el curso normal de los hechos, la celuladepende de los procesos de duplicacion, transcrip­cion y traduccion del DNA. No obstante, algunavez la informacion de un RNA celular se convierteen DNA y se inserta en el genoma (evento posi­blemente mediado par un virus RNA). Aunque latranscripcion inversa no participa en las operacionesregulares de la celula, llega a ser un mecanismo po­tencialmente importante cuando se analiza la evo­lucion del genoma.

1.9 La informacion genetica puede ser proporcionada por el DNA 0 eL RNA 11

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La horquilla de duplicaci6n es la regi6n del DNAen la cual hay una transici6n del duplex progenitor desenrolla­do a los duplex hijos recientemente replicados.

do sintetizada. Las enzimas se nombran segun eltipo de cadena que sintetizan: las DNA polimera­sas sintetizan DNA, las RNA polimerasas, RNA.

La degradacion de los acidos nucleicos tambien re­quiere de enzimas especificas: las desoxirribo­nucleasas (DNAsas) degradan al DNA y las ribonu­cleasas (RNAsas) degradan al RNA. Las nucleasasse incluyen en las clases generales de exonuclea­sas y endonucleasas:

• Las endonudeasas cortan enlaces individua­les en el interior de las moleculas de DNA yde RNA y generan fragmentos discretos. Al­gunas DNAsas dividen ambas cadenas de unDNA duplex en el sitio diana, mientras queotras dividen solo una de ellas. Las endo­nudeasas participan en reacciones de corte,como se observa en la FIGURA 1 14.

• Las exonucleasas eliminan los residuos, unoa uno, a partir del extrema de la molecula, ygeneran mononucleotidos. Siempre actuanen una sola cadena de acido nucleico, y cadaexonucleasa avanza en una djreccion especi­fica, es decir, empieza en un extrema 5' 0 3'para dirigirse hacia el otro. Estan involucra­das en reacciones de ajuste, como se muestraen la ".1" n 1

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Una endonucleasa divide a un enlace en un acidonuclei co. En este ejemplo se muestra una enzima que ataca auna cadena de un DNA duplex.

'1Moleculas de DNA repllcadas ,

Horquilla de duplicaci6n

Enlace rota

~.

....-.

Una exonucleasa elimina bases, una a la vez,dividiendo el ultimo enlace de una cadena polinucleotidica.

III La informacion genetica puedeser proporcionada por el DNAo el RNA

Conceptos principales

mento, solo un tramo pequeno del DNA duplex sesepara en cadenas individuales.

La estructura helicoidal de una molecula deDNA dedicada a la duplicacion se ilustra en la

. La region no replicada es el duplex proge­nitor que se abre hacia la region replicada, dondese han formado los dos duplex hijos. La estructurahelicoidal doble se rompe en la union en tre las dosregiones, Hamada horquilla de duplicacion. Laduplicacion implica el movimiento de la horqui­lla de duplicacion a 10 largo del DNA progenitor, demodo que hay un desenrollamiento continuo de lascadenas progenitoras y un enrollamiento de los du­plex hUos.

La sintesis de acidos nucleicos es catalizada porenzimas especificas, las cuales reconocen el moldey emprenden la tarea de catalizar la adicion de sub­unidades a la cadena polinucleotidica que esta sien-

• Los genes celulares son DNA, pero los virus y losviroides pueden tener genomas de RNA.

• El DNA se convierte en RNA por transcripci6n, y el RNApuede convertirse en DNA por transcripci6n inversa.

• La traducci6n del RNA a proteina es unidireccional.

El dogma central define el paradigma de la biologiamolecular. Los genes se perpetuan como seclienciasde acido nucleico, si bien actuan al ser expresadosen forma de protefnas. La duplicacion es respon­sable de la herencia de la informacion genetica. Latranscripcion y la traduccion son responsables de laconversion de una forma a otra.

En la GI 1 ~6 se ilustran las funciones de laduplicacion, la transcripcion y la traduccion desdela perspectiva del dogma central:

• La perpetuaci6n del dcido nucleico suele implicaral DNA 0 el RNA como el material genitico. Lascelulas utilizan unicamente DNA, en tantoque algunos virus usan RNA, y la duplica-

10 CAPITULO 1 Los genes son DNA

---

Proteina

Cadena antigua

} Cadenas nuevas

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Molde de doble --:"Il

YJ\YAy--<;~

Molde de cadenaindividual

VV\---. YJWR{'IVV -+VV\

La duplicaci6n genera dos duplex hijos, cada uno de loscuales contiene una cadena progenitora y una cadenafabricada recientemente

Transcripci6ninversa

..

...........

..............

RNA

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Duplicaci6n

@Duplicaci6n

• 1 Los acidos nucleicos, tanto los de doble cadenacomo los de cadena individual, se replican por la sintesis decadenas complementarias regida por las reg las del apareamien­to de bases.

URA 1.16 El dogma central manifiesta que la informa­:" n del acido nucleico puede ser perpetuada 0 transferida,:'a embargo la transferencia de la informacion a proteinas es~eversible.

La cadena progenitora individuales utilizada para sintetizar unacadena complementaria

La cadena complementaria esutilizada para sintetizar una copiade la cadena progenitora

cion del RNA virico ocurre en la c€lula in­fectada.

• La expresion de la informacion genetiea eelularsuele ser unidireecional. La transcripcion delDNA genera moleculas de RNA que {tniea­mente pueden ser utilizadas otra vez paragenerar secuencias de proteinas; en generalno pueden recuperarse para usarlas comofuente de informacion genetica. La traduc­cion del RNA a protelna siempre es irrever­sible.

Estos mecanismos son igualmente efectivos- a la informacion genetica celular de procario­

.0.5 0 eucariotas y para la informacion nansportadar los virus. Los genomas de todos los organismos

:"os estan formados por DNA dllplex. Los viruseen genomas de DNA 0 RNA, Yde cada tipo hay

::~ mplos de doble cadena (ds, double stranded) 0 de:~dena unica (ss, single stranded). Los detalles del-ecanismo de replicacion del acido nucleico varian::::me los diferentes sistemas viricos, pero el princi-

.0 de duplicacion por sintesis de cadenas comple­

.entarias sigue siendo el mismo, segun se Hustra:: , la FIGURA 1.17.

Los genomas celulares reproducen el DNA por=~ mecanismo de duplicacion semiconservadora. Los=~nomas vfricos de doble cadena, sean de DNA 0

- -A, tambien se replican utilizando como molde= cadenas individuales del d{lplex para sintetizaro~ las cadenas complementarias.

Los virus con genomas de una sola cadena la__~zan como molde para sintetizar una cadena::cmplementaria, la cual, a su vez, es utilizada para

sintetizar a su complemento. que, por supuesto, esidentico a la cadena original inicia1. La duplicacionpuede implicar la formacion de intermediarios es­tables de doble cadena 0 utilizar acido nueleico dedoble cadena solo como una fase transitoria.

La restriccion de la transferencia unidireccionalde DNA a RNA no es absoluta. ha sido superada porlos retrovirus, cuyos genomas estan formados pormoleculas de RNA de una sola cadena. Durante elcielo infeccioso, el RNA se convierte en una cadena{mica de DNA por el proceso de transcripci6n in­versa; dicha cadena, a su vez, es convertida en unDNA de doble banda. Este DNA d{lplex se convier­te en parte del genoma de la celula y es heredadocomo cualquier otro gen, de manera que la transerip­cion inversa permite que una seeueneia de RNA sea reeu­perada y utilizada como informacion genetiea.

La existenc~a de la duplicacion del RNA y de latranscripcion inversa establece el principio generalde que la informacion en eualquier tipo de seeueneia deCicido nucleieo puede eonvertirse en el otro tipo. Sin em­bargo, en el curso normal de los hechos, la celuladepende de los procesos de duplicacion, transcrip­cion y traduccion del DNA. No obstante, algunavez la informacion de un RNA celular se convierteen DNA y se inserta en el genoma (evento posi­blemente mediado por un virus RNA). Aunque latranscripcion inversa no participa en las operacionesregulares de la celula, llega a ser un mecanismo po­tencialmente importante cuando se analiza la evo­lucion del genoma.

1.9 La informacion genetica puede ser proporcionada por el DNA 0 el RNA 11

" f'. WU utra~4' C"R"'au·II"Ui"Ui'J(S'z"j'ruu·'i'f;''-'VJu,-Genoma Numero de genes Pares de bases

OrganismosPlantas <50 000 <1011

Mamiferos 30 000 -3 X 109

Gusanos 14 000 _108

Moscas 12 000 1.6 x 108

Hongos 6 000 1.3 x 107

Bacterias 2-4 000 <107

Micoplasma 500 <106

Virus DNAdsVaccinia <300 187 000Papova (SV40) -6 5226Fago T4 -200 165 000

Virus DNAssParvovirus 5 5 000FagofX174 11 5387

Virus RNAdsReovirus 22 23 000.Virus RNAssCoronavirus 7 20 000Influenza 12 13500TMV 4 6400Fago MS2 4 3569STNV 1 1300

ViroidesPSTV RNA a 359

La cantidad de acido nucleico del genoma variaen un range enorme. ds, doble cadena; 55, cadena unica.

Los mismos principios se aplican a la perpetua­cion de la informacion genetica tanto en los geno­mas enormes de plantas 0 anfibios como en los ge­nomas diminutos del micoplasma y en la informa­cion genetica aun mas pequefia de los virus de DNAo RNA. En la se resumen algunos ejem­plos de la gama de tipos y tamanos de los genomas.

En toda la gama de organismos, cuyo comeni­do total de genomas varia en un rango superior alas 100 000 veces, prevalece un principio comun:el DNA codifica a todas las proteinas que la(s) dlula(s)del organismo debe(n) sintetizar, y las proteinas, a su vez(directa 0 indirectamente), proporcionan las funcionesnecesarias para la supervivencia. Mediante un princi­pio similar se describe la funcion de la informaciongenetica de los virus, ya sea de DNA 0 RNA: el dcidonucleico codifica a la(s) protefna(s) necesaria(s) para em­paquetar al genoma y tambien para cualquier funci6nadicional a las proporcionadas por la dlula hospedadoranecesaria para la reproducci6n del virus durante su cicloinfeccioso. (El virus mas pequeno, el virus satelite dela necrosis del tabaco [STNV, satellite tobacco necrosisvirus], no puede replicarse de forma independiente,requiere de la presencia simultanea de un virus "co­operador", el virus de la necrosis del tabaco [TNV,tobacco necrosis virus], que por si mismo es un virusnormalmente infeccioso.)

12 CAPITULO 1 Los genes son DNA

III Los acidos nudeicosse hibridan por apareamientode bases

Conceptos principales

• El calentamiento provoca que las dos cadenas de unDNA duplex se separen.

• La Tm es el punto medio del rango de temperatura dedesnaturalizaci6n.

• Las cadenas complementarias unicas puedenrenaturalizarse cuando 5e reduce la temperatura.

• Puede haber desnaturalizaci6n y renaturalizaci6njhibridaci6n con combinaciones de DNA-DNA, DNA­

RNA a RNA-RNA, y pueden ser intermoleculares aintramoleculares.

• La capacidad de dos preparaciones de acido nucleicode una sola cadena para hibridarse demuestra sucomplementariedad.

Una propiedad clave de la helice duplex es su ca­pacidad para separar las dos cadenas sin afectar losenlaces covalentes; esto hace posible dicha separa­cion, y que se reformen en condiciones fisiologicas ala velocidad necesaria (muy rapida) para mamenerlas funciones geneticas. La especificidad del procesodepende del apareamiento complementario de lasbases.

El concepto de apareamiento de las bases es fundamen­tal para todos los procesos relacionados con los dcidos nuclei­cos. La separaci6n de los pares de bases es un aspecto crucialde la funci6n de una mol&ufa de doble cadena, mientrasque la capacidad para formar pares de bases 10 es parala actividad de un dcido nucleico de cadena (mica. En la

se muestra que el apareamiento de basesperrnite que los acidos nucleicos complementarios decadena unica formen una estructura duplex.

• Una region duplex intramolecular puedeformarse por apareamiento de las basesentre dos secuencias complementarias queforman parte de una molecula de cadenaunica.

• Una molecula de cadena unica puede apa­rearse a traves de las bases con una moleculade cadena unica, complementaria e inde­pendiente, para formar un duplex intermo­lecular.

La formacion de dominios duplex a partir deacidos nucleicos de cadena unica es mas importantepara el RNA, pero tambien existe un DNA de cade­na unica (en forma de genomas viricos). El aparea­miento de las bases entre cadenas complementariasunicas e independientes no esta restringido a com­binaciones DNA-DNA 0 RNA-RNA, tambien puedeocunir entre una molecula de DNA y una de RNA.

./

• • • 1 • •• • ~ I •

19 El apareamiento de bases ocurre en los DNA~_:31( e incluso en las interacciones intermoleculares e intra­-: -=:ulares del RNA (0 del DNA) de cadena individual.

DNArenaturalizado

DNA de doblecadenal (Desnaturalizaci6n )

VVVV DNA de cadena/V individual

-:: areamiento-. amolecular:el RNA

areamiento RNA largo

- ermolecular entre VV' RNA cortooleculas cortas

. largas de RNA ,

La carencia de enlaces covalentes entre cadenasplementarias pennite manipular al DNA in vitro.

- ;- fuerzas no covalentes que estabilizan a la heliceplex se intern.unpen por calentarniento 0 exposi­

a concentraciones bajas de sales. Las dos cade­;- de la helice duplex se separan completamente

__ando se rompen lOdos los puentes de hidrogeno::..:e las unen.

EI proceso de separacion de cadenas se llamaesnaturalizacion 0 (coloquiatmente) fusion. (EI

-;;:rmino "desnaturalizacion" tambien se utiliza para_5cribir la perdida de la estructura autentica de una-:- efna; es un termino general que implica que la~ nformacion natural de una macromolecula se ha::-- sformado.)

La desnaturalizacion del DNA se presenta en un:; go lirnitado de temperatura y da lugar a cambios: rprendentes en muchas de sus propiedades flsicas.:=: punto medio del rango de temperatura en que las-- enas del DNA se separan se conoce como tempe­r.::ura de fusion (T

m, melting temperature), la cual de­

~ nde de la proporcion de pares de bases G-c. Como:::.i a uno de estos pares tiene tres puentes de hidro­5eno, es mas estable que un par de bases formado~ r A-T, el cual solo cuenta con dos de dichos puen­: . Entre mas pares de G-C contenga el DNA, mayor: ra la cantidad de energfa necesaria para separar las- denas. En solucion y en condiciones fisiologicas,::n DNA con 40% de puentes G-C, valor tfpico de lossenomas de los marnfferos, se desnaturaliza a una T

maproximada de 87°C, de modo que el DNA duplexes estable a la temperatura de la celula.

La desnaturalizacion del DNA es reversible en·ondiciones apropiadas. La capacidad de las dos-adenas complementarias separadas para volver a:ormar una helice duplex se llama renaturaliza­don, la cual depende del apareamiento especffico'e las bases entre las cadenas complementarias. En

.a "2 se observa que la reaccion tiene lugar

Las cadenas individuales de DNA desnaturaliza­das pueden renaturalizarse para formar una estructura duplex.

en dos etapas. Primero, las cadenas individuales deDNA que estan en la solucion se encuentran porcasualidad; si sus secuencias son complementarias,aparearan sus bases para generar una region cortade helice duplex. Posteriormente, dicha region seextiende a 10 largo de la molecula como una cre­mallera para formar una molecula duplex larga.La renaturalizacion de la helice duplex restaura laspropiedades originales perdidas con la desnaturali­zacion del DNA.

La renaturalizacion describe la reaccion entre dossecuencias complementarias separadas por desnatu­ralizacion. Sin embargo, la tecnica puede ampliarsepara permitir que cualesquiera dos secuencias com­plementarias de acidos nucleicos reaccionen entre sfpara formar una estructura duplex. A este procesose le llama asociacion, si bien la reaccion se descri­be de forma mas general como hibridacion cuandoparticipan acidos nucleicos de diferentes orfgenes,como sucede cuando una preparacion es DNA y laotra, RNA. La capacidad de dos preparaciones de !lcidosnucleicos para hibridarse demuestra con precision su com­plementariedad, pues solo las secuencz'as complementariaspueden formar una estructura duplex.

El principio de la reaccion de la hibridacion esponer frente a frente dos preparaciones de acidosnucleicos de cadena individual y despues calcular lacantidad de materia de doble cadena que se forma.En la se Hustra un procedimiento porel cual se desnaturaliza una preparacion de DNA yse adsorben en un filtro las cadenas unitarias. Pos­teriormente se aiiade una segunda preparacion deDNA (0 de RNA) desnaturalizado. EI filtro es tratadode tal forma que la segunda preparacion se adsor­ba solo si puede formar pares de bases con el DNAadsorbido en un principio. Usua]mente la segunda

1.10 Los acidos nucleicos se hibridan por apareamiento de bases 13

YJ\:i

~

Conceptos principales

mas, un cambio en el fenotipo del organismo puedepermitir que se identifique la funcion de la protefna.La existencia de numerosas mutaciones en un genpermite que se comparen numerosas variantes deuna protefna, y mediante un anatisis detallado seidentificaran las regiones de la protefna responsablesde una funcion enzimatica 0 de otras funciones.

Todos los organismos experimentan cierto nu­mero de mutaciones como resultado de las ope­raciones celulares normales 0 de las interaccionesaleatorias con el ambiente a las cuales se les llamamutaciones espontaneas; la velocidad a la que seproducen es caracterfstica del organismo especffico,yen ocasiones se Ie llama nivel de Condo. Las mu­taciones son eventos raros y, por supuesto, las quedafian a un gen son descartadas con la evolucion,de modo que es dificil obtener grandes cantidadesde mutantes espontaneos para estudiarJos en las po­blaciones naturales.

La incidencia de las mutaciones suele incremen­tarse mediante tratamientos can ciertos compuestos;se les llama mutagenos, y los cambios que provo­can se conocen como mutaciones inducidas. Lamayorfa de los mutagenos actuan directamente envirtud de su capacidad para modificar una base es­pecffica del DNA 0 para incorporarse en el acido nu­cleico. La efectividad de un mutageno se juzga porla medida en que incrementa la tasa de mutacionesrespecto del nivel de fondo. Utilizando mutagenas sepueden inducir numerosos cambios en un gen.

Las mutaciones espontaneas que desactivanel funcionamiento de un gen tienen lugar en losbacteriofagos y en las bacterias a una tasa relativa­mente constante de 3 a 4 x 10-3 por genoma, porgeneracion. Dada la gran variacion en el tamaliode los genomas entre bacteriofagos y bacterias, estatasa corresponde a amplias diferencias en el ritmode las mutaciones par par de bases, 10 cual sugiereque la tasa global de mutacioh ha estado sujeta afuerzas selectivas, que han equilibrado los efectosnocivos de la mayorfa de las mutaciones respectode los favorables de algunas mutaciones. Esta con­clusion se refuerza por la observacion de que unaarqueobacteria que vive en condiciones adversasde altas temperaturas y acidez (que supuestamen­te dafian el DNA) no muestra una tasa elevada demutaciones, de hecho la tasa de mutacion globalapenas es menor al rango promedio.

En la FIGURA 1 22 se muestra que en las bacterias,la tasa de mutaciones corresponde a -10--6 eventospor locus par generacion, 0 a una tasa promedia decambio por par de bases de 10-9 a 10-10 por genera­cion. La tasa en pares de bases individuales varfaconsiderablemente, en un rango de 10 000 veces. Nohay un dlculo preciso de la tasa de mutaciones en

5e desnaturalizael DNA en soluci6n

~

"WA.YAlU5e desnaturaliza el DNAy se adsorbe en un fHlro

~

(~...~)

5e sumerge el filtro en la soluci6n

l

~5e determina el DNA unido al filtro

l~~.\(~~\

~T." , La hibridaci6n en filtro establece si la soluci6n

de DNA (0 RNA) desnaturalizado contiene secuencias comple­mentarias a las cadenas inmovilizadas en el filtro.

'''' ElexpirTmentodelfiitroevalua la complemenlariedad

Las mutaciones proporcionan evidencias determi­nantes de que el DNA es el material genetico. Cuandoun cambia en la secuencia del DNA provoca una mo­dificacion en la secuencia de una protefna, se puedeconcluir que el DNA codifica a dicha protefna. Ade-

• Todas las mutaciones consisten en cambios en lasecuencia del DNA.

• Las mutaciones pueden ser espontaneas 0 inducidaspor mutagenos.

preparacion se marca radioactivamente, de maneraque se pueda medir la reaccion como la cantidad demarcador radioactivo retenido par el filtro.

La extension de la hibridacion entre dos acidosnucleicos de cadena individual depende de su com­plementariedad. No es necesario que dos secuenciassean perfectamente complementarias para hibridar­se. Si estan estrechamente relacionadas, pero noson identicas, se farma un dllplex imperfecto en elcual el apareamiento de bases se interrumpe en lasposiciones en que las cadenas individuales no co­rresponden.

• Las mutaciones cambianla secuencia del DNA

14 CAPITULO 1 Los genes son DNA

tipo silvestre

. .H

CITOSINA ~r7'Y 'H

/N)(~ )

URAGlLa a a

~....NvN,

. II Ho

U

~mutanteA

C

C

....

G

Acidonitroso

. ..

EI genoma,1 en 300generaciones

Cualquier gen,1 en 105-106

generaciones

Cualquier par debases, 1 en 109-1010

generaciones

Tasa de mutaci6n

TCGGACTTACCGGTT~ ..

.~~ fu~-AGCCTGAATGGCCAAT ..

G

. Un par de bases muta a una tasa de 10-9 a 10-10

::- ;eneraci6n, un gen de 1 000 pares de bases muta a una tasa:" -:0-6 por generaci6n, en tanto que un genoma bacteriano- .3 a una tasa de 3 x 10-3 por generaci6n.

Las mutaciones pueden ser inducidas por modi­ficacion quimica de una base.

1.12 Las mutaciones pueden afectar a pares de bases individuales 0 a secuencias mas largas 15

=...:cariotas, aunque en general se piensa que hasta-eno punta es similar a la de las bacterias, calculada_ !" locus y por generacion.

Las mutaciones pueden afectara pares de bases individualeso a secuencias mas largas

(onceptos principales

• Una mutaci6n puntual modifica a un solo par de bases.

• Las mutaciones puntuales pueden ser provocadas por laconversi6n quimica de una base en otra 0 por erroresdurante la duplicacion.

• Una transicion rem plaza un par de bases G-C con unpar de bases A-T, 0 viceversa.

• Una transversion remplaza una purina con unapirimidina, por ejemplo, A-TaT-A.

• Las inserciones son el tipo mas comun de mutaci6n,son resultado del movimiento de elementostransponibles.

-:wlquier par de bases del DNA puede mutar. Unamutacion puntual cambia solo un par de bases, y

ede ser provocada por dos tipos de eventos:• La modificacion qufmica del DNA convierte

directamente una base en otra diferente.• Un mal funcionamiento durante la duplica­

cion del DNA provoca la insercion de unabase equivocada en una cadena polinueleo­tfdica durante la sfntesis del DNA.

Las mutaciones puntuales pueden ser de dos ti­pos, dependiendo de la naturaleza del cambio cuan­do una base es sustituida por otra:

• La elase mas comun es la transicion, queconsiste en la sustitucion de una pirimidinapor la otra, 0 de una purina por la otra, encuyo caso, un par G-C es remplazado par unpar A-T, 0 viceversa.

• La elase menos comun es la transversion,en la cual una purina es remplazada por unapirimidina 0 viceversa, de tal forma que unpar A-T se convierte en T-A 0 en CoG.

Los efeetos del acido nitroso constituyen unejemplo elasico de transicion porIa conversionqufmica de una base en otra. En la semuestra que el acido nitroso lleva a cabo una des­aminacion oxidativa que convierte a la citosina enuracilo. En eJ cielo de duplicaci6n que sigue a latransici6n, el U se aparea can una A, y no con la G,con la cualla C original se habrfa apareado. De estamanera, el par CoG es remplazado por un par T-Acuando la A se aparea con la T en el siguiente cielode duplicacion. (EI acido nitroso tambien desaminaa la adenina, provocando la transicion inversa deA-T a G-C.)

Las transiciones tambien son provocadas porapareamiento erroneo de bases, cuando pare­jas inusuales se aparean desafiando la restricci6nusual de los pares de Watson y Crick. En generaL elapareamiento erroneo de bases es una aberraci6n,resultado de la incorporacion en el DNA de una baseanormal que tiene propiedades ambiguas de aparea­miento. En la se muestra el ejemplo delbromouracilo (BrdU), molecula analoga a la timina

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HC""'C'Q;<'O, ,N N 'H....W'H

/ Y'H, 1., " "N""C....C;;-N

Azucar 0 I II ~H

Par A.T HC""N"'C.....JEI SrdU se aparea can I )ucarla A en la duplicacion t

Sr

H~""'C""C<'O"N N '·H.......H

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Azucar 0 I II ~HHC"" "'C.....N'

N ~Par SrdU-A Azucar

EI cambia ceto-enol permite que el SrdU se aparee can la G

Sr SrI I

HC""C'c"'~) Cambia ceto-enol HC""C....C...OHI I~ • I II

./N.....CN,H /N....C"'N., II ., 11

Azucar 0 Azucar 0

I EI SrdU se apareat can la G en la duplicacion

SrI

HC"'CC"'0"H. Par SrdU-GI II '"

./N....C...N,. .?., II "H'N"'~C-N

Azucar 0" I II ~CH, 'H'N...G""-"C.....N'

H N ~Azucar

Se pueden inducir mutaciones al incorporar ana­logos de bases en el DNA.

que contiene un aromo de bromina en lugar del gru­po metilo de la timina. EI BrdU se incorpora al DNAen lugar de la timina. No obstante, sus propiedadesde apareamiento son ambiguas porque el atomo debromina permite que se realice un cambio en el cualla base modifica su estructura, de una forma ceto(=0) a una forma enol (-OR). Esta tlltima puedeaparearse con la guanina, to cual conduce a la sus­Jitucion del par original A-T pOl' un par G-c.

EI apareamiento erroneo puede ocurrir durantela incorporacion original de la base 0 en un ciciosubsigulente de duplicacion. La transicion es indu­cida con cierta probabilidad en cada cicio de dupli­cacion, de modo que la incorporacion de BrdU tieneefectos continuos en la secuencia del DNA.

Durante mucho tiempo se penso que las mu­taciones puntuales eran la via principal de cambio

16 CAPITULO 1 los genes son DNA

en genes individuales, pero ahora sabemos que lasinserciones de fragmentos de material adicionalson muy frecuentes. La fuente del material inser­tado yace en los elementos transponibles, queson secuencias de DNA susceptibles de cambial' delugar (vease Capitulo 21, Transposones, y Capitulo22, Retrovirus y retroposones). Normalmente, unainsercion suprime la actividad de un gen, y dondehan ocurrido dichas inserciones, despues puedenproducirse deleciones de una parte 0 todo el mate­rial insertado, y hasta de los dominios adyacentes.

Una diferencia significativa entre las mutacio­nes puntuales y las inserciones/deleciones es quela frecuencia de las primeras puede incrementarsepOl' los mutagenos, mientras que la incidencia delos cambios provocados pOl' elementos transponi­bles no se ve afectada. Sin embargo, las insercio­nes y deleciones tambien pueden ser producto demecanismos, pOl' ejemplo, los que implican errorescometidos durante la duplicacion 0 la recombina­cion, aunque probablemente sean menos comunes.Por otra parte, una clase de mutagenos, las acri­dinas, dan lugar a inserciones y deleciones (muypequeii.as) .

lID Los efectos de las mutacionespueden ser revertidos

Conceptos principales

• las mutaciones directas desactivan a un gen, en tantoque inversas (0 revertientes) revierten sus efectos.

• las inserciones pueden revertir por deleci6n delmaterial insertado, pero las deleciones no puedenreverti rse.

• la supresi6n ocurre cuando una mutaci6n de un segundogen anula el efecto de la mutaci6n del primero.

En la 2 se muestra que el aislamiento delos revertientes es una caracterfstica importanteque distingue las mutaciones puntuales y las inser­ciones de las deleciones:

• Una mutacion puntual puede revertirse alrestaurar la secuencia original 0 al adquiriruna mutacion compensadora en alguna otraparte del gen.

• Una insercion de material adicional puedeser revertida por delecion del material inser­tado.

• Una delecion de una parte de un gen nopuede revertirse.

Las mutaciones que desactivan a un gen son lla­madas mutaciones directas, y sus efectos son re­vertidos por mutaciones inversas, las cuales sonde dos tipos, reversion verdadera y reversion supre­sora intragenica.

ATCGGACTTACCGGTTATAGCCTGAATGGCCAAT

Mutaci6n Ipuntual tATCGGACOACCGGTTATAGCCTGAGTGGCCAAT

Reversi6n ~

ATCGGACTTACCGGTTATAGCCTGAATGGCCAAT

ATCGGACTTACCGGTTATAGCCTGAATGGCCAAT

Inserci6n

ATCGGACTTXXXXXACCGGTTATAGCCTGAAYYYYYTGGCCAAT

Reversi6n Ipar deleci6n tATCGGACTTACCGGTTATAGCCTGAATGGCCAAT

ATCGGACTTACCGGTTATAGCCTGAATGGCCAAT

ATCGGACGGTTATAGCCTGCCAAT

Reversi6n imposible

FlGl. Las mutaciones puntuales y las insercianes pue-den ser revertidas, pero las deleciones son irreversibles.

Una reversion exacta de la mutacion originalse llama reversion verdadera, de tal manera quesi un par A-I ha sido remplazado pOI un par G-C,otra mutacion que restituya el par A-I regeneraniexactamente la secuencia de tipo silvestre.

El segundo tipo de mutacion inversa, la rever­sion supresora intragenica, puede tener lugaren otro sitio del gen, y sus efectos compensan ala primera mutacion. Por ejemplo, un cambio deaminoacido en una protefna puede aboUr la fun­cion del gen, pero una segunda alteracion puedecompensar por la primera y restaurar la actividadde la protefna.

Una mutacion directa resulta de cualquier cam­bio que desactive un gen, mientras que una muta­cion inversa debe restaurar la [uncion de una protef­na danada por una mutacion directa en particular,de modo que las demandas de una mutacion inversason mucho mas especfficas que las de una mutaciondirecta. En proporcion, la tasa de retromutacion esmenor que la de mutacion directa, normalmente porun factor de -10 veces.

Las mutaciones tambi61 pueden ocunir enotros genes para contrarrestar los efectos de unamutacion en el gen original, deeto que se conocecomo supresion. Se llama supresor al locus enque una mutacion suprime el efecto de una muta­cion en otro.

lID Las mutacianes se cancentranen puntas calientes

(oncepto principal

• La frecuencia de las mutacianes en cualquier parde bases en particular depende de una fluctuaci6nestadistica, excepto en los puntas calientes, en loscuales la frecuencia se incrementa cuando menos en unorden de magnitud.

Basta ahora se han descrito las mutaciones en fun­cion de los cambios individuales en la secuenciadel DNA que influyen en la actividad de la unidadgenetica en la cual ocurren. Cuando se analizanlas mutaciones desde la perspectiva de la desac­tivacion del gen, la mayorfa de los genes de unaespecie muestran tasas mas 0 menos similares demutacion respecto de su tamano, 10 cual sugiereque el gen puede ser considerado como un objetivode la mutacion, y que un dana en cualquiera de suspartes puede abolir su funcion, pOI consiguiente, lasusceptibilidad a la mutacion es aproximadamenteproporcional al tamano del gen. Pero consideran­do los sitios de mutacion de la secuencia del DNA,,)odos los pares de bases de un gen son igualmentesusceptibles 0 algunos son mas propensos que otrosa sufrir mutaciones?

(,Que sucede cuando se afsla un numero im­portante de mutaciones independientes del mismogen? Se obtienen numerosos mutantes, cada unode los cuales es resultado de un evento mutacionalindividual. Posteriormente se determina el sitio decada mutacion. La mayorfa de las mutaciones ra­dicaran en sitios diferentes, si bien algunas estaranen la misma posicion. Dos mutaciones aisladas demanera independiente en el mismo sitio puedenconstituir exactamente el mismo cambio en el DNA(en cuyo caso el mismo evento mutacional ha su­cedido en mas de una ocasion), 0 pueden constituircambios diferentes (en cada par de bases son posi­bles tres mutaciones puntuales diferentes).

En el histograma de la se muestrala frecuencia con la cual se encuentran mutacio­nes en cada par de bases del gen lac! de E. coli. Laprobabilidad estadistica de que ocuna mas de unamutacion en un sitio particular se determina porcinetiea de impactos aleatorios (como se observa en

1.14 Las mutacianes se cancentran en puntas calientes 17

50 100 150 200 250 300 bpDistancia a 10 largo del gen

Las mutaciones espontaneas ocurren a lo largodel gen lacI de la bacteria E. coli, perc estan concentradas enun punto caliente. La desaminaci6n de la citosina produce uracilo,

y la de 5-metilcitosina, timina.

Citosina 5-metilcitosina CH3 H

IY~'H/'Nf(N )

o

CH 3Timina 1 ~O

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g 40'(3

5 30E(1) 20D0ID 10E

'OJz

la distribucion de Poisson). Por 10 tanto, algunossitios adquiriran una, dos 0 tres mutaciones, mien­tras que otros no obtendran ninguna. Algunos sitiosadquieren muchas mas mutaciones de las esperadasen una distribucion aleatoria; pueden presentar 10 eincluso 100 veces mas mutaciones que las predichaspor los impactos aleatorios. Estos sitios se Hamanpuntos calientes. En los puntos calientes puedenocurrir mutaciones espontaneas, y mutagenos dife­rentes pueden tener diferentes puntos calientes.

III Numerosos puntos calientes sonresultado de bases modificadas

Concepto principal

• Una causa comLin de puntos calientes es la basemodificada 5-metilcitosina, la cual sufre desaminaci6nespontanea y se convierte en timina.

Una causa importante de mutacion espontanea re­sulta de la presencia de una base inusual en el DNA.Ademas de las cuatro bases que se insertan en estecuando es sintetizado, en ocasiones se pueden ob­servar bases modificadas cuyo nombre refleja suorigen; son producidas al modificarse quimicamenteuna de las cuatro bases ya presentes en el DNA. Labase modificada mas comun es la 5-metilcitosina,generada par una enzima metilasa que agrega ungrupo metilo a ciertos residuos de citosina en sitiosespecfficos del DNA.

Los sitios que contienen 5-metilcitosina propar­cionan puntos calientes para que se desarrollen mu­taciones puntuales espontaneas en E, coli. En cadacaso, la mutacion adquiere la forma de una transi­cion de G-C a A-T. Las cepas de E. coli incapaces demetilar la citosina carecen de puntos calientes.

La razon de la existencia de los puntos calienteses que las bases de citosina sufren desaminacion

espontanea con frecuencia considerable. En esta re­accion, el grupo amino es remplazado por un grupoceto. Recuerdese que la desaminacion de la citosinagenera uracilo (vease Figura 1.23). En la • U

se compara esta reaccion con la desaminacion de5-metilcitosina, en donde la desaminacion generatimina. El efecto en el DNA es la generacion de pa­res de bases G-U YG-T, respectivamente, donde hayun apareamiento erroneo entre parejas.

Todos los arganismos cuentan con sistemas dereparacion que corrigen pares de base apareadoserroneamente eliminando y remplazando una delas bases. La operacion de estos sistemas determinasi los pares apareados erroneamente, como G-U YG-T, resultan en mutaciones.

En la se muestra que las conse-cuencias de la desaminacion son diferentes para la5-metilcitosina y para la citosina. La desaminacion(poco frecuente) de la 5-metilcitosina provoca unamutacion, en tanto que la desaminacion de la cito­sina mas comun no tiene este efeeto porque los sis­temas de reparacion son mucho mas efectivos parareconocer G-U que G-T.

La E. coli contiene una enzima, uracilo-DNA­glucosidasa, que elimina los residuos de uracilo delDNA (vease la seccion 20.5, La inversion de baseses utilizada por las metilasas y las glucosilasas). Estaaccion deja sin aparear un residuo de G, y posterior­mente "un sistema de reparacion" inserta una base Cpara aparearlo. El resultado final de estas reaccioneses la restauracion de la secuencia original del DNA.Este sistema protege al DNA de las consecuenciasde la desaminacion espontanea de la citosina (perono es 10 suficientemente activo como para prevenirlos efectos del alto nivel de desaminacion provocadopor el acido nitroso; vease la Figura 1.23).

Notese que la desaminacion de la 5-metilcitosi­na produce tirnina, 10 cual da lugar a un par de basesapareadas erroneamente, G-T. Si el apareamiento

18 CAPITULO 1 Los genes son DNA

La remocion del uracilo evita las mutaciones - ;::;

c Me C~Y7\.'VAYAW

G GDesaminaci6n oxidativa

La T remplaza a la Me-C I EI U remplaza a la CT .. u

~YA±lA.lVGIG

T .. Eliminaci6n del uracilo

~~WG G

I Insercion de citosinaT .. C

~--.u\.YA.l()\.Y7VJ.VG G

Duplicaci6n

C ~ C~Y7\.YAYJ\JU

G GT Y c

W'WAYAYAJUA G

la T se aparea cin la A I

Mutaci6n Sin mutaci6n

FIGURA 1 2 La desaminaci6n de la 5-metilcitosina producetimina (por transiciones de C-G a T-A), en tanto que la desami­naci6n de la citosina produce uracilo (que suele ser eliminadoy posteriormente remplazado por citosina).

erroneo no se corrige antes del siguiente cido deduplicacion, resulta una mutacion. En la siguien­te duplicacion, las bases del apareamiento erroneoentre G y T se separan y posteriormente se apareancon nuevas parejas para producir un par G-C de tiposilvestre y un par A-T mutante.

La desaminacion de la 5-metilcitosina es la cau­sa mas comun de la produccion de pares erroneosde G-T en el DNA. Los sistemas de reparacion queactuan en dichos pares tienden a remplazar T por C(en vez de la alternativa de remplazar G por A), 10cual ayuda a reducir la tasa de mutacion (vease laseccion 20.7, Control de la direccion de la repara­cion del apareamiento erroneo) . No obstante, estossistemas no son tan efectivos como la remocion deV de los pares erroneos G-V, de modo que la des­aminacion de la 5-metilcitosina provoca mutacionescon mucha mayor frecuencia que la desaminacionde la citosina.

La 5-metilcitosina tambien crea puntos calien­tes en el DNA de eucariotas, fenomeno comlm endinudeotidos CpG concentrados en regiones de­nominadas islas CpG (vease la seccion 24.19, Losislotes CpG son dianas reguladoras). Si bien la 5­metilcitosina representa -1 % de las bases del DNAhumano, los sitios que contienen la base modifica-

da representan -30% de las mutaciones puntuales;esto hace del estado de la 5-metilcitosina un factordeterminante de mutacion muy importante en lascelulas animales.

Los efectos de la eliminacion de la enzima delraton MBD4, glucosilasa susceptible de eliminar T(0 V) de pares erroneos con G, subrayan la impor­tancia de los sistemas de reparacion para reducirla tasa de mutaciones; el resultado es una tasa demutacion tres veces mayor en los sitios CpG. (Larazon de que eJ efecto no sea mayor es que la MBD4constituye solo uno de los numerosos sistemas queinciden en los pares erroneos G-T; es de imaginarque la eliminacion de wdos los sistemas incremen­tara mucho mas la tasa de mutacion.)

La operacion de estos sistemas proyecta una luzinteresante en el uso de la T en el DNA respecto dela V en el RNA que quiza se relacione con la nece­sidad de estabilidad de la secuencia del DNA; el usade T significa que cualquier desaminacion de C sedetecta de inmediato debido a que genera una base(V) que suele estar ausente del DNA 10 cual incre­menta en gran medida la eficiencia con que puedenfuncionar los sistemas de reparacion (comparadoscon la situacion en que tienen que detectar aparea­mientos erroneos G-T, los cuales tambien puedenser producidos por situaciones en que la eliminacionde la T no serla la respuesta apropiada). Asimis­mo, el enlace fosfodiester del esqueleto es mas labilcuando la base es V.

lID Algunos agentes hereditariosson extremadamente pequefios

Concepto pri nci pal

• Algunos agentes hereditarios muy pequeiios nocodifican proteinas, pero constan de RNA 0 deproteinas que tienen propiedades hereditarias.

Los viroides son agentes infecciosos que producenenfermedades en plantas superiores; son molecu­las circulares de RNA muy pequeiias. A diferenciade los virus, en los cuales el agente infeccioso esun virion, genoma encapsulado en una cubiertade protefna, el RNA viroide es el agente infeccioso. EIviroide esta formado unicamente por RNA cuyasbases estan extensamente apareadas pero de formaimperfecta, de modo que forman una barra carac­teristica, como la ilustrada en la ! II . J. Lasmutaciones que interfieren con la estructura de estabarra reducen su capacidad infecciosa.

Un RNA viroide consiste en una especie mole­cular individual que se replica de forma autonomaen cHulas infectadas y cuya secuencia se perpetlla

1.16 Algunos agentes hereditarios son extremadamente pequeiios 19

'J..."tIU~'T. ..~....r~.!JllIn ~~

, PSTV grave ~ ., 00 ,~ 'M

j j { I I j ,','" C UOu C o"'c U /,:>. A"'A AO GC oG A GAA/fl /flC ","II AC A e" C e u u cc C

°O"ACU AACU ouoouuec GGUU CACCU CUCC OAoeAO AAGA OAAOGCGG CUCGG Gil. GCUUCAO uec eCGGO CC\OAOCOA UGGC A"'AGG GGUGOGG GUO CC BCGG co AOOAO ccca GAAA AOGGUUU11111111111111111 1111 111111 11111111111111 11IlllIIIIIlll II 1111111 11111111 1111111111111 IIIII llllll! III II 1111111 II1II 11111111 1111

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IeCuuoo UUGA CGCCAAOO CCOA UGUOOG GGOO uUCGUUuuuucu uuuuutGCc GAGCC co OOAAGUc AOO GGCCC GoG cuUCGCU GUCG GUuuc CtGCUCC CAC GG CGCC GC UCCUU GGGC CUUU UUUUA

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Vcu \ ACA\ VCAU I I CuG

359 330 300 210 240 210 180

+U A-.U

El RNA del PSTV es una molecula circular que forma una estructura extensa de doble cadena inte­rrumpida por numerosos lazos interiores. La forma leve difiere de la grave en tres sitios.

fielmente en sus descendientes. Los viroides pue­den clasificarse en numerosos grupos. Un viroidedado se identifica con un grupo porIa similitud desu secuencia con la de otros miembros del grupo.POl' ejemplo, cuatro viroides relacionados con el deltuberculo ahusado de la papa (PSTV, potato spindletuber viroid), muestran similitudes de secuencia del70 al 83 pOl' ciento. Los diferentes aislamientos deuna cepa de un viroide en particular pueden va rial'entre ellos, y el cambio puede afectar al fenotipode celulas infectadas. POl' ejemplo, las cepas levesy severas de PSTV difieren par tres sustituciones denucleotidos.

Los viroides se asemejan a los virus en que susgenomas de acido nucleico son heredables porquecumplen con todos los requisitos de la informaciongenetica, aunque los viroides, lIamados en ocasio­nes patogenos subviricos, difieren de los virus enestructura y funcion. EI RNA viroide no parece sertraducido a protefnas, pOl' 10 tanto no puede codifi­car pOl' sf mismo las funciones necesarias para su su­pervivencia, fenomeno que genera dos interrogan­tes: cComo se replica el RNA viroide? cComo afectaal fenotipo de la celula de la planta infectada?

La duplicacion debe ser realizada pOl' enzimasde la celula hospedadora, subvertidas de su funcionnormal. La heredabilidad de la secuencia del viroideindica que el RNA viroide proporciona el molde.

Presumiblemente, los viroides son patogenicosporque interfieren con los procesos celulares nor­males, quiza de forma relativamente aleatoria, pOl'ejemplo, secuestrando una enzima esencial para supropia duplicacion 0 interfiriendo con la produc­cion de moleculas necesarias de RNA celular, 0 bien,pueden comportarse como moleculas reguladarasanormales con efectos particulares en la expresionde genes individuales.

Un agente aun menos comun es la encefalo­patfa espongiforme de ovejas y cabras (scra-

20 CAPITULO 1 Los genes son DNA

pie), enfermedad neurologica degenerativa de ove­jas y cabras que se relaciona con kuru y sfndromede Creutzfeldt-Jakob, enfermedades humanas queafectan la funcion cerebral.

El agente infeccioso del scrapie no contiene dcidonudeico. Este agente extraordinario lIamado prion(agente infeccioso proteinaceo) es una glicoprotef­na hidrofoba de 28 kD, 0 PrP, codificada pOl' ungen celular (conservado entre los mamfferos) quese expresa en el cerebro normal. La protefna existeen dos formas, el producto que se encuentra en elcerebra normal conocido como Prpc, que es comple­tamente degradado por proteasas. La protefna en­contrada en los cerebros infectados se conoce comoPrpsc y es extremadamente resistente a la degrada­cion por proteasas. La PrPC se convierte en PrPSC poruna modificacion 0 cambio conformacional queconfiere resistencia a las proteasas y que aun no hasido descrita por completo.

Como agente infeccioso del scrapie, el PrPSC debemodificar de alguna manera la sfntesis de su contra­parte celular normal, de tal forma que, de ser inocuose tome en infeccioso (vease la seccion 31.12, Lospriones provocan enfermedades en los mamfferos).Los ratones que carecen del gen PrP no pueden serinfectados para que en ellos se desarrolle scrapie, 10cual demuestra que el PrP es esencial para el desa­rrollo de la enfermedad.

III ResumenMediante dos experimentos clasicos se demostroque el DNA es elmaterial genetico. El DNA aisla­do de una cepa de la bacteria Pneumococcus puedeconferir propiedades de dicha cepa a otra. Ademas,el DNA es el unico componente heredado porIaprogenie de los fagos progenitores. EI DNA puedeutilizarse para transferir nuevas propiedades a ce­lulas eucariotas.

El DNA es una helice duplex formada par cade­"as antiparalelas en las cuales los nucleotidos estan

idos pOl' enlaces fosfocliester 5'a -3'. El esqueleto:orma la parte exterior; las bases de purina y de piri­::niclina estan apiladas en el interior formando pares,::ll los cuales la A es complementaria de la T, y la G,":'e la C. Las cadenas se separan y recurren al apa­::-eamiento complementario de bases para ensamblar-- enas hijas siguiendo un patron de duplicacion= miconservadora. El apareamiento complementa­_:0 de bases tambien se u tiliza para transcribir un~\A que representa una sola cadena de un DNAiiiplex.

Un fragmento de DNA puede codificar a una~,oteina.El codigo genetico describe la relacion en­=e la secuencia del DNA y la secuencia de la protei-

-. Solo una de las dos cadenas del DNA codifica a'..:na proterna. Un codon esta farmado pOl' tres nu­~eotidos que representan un solo aminoacido. Una=e enda codificadora de DNA consiste en una serie.:: codones, los cuales son leidos desde un punto de:.aicio predeterminado. En general, uno de los tres_arcos de lectura posibles puede ser traducido en_,oteinas.

Una mutacion es un cambio en la secuencia de_Q pares de bases A-T y G-C del DNA que, en una=:.'cuencia codificadora, puede cambiar la secuenciaie aminoacidos de la proteina correspondiente. Una:2utacion por desplazarniento del marco de lectura::J.odifica el marco de lectura subsiguiente insertando~ eliminando una base, de modo que se produce una=erie completamente nueva de aminoacidos a partir'el sitio de la mutacion. Una mutacion puntual cam­

.=":a solo al arninoacido representado par el condon en':~ cual sucede la mutacion. Las mutaciones puntua­,::5 pueden ser revertidas por mutacion inversa de la:::mtacion original. Las inserciones pueden revertirse:- r la perdida del material insertado, pero las de­.::ciones son irreversibles. Las mutaciones tambien." ;Jeden ser suprimidas de manera inclirecta cuando~a mutacion de un gen diferente antagoniza al de­'::GO original.

La incidencia natural de las mutaciones se in­=ementa pOl' medio de mutagenos. Las mutacio­:::es pueden concentrarse en puntos calientes. Una':rri.edad de punto caliente responsable de algunas

=·.naciones puntuales es provocada por la desami­~-cion de la base modificada 5-metilcitosina.

Las mutaciones directas ocurren a una tasa de- ~ 0-6 pOl' locus por generacion; las retromutaciones

mutaciones inversas) son menDs comunes. Noas las mutaciones inciden en el fenotipo.Aunque toda la informacion genetica de las ce­

___as es transportada por el DNA, los virus tienen=:=::lOmas de doble cadena 0 de una sola cadena de

o de RNA. Los viroides son patogenos subviri-

cos formados unicamente por moleculas circularespequeiias de RNA, sin cubierta protectora. El RNAno codifica proteinas; se desconoce su forma de per­petuacion y de patogenesis. El scrapie es un agenteproteinico infeccioso.

Referencias

III Introducci6n

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III El DNA es el matelial genetico de las bacterias

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.. El DNA es el material genetico de los virus

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III El DNA es el material genetico de las celulasanimales

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III La duplicaci6n del DNA es semiconservadora

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22 CAPITULO 1 Los genes son DNA

l1li Numerosos puntos calientes son resultado de basesmodificadas

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scrapie. Cell 73, 1339-1347.McKinley, M. P., Bolton, D.C., and Prusiner, S. B. (1983).

A protease-resistant protein is a structural componentof the scrapie prion. Cell 35, 57-62.

Los genes codifican proteinas

--......

...

ESQUEMA DEL CAPITULO JIntroducci6n

Un gen codifica a un solo polipeptido• La hip6tesis de un gen : una enzima resume Las bases de la

genHica moderna: que un gen es un fragmento de DNA quecodifica a una sola cadena polipeptidica.

• La mayoria de las mutaciones deterioran La funci6n del genen el cual se producen.

Las mutaciones que se presentan en el mismo genno se pueden complementar• Una mutaci6n en un gen afecta s6Lo a La proteina

codificada por la copia mutante del gen y no a lasproteinas codificadas por algun otro alelo.

• La incapacidad de dos mutaciones para complementarse(producir un fenotipo silvestre cuando se presentan enconfiguraci6n trans en un heterocigoto) significa queforman parte del mismo gen.

Las mutaciones pueden provocar perdidao ganancia de funci6n• Las mutaciones recesivas son provocadas por perdida de

funci6n del producto proteinico.• Las mutaciones dominantes son resultado de una ganancia

de funci6n.• La evaluaci6n de la esencialidad de un gen requiere de una

mutaci6n nula (que elimine por completo su funci6n).• Las mutaciones silenciosas no tienen ningun efecto porque

el cambio de base no altera la secuencia ni la cantidad deproteina, 0 porque el cambio de la secuencia de la proteinano tiene ningun efecto.

• Las mutaciones rezumantes (0 hipomorfas) inciden en lafunci6n del producto del gen, pero no se observan en elfenotipo debido a que prevaLece la actividad suficiente.

Un locus puede tener numerosos alelos mutantesdiferentes• La existencia de varios alelos permite ocurrencia de

heterocigotos con cualquier combinacion en pares de alelos.

Un locus puede tener mas de un alelo de tiposilvestre• Un locus puede tener una distribucion polim6rfica de alelos

sin un aLeLo individual que pueda ser considerado como elunico de tipo silvestre.

La recombinaci6n ocurre por el intercambio fisicode DNA• La recombinaci6n es resultado del entrecruzamiento que

ocurre en los quiasmas e involucra a dos de las cuatrocromatidas.

• La recombinacion se debe a un rompimiento y una reuni6nque tienen Lugar a traves de un intermediario de DNA hibrido.

El c6digo genetico se lee en tri pletes• EL c6digo genHico se lee en tripletes de nucleotidos

denominados codones.• Los tripletes no estan superpuestos y se leen a partir de un

punta fijo de inicio.• Las mutaciones que insertan 0 eliminan bases individuales

provocan un cambio en Los grupos de tripletes despues delsitio de la mutaci6n.

• Las combinaciones de mutaciones que insertan 0 eliminantres bases (0 multiplos de tres), insertan 0 eliminanaminoacidos, pero no cambian La lectura de Los tripletesmas aLla del ultimo sitio de mutacion.

(ada secuencia tiene tres marcos de lectura posibles• Usualmente solo un marco de lectura es traducido y

los otros dos son bloqueados por senales frecuentes determinaci6n.

Los genes procari6ticos son coli nealescon sus proteinas• Un gen procari6tico es un fragmento constante de 3N

nucleotidos que codifica a N aminoacidos.• El gen, el RNAm y la proteina son todos colineales.

Numerosos procesos son necesarios para expresarel producto protelnico de un gen• Un gen procari6tico se expresa por transcripci6n en RNAm

y posteriormente por traducci6n del RNAm en una proteina.• En Las eucariotas, un gen puede contener regiones internas

no representadas en la proteina.• Las regiones internas son eliminadas del transcrito de RNA

por el corte y empaLme de este para dar origen a un RNAmcolineal respecto del producto proteinico.

• (ada RNAm esta formado por una regi6n lider 5' notraducida, una regi6n codificadora y una regi6n posterior 3'no traducida.

Las proteinas actuan en trans, pero los sitios delDNA, en cis• Todos los productos de los genes (RNA 0 protejnas) actuan

en trans; pueden actuar en cualquier copia de un gen en lacelula.

• Las mutaciones de actuacion en cis identifican a lassecuencias de DNA que son el objetivo de reconocimientode los productos de actuaci6n en trans. No se expresancomo RNA ni como proteinas, y afectan s6lo al fragmentocontiguo de DNA.

Resumen

23

gen son las diferentes formas que se encuentran ensu locus.

La clave para comprender la organizacion de losgenes en los cromosomas fue el descubrimiento delligamiento genetico, 0 tendencia de los genes de unmismo cromosoma a mantenerse juntos en la pro­genie, en Lugar de ordenarse de manera indepen­diente, como pronostican las leyes de Mendel. Unavez que se introdujo la unidad de recombinacion(reordenamiento) como medida de vinculacion, fueposible construir mapas geneticos.

La resolucion del mapa de recombinacion deuna eucariota superior esta restringida por 10 re­ducido de la progenie que puede obtenerse de cadacruza. La recombinaci6n es tan poco frecuente en­tre puntos cercanos, que se observa rara vez entremutaciones diferentes del mismo gen. Por ello, enlos mapas de ligamiento clasico de las eucariotas sepuede colocar a los genes en orden, perc no es posi­ble determinar las relaciones en un gen. Al cambiara un sistema microbiano en el cual se puede obteneruna progenie muy numerosa de cada cruza gene­tica, los investigadores pudieron demostrar que larecombinacion ocurre dentro de los genes y que si­gue las mismas reglas que se dedujeron previamentepara la recombinacion entre genes.

En un gen, las mutaciones pueden estar organi­zadas de forma lineaL con 10 cual se demuestra queel gen mismo posee la misma construccion linealque el ordenamiento de genes en un cromosoma, demodo que el mapa genetico es lineal en los loci y en­tre estos: esta formado por una secuencia continuadentro de la cual residen los genes. Esta conclusioncondujo naturalmente a la perspectiva modernaque se resume en la I U A 2. , en la cual se consi­dera que el material genetico de un cromosoma estafarmado por una molecula ininterrumpida de DNAque representa a numerosos genes.

- ...... .. . .• • • ••• AA

EI cromosoma contienenumerosos genes

EI gen es la unidad funcional de la herencia queconstituye una secuencia del genoma cuya funciones dar origen a un producto discreto (ya sea unaprotefna 0 un RNA); su comportamiento basico fuedefinido por Mendel hace mas de un siglo. Resumi­do en sus dos Leyes, el gen fue reconocido como un"factor de partfculas" que se transmite sin cambiosdel progenitor a su progenie. Un gen puede existiren formas alternas que se conocen como alelos.

En los organismos diploides, los cuales tienendos conjuntos de cromosomas, una copia de cadauno de ellos se hereda de cada progenitor, mismocomportamiento exhibido por los genes. Una de lasdos copias de cada gen es el alelo paterno (heredadodel padre), el otro es el materna (heredado de la ma­dre). La equivalencia condujo al descubrimiento deque, de hecho, los cromosomas portan a los genes.

Cada cromosoma consiste en una estructura li­neal de genes. Cada gen reside en una localizacionparticular del cromosoma. La localizacion se conocede manera mas formal como locus. Los alelos de un

III Introducci6n

Un cromosoma es una molecula de DNA muy larga . 00=;;;;;;;;;;;;;;;;;::""

Cada gen es parte deuna secuencia

continua de DNA

11Inicio del gen Final del gen

III Un gen codifica a un solopolipeptido

Conceptos principaLes

• La hip6tesis de un gen : una enzima resume las basesde La geneiica moderna: que un gen es un fragmento

de DNA que codifica a una soLa cadena poLipeptidica.

• La mayorla de las mutaciones deterioran La funci6n deL

gen en el cual se producen.

CATATAAGGTGAGGTAGGATCAGTTGCTCCTCACAATGCGTATATTCCAcrCCATCCTAGTCAAOGAGGAGTGTTACG

GU f Cada cromosoma tiene una sola molecula larga deDNA dentro de La cual se encuentran las secuencias de genesindividuaLes.

Mediante el primer intento sistematico de relacionara los genes con las enzimas se demostr6 que cadaetapa de la ruta metabolica es catalizada par una solaenzima y que puede ser bloqueada por mutaciones enun gen diferente. Esto condujo ala hipotesis de un gen:

24 CAPITULO 2 Los genes codifican proteinas

una enzima. Cada paso metabolico es catalizado poruna enzima especffica cuya produccion es responsabi­lidad de un solo gen. Una mutacion en el gen altera laactividad de la proteina de la cual es responsable.

Para incluir a las proteinas formadas por mas delilla subunidad, es necesario modificar la hipotesis. Silas subunidades son todas iguales, la proteina es un ho­momultimero, y esta representada par un solo gen.Si las subunidades son diferentes, la proteina es un he­teromultimero. Expresada como una regIa mas ge­neral aplicable a cualquier proteina homomultimerica,la hipotesis de un gen : una enzima se manifiesta conmayor precision como un gen : una cadena polipeptfdica.

Identificar que proteina representa a un gen enparticular puede ser tardado jLa mutacion que diolugar a los chfcharos rugosos murantes de Mendelno se identifico sino hasta 1990, como una altera­cion que inactiva al gen que codifica a una enzimaramificadora del almidon!

Es importante recordar que un gen no producedirectamente una proteina. Como se mostro previa­mente en la Figura 1.2, un gen codifica a un RNA,que a su vez puede codificar a una proteina. La ma­yor parte de los genes codifica a las proteinas, peroalgunos codifican moleculas de RNA que no produ­cen proteinas. Dichas moleculas de RNA pueden sercomponentes estructurales del aparato responsablede la sintesis de proteinas, 0 bien, regular la expre­sian genetica. El principio basico consiste en queel gen es una secuencia de DNA que especifica lasecuencia de un producto independiente. El proceso

. . . . ...Homocigoto ~ Heterocigoto de Homocigotode tipo silvestre tipo silvestre/mutante mutante

Ambos aielos Un alelo (dominante) Ninguno de losproducen produce una proteina alelos produceprotefnas activas activa proteinas

flOflO"''''r:J n.n.fllflOe>.

-""""""____ VI

t ttipo silvestre tipo silvestre mutante

tipo silvestre mutante mutante

!no. no. n. r> r:J----

Fenotipo Fenotipo Fenotiposilvestre silvestre mutante

FIGURA 2 2 Los genes codifican proteinas; la dominancia seexplica por las propiedades de las proteinas mutantes. Un alelorecesivo no contribuye al fenotipo debido a que no produce nin­guna proteina (0 produce una proteina que no es funcional).

de la expresion de los genes puede terminar en unproducto que sera RNA 0 proteina.

Una mutacion es un evento aleatorio respeCto dela estructura del gen en el cual es muy probable quese dane, 0 incluso que se suprima, la funcion del gen.Casi todas las mutaciones que afectan el funciona­miento de un gen son recesivas: representan ausenciade funci6n, pues al gen mutante se Ie ha impedido producirsu protefna usual. En la I R 2 se ilustra 1a relacionentre alelos de tipo recesivo y alelos de tipo silvestre.Cuando un heterocigoto contiene un alelo de tiposilvestre y un alelo de tipo mutante, este ultimo essusceptible de regir la produccion de la enzima, y por10 tanto, es dominante. (Esto implica que elunicoalelo de tipo silvestre produce una cantidad adecuadade proteina. Cuando esto es falso, 1a menor cantidadproducida por un alelo, comparada con la de dosalelos, resulta en el fenotipo intermedio de un aleloparcialmente dominante en un heterocigoto.)

III Las mutaciones quese presentan en el mismo genno se pueden complementar

Conceptos principales

• Una mutaci6n en un gen afecta s6lo a la proteinacodificada por la copia mutante del gen y no a lasproteinas codificadas por algOn otro alelo.

• La incapacidad de dos mutaciones para complementarse(producir un fenotipo silvestre cuando se presentan enconfiguraci6n trans en un heterocigoto) significa queforman parte del mismo gen .

LComo determinamos si dos muraciones que provo­can un fenotipo similar se encuentran en el mismogen? Si en e1 mapa estan muy cerca, pueden ser ale­los. Pero tambien podrian representar mutacionesde dos genes diferentes cuyas proteinas estan impli­cadas en la misma funcion. La prueba de comple­mentacion permite determinar si dos muracionesyacen en el mismo gen 0 en genes diferentes. Laprueba consiste en hacer un heterocigoto para las dosmutaciones (apareando a progenitores homocigoti­cos para cada muracion).

Si las mutaciones se encuentran en el mismogen, los genotipos progenitores pueden represen­tarse como:

m] m 2-y-In] m2

El primer progenitor proporciona un alelo mu­tante m] y el segundo, un alelo m

2, por 10 tanto, el

heterocigoto tendra 1a constitucion:

2.3 Las mutaciones que se presenta n en el mismo gen no se pueden complementar 2S

MUTACIONES EN EL MISMO GEN

. . .

No se observa ningun gen de tipo silvestre, por 10tanto, el heterocigoto tiene un fenotipo mutante.

Si la mutacion yace en genes diferentes, los ge-notipos progenitores pueden representarse como:

m l + +m2-y-m1+ +m

2

Cada cromosoma tiene una copia tipo silvestrede un gen (representada por el signa mas) y unacopia mutante del otro, de modo que la constituciondel heterocigoto sera:

m1++m

2

en la cuallas dos progenitores han proporcionadouna copia de tipo silvestre de cada gen. El heteroci­goto tiene el fenotipo silvestre, de modo que se diceque los dos genes se complementan.

La prueba de la complementacion se describemas ampliamente en la FI ? ". La basica consisteen la comparacion que se muestra en la parte supe­rior de la figura. Si dos mutaciones se encuentranen el mismo gen, se observa una diferencia en losfenotipos de la configuracion trans y de la configura­cion cis. La configuracion trans es mutante, pues cadaalelo tiene una mutacion (difereme). Sin embargo,la configuracion cis es de tipo silvestre, debido a queun alelo tiene dos mutaciones y el otro, ninguna.En la parte inferior de la figura se muestra que si lasdos mutaciones se encuentran en genes diferentes,

siempre se observara un fenotipo silvestre. Siemprehay un alelo de tipo silvestre y un alelo mutante decada gen, y la configuracion no tiene importancia.La incapacidad para complementar significa que dosmutaciones son parte de la misma unidad genetica.Se dice que las mutaciones que no se complementanforman parte del mismo grupo de complementa­cion. Otro termino utilizado para describir a la uni­dad definida porIa prueba de complememacion escistron, que significa 10 mismo que gen. Basicamen­te estos tres terminos describen a un fragmento deDNA que funciona como una unidad que dara lugara un RNA 0 un producto protefnico. Las propiedadesdel gen respecto de la complementacion se explicanpor el hecho de que este producto es una molecula(mica que se comporta como una unidad funcional.

• Las mutaciones recesivas son provocadas por perdidade funci6n del producto proteinico.

• Las mutaciones dominantes son resultado de unaganancia de funci6n.

• La evaluaci6n de la esencialidad de un gen requiere de una

mutaci6n nula (que elimine por completo su funci6n).

• Las mutaciones silenciosas no tienen ningun efectoporque el cambio de base no altera la secuencia ni

la cantidad de proteina, 0 porque el cambio de la

secuencia de la proteina no tiene ningun efecto .

• Las rnutaciones rezumantes (0 hipomorfas) afectan a lafunci6n del producto del gen, pero no se observan en

el fenotipo porque queda actividad suficiente.

Conceptos principales

lit Las mutaciones puedenprovocar perdida 0 gananciade funci6n

configuraci6n cisconfiguraci6n trans

R oJ El cistr6n se define mediante la prueba de complemen-taci6n. Los genes estan representados por espirales; los asteriscosrojos identifican a los sitios de mutaci6n.

Los diversos efectos posibles de las mutacionesen un gen se resumen en la r

Cuando un gen ha side identificado, en principiose puede !legar a conacer su funcion produciendoun organismo mutante que carezca completamentedel gen. Una mutacion que elimina por completo lafuncion de un gen,normalmente porque el gen hasido eliminado, se llama mutacion nula, y si el genes esencial, la mutacion nula es letal.

Para determinar el efecto del gen en el fenoti­po, es fundamental caracterizar a un mutante nulo.Cuando una mutacion no afecta al fenotipo, siem­pre cabe la posibilidad de que se trate de una muta­cion rezumante, es decir, se produce una cantidadsuficiente de producto activo para que cumpla consu funcion, aunque la actividad se reduce cuantita­tivamente 0 es cualitativamente diferente del tiposilvestre. Sin embargo, si una mutacion nula noafecta al fenotipo, se puede conduir con toda segu­ridad que la funcion del gen no es necesaria.

tipo silvestre

mutante 2

~~ mutantedoble

t tVVVV VVifV Un gen es de\1' I'",/V VVVV tipo silvestre

~ ~ Fenotipo silvestre

~ ~ tiposilvestremutante 2

tipo silvestre

mutante 1

mutante 1

MUTACIONES EN GENES DIFERENTES (configuraci6n trans)

~VVVVVVVV

~

Sin complementaci6nFenotipo mutante

Complementaci6n(fenotipo silvestre)

Una copia de cadagen es de tipo silvestre

26 CAPITULO 2 Los genes codifican proteinas

Concepto principal

• La existencia de aLeLos muLtiples permite que los heterocigotosrepresenten cuaLquier combinaci6n en pares de aLeLos.

Un locus puede tener numerososalelos mutantes diferentes

Si se produce una mutacion recesiva por cada cambioque impide la produccion de una protefna activa enun gen, debe haber gran numero de dichas mutacio­nes en cualquier gen. Numerosos remplazos de ami­noacidos pueden cambiar la estructura de la proteina10 suficiente como para impedir su funcion.

Las diferentes variantes del mismo gen se lla­man alelos multiples, y su existencia permite lacreacion de un heterocigoto entre alelos mutantes.La relacion entre estos alelos multiples asume di­versas farmas.

En el caso mas sencillo, un gen de tipo silvestrecodifica a un producto proteinico funciona!. EI alelomutante, 0 los alelos mutantes, codifica(n) protei­nas que no son funcionales.

Sin embargo, con frecuencia se presentan casosen que una serie de alelos mutantes tiene fenotiposdiferentes. Por ejemplo, la funcion de tipo silvestre dellocus blanco de la Drosophila melanogaster es necesariapara el desarrollo del color rojo normal de los ojos. EIlocus recibe su nombre segun el efecto de mutaciones(nulas) extremas, las cuales provocan que la moscatenga ojos blancos en homocigotos mutantes.

Para describir a los alelos mutantes y a los de tiposilvestre, el genotipo silvestre se indica mediante unsuperindice "mas" (+) despues del nombre del locus(w es el alelo silvestre para los ojos [rojos] de la D.melanogaster). En algunos casos se utiliza el simbolo+ para describir el alelo de tipo silvestre, y solo losalelos mutantes se indican con el nombre del locus.

Una forma completamente defectuosa del gen (0ausencia de fenotipo) suele indicarse mediante un su­perindice "menos" (-). Para poder distinguir entre unavariedad de alelos mutantes con efeetos diferentes,pueden utilizarse on'os superindices, como Wi 0 wa.

El alelo w es dominante respecto de cualquieraotro en los heterocigotos. Hay muchos aIelos mutan­tes diferentes; una muestra (pequefia) se ilustra enla

GURA 2 5. Si bien algunos alelos carecen de color deojos, muchos otros producen algllD color, de modoque cada uno de estos alelos mutantes representarauna mutacion diferente del gen, la cual no eliminapor completo su funcian, sino que deja una actividadresidual que produce un fenotipo caracteristico. Enun homocigoto, estos aielos son denominados por elcolor de los ojos. (La mayoria de los alelos wafectanla cantidad de pigmento del ojo. Los ejemplos de lafigura estan organizados [mas 0 menos] en ordendescendente de cantidad de color, pero otros, comoel w SP, afectan el patron en el cual es depositado.)

Cuando existen muchos alelos, un animal pue­de ser un heterocigoto que porte dos alelos mutantesdiferentes, y su fenotipo dependera de la naturalezade la actividad residual de cada alelo. En principio,la relacion entre dos alelos mutantes no difiere de laque se observa entre los alelos mutantes y los de

Una mutaci6n puntualpuede dafiar la funci6n

~Y/

!

•Una mutaci6n puntual puedecrear una nueva funci6n

WJW\.YAU~.,

Una mutaci6n nula noproduce protefnas

WJW\.'YAU

!

Una mutaci6n silenciosano afecta a la proteina

WJ\U\1lJ\U

!~

EI gen de tipo silvestre codifica a una protefna

'WA.YM7\JU~

~

FIGURA 2.' Las mutaciones que no afectan a la secuencia 0

a La funci6n de La proteina son siLenciosas, en tanto que lasmutaciones que eLiminan toda La actividad de la proteina sonnulas. Las mutaciones puntuales que provocan perdida de lafuncion son recesivas, a diferencia de las que provocan ganan­cia de la funcion, que son dominantes.

Las mutaciones nulas, u otras mutaciones queimpiden la funcion del gen (pero que no necesa­riamente la eliminan por completo) se denominanmutaciones de perdida de funcion (0 amorfas).Una mutacion de perdida de funcion es recesiva(como en el ejemplo de la Figura 2.2). En ocasiones,una mutacion tiene el efeeto opuesto y provoca queuna proteina adquiera una nueva funcion; dichocambio es conocido como mutacion de gananciade funcion, la cual es dominante.

No todas las mutaciones del DNA provocancambios detectables en el fenotipo; aquellas sin unefecto aparente se conocen como mutaciones si­lenciosas, las cuales pueden ser de dos tipos; unode eUos implica cambios de bases en el DNA queno provocan ningllD cambio en el aminoacido de laproteina correspondiente, en tanto que el segundo,cambia al aminoacido, perc el remplazo en la pro­teina no afecta a su actividad; a estas sustitucionesse les llama neutrales.

2.5 Un locus puede tener numerosos alelos mutantes diferentes 27

transferasa A

'-Yi\.W\."VJ\:.Y/gen A

Gal~1-R2 Delecion 2J. cambios de aminoacidos

FJ.1 antigeno 0

uca. gen B

'-'YA.YA.YlVUtransferasa B

Gala.1

. ~: ~ antigeno B ~al~1-R

iFuca.1

Alelo Fenotipo del homocigoto

w+ ojos rojos (fenotipo silvestre)Wbl sangre~h cerezawbf gamuzawh mielwe albaricoquewe eosinawi marfilWZ cascara de limon (amarillo limon)If'fP moteado, el color variaw1 blanco (sin color)

Ellocus w tiene una serie extensa de alelos cuyosfenotipos van del color de tipo silvestre (rojo) a la ausenciatotal de pigmento.

tipo silvestre: un alelo puede ser dominante, puedehaber dominancia parcial, 0 codominancia.

..................GaiNAca1

J,.

antfgenoA aa'~1-R2i

Fuca.1

t

III Un locus puede tener masde un alelo de tipo silvestre

Fenotipo

oABAB

Genotipo

00AOoAABOo BBAB

Actividad

NingunaN-Ac-gal transferasaGal transferasaGaIN-Ac-Gal-transferasa

Concepto principal

• Un locus puede tener una distribuci6n polim6rfica dealelos sin un alelo individual que pueda ser consideradocomo el unico de tipo silvestre.

No necesariamente hay un solo tipo de alelo silves­tre en un locus especffico, por ejemplo, el controldel sistema del grupo sangufneo. La falta de fun­cion es representada por el tipo nulo, 0 grupo O. Noobstante, los alelos funcionales A y B proporcionanactividades codominantes entre sf y dominantesrespecto del grupo O. Las bases de esta relacion seilustran en la F G A 2 6.

El antfgeno 0 (0 H) se genera en todos los indivi­duos. y consiste de un grupo carbohidrato particularque se agrega a las protefnas. Ellocus ABO codificaa una enzima galactosil-transferasa que agrega otrogrupo de azucar al antfgeno O. La especificidad deesta enzima determina el grupo sangufneo. EI alelo Ada lugar a una enzima que utiliza el cofactor UDP-N­acetilgalactosa y crea el antfgeno A. EI alelo B produ­ce una enzima que utiliza el cofactor UDP-galactosay crea el antfgeno B. Las versiones A y B de la pro­tefna transferasa difieren en matro aminoacidos quepresumiblemente afectan su reconocimiento del tipode cofactor. El alelo 0 tiene una mutacion (delecionpequefia) que elimina la actividad, de modo que enel antfgeno 0 no hay modificaciones.

Esto explica porque los alelos A y B son domi­nantes en los heterocigotos AO y BO: la actividad

28 CAPITULO 2 Los genes codifican proteinas

FIGURA 2.6 El locus del grupo sanguineo ABO codifica a lagalactosiltransferasa cuya especificidad determina el gruposanguineo.

transferasa correspondiente crea el antfgeno A 0 elB. Los alelos A y B son codominantes en los hete­rocigotos AB debido a que ambas actividades trans­ferasa estan expresadas. EI homocigoto 00 es nuloy no tiene ninguna actividad, por 10 tanto, carecede ambos antfgenos.

Ni A ni B pueden ser considerados unicamentecomo de tipo siJvestre porque representan actividadesalternativas, mas que perdida 0 ganancia de funcion.Una situacion como esta, en la que hay multiples ale­los funcionales en una poblacion, se describe comopolimorfismo (vease la seccion 4.3, Los genomasill.dividuales muestran una variacion extensa).

III La recombinaci6n ocurrepor intercambio fisico de DNA

Conceptos principales

• La recombinaci6n es resultado del entrecruzamiento

en los quiasmas e involucra a dos de las cuatrocromatidas.

• La recombinaci6n ocurre por rompimiento y reuni6n,que tienen lugar a traves de un intermediario de DNA

hibrido.

Recombinaci6n intermedia

Moleculas de DNA progenitor

. ...A BA B

a ba b

~AA

aa

::1 quiasma~s provocado porantrecruzamiento entre dos.e las cromatidas

Dos cromosomas siguen siendoos progenitores (AB y ab).-os cromosomas recombinantes ~~~~~~~~contienen material de cadaorogenitor y tienen nuevas ~ ~~~~~~~ombinaciones geneticas (Ab yaB).

_ bivalente:ontiene 4 cromatidas,2: de cada progenitor

r J A 2" La formaci6n del quiasma es responsable de la-roducci6n de recombinantes.

=-a recombinacion genetica describe la generacionde combinaciones nuevas de alelos en cada gene­::-acion de organismos diploides. Las dos copias de(ada cromosoma pueden tener diferentes alelos enalgunos loci. Intercambiando las partes correspon­dientes entre los cromosomas. se pueden generarcromosomas recombinantes diferentes de los cro­mosomas progenitores.

La recombinacion resulta de un intercambio fi­ico de material cromosomico. fenomeno visible en

el entrecruzarniento que ocurre durante la meiosisdivision especializada por la que se producen las ce­

luJas gerrninales haploides). La meiosis empieza conuna celula que ha duplicado sus cromosomas, de talforma que posee cuatro copias de cada uno. En lasprimeras etapas de la meiosis, esas cuatro copias estanfntimamente relacionadas (en sinapsis) en una estruc­tura llamada bivalente. En esta etapa. cada unidadcromosornica se denomina cromatida. Los intercam­bios en pares de material ocurren entre cromaridas.

EI resultado visible de un evento de entrecruza­rniento se denomina quiasma, y se Hustra a manerade diagrama en la u . Un quiasma es un sitioen el que dos de las cromatidas de un bivalente sehan rota en los puntos correspondientes. Los extre­mos rotos se han reunido de forma entrecruzada, ge­nerando nuevas cromatidas. Cada cromatida nuevaesta formada por material proveniente de una cro­matida de un lado del punto de union y por materialproveniente de la otra cromatida en ellado opuesto.Las dos cromaridas recombinantes poseen estructurasrecfprocas. El evento se define como rotura y re­union. Su naturaleza explica porque un solo eventode recombinacion puede producir solo el 50% de re­combinantes: cada evento de recombinacion involu­cra solo dos de las cuatro cromaridas asociadas.

Recombinantes

La recombinaci6n implica el apareamiento entre lascadenas complementarias de dos dOplex de DNA progenitores.

La complementariedad de las dos cadenas deDNA es esencial para el proceso de recombinacion.Cada una de las cromaridas que se muestran enla Figura 2.7 consiste en un larguisimo duplex deDNA. Para que estas se rompan y reconecten sinperdida de material. se requiere de un mecanismoque reconozca exactamente las posiciones corres­pondientes, 10 cual sucede gracias al apareamientocomplementario de bases.

La recombinacion implica un proceso en el cuallas cadenas individuales de la region de entrecru­zamiento intercambian parejas. En la semuestra que este evento da lugar a un fragmentode DNA hibrido, en el cualla cadena individualde un duplex se aparea con su complemento prove­niente del otro duplex. Por supuesto. el mecanismoinvolucra otras etapas (las cadenas deben rompersey resellarse) que se analizaran en detalle en el Capi­tulo 20. Sistemas de reparacion. pero la caracteristicacrucial que hace posible ]a recombinacion exacta esla complementariedad de las cadenas de DNA. Lafigura muestra solo algunas etapas de la reaccion.pero podemos observar que en ]a recombinacionintermedia se forma un fragmento de DNA hfbridocuando una sola cadena cruza de un duplex a otro.Cada recombinante esta formado por un duplex deDNA progenitor dellado izquierdo, el cual esta co­nectado por un fragmento de DNA hfbrido a] otroduplex progenitor dellado derecho. Cada duplex de

2.7 La recombinaci6n ocurre por intercambio fisico de DNA 29

DNA corresponde a una de las cromatidas implicadasen el proceso de recombinacion de la Figura 2.7.

La formacion del DNA hfbrido exige que las se­cuencias de los duplex recombinantes se encuentren10 suficientemente cerca como para lograr el aparea­miento entre las cadenas complementarias. Si no haydiferencias entre los dos genomas progenitores enesta region, la formacion de DNA hfbrido sera perfec­ta. Sin embargo, la reaccion puede ser tolerada auncuando haya diferencias diminutas, en cuyo caso, elDNA hfbrido tiene puntos de apareamiento erroneo,en los cuales una base de una cadena confronta a unabase de la otra cadena que no es complementaria.La correccion de dichos errores de apareamiento esotra caracteristica de la recombinacion genetica (vea­se Capitulo 20, Sistemas de reparacion).

III El c6digo genetico se leeen tripletes

Conceptos principales

• El c6digo genetico se lee en tripletes de nucle6tidosdenominados codones.

• Los tripletes no estan superpuestos y se leen a partirde un punta fijo de inicio.

• Las mutaciones que insertan 0 eliminan basesindividuales provocan un cambio en los grupas detripletes despues del sitio de la mutaci6n.

• Las combinaciones de mutaciones que insertan 0

eliminan a tres bases en conjunto (0 en multiplosde tres) insertan 0 eliminan aminoacidos, pero nocambian la lectura de los tripletes mas alla del ultimositio de mutaci6n.

Cada gen representa una cadena proteinica especf­fica. El concepto de que cada protefna esta formadapar una serie de aminoacidos en particular, data de lacaracterizacion de Sanger de la insulina, de la decadade 1950. El descubrimiento de que un gen esta for­mado par DNA dio lugar a la interrogante de comouna secuencia de nucleotidos del DNA represen­ta una secuencia de aminoacidos en las protefnas.

Una caracteristica clave de la estructura generaldel DNA es que es independiente de la secuencia parti­cular de los nucleatidos que la componen. La secuenciade nucleotidos del DNA es importante no por suestructura per se, sino porque codifica a la secuenciade aminoacidos que constituye al polipeptido co­rrespondiente. La relacion entre una secuencia deDNA y la secuencia de la protefna correspondientese denomina codigo genetico.

La estructura y la actividad enzimatica de lasproteinas se deben a su secuencia primaria de ami­noacidos, que al ser determinada en cada una, elgen puede transportar toda la informacion necesa­ria para especificar una cadena polipeptidica aeti-

30 CAPITULO 2 Los genes cadifican proteinas

va. De esta manera, un solo tipo de estructura -elgen- es susceptible de representarse a sf mismo eninnumerables formas de polipeptidos.

En conjunto, los diversos productos proteinicosde una celula asumen las actividades catalfticas yestructurales responsables de establecer su fenoti­po. Obviamente, ademas de las secuencias que co­difican a las protefnas, el DNA tambien contieneciertas secuencias cuya funcion es ser reconocidaspor moleculas reguladoras, usualmente proteinas.En este caso, la funcion del DNA es determinadadirectamente por su secuencia, no a traves de uncodigo intermediario. Ambos tipos de region, losgenes expresados como protefnas y las secuenciasreconocidas como tales, constituyen la informaciongenetica.

El codigo genetico es descifrado por un meca­nismo complejo que interpreta las secuencias de losacidos nucleicos, el cual es esencial si la informaciontransportada en el DNA tiene que tener algun signi­ficado. En una region dada, solo una de las dos ca­denas de DNA codifica a una protefna, por 10 tanto,el codigo genetico se representa como una secuen­cia de bases (mas que como pares de bases).

El codigo genetico se lee en grupos de tres nu­cleotidos, cada uno de los cuales representa a unaminoacido; cada secuencia de tres nucleotidos sedenomina codon. Un gen incluye una serie de co­dones que se lee de forma secuencial desde un pun­to de partida de un extremo hasta un punto final, enel otro extremo. Escrita en la direccion convencio­nal 5' a 3', la secuencia de nucleotidos de la cadenade DNA que codifica a la proteina corresponde a lasecuencia de aminoacidos de la proteina escrita determinal N hasta terminal C.

El codigo genetico se lee en tripletes no superpues­tos a partir de un punto fijo de inicio:

• No superpuestos implica que cada codonesta formado par tres nucleotidos y que loscodones sucesivos estan representados portrinucleotidos sucesivos.

• El uso de un punta fijo de iniciacian significaque el ensamblaje de una proteina debe co­menzar en un extremo y avanzar hacia elotro, de manera que las diferentes partesde la secuencia codificadora no puedan serlefdas de manera independiente.

La naturaleza del codigo pronostica que dos tipos demutaciones tendran efeetos cliJerentes. Si una secuen­cia en particular se lee de forma secuencial como:

UUU AAA GGG CCC (codones)aa1 aa2 aa3 aa4 (aminoacidos)

entonces una mutacion puntual afectara. solo a unaminoacido. Por ejemplo, la sustitucion de una Apor cualquier otra base (X) provoca que aa2 searemplazado por aa5:

Mutante doble C- ~:=:J GCU GCU AGC UGC UGC UCU GCU GCUrz:

A a la Ser Cys Cys Ser Ala Ala

Mutante triple C- C- C-:=:J GCU GCA UGC UGC AUG CAU GCU GCUC

Ala Ala Cys Cys Met His Ala Ala

UUU AAX GGG CCC

aal aa5 aa3 aa4

porque solo el segundo codon ha sufrido cambios.Sin embargo, una mutaci6n que inserta 0 elimina

una sola base cambiara a los grupos de tripletes de toda lasecuencia subsiguiente. Un cambio de este tipo se lla­ma desplazantiento del marco de lectura. Unainsercion puede asumir la siguiente forma:

UUU AAX AGG GCC Caal aa5 aa6 aa7

Debido a que la nueva secuencia de tripleteses completamente diferente a la antigua, la secuenciacompleta de aminoclcidos de la protefna se modificaa partir del sitio de la mutacion, de modo que esprobable que la funcion de la protefna se pierda porcompleto. Las mutaciones de cambio del marco delectura son inducidas por las acridinas, compuestosque se unen al DNA y que distorsionan la estructu­ra de la doble helice, provocando la incorporacionde bases adicionales 0 la omision de bases duranteel proceso de replicacion. Cada evento mutagenicoprovocado por una acridina resuIta en la adicion 0

eliminacion de un solo par de bases.Si se produce un mutante de acridina por, diga­

mos, la adici6n de un nucleotido, este debe regresaral tipo silvestre por la delecion de dicho nucleotido.Sin embargo, la reversion tambien puede ser provo­cada por delecion de una base diferente en un sitiocercano al primero. Las combinaciones de dichas

Concepto principal

• En general, solo un marco de lectura es traducido, los OtTOSdos son bloqueados por senales frecuentes de terminacion.

mutaciones proporcionan evidencias reveladorasreferentes a la naturaleza del codigo genetico.

En la se ilustran las propiedades delas mutaciones de cambio del marco de lectura. Unainsercion 0 una delecion cambia la secuencia com­pleta de la protefna despues del sitio de la mutacion,pero la combinacion de una insercion y una delecionhace que el codigo se lea de forma incorrecta soloentre los dos sitios de mutacion; la lectura correctase restablece despues del segundo sitio.

En 1961, mediante el analisis genetico de las mu­taciones por acridina en la region rII del fago T6 sedemostro que todas las mutaciones podrian ser cla­sificadas en uno de dos grupos descritos como (+) 0

(-). Cada tipo de mutacion provoca por sf misma uncambio en el marco de lectura: el tipo (+) por adicionde una base y el tipo (-) por delecion de una base. Lascombinaciones de mutantes dobles de los tipos (++) Y(- -) siguen mostrando un comportamiento mutan­te, pero las combinaciones de los tipos (+ -) 0 (- +)

se suprimen una a la otra. En este caso, la segundamutacion se describe como supresora del cambioen el marco de lectura de la primera mutacion.(En el contexto de este trabajo, la palabra "supresOI"se utiliza en un sentido inusual porque la segundamutacion esta en el mismo gen que la primera.)

Estos resultados muestran que el codigo geneticodebe ser lefdo como una secuencia establecida pOI elpunto de iniciacion, de modo que las adiciones 0 lasdeleciones se compensan mutuamente, mientras quelas adiciones 0 las deleciones dobles siguen siendomutantes. De cualquier forma, estos hallazgos no re­velan cuantos nucleotidos constituyen cada codon.

Cuando se construyen mutantes triples, solo lascombinaciones (+++) y (- - -) muestran el fenoti­po silvestre, mientras que las otras siguen siendomutantes. Si se considera que tres adiciones 0 tresdeleciones corresponden respectivamente a la adi­cion 0 la omision global de un solo aminoacido, estoimplica que el codigo se lee en tripletes. Entre losdos sitios de mutacion hay una secuencia incorrectade aminoacidos, mientras que a cada lado de lossitios de mutacion las secuencias siguen siendo detipo silvestre, como se indica en la Figura 2.9.

III (ada secuencia tiene tresmarcos de lectura posibles

Secuencia mutanteSecuencia de tipo silvestre

Las mutaciones de cambia del marco de lecturamuestran que el codigo genetico se lee en tripletes desde unpunta fijo de inicio.

Si el codigo genetico se lee en tripletes no superpues­tos, son tres las formas posibles de traducir cualquier

2.9 (ada secuencia tiene tres marcos de lectura posibles 31

secuencia de nucleotidos en protefnas, dependiendodel punto de iniciacion; a dichas secuencias se lesllama marcos de lectura. Para la secuencia

ACGACGACGACGACGACG

los tres marcos de lectura posibles son

ACG ACG ACG ACG ACG ACG ACGCGACGACGACGACGACGACGAGAC GAC GAC GAC GAC GAC GAC

Los genes procari6ticos soncoLineales can sus protelnas

Conceptos principales

• Un gen procari6tico es un fragmento constante de 3Nnucle6tidos que codifica a N aminoacidos.

• El gen, el RNAm y la protelna son todos colineales.

J Un marco de lectura abierto empieza con AUG y continuaen tripletes hasta un cod6n de terminaci6n. Los marcos de lecturabloqueados pueden ser interrumpidos con frecuencia por codones determinaci6n.

Un marco de lectura que consta exclusivamentede tripletes que representan a aminoacidos, se llamamarco de lectura abierto u 0 RF (open reading fra­me). Una secuencia que se traduce en una protefnatiene un marco de lectura que empieza con un co­don de iniciacion especial (AUG) y que posterior­mente se extiende a traves de una serie de tripletesque represeman a aminoacidos, hasta terminar enuno de los tres tipos de codones de terminacion(vease el Capftulo 7, El RNA mensajero).

Cuando un marco de lectura no puede ser tra­ducido en protefna porque con frecuencia se pre­seman codones de terminacion, se dice que establoqueado. Si una secuencia esta bloqueada en lostres marcos de lectura, no puede tener la funcion decodificar a una protefna.

Cuando se obtiene la secuencia de una region deDNA de funcion desconocida, se analiza cada marcode leetura posible para determinar si esta abierto 0

bloqueado. Normalmente, no mas de uno de los tresmarcos de lectura posibles esta abierto en un solofragmento de DNA. En la r se muestra elejemplo de una secuencia que puede leerse en soloun marco de lectura debido a que los marcos de lec­tura alternativos estan bloqueados por codones determinacion frecuentes. Es poco probable que porcasualidad exista un marco de lectura largo y abier­to; si no se tradujera en una protefna, no habrfa pre­sion selectiva para evitar la acumulacion de codonesde terminacion, de modo que la identificacion de unmarco de lectura largo y abierto se considera comoevidencia en primera instancia de que la secuencia setraduce en proteina en dicho marco. Un ORF parael cual no se ha identificado un producto protefnicosuele denominarse marco de lectura no identificado(URF, unidentified reading frame).

EI segundo marco de lecturaesta bloqueado

EI tercer marco de lecturaesta bloqueado

Comparando la secuencia de nucleotidos de un gencon la secuencia de aminoacidos de una protefna,podemos determinar directamente si el gen y laprotefna son colineales; esto es, si la secuencia denucleotidos del gen corresponde exactamente a lasecuencia de aminoacidos de la protefna. En las bac­terias y sus virus hay una equivalencia exacta, cadagen contiene un fragmento continuo de DNA cuyalongitud es directamente proporcional al numero deaminoacidos de la protefna que representa. Es ne­cesario un gen de 3N pares de bases (bp, base pairs)para codificar una protefna de N aminoacidos, deacuerdo con el codigo genetico.

La equivalencia del gen bacteriano y su produc­to significa que un mapa ffsico de DNA correspon­ded exactamente a un mapa de aminoacidos de laprotefna. (,Que tan bien se acoplan estos mapas conel mapa de recombinacion?

El paralelismo del gen y la protefna se investigooriginalmente en el gen de la triptofano sintetasade E. coli. La distancia genetica se valoro a traves delporcentaje de recombinacion entre mutaciones, entanto que la distancia de la protefna se midio pormedio del numero de aminoacidos que separaban alos sitios de remplazo. En la l se comparanambos mapas. El orden de siete sitios de mutacion esel mismo que el orden de los sitios correspondien­teS a los remplazos de aminoacidos, y las distanciasde recombinacion son relativamente similares a lasdistancias reales de la proteina. El mapa de recom­binacion amplfa las distancias entre algunas muta­ciones, pero por 10 demas, la distorsion del mapa derecombinacion es escasa, respecto del mapa fisico.

El mapa de recombinacion hace ver dos puntosgenerales acerca de la organizacion del gen. Muta­ciones diferentes pueden provocar que un amino­acido de tipo silvestre sea remplazado por sustitutosdiferentes. Si dos de estas mutaciones no puedenrecombinarse, deben involucrar mutaciones pun­tuales diferentes en la misma posicion del DNA. Silas mutaciones pueden separarse en el mapa gene­tico, pero afectan al mismo aminoacido en el mapasuperior (las lineas comunicantes convergen en lafigura) , deben implicar a mutaciones puntuales enposiciones diferentes que afectan al mismo amino­acido debido a que la unidad de recombinacion ge-

32 CAPiTULO 2 Los genes codifican protelnas

.. .. ~ . . . ... . .. ~ ~ ... . .. - . .-. ~,

Conceptos principales

netica (en realidad 1 bp) es mas pequena que la uni­dad que codifica al aminoacido (en realidad 3 bp).

IGUR El mapa de recombinacion del gen de la tripto-fano sintetasa corresponde a la secuencia de aminoacidos dela proteina.

EI DNA esta formado par dos cadenas apareadas por medio de bases

cadena superior5' ATGCCGTIAGACCGTIAGCGGACCTGAC3' TACGGCAATCTGGCAATCGCCTGGACTG

tcadena inferior

Sfntesisde RNA

5'AUGCCGUUAGACCGUUAGCGGACCUGAC3

EI RNA tiene la misma secuencia que la cadena superior de DNA;es complementaria a la cadena inferior de DNA

El RNA se sintetiza utilizando una cadena de DNAcomo molde para el apareamiento complementario de las bases.

mente, para sintetizar protefna (como se 0 bservaen detalle en el Capftulo 7, El RNA mensajero).

El RNA mensajero se sintetiza por el mismoproceso de apareamiento complementario de basesutilizado para replicar el DNA, con la importantediferencia de que corresponde solo a una cadena delDNA de doble helice. En la se muestraque la secuencia del RNAm es complementaria dela secuencia de una cadena de DNA y que es icten­tica (excepto por el remplazo de T por U) ala otracadena de DNA. La forma convencional de escribirlas secuencias del DNA implica que la cadena dearriba vaya en direccion 5'~ 3', con la secuenciaigual a la del R A.

El proceso por el cual un gen da lugar a unaprotefna se llama expresion genica, que en lasbacterias consta de dos etapas. La primera etapaes la transcripcion, durante la cual se produceuna copia de RNAm de una cadena del DNA, entanto que la segunda es la traduccion del RNAmen una protefna. Mediante este proceso se lee entripletes la secuencia de un RNAm para originarla serie de aminoacidos que crea a la protefna co­rrespondiente.

Un RNAm incluye a una secuencia de nucleo­tidos que corresponde ala secuencia de aminoaci­dos de la protefna; esta parte del acido nucleico seconoce como region codificadora. Sin embargo,el RNAm incluye secuencias adicionales en ambosextremos, las cuales no representan directamentea una protefna. La region 5' no traducida se llamalider, en tanto que a 1a region 3' no traducida se 1econoce como remolque.

El gen incluye la secuencia completa represen­tada en el RNA mensajero. Ocasionalmente, lasmutaciones que impiden la funcion del gen se en­cuentran en las regiones adicionales no codificado­ras, con 10 cual se confirma la perspectiva de quedichas regiones comprenden una parte legftima dela unidad genetica.

Las mutaciones puedenestar separadas, perc afectana la misma posicion

Glu Proteina

@@! @)

I II I

Ty.: r :: :QII II I~

: de tipo silvestre :: : :: ::I 111 I' IIt Mapa de a.miriOacido " 'e la 'rotina

1 : i I : I ~\

: ,': : ~: ~\:-Distancia entre ml.ltacion~s ---i\\I II' 'II 1\\

~Mapader~(;ombin "iO' de": '"

I II I III

'@111111V Proteina mutante Cis: II :: v

I I II, "

GI Ar :,

Mutaciones diferentesen la misma posicion

• Un gen procariotico se expresa por transcripcion enRNAm y posteriormente por traduccion del RNAm en

una proteina.

• En las eucariotas, un gen puede contener regionesinternas no representadas en la proteina.

• Las regiones internas son eliminadas del transcrito deRNA por el corte y empalme de este para dar origen a

un RNAm colineal respecto del producto proteinico.

• Cada RNAm esta formado par una region lider 5'no traducida, una region codificadora y una regionposterior 3' no traducida.

Al comparar un gen y una protefna se trata solocon la secuencia de DNA ubicada entre los puntoscorrespondientes a los extremos de la protefna. Sinembargo, un gen no se traduce directamente a unaprotefna, se expresa mediante la produccion de unRNA mensajero (RNAm, messenger RNA), que esun acido nucleico intermedio utilizado, efectiva-

fill Numerosos procesos sonnecesarios para expresar elproducto proteinico de un gen

2.11 Numerosos procesos son necesarios para expresar el producto proteinico de un gen 33

RNAm

.. ~ ..Ex6N 1 Ex6N 2

~INTR6NI\) ¥/

!

RNAl

5' V. /\. 3'

f Ribosoma

\ (TradUCCion )

~

. ... .

DNA

CITOPLASMA

La expresi6n de un gen es un proceso que sucedeen multiples etapas.

NUCLEO

5' ~~INTR6NVV 3'

pre-RNAm

l1NTR6N r~ (--c-or-te-y-e-m-p-al--':'m-e)

5'~ ~

Protefna

.. -:. .

Transcripcion

Traduccion

RNA

-- EI ribosoma traduce al RNAm

DNA

Region Ifder ~ Remolque5'V V 3' RNA

I I I

La longitud del RNA define a la region del gen

~N~C Proteina

I I I

La proteina define a la region codlficadora

El gen puede ser mas largo que la secuencia quecodifica a la proteina.

En las bacterias, la transcripci6n y la traducci6n ocurrenen el mismo compartimiento.

En la se ilustra esta situacion, en lacual se considera que el gen comprende un frag­mento continuo de DNA necesario para produciruna proteina en particular; incluye la secuenciacodificadora para dicha proteina, pero tambien se­cuencias a ambos lados de la region codificadora.

Una bacteria esta formada por un solo compar­timiento, de modo que la transcripcion y la traduc­cion ocurren en el mismo lugar, como se Hustra enla . En las eucariotas, la transcripci6ntiene lugar en el nucleo, no obstante, el productode RNA debe ser transportado al citoplasma para sertraducido. En los genes mas simples de las eucario­tas (igual que en las bacterias), el RNA transcritoes de hecho el RNAm. Sin embargo, para los genesmas complej os, el transcrito inmediato del gen esel pre-RNAm, que requiere de cierto procesa­miento para generar al RNArn maduro. Las etapasbasicas de la expresion genica de una eucariota sebosquejan en la Este proceso resulta en

una separaci6n espacial entre la transcripci6n (en elnucleo) y la traduccion (en el citoplasma).

La etapa mas importante del procesarniento es elcorte y empalme del RNA. Numerasos genes de laseucariotas (y casi todos los de las eucariotas superio­res) contienen regiones internas que no codifican pro­teinas. En el proceso de corte y empalme se eliminanestas regiones del pre-RNArn para generar un RNAcon un marco de lectura abierto y continuo (vease laFigura 3.1). Otras eventos procesadores que ocurrenen esta etapa implican la modificaci6n de los extremos5' y 3' del pre-RNAm (vease la Figura 7.16).

La traducci6n tiene lugar mediante un complejomecanismo que incluye tanto protefnas como com­ponentes de RNA. La "maquina" que se encarga delproceso es el ribosoma, un gran complejo que incluyealgunas moleculas extensas de RNA (RNA ribos6mico,o RNAr) y numerosas proteinas pequefias. El procesopor el cual se reconoce que arninoacido correspondea un triplete de nucle6tidos en particular implica unRNA de transferencia intermedio (0 RNAt); hay cuan­do menos una especie de RNAt para cada aminoaci­do. Numerosas proteinas accesorias estan implicadas.La traducci6n se describe en el Capitulo 7, El RNA

34 CAPITULO 2 Los genes codifican proteinas

mensajero, pero considerese por ahora que los ribo­somas son las grandes estructuras que se mueven a10 largo del RNAm en la Figura 2.14.

El punto impartante de esta etapa es que el pro­ceso de la expresion genica implica al RNA no solocomo sustrato esencial, tambien como proveedorde componentes para el mecanismo. Los compo­nentes RNAr y RNAt son codificados por genes ygenerados par el proceso de transcripcion (como elRNAm, excepto que no hay una etapa de traduccionsubsiguiente) .

fill Las protelnas actCtan en trans,pero los sitios deL DNA, en cis

Conceptos principales

• Todos los productos de los genes (RNA 0 proteinas)actuan en trans; pueden actuar en cualquier copia deun gen de la celula.

• Las mutaciones de actuacion en cis identificana las secuencias de DNA que son el objetivo dereconocimiento de los productos de actuacion en trans.No se expresan como RNA ni como proteinas, y afectansolo al fragmento contiguo de DNA.

Una etapa clave para la definicion del gen hle eldescubrimiento de que todas sus partes deben estarpresentes en un fragmento contiguo de DNA. En laterminologfa genetica, se dice que la configuracionde los sitios localizados en el mismo DNA esta en cis,mientras que de la configuracion de los localizadosen dos moleculas diferentes de DNA, se dice queesta en trans, de modo que dos mutaciones puedenpresentarse en cis (en el mismo DNA) 0 en trans (enmoleeulas diferentes de DNA). La prueba de com­plementacion recune a este concepto para determi­nar si dos mutaeiones estan en el mismo gen (veasela Figura 2.3 de la Seccion 2.3. Las mutaciones quese presentan en el mismo gen no se pueden comple­mentar), y ahora podemos ampliar el concepto dela diferencia entre los efectos eis y trans de la de­finicion de la region codificadora de un gen a ladescripcion de la interaccion entre los elementosreguladores y un gen.

Supongamos que la capacidad de un gen paraser expresado depende de una protefna que se uneal DNA eerca de la region codificadora. En el ejem­plo representado en la 1 u , 2 1 , el RNAm puedeser sintetizado solo cuando la protefna esta unida alDNA, pero sup6ngase que en la secuencia del DNAenla cual se une esta protefna ocune una mutaciony la protefna ya no reconoce al DNA: el DNA ya nopodrfa expresarse.

Par 10 tanto, un gen puede ser desaetivado tanto paruna mutaci6n en un sitio de control, como par una mutaci6nen una region codijicadora. Las mutaciones no pueden

~~"'~;;'-",Lasproteinas se unen a los sitiosi~~': _~' '" de control de actuacion en cis

"J Sifo:ae control Regi6n codificadora UNA

~Dos tipos de ! EI RNAsecuencias de DNA se sintetiza

RNA

Los sitos de control del DNA proporcionan sitiosde union para proteinas; las regiones codificadoras se expresana traves de la sintesis de RNA.

Ambos alelos sintetizan RNA en el tipo silvestre

La mutaci6n en el sitio de control afecta s610 al DNA contiguo

Mutaci6n

I

NO HAY SINTESIS DE RNA MEDIADA POR EL ALELO 1

La sintesis de RNA Icontinua a partir del alelo 2 ~

I Un sitio de actuacion en cis controla al DNAadyacente, perc no influye en el otro alelo.

distinguirse geneticamente parque ambos tienen lapropiedad de actuar solo en la secuencia del DNA delalelo individual en el cual oeunen, sus propiedadesson identicas en la prueba de complementacion, demodo que una mutacion en una region de controlse define como parte integrante del gen, de la mismaforma que una mutacion en la region codificadara.

La muestra que una deficiencia enel sitio de control afecta solo a la region codificadora ala eual estd eometada; no afecta la capacidad del afro alelo

2.12 Las proteinas actuan en trans, pero los sitios del DNA, en cis 35

NO HAY SiNTESIS DE RNA A PARTIR DEL ALELO 1

La protefna activa actua en ambos alelos

gen (0 cistron) se transcribe en un producto deRNA, el cual a su vez es traducido en una secuen­cia polipeptfdica si el gen codifica a una proteina.Se dice que un RNA 0 un producto protefnico deun gen son de actuacion en trans. Un gen se definemediante la prueba de complementacion como unaunidad de un fragmento individual de DNA. Se diceque un sitio del DNA que regula la actividad de ungen adyacente es de actuacion en cis.

Cuando un gen codifica a una proteina, la re­lacion entre la secuencia de DNA y la secuencia dela protefna depende del codigo genetico: Solo unade las dos cadenas de DNA codifica a una proteina.Un codon esta formado por tres nucleotidos querepresentan un solo aminoacido. Una secuenciacodificadora de DNA consiste en una serie de co­dones, los cuales son leidos desde un punta fijode inicio. En general, solo uno de los tres marcosde lectura posibles puede ser traducido en pro­teinas.

Un gen puede tener multiples alelos; los rece­sivos son provocados por mutaciones de perdida defuncion que interfieren con la funcion de la protei­na. Un alelo nulo tiene perdida total de la funcion.Los alelos dominantes son provocados por mutacio­nes de ganancia de funcion que crean una nuevapropiedad en la protefna,

!t(fU

!

NO HAY SfNTESIS DE RNA A PARTIR DEL ALELO 2

Q-protefna mutante

La protefna mutante no puede unirse a ninguno de los alelos

Una mutaci6n de actuaci6n en trans de una proteinaafecta a Los dos aLeLos del gen que controla.

para expresarse. Una mutacion que actua exclusiva­mente afectando las propiedades de la secuencia con­tigua del DNA se denomina de actuacion en cis.

El comportamiento de la mutacion de actua­cion en cis que se muestra en la Figura 2.17 se pue­de comparar con el resultado de una mutacion enel gen que codifica a la protefna reguladora. En la

se muestra que la ausencia de protefnareguladora evitara que ambos alelos se expresen; sedice que una mutacion de este tipo es de actuacionen trans.

Revirtiendo el argumento, se sabe que si unamutacion es de actuacion en trans, su efecto debe­ra ser ejercido a traves de algun producto difusible(tipicamente una proteina) que actue en multiplesdianas en una celula. Sin embargo, si una mutaciones de actuacion en cis, su funcion afectara directa­mente a las propiedades del DNA contiguo, 10 cualsignifica que no se expresa en laforma de RNA 0 de unaproteina.

l1li ResumenUn cromosoma es un fragmento ininterrumpido deDNA duplex que contiene numerosos genes. Cada

Referencias

III EL c6digo genHico se Lee en tripLetes

RevisionesRoth. J. R. (1974). Frameshift mutations. Annu. Rev. Genet.

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Los genes procari6ticos son coLineaLescon sus proteinas

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Yanofsky, C. et al. (1964). On the colinearity of gene struc­ture and protein structure. Proc. Nat!. Acad. Sci. USA,51, 266-272.

36 CAPITU LO 2 Los genes codifica n protei nas

El replic6n

ESQUEMA DEL CAPITULO JIntroducci6n

Los replicones pueden ser lineales 0 circulares• Una regi6n repLicada aparece como un ojo dentro deL DNA

no replicado• En el origen inicia una horquiLLa de replicaci6n y despues

se desplaza de forma secuenciaL por eL DNA.• La repLicaci6n es unidireccional cuando se crea una sola

horquilla de replicaci6n en un origen.• La replicaci6n es bidireccional cuando un origen crea dos

horquillas de repLicaci6n que se despLazan en direccionesopuestas.

Es posible elaborar el mapa de los origenes conautorradiografia y electroforesis• El desplazamiento de la horquilla de replicaci6n puede

detectarse por medio de autorradiograna utiLizando pulsosradioactivos.

• Las horquillas de replicaci6n crean estructuras en forma deYque aLteran La migraci6n electroforetica de los fragmentosde DNA.

(Regula la metilaci6n del origen a la iniciaci6n?• ode contiene 11 repeticiones ~:T~ que estan metiladas en

la adenina en ambas cadenas A• La repLicaci6n produce DNA hemimetilado, eL cuaL es

incapaz de iniciar la replicaci6n.• Hay un retraso de 13 min antes de que las repeticiones

GATe sean metiladas de nuevo.CTAG,

Los ongenes pueden ser secuestrados despues dela replicaci6n• SeqAse une al DNA hemimetilado y es necesaria para el

retraso de la replicaci6n.• SeqA puede interactuar con DnaA.• Puesto que Los origenes estan hemimetilados, se unen a la

membrana celuLar y en ocasiones no estan a disposici6n delas metiLasas.

• La naturaLeza de la conexi6n entre el origen y La membranaaun no es clara.

(ada cromosoma eucari6tico contiene numerososreplicones• Los repLicones eucari6ticos tienen una longitud de 40 a

100 kb.• Un cromosoma se divide en numerosos replicones.• Los replicones individuaLes se activan en momentos

caracteristicos durante la fase S.• Los patrones de activaci6n regional sugieren que los

replicones cercanos entre Sl son activados al mismotiempo.

376

En las levaduras pueden aislarse los origenes :=replicaci6n• Los origenes de S. cerevisiae son secuencias cortas ri ,­

A-T que tienen una secuencia esencial de 11 bp.• El ORC es un complejo de seis proteinas que se une a _

ARS.

El factor de competencia controla la replicaci:eucari6tica• El factor de competencia es indispensable para La in·:-.=­

de La replicaci6n en cada origen.• Esta presente en elnucleo antes de la replicaci6n, p~-:

desactivado 0 destruido por la replicaci6n.• La iniciaci6n de otro ciclo de replicaci6n es posibLe~:

despues de que eL factor de competencia entra de nL:'nucleo despues de la mitosis.

El factor de competencia esta formado porprote1oas MCM• El ORC es un complejo de proteinas que esta asociac: ­

origenes de las levaduras durante todo eL ciclo celu!.=.-• Cdc6 es una proteina inestable que se sintetiza s6Lo ,,-• Cdc6 se une al ORC y permite la uni6n de las proteir,o.:

MCM.• Cuando la repLicaci6n se inicia, las proteinas Cdc6 y

MCM son desplazadas. La degradaci6n de Cdc6 impic~

reiniciaci6n.• Algunas proteinas MCM se encuentran en eL nucleo e­

eL ciclo, pero otras pueden entrar s6Lo despues de lcmitosis.

Los lazos 0 mantienen a los origenesmitocondriales• Las mitocondrias utilizan diferentes secuencias de c-­

para iniciar la replicaci6n de cada cadena del DNA. -• La replicaci6n de La cadena Hinicia en un Lazo D.• La repLicaci6n de la cadena Linicia cuando su orige­

expuesto por el movimiento de La primera horquilLa :"replicaci6n.

Resumen

Introducci6n- ~ c€lula tiene un solo cromosoma (como en las=:iotas) 0 varios (como en las eucariotas), el ge­~ completo debe ser replicado precisamente una

...:::. cada clivision celular LDe que manera se vincu­::pisoclio de la replicacion con el cido celular?== utilizan dos conceptos generales para com­- el estado de replicacion con la condicion del:elular:• La iniciaci6n de la replicaci6n del DNA obliga a

la cilula (procari6tica 0 eucari6tica) a experimen­tar una divisi6n posterior. Desde este punto devista, el numero de descenclientes que generauna celula esta determinado por una serie dedecisiones en cuanto a iniciar 0 no la repli­cacion del DNA. Esta se controla en la etapade la iniciacion. Una vez que la replicaci6n hacomenzado, continua hasta que se haya duplicadoelgenoma completo.

• Si la replicacion prosigue, no se puede per­mitir que ocuna la division consiguientehasta que la replicacion haya sido comple­tada. De hecho, la conclusion de la repli­cacion puede desencadenar la division ce­lular. Despues, los genomas duplicados sonsegregados en cada celula hija. La unidad desegregacion es el cromosoma.

:::n las procariotas, la iniciacion de la replicacionepisodio inclividual que involucra a un sitio uni­

== el cromosoma bacteriano. El proceso de la clivi­~ logra mediante el desarrollo de un tabique que

~:: e la pared celular y que divide a la celula en=:n las celulas eucarioticas, la iniciacion de la re­

...2:ion se identifica pOI el cornienzo de la fase S, un_do prolongado durante el cual ocurre la smtesis

=_ 'A Yque comprende numerosos episodios indi­es de iniciacion. La division se logra por la reor­

:....::acion de la celula en la mitosis. En este capitulo~ rdara la regulacion de la replicacion del DNA.

_ =:10 inicia un cido de replicacion? LQUe controla:-ogreso y como se se11aliza su terminacion?:::"<1 unidad de DNA en la que tiene lugar un solode replica cion se denomina replicon. Cada re­II "se activa" una sola vez, solo una, en cada cidoar. El replicon se define por poseer los elementos

_ ntrol necesarios para la replicacion. Tiene un~en en el cual se inicia la replicacion. Asimismo,_ 'e tener un termino en el cual se detiene la re­.:3.cion.

Cualquier secuencia adherida a un origen 0,

=' rminos mas precisos, no separada de un ori­== por un termino, se replica como parte de ese

·con. El origen es un sitio de actuacion en cis,- az de afectar solo a la molecula de DNA en la" reside.

(La concepcion original del replicon [en las pro­cariotas] 10 visualizaba como una unidad que poseiael origen y el gen que codifica la protefna regula­dora. Sin embargo, en la actualidad, en los eromo­somas eucarioticos, el termino "replicon" se aplicaen general para describir una unidad de replicacionque contiene un origen; las protemas reguladoras deactuacion en trans pueden ser codificadas en cual­quier otra parte.)

El genoma de una celula procariotica constituyeun solo repJicon; por 10 tanto, las unidades de repJi­cacion y de segregacion coinciden. La iniciacion enun solo origen promueve la repJicacion del genomacompleto, una vez en cada division celular. Cadabacteria haploide contiene un solo eromosoma, par10 que este tipo de control de repJicacion se deno­mina de una sola copia.

Las bacterias pueden contener mas informaciongenetica en la forma de plasmidos. Un plasmido esun genoma aut6nomo de DNA circular que constituye unreplic6n independiente (vease la Figura 14.2). El repli­can de un pl<ismido puede ser controlado por unasola copia, 10 que significa que se replica una solavez cada vez que se replica el cromosoma bacteria­no, 0 puede estar bajo control de copias multi­ples, cuando esta presente en un numero de copiasmayor que el cromosoma bacteriano. Cada fago 0

DNA de los virus tambien constituye un replicony, por 10 tanto, es capaz de iniciar numerosas vecesdurante un ciclo infeccioso. Quiza una mejor ma­nera de considerar un replicon procariotico, por 10tanto, sea invertir la definicion: cualquier molecula deDNA que contiene un origen puede ser replicada de formaaut6noma en la dlula.

En la replicacion se observa una diferencia fun­damental en la organizacion de los genomas bacte­rianos y eucarioticos. Cada cromosoma eucarioticocontiene un gran numero de replicones; pOI 10 tan­to, la unidad de segregacion induye muchas uni­dades de replicacion. Esto agrega otra dimension alproblema del control: todos los replicones que seencuentran en un cromosoma deben ser activadosdurante un cido celular. Sin embargo, no se activande manera simultanea. Cada replicon debe ser acti­vado en un periodo bastante prolongado y cada unodebe ser activado no mas de una vez en cada ciclo celular.

Alguna serral debe distinguir entre los repliconesreplicados y los no replicados para garantizar quelos replicones no se activen una segunda ocasion.Numerosos replicones son activados de manera in­dependiente, por 10 que debe existir otra serral queindique el momenta en el cual se ha completado elproceso de la replicacion de todos los replicones.

Ahora se ha comenzado a reunir informacionsobre la construccion de los replicones individuales,perc todavia se tiene poca informacion sobre la re-

15.1 Introducci6n 377

- . . -,-

ORIGEN

Horquilla dereplicacicin----.

Horquilla de replicaci6n----.~~~J~DNA replicado

~~

Horquilla dereplicaci6n+--

DNAprogenitor

REPLICACION UNIDIRECCIONAL

FIGURA 1<; 2 Los replicones pueden ser unidireccionaL~

bidireccionales, segun La formaci6n de una 0 de dos horql2:"de replicaci6n en el origen.

Una molecula de DNA comprometida en la rep~

cacion tiene dos tipos de regiones. La FIGURA 1muestra que cuando se observa el DNA en rep·cacion mediante microscopia electronica, la regireplicada aparece como un ojo de replicaci'dentro del DNA no replica do. La region no re .cada consiste en el duplex progenitor; este se ab~

en la region replicada en donde se han formado 1dos duplex hijos.

El sitio donde tiene lugar la replica cion se d­nomina horquilla de replicacion (en ocasior::tambien se Ie conoce como punto de crecimieto). Una horquilla de replicaci6n se desplaza de f017

secuencial pOl' el DNA desde su punta de inicia en el -­gen. EI origen puede aprovecharse para come~la replicacion unidireccional 0 la replicacibidireccional. El tipo de episodio esta determina­por la formacion de una 0 de dos horquillas de rer_cacion en el origen. En la replicacion unidireccio ­una horquilla de replicacion abandona el origer;continua por el DNA. En la replicacion bidireccnal, se forman dos horquillas de replicacion; esta..alejan del origen en direcciones opuestas.

La aparicion del ojo de replicacion no disc­gue entre replica cion unidireccional y bidirecnal. Como se ilustra en la FIGURA 15 2, el ojo pue­representar cualquiera de las dos estructuras. Sigenera por medio de replicacion unidireccional

REPLICACION BIDIRECCIONAL

DNA noreplicado

Ojo dereplicaci6n

Aspecto

Estructura molecular

DNA noreplicado

• Una regi6n repLicada aparece como un ojo dentro deL DNAno repLicado.

• En eL origen inicia una horquilla de replicaci6n y despuesse des plaza de forma secuencial por el DNA.

• La replicaci6n es unidireccional cuando se crea una solahorquilla de replicaci6n en un origen .

• La repLicaci6n es bidireccional cuando un origen crea doshorquillas de replicaci6n que se desplazan en direccionesopuestas.

Conceptos principaLes

FIGURA El DNA replicado se observa como un ojo dereplicaci6n flanqueado por DNA no replicado.

lacion que existe entre eUos. No se sabe si el patronde replicacion es el mismo en cada cido celular LSeutilizan siempre todos los origenes 0 algunos sonsilentes en algunas ocasiones? LLos origenes siem­pre se activan en el mismo orden? Si hay diferentestipos de origenes, Lque los distingue?

En contraste con los cromosomas nudeares, loscuales son controlados por una sola copia, el DNAde las mitocondrias y de los doroplastos puede serregulado mas como plasmidos que existen en copiasmultiples por bacteria. Hay numerosas copias de cadaDNA de los organelos por celula y el control de sureplicacion debe relacionarse con el cido celular.

En todos estos sistemas, la cuestion fundamen­tal es definir las secuencias que funcionan comoorfgenes y determinar como son reconocidas porlas protefnas adecuadas del mecanisme de replica­cion. Se comienza por considerar la construccionbasica de los replicones y las diversas formas queadquieren; despues de la consideracion del origen,se plantea la pregunta de como la replicacion del ge­noma se coordina con la division bacteriana y que seencarga de segregar los genomas a la bacteria hija.

1111 Los replicones pueden ser linealeso circulares

378 CAPITULO 15 El replic6n

A 15. .J Un ojo de replicaci6n forma una estructura El en- Acircular.

RA 1 El ojo de replicaci6n se agranda a medida que.:.: norquillas de replicaci6n prosiguen por el replic6n. N6tese

_= el "ojo" se hace mas grande que el segmento no replicado.-:: dos lados del ojo pueden definirse porque ambos tienen

isma longitud. Fotografia cortesja de Bernard Hirt, Swiss-~_'tute for Experimental Cancer Research (ISREC).

. ... .REPLICACI6N UNIDIRECCIONAL

1-

-<---.-to---->-REPLICACI6N BIDIRECCIONAL

-<------->-

La cantidad de horquillas de replicacion que hay enun ojo de replica cion puede determinarse de dosformas. La eleccion del metodo depende de que elDNA sea una molecula definida 0 una region noidentificada de un genoma celular.

Con una molecula lineal definida se puede uti­lizar microscopia electronica para medir la distanciaentre cada extremo del ojo y el extrema del D AYluego comparar las posiciones de los extremos delos ojos en las moleculas que tienen ojos de diferen­tes tamaiios. Si la replicacion es unidireccionaL solouno de los extremos se movera; el otro es el origenfijo. Si la replicacion es bidireccionaL ambos se des­plazaran; el origen es el punto medio entre ellos.

Con regiones no definidas de genomas exten­50S se pueden utilizar dos puIsos de radioactividadsucesivos para etiquetar el desplazamiento de lashorquillas de replicacion. Si un pulso tiene una eti­queta mas intensa que el otIO, pueden distinguirsepor las intensidades relativas del etiquetamiento.

Conceptos principales

r Pueden utilizarse diferentes densidades de eti-quetamiento radioactivo para distinguir entre la replicaci6nunidireccional y la replicaci6n bidireccional.

_ Eliquela de densidad pesada (incorporadaprimero)

- Eliqueta de densidad ligera (incorporada ensegundo lugar)

-- Sin etiqueta (invisible en la autorradiografia)

• El desplazamiento de la horquilla de replicaci6n puededetectarse por medio de autorradiografia utilizandopulsos radioactivos.

• Las horquillas de replicaci6n crean estructuras en formade Yque alteran la migraci6n electroforetica de losfragmentos de DNA.

1111 Es posible elaborar el mapade los orlgenes conautorradiografia yelectroforesis

Apariencia de laestructura e pormedio de microscopiaeleclr6nica

Estruclura dereplicaci6n e

:epresenta un origen fijo y una horquilla de'cacion movible. Si se genera por replicacion bi­

-;: donal, el ojo representa un par de horquillas:eplicacion. En cualquier caso, el avance de lajcacion expande el ojo hasta que termina por

-:car todo el replicon.Cuando un replicon es circular, la presencia dejo forma la estructura e, la cual se muestra enJRA 1 oJ. Las etapas sucesivas de la replicacion

~NA circular del virus del polioma se yen a tra­- e microscopia electronica en la

15.3 Es posible elaborar el mapa de los origenes con autorradiografia yelectroforesis 379

La primera dimensi6n separada por masa ----..

Antes de la replicacion, el sitio diana palind:­mico es metilado en las adeninas de ambas eaden~

La replicacion inserta las bases normales (no m -

primera dimension que los separa por masa y euna segunda dimension en donde el movimien~es determinado sobre todo por la morfologfa. Ldiferentes tipos de moIeculas en replicacion sigu ­rutas caracterfsticas, medidas por su desviacion ':la linea que seguirfa una molecula lineal de DK.­del doble de tamano.

Una simple estructura Y, en la cual una horqu'"se desplaza por un fragmento lineal, sigue una ru­continua. Cuando las tres ramas tienen una misIlongitud ocurre un punto de inflexion y la estru­tura se desvfa mas del DNA lineal. Consideracion­analogas determinan las rutas de las estructuras _bles en forma de Y 0 de las burbujas. Una burb_ja asimetrica sigue una ruta interrumpida con ­rotura en el sitio donde la burbuja se convierte e­estructura en forma de Ya medida que una horq .­abandona el extremo.

Juntas, las diferentes tecnicas para describirDNA en replicacion muestran que los orfgenes "utilizan con mayor frecuencia para iniciar episodi­de replicacion bidireccional. A partir de este nivelresolucion, se debe avanzar ahora al nivel molec~para identificar las secuencias de actuacion enque forman el origen y los factores de actuaciontrans que 10 reconocen.

(Que caracterfstica de un origen bacteriano (0 p1=.mido) garantiza que sea utilizado para iniciar 1a :-­plicacion solo una vez en cada cielo? (La inieiac:,se asocia a a1gun cambio que marca el origen de ­manera que un origen replieado pueda distingui:de un origen no replieado?

Algunas secuencias que se utilizan para e"proposito estan ineluidas en el origen. oriC con::

ne 11 copias de la secuencia g¢l~, la eual es -­

diana de metilacion en la posicion N6 de la adeni;­par la metilasa Dam. La reaccion se ilustra er:

lilt (Regula la metHaci6ndel origen la iniciaci6n?

Conceptos principales

• orie cantiene 11 repeticiones ~~1~ que estim metiladasen la adenina en ambas cadenas.

• La replicaci6n produce DNA hemimetilado, el cual esincapaz de iniciar la replicaci6n.

• Hay un retraso de 13 min antes de que las repeticione.:~~1~ sean metiladas de nuevo.

Burbujaasimetrica

--0-

--0-<---L-

['J1 kb 1 kb

BurbujaY doble

>--< ---0-­

>--< --0­>-< -0­>< c::>

Y simple

. . ... .:

, ; .; .I-

DNA DNAmetilado hemimetilado

MeGATC-CTAG

Gf'.JtTC Replicaci6n j Nletilasa DamCTAG "\Me

GATCCTAG-

Me

Estas pueden visualizarse por medio de autorra­diograffa. La muestra que la replicacionunidireccional hace que a una etiqueta Ie siga la otraen un extrema del ojo. La replicacion bidireccionalproduce un patron (simetrico) en ambos extremosdel ojo. Este patron se observa por 10 general en losreplicones de los cromosomas eucarioticos.

Un metodo mas reciente para elaborar el mapade los orfgenes con mayor resolucion se vale delos efectos que tienen los cambios de la forma delDNA sobre la migracion electroforetica. La

ilustra la tecnica de mapeo bidimensional,en la cuallos fragmentos de restriccion del DNA enreplicacion son sometidos a electroforesis en una

La replicaci6n del DNA metilado origina DNAhemimetilado, el cual mantiene su estado en los sitios GATChasta que la metilasa Dam restaura la condici6n metilada porcompleto.

~~seengs~~~~xagera1C\la contribuci6n de

la forma de tres 2 kb ... kbdlmenslones 2

1 kb 1 kb

EI tamano delfragmento seduplica durantela replicaci6n

La posici6n del origen y el numero de horquillas en replica­ci6n determinan la forma de un fragmenta de restricci6n en replicaci6n,la cual puede deducirse par su ruta electroforetica (linea continua). Lalinea punteada muestra la ruta del DNA lineal.

380 CAPITU LO 15 El replic6n

15.5 Los origenes pueden ser secuestrados despues de la replicaci6n 381

- as) en las cadenas hijas. Esto genera DNA he­etilado, en el cual una cadena esta metilada

- tra no. Par 10 tanta, la replicacion conviertesitios diana Dam de metilados par completo a

-:::imetilados..:.Cual es la consecuencia de la replica cion? La~ idad que tiene un plasmido con base en oriC:-eplicarse en E. coli dam- depende de su esta-

e metilacion. 5i el plasmido esta meti]ado sete a una sola ronda de replicacion y despues

roductos hemimetilados se acumulan, como se.:ribe en ]a . Par 10 tanto, un arigen

- 'metilado no puede usarse para iniciar un cielo::-eplicacion.£:sto sugiere dos explicaciones: la iniciacion

=je requerir la metilacion completa de los sitios7 _3 Dam en el origen a puede ser inhibida par la-_ irnetilacion de estos sitios. La ultima posibilidad~:: e ser la correcta parque un origen de DNA no= ado puede funcionar de manera eficiente.

Asi, los orfgenes hemimetiJados no pueden ini­- e nuevo hasta que la metilasa Dam los haya-~-formado en orfgenes metilados par completo.

:itios GATC localizados en el origen permanecen- imetilados -13 min despues de la replicacion.

c largo periodo no es habitual porque en los sitios-_-=-C tipicos en cualquier otro lugar del genoma,-.>metilacion comienza de inmediata «1.5 min)

es de la replicacion. Otra region actua como-:. el promotor del gen dnaA tambien muestra re­

antes de que comience la remetilacion.;::1 promotor del gen dnaA estara reprimido

=:J.tras este hemimetilado, 10 cual reduce el nivelc a proteina DnaA. Par 10 tanto, eJ origen esta=:Le y la produccion de la proteina iniciadora cru­

es reprimida durante este periodo.

Los orlgenes puedenser secuestrados despuesde la replicaci6n

I i:onceptos principales

SeqA se une al DNA hemimetilado y es necesaria para=1 retraso de la replicaci6n.SeqA puede interactuar con DnaA.Juesto que los origenes estan hemimetilados, senen a la membrana celular yen ocasiones no estan aisposici6n de las metilasas.

_a naturaleza de la conexi6n entre el origen y lamembrana aun no es clara.

-- que se debe el retraso de la remetilacion en oriC-n dnaA? La explicacion mas probable es que estas

-~ .ones son secuestradas en una forma en la cual"' inaccesibles a la metilasa Dam.

..•

~()'~Y.~1(}I~1l~j(i~\.'L'I\.1"/ Origen activo

Replicaci6n!•

\.~rA"fj\'L'I\.l(J';L)~rA,'H Origenes

\)(}'.':'L'\.i(}I\.)l''\JOl.~'I\.~''/ inactivos•

Metilasa Dam!•

\)(}\yj1\)fJ'YJI\)(J'~f\U Origen activo

S6lo los origenes metilados por completo puedeniniciar la replicaci6n; los origenes hijos hemimetilados no pue­den utilizarse de nuevo hasta que hayan recuperado su estadode metilaci6n completa.

Un circuito encargado de controlar la reutiliza­cion de los orfgenes es identificado par mutacionesen el gen seqA. Los mutantes reducen el retraso de laremetilacion en oriCy en dnaA. Como resultado, ini­cian la replicacion del DNA demasiado pronto, can10 que se acumula un numero excesivo de origenes.Esto sugiere que seqA forma parte de un circuito re­gulador negativo que impide que los arfgenes seanmetilados de nuevo. La proteina SeqA se une canmayor fuerza al DNA hemimctilado que al DNA me­tilado par completo. Puede iniciar la union cuandoel DNA es hemimetilado, momenta en que su pre­sencia continua impide la formacion de un complejoabierto en el origen. SeqA no tiene especificidadpar la secuencia oriC y parece probable que esta seaconferida par la protefna DnaA. Esto explicaria lasinteracciones geneticas entre seqA y dnaA.

La hemimetilacion de las secuencias GATC delorigen es indispensable para su asociacion can lamembrana celular in vitro. El DNA oriC hemimeti­lado se une a las membranas, pero el DNA que estametilado par completo, no. Una posibilidad es que laasociacion a la membrana tenga que ver en el con­trol de la actividad del origen. Esta funcion podrfaser independiente de cualquier funcion que tenga lamembrana en la segregacion (vease la Figura 17.4).La asociacion a la membrana podrfa impedir queocurriera la reiniciacion de manera prematura, deforma inctirecta par el secuestro de los origenes, adirecta par la inhibicion de la reaccion par parte dealgun componente en la membrana.

Las propiedades de la fraccion de la membranasugieren que ineluye componentes que regulan lareplica cion. Un inhibidor observado en esta fracci6ncompite can la proteina DnaA. Este inhibidor pue­de impectir la iniciacion de la replicacion solo si es

Un inhibidor unido a la membrana se adhiere alDNA hemimetilado en el origen y puede funcionar al impedirla union de DnaA. Es liberado cuando el DNA es metHado denuevo.

ciacion, perc que cuando se combinen logren =resultado esperado. Algunas mutaciones en el gednaA provocan replicacion asincronica. 10 cual su­giere que DnaA podrfa ser el "titulador" 0 el "rei ~

que mide el nllmero de orfgenes en relacion con :.:masa celulay. La sobreproduccion de DnaA da luga­a resultados conflictivos, los cuales pueden vari­desde no tener ningun efecto hasta causar que ..::iniciacion suceda en una masa reducida.

Ha sido diffcil identificar los componentes pr-­tefnicos que median la adhesion a la membrana. "L:indicio de que esta es una funcion de la prote' ­DnaA 10 constituye su respuesta a los fosfolfpid :Estos facilitan el intercambio de ATP con el ~~unido a la protefna DnaA. Se desconoce la funci'que tiene esto en el control de la actividad de Dn- ­(la cual requiere ATP). perc la reaccion implica ql:.:es probable que DnaA interactue con la membran=..Esto significarfa que mas de un episodio tiene q...::ver en la asociacion a la membrana. Quiza un or:­gen hemimetilado este unido al inhibidor asocia 'a la membrana, pero cuando el origen se metilacompleto, el inhibidor es desplazado por la prote'~­

DnaA asociada a la membrana.Si DnaA es el iniciador que desencadena un c­

cIo de replicacion, el suceso principal serfa su a '­mulacion en el origen en un nivel crftico. No he.­variaciones cfclicas en la expresion 0 en la conce::­tracion global de la protefna DnaA, 10 cual sugie­que los sucesos locales deben ser los responsablc:Para que sea activa en la iniciacion de la replicaci6=.DnaA debe encontrarse en su forma unida a ATP.::"':protefna DnaA tiene una actividad intrfnseca de~

que transforma el ATP en ADP. Esta actividad "­intensifica la subunidad ~ de la polimerasa de Di -,­III. Cuando la replicasa es incorporada al comple:de replicacion, esta interaccion ocasiona la hidrolis_del ATP unido a DnaA, 10 que desactiva la prote'DnaA e impide que comience otro ciclo de replicc­cion. Esta reaccion ha sido denominada RlDA (re-- ­latory inactivation ofDnaA, desactivacion regulad ::de DnaA). Es potenciada por una protefna llama""'­Hda. Todavfa no se sabe que controla la cranolocr-­de la reactivacion de la protefna DnaA.

Otro factor que controla la disponibilidad '.DnaA en el origen es la competencia por unirla :otros sitios del DNA. En particular, un locus denminado dat tiene una gran concentracion de sitide union a la protefna DnaA. Se Ie une unas ocveces mas DnaA que al origen. La delecion de .hace que la iniciacion ocurra con mayor frecuen '=Esto reduce de manera significativa la cantidad c:­DnaA disponible para el origen, perc no se sabe co­exactitud que funcion pueda tener en el control (:,­la cronologfa de la iniciacion.

EI DNA es metiladode nuevo y Iibera alinhibidor

DnaA se une a oriC

EI inhibidor unido a lamembrana se adhiereal DNA hemimetilado

Cc

Me

Me"GATC NNNNNNN'CTAG NNNNNNN

Me

MeiGATC N~~lCTAG~

agregado antes que la protefna DnaA a un sistemain vitro. Esto sugiere el modelo que se muestra en la

, en el cual el inhibidor reconoce de ma­nera especffica el DNA hemimetilado e impide quese una la protefna DnaA. Cuando el DNA es meti­lado de nuevo, el inhibidor es liberado y la pratefnaDnaA es libre de iniciar la replicacion. Si el inhibi­dor esta asociado a la membrana, es posible que laasociacion y la disociacion del DNA a la membranatengan que ver con el control de la replicacion.

La extension completa del sistema utilizadopara controlar la reiniciacion no es clara, pero esposible que participen numerosos mecanismos: elsecuestro ffsico del origen, el retraso de la remetila­cion, la inhibicion de la union de la pratefna DnaAy la represion de la transcripcion del gen dnaA. Noes evidente cual de estos episodios ocasiona los de­mas, y si sus efectos en la iniciacion son directos 0

indirectos.Alm se debe resolver el tema central de cual

caracterfstica tiene el encargo fundamental de sin­cronizar los sucesos. Una posibilidad es que la adhe­sion a la membrana ocurre en la iniciacion y que seanecesario el ensamble de alguna estructura extensapara liberar el DNA. El periodo de secuestro pareceaumentar con la longitud del ciclo celular, 10 cualsugiere que refleja de manera indirecta el reloj quecontrola la reiniciacion.

Como unico integrante del mecanismo de repli­cacion indispensable solo en el origen, la protefnaDnaA ha atrafdo mucha atencion. Esta protefna esla diana de numerosos sistemas reguladores. Es po­sible que ninguno de estos sistemas sea suficientepor sf solo para controlar la frecuencia de la ini-

382 CAPITULO 15 El replicon

(ada cromosoma eucari6ticocontiene numerosos replicones Origen 1

~

.. . .. _. ~ . .

Origen 2

=':-,:=pios principales

-:5 replicones eucari6ticos tienen una longitud de 40 a_= kb._- cromosoma se divide en numerosos replicones._:- replicones individuales se activan en momentos:;acteristicos durante la fase S._=s patrones de activaci6n regional sugieren que los-=Jlicones cercanos entre 51 son activados al mismo=-:mpo.

-" celulas eucarioticas la replicaci6n del DNA..:. confinada a una parte del cido celular. La fase

ele durar unas cuantas horas en una celula eu-rica superior. La replicaci6n de la gran cantidad

=:>NA contenido en un cromosoma eucari6tico_QIa al dividirlo en numerosos replicones indivi­

=·es. Solo algunos de estos replicones participan.3 replicacion en un momento dado de la fase S,arecer cada replicon es activado en un momen­

:= ecffico durante la fase S, aunque los datos que-- -obre el tema no son decisivos.

El inicio de la fase S 10 seiiala la activaci6n de_rimeros replicones, En las pocas horas siguien­!os episodios de iniciacion tienen lugar en otros

- Jcones de manera ordenada. Mucho de 10 que: be sobre las propiedades de los replicones in­: uales proviene de estudios autorradiogrMicos

_~ recurren en general a los tipos de protocolos_-trados en la Figura 15.5 yen la Figura 15,6. Los

-_ :.icones cromosomicos suelen mostrar replicacion2ireccional.

LQue tan grande es el replic6n promedio yantos hay en el genoma7 Una dificultad para

=:cribir la unidad individual es que los replicones~'acentes pueden fusionarse y formar ojos repli-

- os extensos, como se ilustra en la II-=. metodologfa utilizada en general para distinguir=~re los replicones individuales y los ojos fusio­=.dos consiste en utilizar fragmentos de DNA en- cuales puedan observarse numerosos replicones

_~vos, capturados al parecer en una etapa en la~al todos han iniciado casi al mismo tiempo, perc

,,-res de que se reunan las horquillas de las unida­_=s adyacentes.

En grupos de replicones activos, el tamaiio pro­-=.edio de la unidad se mide por la distancia que

y entre los orfgenes (es decir, entre los puntosedios de los replicones adyacentes). La velocidad

: n la cual se desplaza la horquilla de replicacionuede estimarse a partir de la distancia maxima que

=-_corren los rastros autorradiograficos durante un~eriodo determinado.

Longitud medida del repiic6n...-----., I

Replicones fusionados

Para medir el tamaiio del replic6n se necesita un frag­mento de DNA en el cuallos replicones adyacentes esten activos.

Los replicones individuales de los genomas eu­cari6ticos son relativamente pequefios, por 10 ge­neral de -40 kb en las levaduras 0 en las moscas yde -100 kb en las celulas animales. Sin embargo,pueden variar mas de 10 veces en longitud dentrode un genoma. La velocidad de replicacion es de-2 000 bp/min, la cual es mucho menor que la deldesplazamiento de la horquilla de replicacion bac­teriana (50 000 bp/min).

Por la velocidad de replicacion, es evidente queel genoma de un mamffero podrfa replicarse en cercade 1 h si todos los replicones funcionaran de manerasimultanea. Sin embargo, la fase S dura mas de 6 hen una celula somatica tfpica, 10 cual implica que nomas del 15 % de los replicones tienden a estar acti­vos en un momenta dado, Hay casos excepcionales,como las divisiones embrionarias tempranas de losembriones de Drosophila, en donde la duracion de lafase S se comprime por el funcionamiento simulta­neo de un gran numero de replicones,

LComo se seleccionan los orfgenes para la ini­ciacion en momentos distintos durante la fase S7 EnSaccharomyces cerevisiae, parece ser que esta prede­terminado que los orfgenes se repliquen temprano,pero que las secuencias de actuacion en cis puedanhacer que los origenes ligados a ellas se repliquendespues.

Los datos disponibles sugieren que los repli­cones cromos6micos no tienen terminalesen lascuales las horquillas de replicacion interrumpan eldesplazamiento y (al parecer) se disocien del DNA.Parece mas probable que la horquilla de replicacioncontinue desde su origen hasta que encuentre una

15.6 (ada cromosoma eucari6tico contiene numerosos replicones 383

Las horquillas de replicaci6n se organizan enfocos dentro del nucleo. Las celulas fueron etiquetadas conBrdU. El segmento izquierdo de la figura se tifi6 con yoduro depropidio para identificar la masa de DNA. El derecho se tifi6 conUll anticuerpo contra BrdU para identificar el DNA en replica­ci6n. Fotografia cortesia de Anthony D. Mills and Ron Laskey,Hutchinson/MRC Research Center, University of Cambridge.

horquilla que avance hacia ella desde el replicon ad­yacente. Ya se ha mencionado el posible problematopologico de unir el DNA que acaba de sintetizarseen la union de las harquillas de replicacion.

La predisposicion de los replicones vecinos aestar activos de manera simultanea podria expli­carse por la presencia de controles "regionales", enlos cuales los grupos de replicones son iniciados demodo mas 0 menos coordinado, al contrario de unmecanismo en el cual los replicones individualesson activados uno par uno en areas dispersas delgenoma. Dos caracteristicas estructurales sugierenla posibilidad de una organizacion a gran escala.Regiones bastante extensas del cromosoma puedende£lnirse como "de replicacion temprana" 0 "de re­plicacion tardia", 10 cual implica que hay poca dise­minacion de replicones que se activan en momentostempranos 0 tardfos. La visualizacion de las horqui­llas de replicacion par medio de etiquetamiento conprecursores de DNA identi£lca de 100 a 300 "focos"en vez de una tincion uniforme; es probable quecada foco que se muestra en la conten­ga >300 horquillas de replicacion. Los focos podrianrepresentar estructuras fijas a traves de las cualesdebe moverse el DNA en replica cion.

l1li En las levaduras puedenaislarse los origenesde replicaci6n

Conceptos principales

• Los origenes de S. cerevisiae son secuencias cortas ricasen A-T que tienen ulla secuencia esencial de 11 bp.

• El ORC es L11l complejo de seis proteinas que se une auna ARS.

384 CAPITULO 15 El replic6n

Cualquier segmento de DNA que tenga un origer:debe estar en condiciones de replicarse; par 10 tan­to, aunque los plasmidos son muy poco frecuente~

en las eucariotas, puede ser posible construirlos p :­medio de una manipulacion apropiada in vitro. EST_se ha logrado en las levaduras, aunque no en laeucariotas superiores.

Los mutantes de S. cerevisiae pueden ser "tran:­formados" en su fenotipo silvestre con la adicion c.:DNA que transporte una copia silvestre del gen. ::.descubrimiento de los origenes de las levaduras tu ­lugar cuando se observo que algunos fragmentos G:DNA de las levaduras (cuando forman un circul­son capaces de transformar las celulas defectuo ~

con mucha e£lciencia. Estos fragmentos puedenbrevivir en la celula en estado no integrado (au~.

nomo), es decir, como plasmidos autorreplicamc-Un fragmento transformante de alta frecuenc...

posee una secuencia que Ie da la capacidad de repcarse e£lcientemente en las levaduras. Este segme~se denomina ARS (autonomousZy replicating seque·:.secuencia de replicacion autonoma). Los elemer-~

ARS se derivan de origenes de replicacion.En los casos en los que los elementos ARS

han mapeado de manera sistematica en regio.ccromosomicas extensas, parece que solo algl!­de ellos en realidad se aprovechan para inicia':­replicacion. Los otros son silenciosos 0 quiza se ~

licen con poca frecuencia. Si es verdad que al -.origenes tienen probabilidades variables de ser _lizados, tampoco podria haber terminales £ljas e::::los replicones. En este caso, una region dada decromosoma podria ser replicada desde arigenes .:­tintos en ciclos celulares diferentes.

Un elemento ARS esta formado por una re.:rica en A-T que contiene sitios discretos en 10 ;:­les las mutaciones afectan el funcionamiemorigen. La composicion de bases, mas que la sec~

cia, puede ser importante en el resto de la re.La muestra un analisis sistematic­mutaciones a todo 10 largo de un origen. EI :cionamiento del origen es inhibido por com._por mutaciones en una region "nuclear" de 1."denominada dominio A, la cual contiene un~

cuencia de consenso de 11 bp formada por per-:­bases A·T. Esta secuencia de consenso (en ocas_denominada ACS, ARS consensus sequence, se ~

de consenso de la ARS) es la (mica homologialos elementos ARS conocidos.

Las mutaciones en tres elementos adya e­numerados B1 a B3, disminuyenla funcion degen. Un arigen puede funcionar de manera =­

con dos elementos B cualesquiera, siempre y c =

haya un elemento A funcional. (Las copias :_­fectas del consenso nuclear, que suelen conf r=

en las posiciones 9111, se ubican cerca de, 0 =-

..

Complejo deposreplicaci6n

VR.

ORC

ORC

ORC

Fase S

Fase G1 MCMtardfa

/A~

Fase G2

/AYA.YA.VAYJ: ,

Fase G1 temprana

fA-YAYA"VA.YJ., t

Cdc6..0IIII(. -.····

Despues de la replicaci6n, el factor de competencia:que se encuentra en el nLicleo es inactivo; el factorde competencia del citoplasma no puede entrar alnLicleo

DYAYlt')./A

~~

.IfiYA-~~

.- .

La disoluci6n de la membrana nuclear durante lamitosis permite que el factor de competencia seasocie al material nuclear

:"ntes de la replicaci6n, el nLicleo contiene factor decompetencia activo

La divisi6n celular genera nLicleos hijos competentespara respaldar la replicaci6n

15.14 El factor de competencia que se encuentra en- - Jcleo es desactivado despues de la replicaci6n. Un nuevo-~tecimiento de factor de competencia puede entrar s6lo

- .:oldo se rompe la membrana nuclear en la mitosis.

__erdese que el aRC es un complejo de 400 kD__e se une a la ARS de S. cerevisiae (vease la seccion';.. En las levaduras pueden aislarse los orfgenes~ replicacion). El origen (ARS) esta formado por- secuencia de consenso A y por t-res elementos

::- vease la Figura 15.12). El aRC de seis protei-:::25 (de las cuales todas son codificadas por genes-:.::nciales) se une a la secuencia A y al elemento:::.yacente B1. Se necesita ATP para la union. pero~-:e no es hidrolizado hasta alguna etapa posterior.2.-- :actor de transcripcion ABFl se une al elemento~ 3; esto ayuda a la iniciacion. pero son los sucesos__e tienen lugar en los elementos A y B1 los que en=~dad provocan la iniciacion. La mayor parte de

::. orfgenes estan ubicados en las regiones que seo:::.cuentran entre los genes. 10 cual indica que quizaeo. importante para que la estructura de la cromati­

- = local este en una conclicion no transcrita.La caracterfstica sobresaliente es que el aRC

-=rmanece unido al origen en todo el cido celu­=-. No obstante. los cambios ocurren en el patron

-= proteccion del DNA como resultado de la union

1 Las proteinas del origen controlan la suscep-tibilidad a la iniciaci6n.

de otras protefnas al complejo ORC-origen. La~ i resume el cido de los sucesos que tienen

lugar en el origen.Al final del cido celular. el aRC esta unido a A­

B1 Ygenera un patron de proteccion in vivo similaral que se observa cuando se une al DNA libre invitro. En terminos basicos. la region que atraviesaA-B 1 esta protegida contra la DNAasa. pero hay unsitio hipersensible en el centro de B1.

Durante G1 este patron cambia. mas notable­mente por la perclida del sitio hipersensible. Esto sedebe a la union de la protefna Cdc6 al aRc. En laslevaduras. Cdc6 es una protefna muy inestable. conuna vida media de menos de 5 min. Se sintetiza du­rante G1 Ysuele unirse al aRC entre la salida de lamitosis y la etapa G1 tardfa. Su rapida degradacionsignifica que no hay protefna disponible despues enel cido. En las celulas de los mamlferos. se controlade manera distinta; esta fosforilada durante la faseS y como resultado es exportada desde el nudeo.La protefna Cdc6 proporciona la conexion entre elaRC y un complejo de protefnas que participa enla competencia y en la iniciacion. Cdc6 tiene ac­tividad ATPasa indispensable para que respalde lainiciacion.

15.9 El factor de competencia esta formado por proteinas MCM 387

Ciertos mutantes de levaduras nos permiten co­nocer el sistema que controla la disponibilidad delfactor de competencia. Las mutaciones que se pre­sentan en el factor de competencia pueden impedirla iniciacion de la replicacion. Asf es como las mu­taciones actuan en las protefnas de mantenimientodel minicromosoma (minichromosome maintenance.MCM) 2, 3 Y 5. Las mutaciones que ocunen en elsistema que desactiva el factor de competencia des­pues del inicio de la replicacion deben permitir laacumulacion de cantidades excesivas de DNA. por­que la presencia continua de factor de competenciapermite que suceda la replicacion. Dichas mutacio­nes se observan en los genes que codifican los com­ponentes del sistema de ubiquitinacion encargadode la degradacion de ciertas protefnas. Esto sugiereque el factor de competencia puede ser destruidodespues del inicio del cicio de replicacion.

Las protefnas MCM2, 3 Y 5 son necesarias parala replicacion y entran al nu.cleo solo durante la mi­tosis. En las celulas animales se encuentran homo­logos, en donde MCM3 esta unida al material ero­mosomico antes de la replicacion, pero es liberadadespues de la replicacion. El complejo MCM2, 3, 5de la celula animal permanece en elnucleo duranteel ciclo celular, 10 cual sugiere que puede ser uncomponente del factor de competencia. Otro com­ponente, capaz de entrar solo en la mitosis, puederequerirse para que el complejo MCM2, 3, 5 se aso­cie al material cromosomico.

En las levaduras, la presencia de Cdc6 en elarigen permite que las protefnas MCM se unan alcomplejo. Su presencia es indispensable para queocuna la iniciacion en el origen. En consecuencia,el origen entra a la fase S como un complejo deprerreplicaci6n, el cual contiene el aRC y las pro­tefnas Cdc6 y MCM. Cuando ocurre la iniciacion,Cdc6 y MCM son desplazadas y el origen regresaal estado de complejo de posreplicaci6n, el cualcontiene solo el aRc. La protefna Cdc6 es degra­dada con rapidez durante la fase S; pOl' 10 tanto,no esta disponible para respaldar la recarga de lasprotefnas MCM y, en consecuencia, el origen nopuede ser utilizado para un segundo cido de inicia­cion durante la fase S.

Si Cdc6 esta disponible para unirse al origendurante la fase G2 (par expresion ectopica), las pro­tefnas MCM no se unen hasta la siguiente fase G1,10 cual sugiere que hay un mecanismo secundarioque garantiza que se asocien a los orfgenes solo enel momenta adecuado. Esta podrfa ser otra parte delcontrol de la competencia. Al menos en S. cerevisiae,este control no parece ejercerse en el nivel de laentrada al nucleo, pero esta puede ser una diferen­cia entre las levaduras y las celulas animales. Lasprotefnas MCM2-7 constituyen un complejo de seis

388 CAPITULO 15 El replic6n

miembros en forma de anillo alrededor del D -.­Algunas de las protefnas del aRC tienen similiLdes con las protefnas de replicacion que cargan ;:DNA con la polimerasa de DNA. Es posible q;"el aRC utilice la hidrolisis de ATP para cargar ­DNA con el anillo MCM. En los extractos de XeI:pus, la replicacion puede iniciarse si el aRC es el'nado despues de que ha cargado las protefnas Cdy MCM. Esto muestra que la funcion principal ;:aRC es identificar el origen a las protefnas Cdc6MCM que controlan la iniciacion y la competenc::.=

Las protefnas MCM son indispensables parelongacion y para la iniciacion, y continuan func' ­nando en la horquilla de replicacion. Su particip=cion exacta en la elongacion no es clara, pero~posibilidad es que contribuyan a la actividad dehelicasa que desenrolla el DNA. Otra posibilidad :­que actuen como una defensa avanzada que aen la cromatina para permitir que una helicasa -­tue en el DNA.

lED Los lazos Dmantienenlos orlgenes mitocondriales

Conceptos principales

• las mitocondrias utilizan diferentes secuencias de ori­gen para iniciar la replicaci6n de cada cadena del DNA.

• la replicaci6n de la cadena Hinicia en un laza D.

• la replicaci6n de la cadena l inicia cuanda su arigenqueda expuesto par el mavimiento de la primeraharquilla de replicaci6n.

Los arfgenes de los replicones en los cromosoIE..eucarioticos y procari6ticos son estructuras estcL­cas: estan formadas por secuencias de DNA que ('reconocidas en su forma duplex y son utilizad=.para iniciar la replicacion en el momenta adecuad­La iniciacion requiere la separacion de las caden=del DNA y el comienzo de la sfntesis bidirecc: ­nal del DNA. En las mitocondrias se observa ~

organizacion diferente.La replicacion comienza en un origen especmc

localizado en el DNA duplex circular. Sin embarg­en un inicio solo una de las dos cadenas proge ­toras (la cadena H en el DNA mitocondrial de :mamfferos) sirve como molde para ]a sfntesis de r

cadena nueva. La sfntesis continua solo una distil::­cia corta y desplaza a la cadena compafiera orig~(L), la cual permanece como cadena individwcomo se i]ustra en la - r. ~!> 6. La condicion -:esta region da origen a su nombre, laza de despla: ­miento, 0 lazo D.

Las polimerasas de DNA no pueden iniciarsfntesis, sino que requieren un extremo 3' con a

Conceptos principales

El episodio fundamental en el control de la r rcacion es la actuacion del ORC en el origen. -:

• El ORC es un complejo de proteinas que esta asociadoa los origenes de las levaduras durante todo el ciclocelular.

• Cdc6 es una proteina inestable que se sintetiza s6lo e­G1.

• Cdc6 se une al ORC y permite la uni6n de las proteina5MCM.

• Cuando la replicaci6n se inicia, las proteinas Cdc6 yMCM son desplazadas. La degradaci6n de Cdc6 impidela reiniciaci6n.

• Algunas proteinas MCM se encuentran en el nOcleodurante el ciclo, pero otras pueden entrar s6lo despuEc:de la mitosis.

Figura 1.12). Si en el ovocito se bloquea la slntesisde protefnas, la membrana alrededor del materialinyectado permanece intacta y el DNA no puedereplicarse de nuevo. No obstante, en presencia desfntesis protefnica, la membrana nuclear se rompdel mismo modo como 10 harfa en una division ce­lular normaL y en este caso pueden ocurrir ciclOSsubsiguientes de replicacion. El mismo resultadpuede lograrse con agentes que permeabilicen 1­membrana nuclear. Esto sugiere que el nucleo con­tiene una protefna (0 protefnas) indispensable pare:.la replica cion que se consume de alguna maner­por un. ciclo de replicacion, por 10 que aunque haye:.mas proteina en el citoplasma del ovocito, esta salepuede entrar al nucleo si la membrana nuclear erompe. En principio el sistema puede ser lievadeaLll1 mas lejos si se desarrolla in vitro un extractque respalde la replicacion nuclear y permita asf eOaislamiento de los componentes del extracto y l~

identificacion de los factores relevantes.La F GU 'I) 14 explica el control de la reinicic.­

cion al proponer que esta protefna es un factor decompetencia. Esta presente en elnucleo antes de Ii.replicacion. Un ciclo de replicacion desactiva 0 de ­truye el factor, y no puede ocurrir otro ciclO has-=.que se proporcione mas factor. El factor 10calizaGen el citoplasma puede acceder al material nucleiCsolo en la mitosis subsiguieme cuando se rompa :=.envoltura nuclear. Este sistema regulador cumpl­dos propositos. AI eliminar un componente necesar:despues de la replicacion, impide que ocuna mas c::un ciclo de replicacion. Tambien constituye un lazde retroalimentacion que hace que la iniciacion de:=.replicacion dependa del paso por la division celuk

lED El factor de competencia est::formado por protelnas MCM

HL

HH HL

densidad.....

LL

EI DNA en el nucleoliene una densidadligera

EI segundo cicio dereplicaci6n generaDNA pesado y DNAhibrido

La replicaci6nsemiconservadoragenera DNA dedensidad hibrida

EI DNA se replica enpresencia de precursorespesados

Permeabilizaci6n de laenvollura nuclear

Inyecci6n del nucleo al ovocito

>1 cicio de replicaci6n requiere factores citoplasmico~

por la presencia de un represor que impida la replica­cion repetida en los orfgenes que han sido utilizados.Las preguntas cruciales con respecto a la naturalezade este sistema regulador son: ccomo determina elsistema si un origen particular ha sido replicado? ycque componentes protefnicos intervienen?

Se ha conocido un poco la naturaleza de loscomponentes protelnicos al utilizar un sistema enel cual un DNA sustrato experimenta un solo ciclode replicacion. Los ovocitos de Xenopus tienen todoslos componentes necesarios para replicar el DNA(en las primera s horas posteriores a la fertilizacionrealizan 11 ciclos de division sin la expresion de ge­nes nuevos) y pueden replicar el DNA en un nucleoque es inyectado al ovocito. La r resumelas caracterfsticas de este sistema.

Cuando un espermatozoide 0 nucleo en inter­fase es inyectado a un ovocito, su DNA se replicasolo una vez (este episodio puede rastrearse conuna etiqueta de densidad, del mismo modo que enel experimento original en el que se definio la re­plicacion semiconservadora, mostrado antes en la

Un nucleo inyectado en un ovocito de Xeno­pus puede replicarse s6lo una vez a menos que la membrananuclear sea permeabilizada para permitir ciclos subsiguientesde replicaci6n.

386 CAPITULO 15 El replic6n

IIIIJ Resumen

seccion 16.4, Los drculos rodantes producen multf­meros de un replicon).

. - . . • I

Origen de la cadena L

Inicio de la sintesis de RNA

I La conclusion 0genera un circulo .duplex

l

CSe sellan las separaciones deo···.

. las cadenas nuevas

. .

La conclusion de la cadena L nueva Iibera los genomas hijos

I \

C- La conclusion EI genoma 0genera un liberado escirculo duplex parclalmente

- repllcado.

l

Cuando la cadenadesplazada pasa alorigen en la cadena L,inicia la sintesis de lanueva cadena H

o-E'DNA" ,'o\,\i,.,o

La sintesis de una cadena IL nueva crea un lazo D al 'tdesplazar a la cadena CD~progenltora

EI lazo 0 se expande

--.~

l

Cadena L

El cromosoma completo se replica una vez en cadacielo de division celular. La iniciacion de la repli·cacion obliga a la celula a experimentar un ci.elode division; la conclusion de la replicacion puededesencadenar el proceso de division en sf. El ero­mosoma bacteriano esta formado por un solo re­plicon, perc un cromosoma eucariotico se divide

El Lazo D mantiene una abertura en eL DNA mi­tocondrial de los mamiferos, La cuaL separa los origenes para Lareplicaci6n de cada cadena.

'ad cebadora (vease la seccion 18.8, La actividad::' adora es necesaria para comenzar la sfntesis de

__ -A). La replicacion en el origen de la cadena H- inicia cuando la polimerasa de R JA transcribe::: cebador. Los extremos 3' son generados en el_ ador por medio de una endonueleasa que di-

'e el hfbrido de DNA-R! A en numerosos sitios'cretos. La endonueleasa es especffica para la es­:.Ictura triple formada por el hfbrido de DNA-RNA

-as la cadena individual de DKA desplazada. Des­'es, la polimerasa de DNA extiende el extremo 3'interior del DNA.

En las mitocondrias de los mamfferos se encuen­~::l un solo lazo D en forma de una abertura de 500

600 bases. La cadena corta que mantiene ellazo_ es inestable y se voltea; a menudo es degradada y

tetizada de nuevo para mantener la abertura del:iplex en este sitio. Algunas moleculas de DNA mi­condrial poseen numerosos lazos D, 10 cual refleja

.: uso de mllltipies orfgenes. El mismo mecanisme:~ emplea en el DNA de los eloroplastos, en donde

y dos lazos D (en las plantas superi.ores).Para replicar el DNA mitocondrial de los ma·

Heros, la cadena corta localizada en el lazo D se:-xtiende. La region desplazada de la cadena L ori­~:nal se alarga y amplfa el lazo D. Esta expansion: ntinua hasta llegar a unos dos tercios del trayectouededor del drculo. La replicacion de esta region:,xpone un origen en la cadena L desplazada. La_fmesis de una cadena H inicia en este sitio, el cual_- utilizado por una primasa especial que sintetiza. RNA corto. Despues, el RNA es extendido por la

limerasa de DNA y avanza alrededor del moldeie la cadena individual L desplazada en la direccionpuesta a la sfntesis de la cadena L.

Como resultado del rezago en su inicio, la sfn­:esis de la cadena H habra avanzado solo un tercio

el trayecto alrededor del drculo cuando la sfntesis":e la cadena L finalice. Esto libera un cfrculo dllplex: mpleto y un drculo hendido, el cual permaneceparcialmente en forma de cadena individual hasta:;,ue la sfntesis de la cadena H coneluye. Por ultimo,.as cadenas nuevas se sellan para formar estructuras_'1tactas en terrninos covalentes.

La existencia de los lazos D da lugar a un princi­io general: Un origen puede ser una secuencia de DNA

.ale sirve para iniciar la sintesis de DNA utilizando una::1dena como molde. La abertura del duplex no siem­re conduce a la iniciacion de la replica cion en latra cadena. En el caso de la replicacion del DNA

:nitocondrial, los orfgenes para replicar las cadenascomplementarias se encuentran en localizacionesdiferentes. Los orfgenes que facilitan la replica­cion de solo una cadena tambien se encuentran enla forma de replicacion del drculo rodante (vease la

15.11 Resumen 389

en numerosos replicones que funcionan durante elprolongado periodo de la fase S. El problema de re­plicar los extremos de un replicon lineal se resuelveen una variedad de formas, con mayor frecuencia alconvertir el replicon en una forma circular. Algunosvirus tienen proteinas especiales que reconocen losextremos. Los cromosomas eucarioticos confrontaneste problema en sus replicones terminales.

EI orlgen minimo de E. coli esta formado por-245 bp e inicia la replicacion de forma bidireccio­nal. Cualquier molecula de DNA con esta secuenciapuede replicarse en E. coli. Dos horquillas de replica­cion abandonan el origen y se desplazan alrededordel cromosoma, al parecer hasta que se encuentran,aunque se han identificado las secuencias ter que ha­rfan que las horquillas terminaran despues de encon­trarse. Las unidades de transcripcion estan organiza­das de tal manera que la transcripcion prosigue casisiempre en la misma direccion que la replicacion.

La replicacion eucariotica es al menos un ordende magnitud mas lenta que la replicacion bacteria­na. Los orfgenes facilitan la replicacion bidireccionaly tal vez se utilicen en un orden predeterminadodurante la fase S. Los orfgenes de S. cerevisiae tienenuna secuencia nuclear de consenso formada por 11pares de bases, en su mayor parte A-T.

Despues de la division celular, los nucleos de lascelulas eucarioticas tienen un factor de competenciaindispensable para iniciar la replica cion. Su destruc­cion despues de la iniciacion de la replicacion impi­de que ocurran cielos de replicacion posteriores enlas levaduras. El factor de competencia no puede serimportado al interior del nueleo desde el citoplasmay puede ser remplazado solo cuando la membrananuclear se rompe durante la mitosis.

En las levaduras, el origen es reconocido por lasprotefnas del ORC, las cuales permanecen unidasdurante el ciclo celular en las levaduras. La protefnaCdc6 esta disponible s610 en la fase S. En las leva­duras es sintetizada durante la fase S y se degradacan rapidez. En las celulas animales se sintetiza demanera continua, pero es exportada desde el nucleodurante la fase S. La presencia de Cdc6 permite quelas protefnas MCM se unan al origen. Las protefnasMCM son indispensables para la iniciacion. La ac­cion de las protefnas Cdc6 y MCM constituyen lafuncion de competencia.

Referencias

l1li Introduccion

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390 CAPITULO 15 El replicon

IIIJ Los replicones pueden ser lineales 0 circulares

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IIiII Es posible elaborar el mapa de los origenescon autorradiografia y electroforesis

Articulo de investigacionHuberman, J. and Riggs, A. D. (1968). On the mechanisrr:

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III!II Cada cromosoma eucar;otico contiene numerososreplicones

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1m En las Levaduras pueden aisLarse Los origenesde repLicacion

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Referencias 391

Retrovirus yretroposones

ESQUEMA DEL CAPITULO J

550

Introducci6n

El cielo vital de los retrovirus comprende sucesossimilares a la transposici6n• Un retrovirus tiene dos copias de su genoma de RNA de

cadena unica.• Un provirus integrado es una secuencia de DNA de cadena

doble.• Un retrovirus genera un provirus mediante transcripci6n

inversa deL genoma retrovirico.

Los genes retroviricos codifican poliproteinas• Un retrovirus caracteristico tiene tres genes: gag, pol y env.• Las proteinas Gag y PoL se traducen a partir de un producto

de transcripci6n de longitud completa del genoma.• La traducci6n de PoL requiere un cambio de marco por eL

ribosoma.• Env se traduce a partir de un RNAm individual que se

genera por fragmentaci6n.• Cada uno de los tres productos proteinicos es procesado

por proteasas para dar origen a multiples proteinas.

El DNA virieo se genera por transcripci6n inversa• Se repite una secuencia corta (R) en cada extrema deL RNA

virico, de manera que los extremos 5' y 3' corresponden aR-U5 y U3-R, respectivamente.

• La transcriptasa inversa inicia la sintesis cuando un RNAtcebador se une a un sitio distante de 100 a 200 bases delextremo 5'.

• Cuando La enzima alcanza eL extremo, Las bases 5'terminaLes deL RNA se fragmentan, 10 que expone eLextremo 3' del producto DNA.

• Los pares de bases expuestos del extremo 3' se aparean conel extrema 3' de otro genoma de RNA.

• La sintesis continua y genera un producto donde lasregiones 5' y 3' se repiten, Lo que da a cada extremo Laestructura U3-R-U5.

• Ocurren episodios similares de cambio de cadenas cuandola transcriptasa inversa utiliza el producto DNA paragenerar una cadena complementaria.

• El cambio de cadenas es un ejemplo del mecanisme deselecci6n de copias de la recombinaci6n.

El DNA virico se integra al cromosoma• La organizaci6n del DNA provirico en un cromosoma

es la misma que en un transpos6n, donde el proviruses flanqueado por repeticiones directas cortas de unasecuencia en el sitio diana.

• EL DNA lineal se inserta en forma directa en eL cromosomadeL hospedador gracias a La acci6n de la enzima integrasaretrovi ri ca.

• Se pierden dos pares de bases de DNA de cada extreLa secuencia retrovirica durante la reacci6n de integ

Los retrovirus pueden hacer transducci6n desecuencias celulares• Los retrovirus en proceso de transformaci6n se gene

un suceso de recombinaci6n donde una secuencia dlcelular sustituye a una parte del RNA retrovirico.

Los elementos Ty de las levaduras se asemejlos retrovirus• Los transposones Ty tienen una organizaci6n similar

los retrovi rus end6genos.• Los transposones Ty son retroposones con actividad

transcriptasa inversa que reaLizan transposici6n a trun intermediario de RNA.

Muchos elementos susceptibles de transposiresiden en Drosophila melanogaster• Copia es un retropos6n abundante en D. melanogast

Los retroposones son de tres elases• Los retroposones de La superfamilia virica son transl

que se desplazan a traves de un RNA que no constitparticula infecciosa.

• Algunos retroposones se asemejan de manera directretrovirus en su uso de LTR, en tanto otros no tiene

• Se pueden encontrar otros elementos que fueron geipor un episodio de transposici6n mediada por RNA,por si mismos no codifican enzimas que puedan cat,transposici6n.

• Los transposones y retroposones constituyen casi Ladel genoma humano.

La familia Alu tiene muchos miembrosmuy dispersos• Una parte importante deL DNA repetitivo en genoma

mamifero esta constituida por repeticiones de una sfamilia, organizadas como transposones y derivadasproductos de transcripci6n de la polimerasa III de R

Los seudogenes procesados se originaron cosustratos para la transposici6n• Un seudogen procesado se deriva de una secuencia

RNAm por transcripci6n inversa.

Las LIN ES utilizan una endonueleasa para gEun extremo con actividad cebadora• Las LINES no tienen LTR y para cebar La transcripci6

inversa requieren que eL retropos6n codifique unaendonucleasa que genere una hendidura.

Resumen

RNA

RNA

·······..................•

·••" .····INTRACELULAR

EXTRACELULAR 't

ru " En Los cidos reproductivos de Los retrovirus y Losretroposones se aLterna la transcripci6n inversa de RNA a DNAcon La transcripci6n de DNA a RNA. S6Lo Los retrovirus puedengenerar particulas infectantes. Los retroposones se confinan aun cido intracelular.

..

• Un retrovirus tiene dos copias de su genoma de RNA decadena unica.

• Un provirus integrado es una secuencia de DNA decadena doble.

• Un retrovirus genera un provirus mediante transcripci6ninversa deL genoma retrovirico.

••.......•............•· .·I··················

'of

Conceptos principaLes

Los retrovirus tienen genomas de RNA de cadenaunica que se replican gracias a un intermediario deDNA de doble cadena. El cicio vital de un virus com­prende una etapa obligatoria en la que se insertaDNA de doble cadena en el genoma del hospedadorpor un episodio similar a la transposicion y que ge­nera repeticiones directas cortas de DNA diana.

La importancia de esta reaccion rebasa la per­petuacion del virus. Algunas de sus consecuenciasson que:

• Una secuencia retrovfrica integrada en lalfnea germinativa se mantiene dentro delgenoma celular como provirus end6geno.Al igual que un bacteriofago Iisogenico, unprovirus actua como parte del material ge­netico del organismo.

ED El cida vital de los retroviruscamprende sucesas similaresa la transpasici6nLa transposicion que comprende un intermediario

obligatorio de RNA es una propiedad exclusiva delas eucariotas y proviene de la capacidad de los re­trovirus de insertar copias de DNA (provirus) deun genoma virico RNA en los cromosomas de unaelula hospedadora. Algunos transposones eucario­

ticos se relacionan con provirus retrovfricos en suorganizacion general y experimentan transposiciona traves de intermediarios de RNA. Como clase, es­lOS elementos se llaman retroposones (0 a vecesretrotransposones) .

Los retroposones mas sencillos no tienen acti­vidad de transposicion, pero presentan secuenciasque los elementos activos reconocen como sustratospara la transposicion. Por 10 tanto, los elementosque usan una transposicion independiente de RNAvan desde los retrovirus mismos (que tienen capa­cidad para infectar con libertad celulas hospedado­ras), hasta secuencias con transposicion a traves deRNA, y hasta aquellos que por sf mismos no tienenla capacidad de transposicion. Comparten con todosos transposones la caracterfstica diagnostica de ge-erar repeticiones cortas directas de D A diana en

el sitio de una insercion.Incluso en genomas donde no se han detecta­

o los transposones activos se encuentran vestigiose episodios antiguos de transposicion en forma de

repeticiones diana directas que flanquean secuen­cias repetitivas dispersas. Las caracterfsticas de estassecuencias a veces comprenden una secuencia deRNA como progenitora de la secuencia geonomicaDNA), 10 que sugiere que el RNA debe haberse

convertido en una copia de DNA duplex que se in­serto en el genoma por un suceso similar a la trans­

osicion.Como cualquier otro cicio de reproduccion, el

e un retrovirus 0 retroposon es continuo; es arbi­rrario considerar como "inicio" el punto donde se. terrumpe. No obstante, la manera de ver estoselementos es parciaL por la forma en que suelenobservarse (FIGURA 22.~).

Los retrovirus se consideraron primero partf­culas vfricas infecciosas capaces de realizar trans­mision entre celulas y por ello se cree que el ciciointracelular (que comprende un DNA duplex) esun medio de reproduccion de virus RNA. Los re­troposones se descubrieron como componentes delgenoma, y las formas de RNA se han definido en sumayor parte por sus funciones como RNAm. As!,los autores consideran a los retroposones como se­cuencias genomicas (de DNA duplex) que puedenrealizar transposicion dentro de un genoma; no mi­gran entre celulas.

III Introducci6n

22.2 El cido vital de los retrovirus comprende sucesos similares a la transposici6n 55:

LTR LTRDNA lineal ~rJ

~ Integraci6n

I !ranscripci6ntlnversa

ifili Los genes retrovlricoscodifican poliprotelnas

rentes, pero relacionados, es posible que genere pa:­tfculas vfricas heterocigotas que portan un genoII::.-'.de cada tipo. La diploidia puede ser importante pacpermitir al virus adquirir secuencias celulares. Lc-,enzimas transcriptasa inversa e integrasa se tra .:>­

portan con el genoma dentro de la partfcula vfricc.

RNAVV'

FIGURA 22.2 El cido vital retrovirico procede por transcrip­ci6n inversa del genoma del RNA en DNA duplex, que se insertaen el genoma del hospedador para ser transcrito en RNA.

• En ocasiones se recombinan secuencias ce­lulares con la secuencia retrovfrica y des­pues se transportan juntas; estas secuenciaspueden insertarse en el genoma como se­cuencias duplex en nuevas localizaciones.

• Las secuencias celulares que experimen­tan transposicion por un retrovirus puedencambiar las propiedades de una celula cuan­do se infecta can el virus.

Las particularidades del cido de vida de los re­trovirus se ilustran en la FIGURA 22.2. Los pasos cru­ciales son que el RNA vfrico se convierte en DNA,el DNA se integra al genoma del hospedador, y des­pues, el provirus de DNA de transcribe en RNA.

La enzima encargada de generar la copia inicialde DNA a partir del RNA es la transcriptasa in­versa. La enzima convierte el RNA en una cadenaduplex lineal de DNA en el citoplasma de la celulainfectada. El DNA tambien se convierte en formascirculares, pero estas no parecen involucradas enla replicacion.

El DNA lineal se abre camino hacia el nudeo.Una 0 mas copias de DNA se integran al genoma delhospedador. Una sola enzima, lJamada integrasa,se encarga de la integracion. El proyjrus es transcri­to por la maquinaria del hospedador para producirRNA vfrico, que sirve como RNAm y como geno­mas para empaquetamiento dentro de viriones. Laintegracion es una parte normal del cido vital, in­dispensable para la transcripcion.

Dos copias del genoma RNA se empaquetan encada virion, 10 que hace a la particula vfrica indi­vidual eficazmente diploide. Cuando una celula esinfectada de manera simultanea por dos virus dife-

Conceptos principales

• Las proteinas Gag y Pol se traducen a partir de unproducto de transcripci6n de longitud completa delgenoma.

• La traducci6n de Pol requiere un cambio de marco porel ribosoma.

• Env se traduce a partir de un RNAm individual que segenera par fragmentaci6n.

• Cada uno de los tres productos proteinicos esprocesado par proteasas para dar origen a proteinasmultiples.

• Un retrovirus caracteristico tiene tres genes: gag, polenv.

Una secuencia retrovfrica usual contiene tres 0 cua­tro "genes". (En este cantex to el termino genes s'usa para identificar regiones codificantes, cada u c.de las cuales en realidad da origen a multiples pro­tefnas por reacciones de procesamiento.) Un gen ­rna retrovfrico habitual con tres genes se organiuen la secuencia gag-pol-env, como se indica en 1­FIGURA 22.3.

El RNArn retrovfrico tiene una estructura co ­vencional; presenta una cubierta en el extrema 5'~

esta poliadenilado en el extrema 3'. Se represent.:.en dos RNArn. Se traduce la longitud total de RNpara dar lugar a las poliprotefnas Gag y Pol. EI pr ­ducto Gag se traduce mediante la lectura desde e:codon de iniciacion hasta el primer codon de ter·minacion. Este ultimo debe ser pasado por alto pareque Pol se exprese.

Diferentes virus utili zan mecanismos diverso,para avanzar y dejar atras al codon de terminacio.gag, conforme a la relacion entre los marcos delectura gag y pol. Cuando gag y pol se continuan, Iesupresion por un glutamil-RNAt que reconoce e:codon de terminacion permite La generacion de une.sola protefna. Cuando gag y pol estan en diferente~

marcos de lectura, tiene lugar un cambio de marcribosomico que genera una sola protefna. Por 10 ge­neral, la leetura completa es - 5% eficaz, de maneraque la protefna Gag supera por casi 20 tantos a laprotefna Gag-Pol.

vv

~ Transcripci6n

RNAV\r

552 CAPiTULO 22 Retrovirus y retroposones

· .. . ~ ."...Genoma virico

-1800-2900

170-1260

I-cpilio1/--F::;m:;::::r U3 .-/

10-80

J81~-1~0'-·US' gag·

-2000

Cada gen genera varios productos proteinicos

Supresi6n 0 cambio ,Ide marco en el procesamiento...extremo de gag

........._-==-==--=.,.,=== - ......EI empalme produce Traducci6n IRNA subgen6mico ...Traducci6n ~

procesamiento~

Procesamiento!Gag

PolQ

Envo

MA = matriz (entre la nucleocapside y la envoltura virica)CA = capside (principal componente estructural)NC = nucleocapside (que empaqueta el dfmero de RNA)

PR = proteasa (escinde Gag-Pol y Env)RT =transcriptasa inversa (sintetiza DNA)IN = integrasa (integra el provirus DNA al genoma)

SU = protefna de superficie (las espigas sobre el viri6ninteractuan con el hospedador)

TM =transmembrana (media la fusi6n virus-hospedador)

FIGURA 22.3 Los genes de los retrovirus se expresan como poliprotejnas, que son procesadas haciaproductos individuales.

La poliproteina Env se expresa par otros me­dias: el empalme genera un mensajero subgen6mico,mas carta, que se traduce en el producto Env.

El gen gag da origen a los componentes protei­rucos del centro nucleoprotefnico del virion. El genpol codifica funciones encargadas de la sfntesis y re­combinacion de acidos nucleicos. El gen env codificacomponentes de la envoltura de la partfcula, quetambien secuestra componentes de la membranacitoplasmica de la celula.

Los productos Gag, Gag-Pol y Env son polipro­tefnas fragmentadas por una proteasa para liberarlas protefnas individuales que se encuentran en losviriones maduros. La actividad de proteasa es co­dificada por el virus en diversas formas: puede serparte de Gag 0 Pol y a veces adquiere la forma de unmarco de lectura independiente adicional.

La produccion de una partfcula retrovfrica com­prende el empaquetamiento del RNA en el centro,su rodeo por proteinas de la capside y la extraccionpor presion de un segmento de membrana de lacelula del hospedador. En la FIGURA 22.4 se muestrala liberacion de partfculas infecciosas por ese me ..dio. El proceso se revierte durante la infeccion: unvirus infecta una nueva celula al fusionarse con sumembrana plasmatica y luego liberar el contenidodel virion.

FIGURA 22.<1 Los retrovirus (VIH) experimentan gemaci6n des­de la membrana plasmatica de una celula infectada. Fotos porcortesia de Matthew A. Gonda, Ph.D., Chief Executive Officer,International Medical Innovations, Inc.

22.3 Los genes retroviricos codifican poliproteinas 553

Conceptos principales

F GI 2.. " El RNA retrovirico termina en repeticiones directas (R); elDNA lineallibre termina en LTR y el provirus concluye en LTR, acortadoscada uno por un par de bases.

fill El DNA VlrlCa se generapar transcripci6n inversa

duplex. Tiene una actividad de polimerasa que.­permite sintetizar un DNA duplex a partir del pr­ducto de transcripcion inversa de una sola cau:,­na del RNA. La segunda cadena de DNA en es- o

estructura duplex se denomina cadena de D1'_­positiva. Como adyuvante indispensable de es:.:actividad, la enzima tiene una actividad de RNA-'~

H, que puede degradar la porcion RNA del hili '.:RNA-DNA. Todas las transcriptasas inversas rerr-·vfricas comparten similitudes considerables de >secuencias de aminoacidos y se pueden reconoc::­secuencias homologas en algunos otros retrop05-·nes.

En la FIGURA 22.5 se comparan las estructuras :.~

las formas de DNA del virus con el RNA. El R:-.­vfrico tiene repeticiones directas en sus extrem :Esos segmentos R varfan de lOa 80 nucleotidos e­diferentes cepas de virus. La secuencia del extrec.::5' del virus es R-D5 y la secuencia en el extrem ~

es U3-R. Los segmentos R se usan durante la conY~­sian de la forma de RNA a la de DNA para gener=..:las repeticiones directas mas extensas que se obs~­

van en el DNA lineal (FIGURA 22 6 Y FIGURA 22.7). :::...acortamiento de 2 bp en cada extrema de la forr:::: 0

integrada es consecuencia del mecanismo de integE­cion (vease la Figura 22.9).

Al igual que con otras polimerasas de DNA. -0

transcriptasa inversa requiere un cebador. El cebc:.­dar natural es el RNAt. Hay un RNAt del hospe ."­dor, sin carga, en el virion. Se aparea una secueD 'de 18 bases en el extrema 3' del RNAt con las ( ­rrespondientes en un sitio que se encuentra a 10C :.200 bases de distancia del extremo 5' de una de .~

moleculas de RNA vfrico. El RNAt puede tambiaparear sus bases con un sitio cercano al extre ­5' del otro RNA vfrico, 10 que ayuda a la formaci'·de un dfmero entre los RNA vfricos.

He aquf un dilema: la transcriptasa inversa iL.:.­cia la sfntesis del DNA en un sitio apenas 100 a 2C =bases en sentido descendente respecto del extre5'. LComo puede generarse el DNA que represe :~

el genoma intacto de RNA? (Esta es una variac~

extrema del problema general en la replicacion ""los extremos de cualquier acido nucleico lineal; ve=.­se la seccion 16.2, Los extremos del DNA lineal sc;:­un problema para la replicacion.)

La sfntesis in vitro avanza hasta el final y ge­nera una secuencia de DNA breve llamada DK_-.de detencion fuerte-negativo. Esta molecula no :­encuentra in vivo porque la sfntesis continua por:"::reaccion ilustrada en la Figura 22.6. La transcripta.=­inversa cambia de moldes y se lleva al DNA nade .'con ella a un nuevo molde. Este es el primero '::dos saltos entre moldes.

En esta reaccion, la region R en el extrema ::del molde de RNA es degradada por la activid".::.

ILTR

U3 RU5-,

U5 ha perdido 2 bp

U3 R-1Q-80~-=':';'---

-1800 I170-1260

pol

pol

. ... . . .

-2900

eol

RNAvfrico

Forma lineal del DNA vfrico

-2000

gag

Forma de DNA vfrico integrado

U3 RU5 gag- -,

ILTR

250-1400 bp

Los retrovirus se denominan virus de cadenapositiva porque el propio RNA vfrico codifica losproduetos proteinicos. Como su nombre 10 indica,la transcriptasa inversa se encarga de convertir elgenoma (cadena RNA positiva) en una cadena com­plementaria de DNA que se denornina cadena deDNA negativa. La transcriptasa inversa tambiencataliza etapas posteriores de la produccion del DNA

• Se repite una secuencia corta (R) en cada extremo delRNA virico, de manera que los extremos 5' y 3' seanR-U5 y U3-R, respectivamente.

• La transcriptasa inversa inicia la sintesis cuando unRNAt cebador se une a un sitio distante de 100 a 200bases del extremo 5'.

• Cuando la enzima alcanza el extremo, las bases 5'terminales del RNA se fragmentan, lo que expone elextremo 3' del producto DNA.

• Los pares de bases expuestos del extremo 3' se apareancon el extremo 3' de otro genoma de RNA.

• La sintesis continua y genera un producto donde lasregiones 5'y 3' se repiten, lo que da a cada extremo laestructura U3-R-U5.

• Ocurren episodios simi lares de cambio de cadenascuando la transcriptasa inversa utiliza el producto DNApara generar una cadena complementaria.

• El cambio de cadenas es un ejemplo del mecanisme deselecci6n de copias de la recombinaci6n.

10-80 -':RU5

T80-100

Repetici6n de 4-6 bpdel DNA diana

. .~ . .

U3 ha perdido 2 bp

_----.-.1Hospedado U3 RU gag

554 CAPITULO 22 Retrovirus y retroposones

. .. .. ~ .

EI retrovirus provee la cadena positiva de RNA

R U5 • U3 Fl.5'· ~ I - '3'

5'

5'3'

5'

5'3'

5'

3'

5'

3'

.... LTR.....

m:rmrrmrrm1l············,U········

5'.LUConcluye la sfntesis del DNA decadena negativa

3' I I I "'TtFlr"FrrFlr""tIFFr""rrFFu"'r""rRn5'~·

....LTR~

5e degrada el RNA y quedan fragmentos Iresiduales para cebar la sfntesis de DNA .-

3'

Se retira el RNAI cebador3'

5'Concluye la sintesis de la cadenapositiva de DNA

3' 'rrrrrrrrrrrrrrrrr

Se sintetiza la cadena positiva dedetenci6n fuerte del DNA

~~ .~EI DNA de cadena positiva se transfiereal otro extrema de la cadena negativa ~en el segundo saito

3' ",.""",'FFlF"""'C'F'FI__rrtfrr.rrrmrrrn

3'

!

!

Se degrada la regi6n 5'terminal de la cadena )?de RNA

3'e~t~:~oo- 5' :!ol;;.~~IJJi!!:![J;i:!!Jj:!!!E~!:!E:!:I!:!U~f:!:Mi!:·!.!U!:!l~l~.3'

EI RNAt cebador hibridiza al sitiode uni6n sobre el RNAretrovirico ~

R U5&. U3 R5' . -, IiLIilLliUiULJ1l1.W 3'

La transcriptasa inversa inicia la sfntesis del DNA

de cadena negativa lr !• Cadena negativa'

3' .5' ruurn

IuL, I La slntesis de la cadena positiva de DNA requiereun segunda salta.

FIGURA 22.6 Se genera la cadena DNA negativa por media delcambia de molde durante la transcripcion inversa.

de RNAasa H de la transcriptasa inversa. Su retiropermite que la region R en el extrema 3' realiceapareamiento de bases con el DNA recien sintetiza­do. La transcripcion inversa continua despues porla region U3 hacia el cuerpo del RNA.

El origen de la region R que se aparea con elDNA de detencion fuerte-negativo puede estar enel extrema 3' de la misma molecula de RNA (apa­reamiento intramolecular), 0 el extrema 3' de unamolecula diferente de RNA (apareamiento intermo­lecular). Se usa el cambio a un molde diferente deRNA en la figura porque hay datos de que la se­cuencia del RNAt cebador no se hereda en un cidode vida del retroposon. (Si ocurriese apareamientointramolecular, se esperarfa que la secuencia se he­redara porque ofrecerfa la {mica fuente para la se­cuencia de union del cebador en el siguiente cido.El apareamiento intermolecular permite que otroRNA retrovfrico provea esta secuencia.)

El resultado del cambio y la extension es la adi­cion de un segmento U3 al extrema 5'. El segmen­to de secuencia U3-R-U5 se denomina repetici6nterminallarga (LTR) porque una serie similar deepisodios afiade un segmento U5 al extrema 3' y dalugar a la misma estructura de U5-R-U3. Su longi­tud varfa de 250 a 1400 bp (vease la Figura 22.5).

Ahora se necesita generar la cadena de DNApositiva y la LTR en el otro extremo. La reaccion semuestra en la Figura 22.7. La transcriptasa inversaceba la sfntesis de la cadena positiva de DNA a par­tir de un fragmento de RNA que queda despues dedegradar la molecula original de RNA. Se generauna cadena de DNA de detencion fuerte-positivocuando la enzima alcanza el extrema del molde.Este DNA se transfiere entonces al otro extremo deuna cadena negativa, donde tal vez se libere graciasa una reaccion de desplazamiento cuando ocurrauna segunda ronda de sfntesis de DNA a partir deun fragmento cebador en ubicacion mas alta (a suizquierda en la figura). Se hace uso de la regionR para el apareamiento con el extrema 3' de unacadena de DNA negativa. Este DNA de doble cade­na requiere entonces conduir ambas cadenas paragenerar una LTR duplex en cada extremo.

22.4 El DNA virica se genera par transcripci6n inversa 555

nismo para la recombinacion en general. Es p :::probable que se emplee en sistemas celulares, pcconstituye una base COmlIn para la recombinac.::­durante la infeccion por virus RNA, incluso aql.:.;:­lIos que se replican de manera exclusiva a traves-;:formas RNA, como los de la poliomielitis.

El cambio de cadenas ocune con cierta frecue::::­cia durante cada ciclo de transcripcion inversa, :::decir, ademas de la reaccion de transferencia q:..;:es forzada en el final de la cadena del molde. :::.principio se ilustra en la FIGURA 22.8, si bien no ::­sabe mucho del mecanismo. Ocune transcripci6=inversa in vivo en un complejo de ribonucleoprotc-·nas, donde la cadena molde de RNA se une a co ­ponentes del virion, incluida la principal prote~de la capside. En el caso del VIR, la adicion de es-..=:proteina (NCp7) a un sistema in vitro causa recomb:­nacion. El decto es probablemente indirecto: NCp·afecta la estructura del molde de RNA, 10 que a s-_vez altera la posibilidad de que la transcriptasa ir:.­versa cambie de una cadena molde a otra.

3'

, ..

La enzima se une a Iun nuevo molde t

5" -

5'.u..u..r..r '

. .. ".. "

La enzima se disocia Idel molde t

5,~~~~m!1~

Se reinicia la Itranscripci6n tinversa

La transcriptasa inversasintetiza la cadena de DNA

5'_-====-"",-~",~=-=-_3'

FIGURA 22.8 La recombinaci6n con selecci6n de copias tienelugar cuando la transcriptasa inversa libera su molde y reiniciala slntesis de DNA utilizando uno nuevo. Es probable que latransferencia entre las cadenas del molde ocurran de maneradirecta, pero aqui se muestra en pasos independientes parailustrar el proceso.

Ell El DNA virieo se integraal eromosoma

Conceptos principales

Cada panlcula retrovirica pona dos genomasde RNA. Esto hace posible que ocuna la recombi­nacion durante un ciclo vital virico. En principia,esto pudiese presentarse durante la sintesis de lascadenas negativa, positiva, 0 de ambas.

• El apareamiento intermolecular que semuestra en la Figura 22.6 permite que ocu­rra una recombinacion entre secuencias delos dos moldes sucesivos de RNA cuandose sintetiza la cadena de DNA negativa. Larecombinacion retrovirica es en su mayorparte debida a la transferencia de cadenasen esa etapa, cuando se traslada la cadenanaciente de DNA de un molde de RNA aotro durante la transcripcion inversa.

• Se puede sintetizar DNA de cadena positi­va de manera discontinua en una reaccionque comprende varias iniciaciones internas.Puede haber tambien transferencia de ca­denas durante esta reaccion, perc es menosfrecuente.

La caracteristica comLin de ambos episodios esque la recombinacion es consecuencia de un cambiode molde durante el acto de la sintesis de DNA. Istees un ejemplo general de un mecanismo de la re­combinacion lIamado selecci6n de capia. Durantemuchos anos se considero como un posible meca-

• La organizaci6n del DNA provirico en un cromosoma esla misma que en un transpos6n, donde el provirus esflanqueado por repeticiones directas cortas de unasecuencia en el sitio diana.

• El DNA lineal se inserta en forma directa en elcromosoma del hospedador gracias a la acci6n de laenzima integrasa retrovirica.

• Se pierden dos pares de bases de DNA de cada extremode la secuencia retrovirica durante la reacci6n deintegraci6n.

La arganizacion del provirus integrado se asemejaa la del DNA lineal. Las LTR en cada extremo delprovirus son identicas. EI extrema 3' de U5 cons­ta de una repeticion corta invertida con relacional extrema 5' de U3, de manera que la LTR mismatermina en repeticiones cortas invertidas. El DNAprovfrico integrado es como un transposon: la se­cuencia provirica termina en repeticiones inverti­das y flanqueada par repeticiones cortas directas delDNA diana.

Se genera el provirus cuando se inserta de ma­nera directa un DNA lineal a un sitio diana. (Ade­mas del DNA lineal hay formas circulares de lassecuencias vfricas.) Una tiene dos secuencias LTRadyacentes generadas por la union de los extremoslineales. La otra tiene solo una LTR, al parecer ge­nerada por un episodio de recombinacion y que enrealidad constituye la mayor parte de los drculos.

556 CAPITULO 22 Retrovirus y retroposones

-

Durante mucho tiempo parecio que el cfrculo po­drfa ser una integracion intermedia (por analogiacon la integraci6n del DNA A; hoy se sabe que seusa la forma lineal para la integracion) .

La integracion del DNA lineal es catalizada parun producto virico unico, la integrasa, que actua enel DNA lineal retrovfrico y el DNA diana. La reac­cion se ilustra en la FIGURA 22.9.

Los extremos del DNA virico son importantes.Par ejemplo, las mutaciones en los extremos de lostransposones impiden la integracion. La caracteristi­ca mas conservada es la presencia de una secuenciadel dinucleotido CA cerca del extremo de cada re­peticion invertida. La integrasa une los extremos delDNA lineal en un complejo ribonucleoproteinico ydespues convierte los extremos romos en otros enrecesion por el retiro de bases mas alIa del CA quese conserva. En general esto implica la perdida dedos bases.

Se eligen sitios diana en forma aleatoria conrespecto a la secuencia. La integrasa hace cortes es­calonados en un sitio diana. En el ejemplo de laFigura 22.9 los cartes estan separados por 4 bp. Lalongitud de una repeticion diana depende del virusparticular; puede ser de 4, 5 0 6 bp. Al parecer se

etermina por la geometria de la reaccion de la in­:egrasa con el DNA diana.

Los extremos 5' generados por la fragmenta­cion del DNA diana presentan union covalente con-os extremos 3' en recesion del DNA virico. En ese~unto ambos extremos del DNA vfrico se unen par

na cadena al DNA diana. La region de una sola ca­ena es reparada par enzimas de la celula del hos­

pedador, y durante esta reaccion se retiran las dosJases que protruyen en cada extrema 5' del DNA1rico. El resultado es que el DNA virico integradoha perdido 2 bp en cada LTR; esto corresponde a_a perdida de 2 bp desde el extremo izquierdo delU3 terminal y a la perdida de 2 pb desde el extre­:no derecho del U5 3' terminal. Hay una repeticioni:aracterlstica corta directa del DNA diana en cadaextrema de un genoma retrovfrico integrado.

El DNA virico se integra al genoma del hospeda-or en sitios seleccionados en forma aleatoria. Una

-Bula infectada recibe de una a 10 copias del provi­:us. (Un virus infeccioso entra al citoplasma, por su­puesto, pero la forma de DNA se integra al genoma::'n el nucleo.) Los retrovirus pueden replicarse solo en.::elulas proliferantes porque el ingreso al nucleo re­.:J.uiere que la celula pase por la mitosis, cuando el~enoma virico logra el acceso al material nuclear.

La region U3 de cada LTR porta un promotor.::::1 promotor en la LTR izquierda se encarga del ini­jo de la transcripcion del provirus. Recuerdese que~e requiere la generacion del DNA provfrico para'lbicar una secuencia de U3 en la LTR izquierda;

A ,... • ~.. ......

1. La integrasa genera dos ex1remos 2. La integrasa genera extremos3' con retraso de dos bases en LTR escalonados en el DNA diana

3. La integrasa vincula los extremos 3'can retraso de LTA a los ex1remos 5'escalonados de la diana

I~UPA 22 9 La integrasa es la (Jniea proteina viriea neeesariapara la reaeei6n de integraei6n, donde eada LTR pierde 2 bp yse inserta entre repetieiones de 4 bp del DNA diana.

por 10 tanto, se observa que el promotor es, de he­cho, generado par la conversion del RNA en DNAduplex.

A veces (tal vez con muy poca frecuencia), elpromotor en la LTR derecha facilita la transcripcionde las secuencias del hospedador cercanas al ciclode integracion. La LTR tambien !leva un reforzadar(una secuencia que activa a los promotores veci­nos), que puede actuar sobre las secuencias celulary vfrica. Tal vez a la integracion de un retrovirus sedeba que una celula hospedadora pase a un estadotumorigenico cuando se activan ciertos tipos de ge­nes en esta forma. i-Se pueden escindir del genomalos provirus integrados? Podria ocurrir recombina­cion homologa entre las LTR de un provirus; hayLTR solitarias presentes en algunos genomas celu­lares que podrian constituir vestigios de un episodiode escision,

Hasta ahora se han analizado los retrovirus enterminos del cicIo infectante, donde se necesita in­tegracion para la produccion de mas copias de RNA.No obstante, cuando un DNA virico se integra ala linea germinativa se convierte en un "provirusendogeno" originado en el organismo. Los virus en­dogenos por 10 general no se expresan, pero en oca­siones son activados por episodios externos, comouna infeccion con otro virus.

22.5 El DNA virieo se integra al eromosoma 557

cias celulares en la forma ilustrada en la FIGL

2 .1J. Parte de la secuencia virica ha sido sustituipor el gen v-onc. La sintesis de proteinas genera - =Gag-v-One en lugar de las proteinas usuales Gc.:­Pol y Env. El virus resultante presenta un defet:­to de la replicacion; no puede mantener un cicinfectante por si mismo. Sin embargo, puede pe:-­petuarse en compania de un virus auxiliar, q'~:

proporeiona las funeiones virieas faltantes.Las siglas Onc constituyen una abreviatura ~:

oncogenesis, la eapaeidad de transformar eelul::..eultivadas de manera que se liberen de la regulaei ­habitual del crecimiento y sea posible su divisi'-:­inestrieta. Los genes onc virico y celular pueden .~.

causa de la aparicion de eelulas tumorigenieas.Un gen v-onc confiere a un virus la eapaeidad'::

transformar un cierto tipo de celula hospedador::..Los loci con secueneias homologas que se eneue-·tran en el genoma del hospedadar corresponder: ~

genes c-onc. i.. Como adquieren los retrovirus gen::­onc? Una caracteristiea reveladora es la discrepCL:'cia en las estructuras de los genes c-onc y v-onc. Lgenes c-onc por 10 general son interrumpidos por i-­

trones, en tanto los v-onc no son interrumpidos. E5:.sugiere que los genes v-onc se ariginan de capias .::.:los genes c-onc empalmadas al RNA.

En la HGLP 2 11 se ilustra un modelo para :.=formacion de los virus en transformacion. Un ct­trovirus presenta integracion eerca de un gen c-c"Tiene lugar una delecion que origina fusion del p~'.virus al gen c-onc; la transeripcion genera enton(~

un RNA unido que eontiene secueneias virieas cun extremo y secuencias eelulares onc en el OL~El empalme retira los intrones de las partes viri~­

y celular del RNA. El RNA tiene las senales ape­piadas para el empaquetamiento dentro del viric=­se generaran viriones si la celula tambien cantic:otra copia intaeta del provirus. En este punto, 315'de las partfculas vfricas diploides puede eontener =RNA fusionado y un RNA vfrico.

Una reeombinacion entre estas secuencias '.drfa generar el genoma de transformacion, don.::.:hay repetieiones viricas en ambos extremos. (Gc­ne eon freeuencia alta la reeombinacion par \::..­rios medios durante el eielo infectante retroviricNo se sabe nada aeerca de sus requerimientos .::.:homologia en los sustratos, pero se supone que ­reaccion no homologa entre un genoma viricc ­la parte eelular del RNA fusionado proeede por~­

mismos meeanismos que se eneargan de la reco=.­binaeion viriea.)

Las earacteristieas eomunes de todas las ela :::de retrovirus sugieren que pueden derivarse de '_ancestro unieo. Los elementos de las seeuencias '­insereion (IS) primordiales podrian haber rodea.::.a un gen de polimerasa de acido nueleico del he

I Transcripci6n det otro provirus

Empaquetado en el viri6n

/l Empalme

Recombinaci6n del RNAl

Concepto principal

• Los retrovirus transformantes se generan par unepisodio de recombinaci6n donde una secuencia deRNA celular sustituye parte del RNA retrovirico.

Transcripci6n a partir dellprovirus can deJeci6n t

Los virus en transformaci6n can replicaci6ndefectuosa presentan sustituci6n de una secuencia celular paruna parte de la secuencia virica. El virus defectuoso puedereplicarse can la ayuda de un virus auxiliar que realiza lasfunciones naturales.

Virus auxiliarRU5.:9~9':~.~~·--:.-:-=0"1=-=~':;:;;;;;;;;;-;'U3~""R

I Las proternas del" virus auxiliar

M ~~pueden lograr·····la replicaci6n delvirus defectuoso

ED Los retrovirus pueden hacertransducci6n de secuenciascelulares

Virus defectuosoRU5 'gag ~~~~~~~~U3~RR~.

. . .....

Una informacion interesante acerca del cielo vitalvirico surge de la aparicion de virus de transduc­cion, que son variantes que han adquirido secuen-

..--- Provirus I ( gen e-one .......

LTR gag pol env LTR Ex6n Intr6n Ex6nW'A.~:wr'l.~~~~~~~gMj

DELECION

Se pueden generar genes can replicaci6n defectuosamediante la integraci6n y deleci6n de un genoma virico para obtenerun producto de transcripci6n celular-virica unido, que se empaquetacon un genoma normal de RNA. Se necesita recombinaci6n no hom6logapara generar el genoma de transformaci6n can replicaci6n defectuosa.

558 CAPITULO 22 Retrovirus y retroposones

pedador; la unidad resultante tendrfa la forma deLTR-pol-LTR, que pudiese evolucionar hacia un vi­rus infectante por la adquisicion de habilidades mascomplejas para manipular sustratos tanto de DNAcomo de RNA, incluida la incorporacion de genescuyos productos permitieran el empaquetamientodel RNA. Otras funciones, como la transformacionde genes, podrian incorporarse despues. (No haymotivo para suponer que el mecanismo involucradoen la adquisicion de funciones celulares sea exc1usi­vo de los genes one; no obstante, es posible que losvirus que portan estos genes tengan una ventajaselectiva debido a su efeeto estimulador del creci­miento celular.)

III Los elementos Tyde las levaduras se asemejana los retrovirus

Conceptos pr;nc;pales

• Los transposones Ty tienen una organizaci6n similar ala de los retrovirus end6genos.

• Los transposones Ty son retroposones con act;v;dadde transcriptasa inversa que realizan transposici6n atraves de un intermediario de RNA.

Los elementos Ty constituyen una familia de se­cuencias repetitivas dispersas de DNA que se en­cuentran en sitios diversos de cepas disimiles delevaduras. Las siglas Ty corresponden a una abre­viatura de "transposones de levadura" (del ingles,transposon yeast, Ty). Un episodio de transposicionda origen a un vestigio caracterfstico: 5 bp del DNAdiana se repiten a cada lado del elemento Ty in­sertado. Los elementos Ty son retroposones querealizan la transposicion por el mismo mecanismoque los retrovirus. La frecuencia de la transposicionTy es menor que la de gran parte de los transposonesbacterianos, -10-7-10-8 •

Hay mucha divergencia entre los distintos ele­mentos Ty. Casi todos entran en una de dos clasesprincipales llamadas Ty1 Y Ty917. Tienen la mismaorganizacion general ilustrada en la T "lJ , ....

Cada elemento tiene 6.3 kb de longitud; los liltimos330 bp en cada extrema constituyen repeticionesdirectas llamadas 8. Cada uno de los elementos Tyde cada tipo tiene muchos cambios respecto del pro­totipo de su clase, como las sustituciones, insercio­nes y deleciones de pares de bases. Hay - 30 copiasdel tipo Ty1 Y-6 del tipo Ty917 en un genoma carac­teristico de levadura. Ademas, hay -100 elementosdelta independientes llamados 8 solo.

Las secuencias delta tambien muestran muchaheterogeneidad, si bien es posible que las dos repe-

~----=~---:~==;;.....I) lyA lyS

--- RNA de 5.7 kb ----l.~

---RNA de 5.0 kb-.

Proteina TyA

Cambio de marco

2 12 Los elementos Ty terminan en repeticionesdirectas cortas y se transcriben en dos RNA superpuestos. Tie­nen dos marcos de lectura con secuencias relacionadas con losgenes retroviricos gag y pol.

ticiones de un elemento individual Ty sean identicas,o al menDs con una relacion muy cercana. Las se­cuencias delta vinculadas con elementos Ty muestranmayor conservacion de secuencias de los elementosdelta solo, 10 que sugiere que el reconocimiento de lasrepeticiones participa en la transposicion.

El elemento Ty se transcribe en dos especies deRNA poli(Aj+, que constituyen >5% del RNAm totalde una celula haploide de levadura. Ambas especiesinician en el interior de un promotor en el elemento8 en el extremo izquierdo. Uno termina despues de5 kb; el otro 10 hace despues de 5.7 kb, dentro de lasecuencia 8 en el extrema derecho.

La secuencia del elemento Ty tiene dos marcosde lectura abiertos que se expresan en la mismadireccion, pero se leen en fases diferentes y se su­perponen por 13 aminoacidos. La secuencia de TyAhace pensar que codifica una proteina de union alDNA. La secuencia de TyB contiene regiones conhomologfas con las secuencias transcriptasa inversa,proteasa e integrasa de los retrovirus.

La organizacion y las funciones de TyA y TyBson analogas de la conducta de las funciones gag ypol retrovfricas. Los marcos de lectura TyA y TyB seexpresan en dos formas. La protefna TyA representael marco de lectura TyA y termina en su extremo.Sin embargo, el marco de lectura TyB se expresa solocomo parte de una proteina de union, donde la re­gion TyA se fusiona con la region TyB gracias a unepisodio especifico de cambio de marco, que permitepasar por alto el codon de terminacion. (Esto es ana­logo a la traduccion de gag-pol en los retrovirus.)

La recombinacion entre elementos Ty pareceocurrir en salvas; cuando se deteeta un episodiohay una mayor probabilidad de encontrar otros.

22.7 Los elementos Ty de las levaduras se asemejan a los retrovirus 559

Se marca una unidad delta

Elemento Ty de inicio

EI promotor precede al elemento; se agregael intr6n

La transposicion da como resultado la aparicion -­multiples copias del transposon en el genoma delevadura, pero todas las copias carecen del intr6,

Se conoce solo una forma de retirar intrones: e:empalme de RNA 10 que hace pensar que la tra- .posicion tiene lugar por el mismo mecanismo _-.­en los retrovirus. EI elemento Ty se transcribe a:...::RNA que es reconocido por el aparato de desdob:c::­miento. Una transcriptasa inversa reconoce el R.: -_­desdoblado y regenera una copia de DNA duplex:

La analogfa con los retrovirus continua toda- ­mas. EI elemento Ty original tiene una diferenc.::de secuencia entre sus dos elementos delta. Sin e-­bargo, los elementos donde ocunio transposiciL ­poseen secuencias delta identicas, que se derivan c.~

delta 5' del elemento original. Si se considera a .secuencia delta exactamente como una LTR, CO-­

sistente en las regiones U3-R-U5, el RNA de Tr ~=

extiende de una region R a otra. Asf como se mue>tra para los retrovirus en las Figuras 22.3 a 22.6. ~­

regenera la LTR completa cuando se agrega un i.-=al extremo 3' y un U3 al extremo 5'.

La transposici6n es controlada por genes de-·no del elemento Ty. El promotor GAL utilizado PeL':'controlar la transcripcion del elemento Ty marca C

es inducible: se activa con la adicion de galactosa. - =

induccion del promotor tiene dos efectos. Es necc­sario activar la transposici6n del elemento marcac.y esta tambien aumenta la frecuencia de transpo~­

cion de los demas elementos Ty en el cromoso =de la levadura, 10 que implica que los productos -~

elemento Ty pueden actuar en conformacion tTC.'

sobre otros elementos (en realidad sobre sus RNEl elemento Ty no da origen a partfculas infe.:.­

ciosas, pero se acumulan partfculas similares a virc:(del ingles virus-like particles, VLP) en el interior c=las celulas donde se ha inducido la transposici6­Las partlculas, que se pueden observar en la FIGL22.14, contienen RNA de longitud completa, D1\_-.de doble cadena, actividad de transcriptasa inver~~

y un producto TyB con actividad de integrasa. :::..producto TyA es fragmentado como un precurs :­gag para producir las protefnas centrales madura.idel VLP. Esto aumenta todavfa mas la analogfa entre:el transpos6n Ty y los retrovirus. En resumen, t

elemento Ty actua como un retrovirus que perill­su gen env y, por tanto, no puede empaquetar bie:::.su genoma.

No todos los elementos Ty de cualquier genorP-~

de levadura estan activos: la mayor parte de ellos h::perdido la capacidad de transposicion (y son ani­logos a provirus endogenos inertes). No obstanteestos elementos "muertos" conservan las repetici ­nes delta y, en consecuencia, proveen dianas par::la transposicion en respuesta a las protefnas sinte·tizadas por un elemento activo.

·.-

Intr6n

~*

Promotor

Sustituci6n de bases

I*~

Los elementos con transposici6n tienendeltas notorias, sin intr6n

Hay conversion genetica entre elementos Ty en di­ferentes localizaciones, con el resultado de que unoes "sustituido" por la secuencia del otro.

Los elementos Ty pueden escindirse medianterecombinacion homologa entre las secuencias deltade repeticion directa. Es posible que el gran numerode elementos 8 solo constituya un vestigio de dichosepisodios. Una escision de esta naturaleza puedeasociarse a la reversion de una mutacion causadapor la insercion de Ty; el grado de reversion puededepender de las secuencias delta exactas que que­daron atras.

Es una paradoja que ambos elementos deltatengan la misma secuencia y, no obstante, un pro­motor esta activo en el delta de un extremo y unterminador esta activo en el delta del otro extremo.(Se encuentra una caracterfstica similar en otroselementos susceptibles de transposicion, incluidoslos retrovirus.)

Los elementos Ty son retroposones caracterfs­tieos, ya que realizan transposicion a traves de unintermediario de RNA. En la FIGuRA 22 13 se incluyeun esquema ingenioso que permite detectar esteepisodio. Se inserto un intron en un elemento paragenerar una secuencia Ty exclusiva. Esta secuenciase coloco bajo el control de un promotor GAL en unplasmido y se introdujo en las celulas de levaduras.

f v A 2". 3 Un elemento Ty unico sometido a procesos deingenieria para contener un intr6n, experimenta transposici6npara formar capias que carecen del intr6n. Las copias pose enrepeticianes terminales identicas, que se generan desde unode los extremos del elemento Ty original.

560 CAPITULO 22 Retrovirus y retroposones

FIGURA 22.14 Los elementos Ty generan particulas similares avirus. Reproducida de J. Mol. BioI., vol. 292, AL-Khayat H. A.,et al., Yeast Ty retrotransposons... , pp. 65-73. Copyright 1999,con autorizaci6n de Elsevier. Foto por cortesia del Dr. Hind A.AL-Khayat Imperial College London, United Kingdom.

III Muchos elementos susceptiblesde transposici6n residenen Drosophila melanogaster

Concepto principal

• [apia es un retropos6n abundante en Drosophilamelanogaster.

La presencia de elementos susceptibles de transpo­sicion en D. melanagaster se dedujo por primera vezdespues de observaciones analogas a aquellas conque se identificaron las primeras secuencias de inser­cion en E. cali. Se encuentran mutaciones inestablesque revierten al tipo silvestre por deleci6n, 0 quegeneran deleciones del material de los flancos conun punta terminal en el sitio de origen de la muta­cion. Son causadas por varios tipos de secuenciassusceptibles de transposicion, que se ilustran en laFIGURA 22 15. Estas secuencias incluyen al retropo­son capia, la familia FB y los elementos P analizadosantes en la seccion 21.14, Participacion de los ele­mentos susceptibles de transposicion en la disgenesiade hfbridos.

La familia mejor descrita de retroposones escapia. Su nombre refleja la presencia de un grannumero de secuencias relacionadas muy de cercaque codifican abundantes RNAm. La familia capiase toma como paradigma para varios otros tipos deelementos con secuencias que no tienen relacion,pero cuya estructura y conducta general parecensimilares.

EI numero de reproducciones del elemento ca­9ia depende de 1a cepa de 1a mosca; por 10 general esde entre 20 y 60. Los integrantes de la familia estan

Repeticiones directas

~~20-60 capias

Repeticianes invertidas

Repeticiones invertidas largas

-----~_.._..FB

-30 capias

Repeticiones invertidas cortas

r----~ 2900 bp _

P ~oa -50 capias

HGURA 22 lS Tres tipos de elementos de transposici6n en D.melanogaster tienen diferentes estructuras.

bastante dispersos. Las localizaciones de los elemen­tos capia muestran un espectro diferente (si bien consuperposicion) en cada cepa de D. melanagaster.

Estas diferencias han surgido durante periodosevolutivos. Las comparaciones de cepas que hantenido divergencia en fechas recientes (durante losultimos 40 afios) como resultado de su propagacionen ellaboratorio revelan pocos cambios. No se pue­de calcu1ar e1 ritmo del cambio, pero la naturalezade los sucesos subyacentes queda de manifiesto porel resultado de las celulas que crecen en cultivo. EInumero de elementos capia por genoma aumentade manera sustanciaL hasta el triple. Los elementosadicionales representan inserciones de secuenciascapia en sitios nuevos. La adaptacion al cultivo en al­guna forma desconocida aumenta de manera tran­sitoria la tasa de transposicion dentro de los lfmitesde 10-3 a 10-4 episodios por generacion.

EI elemento capia tiene -5 000 bp de longitud,con repeticiones directas terminales identicas de 276bp. Cada una de las repeticiones directas termina enrepeticiones invertidas relacionadas. Una repeticiondirecta de 5 bp de DNA diana se genera en el sitiode insercion. La divergencia entre cada uno de losintegrantes de la familia capia es pequefia, de <5%;las variantes suelen contener pequefias deleciones.Todas estas caracterfsticas son comunes a otras fa­milias sirnilares a copia, si bien sus miembros indi­viduales muestran mayor divergencia.

La identidad de las dos repeticiones directas decada elemento capia indica gue interactLlan parapermitir sucesos de correccion 0 que ambas son ge­neradas a partir de una de las repeticiones directasde un elemento progenitor durante la transposicion.

22.8 Muchos elementos susceptibles de transposici6n residen en Drosophila melanogaster 561

Como en el caso similar de los elementos Ty, estohace pensar en una relacion con los retrovirus.

Los elementos capia en el genoma siempre estanintactos; no se han detectado copias individuales delas repeticiones terminales (aunque seria de esperarque se generasen si la recombinacion produjese de­lecion del material interpuesto). En ocasiones se en­cuentran elementos capia en forma de DNA circularlibre; al igual que los circulos de DNA retrovirico, suforma mas prolongada tiene dos repeticiones termi­nales y la mas corta tiene solo una. Se han comuni­cado particulas que contienen RNA de capia.

La secuencia capia contiene un solo marco delectura largo de 4227 bp. Hay homologias entrepartes del marco de leetura abierta de capia y lassecuencias gag y pal de los retrovirus. Es notablela ausencia de las homologias de alguna relacioncon secuencias retroviricas env indispensables parala envoltura del virus, 10 que significa que es pocoprobable que capia pueda generar particulas simi­lares a virus.

Los productos de transcripcion capia se encuen­tran como RNAm poli(A», que representa produc­tos de transcripcion de longitud total y parcial. LosRNAm tienen un extremo 5' COmLll1 derivado dela iniciacion a la mitad de una de las repeticionesterminales. Se producen varias proteinas, tal vezgracias a episodios como el empalme de RNA y lafragmentacion de poliprotefnas.

No se cuenta con pruebas directas del modo detransposicion de copia; como resultado, hay tantassimilitudes can la organizacion retrovirica que pare­ce inevitable que copia tenga un origen relacionadocon los retrovirus. Es dificil decir cuantas funcionesretroviricas posee capia. Se sabe, por supuesto, queefectua transposicion, pero (como en el caso de loselementos Ty) no hay pruebas de que tenga algunacapacidad infecciosa.

.. .- . ~ -

ED Los retroposonesson de tres clases

Conceptos principales

• Los retroposones de la superfamilia virica sontransposones que se desplazan a traves de un RNA que

no constituye una particula infecciosa.

• Algunos retroposones se asemejan de manera directa aretrovirus en su uso de LTR, en tanto otros no tienen

LTR.

• Se pueden encontrar otros elementos que fuerongenerados por un episodio de transposici6n mediada

por RNA, perc por si mismos no codifican enzimas que

puedan catalizar la transposici6n.

• Los transposones y retroposones constituyen casi la

mitad del genoma humano.

Se define a los retroposones por su uso de mecan':.::­mos de transposicion que comprenden la transcIi;­cion inversa de RNA en DNA. Se conocen tres cla c..de retroposones, incluidos en la FIr. I 2.16:

• Los rniembros de la superfanlilia virica G­

difican actividades de transcriptasa invers-.:.integrasa, 0 ambas. Al igual que otros retr,-,posones, se reproducen de la misma manE­ra que los retrovirus, pero difieren de ell,:'_porque no pasan por una forma infecci xindependiente. Se describen mejor en Ie_elementos Ty y capia de levaduras y mosc:zs

• Las secuencias repetidas largas dispers~_

(LINES) tambien tienen actividad de tra.r.:s­criptasa inversa (y pueden, por tanto, cor.­siderarse como constitutivas de miembrc_mas distantes de la superfamilia viricapero carecen de LTR y usan un mecallisdiferente al de los retrovirus para cebar ~reaccion de transcriptasa inversa. Proviene::.

.. .. ~ ... . ;. :

Superiamilia virica LINES Superiamilia no virica

Tipos frecuentes Ty (5. cerevisiae)copia (0. melanogaster)

Terminaciones

Repeticiones endianasActividadesenzimaticas

Organizacion

Repeticiones terminaleslargas4-6 bp

Transcriptasa inversa,integrasa, 0 ambas

Puede contener intrones(retirados en el RNAmsubgenomico)

L1 (humano)81,82 ID, 84(raton)

Sin repeticiones

7-21 bp

Transcriptasa inversao endonucleasa

Uno 0 dos ORFininterrumpidos

SINES (mamiferos)Seudogenes deproductos de transcripcionde pol IIISin repeticiones

7-21 bp

Ninguna (0 ninguna quecodifique productos detransposones)Sin intrones

I • Los retroposones pueden dividirse en las superfamilias viricas, que son similaresa retrovirus 0 LINES, y superfamilias no viricas, que no ejercen funciones de codificaci6n.

562 CAPITULO 22 Retrovirus y retroposones

int

LTRORF

pol

gag

gagLTR

Ty • TyA

CopiaLTR

LINES - -[_.,~O_R_F_1.a-_....==..;.O~R-=-F-_2--,

Homologfa con

Retrovirus

Los retroposones que se relacionan muy de cer­ca con los retrovirus tienen una organizaci6n similar, pero lasLINES comparten s6lo la actividad de transcriptasa inversa.

secuencias relativamente cortas relacionadas entresf (constituidas por el DNA con repeticion moderadadescritas en la seccion 4.6, Genomas eucarioticosque contienen secuencias de DNA repetitivas y norepetitivas. Las LINES incluyen secuencias dispersaslargas y las SINES, secuencias dispersas cortas. (Sedescriben como secuencias dispersas 0 repeticio­nes dispersas, por su presencia comun y distribu­cion generalizada).

Las plantas contienen otro tipo de elementomovil pequeno llamado MITE (que correspondea un elemento invertido de transposicion repetidaen rniniatura). Tales elementos terminan en repe­ticiones invertidas, tienen una secuencia diana de2 0 3 bp, no presentan secuencias de codificacion ytienen de 200 a 500 bp de longitud. Hay al menDsnueve de tales familias (por ejemplo) en el genomadel anoz. A menu do se encuentran en regiones queflanquean genes que codifican proteinas. No tienenrelacion con SINES 0 LINES.

Las LINES y SINES constituyen una parte signi­ficativa del DNA repetitivo de los genomas animales.En muchos genomas eucarioticos elevados ocupan-50% del DNA total. En la se resume ladistribucion de los diferentes tipos de transposones,que constituyen casi la mitad del genoma humano.Excepto por las SINES, que casi siempre carecen defuncion, los otros tipos de elementos estan consti­tuidos por representantes funcionales y otros quehan sufrido deleciones que eliminaron parte de losmarcos de lectura que codifican las proteinas nece­sarias para la transposicion. Los porcentajes relati­vos de estes tipos de transposones son, en general,similares en el genoma de raton.

Una LINES comun en genomas de mamiferosse denomina Ll. EI miembro usual tiene - 6500bp Y termina en un segmento rico en A. Los dosmarcos de lectura abierta de un elemento de longi­tud total se denominan ORFI y ORF2. El nlimero

de productos de transcripcion de la polime­rasa II de RNA. Una muy escasa parte de loselementos en el genoma tiene funcion com­pleta y puede efectuar transposicion de ma­nera autonoma; otras presentan mutacionesy por ella solo pueden hacer transposicioncomo resultado de un elemento autonomoque actua en configuracion trans.

• Los miembros de la superfamilia no viri­ca se identifican par caracteristicas externase internas que sugieren que provienen desecuencias de RNA. Sin embargo, en estoscasos solo se puede especular acerca de comose genera una copia de DNA. Se supone queeran diana de un episodio de transposicionpor un sistema enzimatico codificado en otrositio, 0 sea, siempre carecieron de autonomia.Se ariginaron en praductos de transcripcioncelular. No codifican proteinas con funcio­nes de transposicion. El componente masprominente de esta familia recibe el nom­bre de secuencias repetidas dispersas cortas(SINES). Estos componentes se derivan deproductos de transcripcion de la polimerasaIII de RNA.

La muestra las relaciones de orga-~zacion y secuencia de los elementos que codifican.a transcriptasa inversa. Al igual que los retrovirus,os retroposones que contienen LTR se puedenlasificar por grupos de acuerdo con el numero de

marcos de lectura independiente para gag, pol e int yel orden de los genes. A pesar de esas diferencias su­~erficiales de organizacion, la caracteristica comunes la presencia de actividades de transcriptasa inver·a e integrasa. Los elementos LINES de mamiferosomunes tienen dos marcos de lectura; uno codifica

wa proteina de union de acido nucleico y la otra laactividad de transcriptasa inversa y endonucleasa.

Los elementos que contienen LTR pueden va­!iar de retrovirus integrados a retroposones que han

erdido la capacidad de generar partlculas infeccio­-as. Los genomas de levadura y mosca tienen ele­~entos Ty y copia que no pueden generar particulas:nfecciosas. Los genomas de mamifero contienen:etrovirus endogenos que, cuando estan activos,

ueden generar particulas infecciosas. EI genomade raton tiene varios retrovirus endogenos activos

ue son capaces de generar particulas que propaganinfecciones horizontales. Por contraste, casi todos.05 retrovirus endogenos perdieron su actividad

ace casi 50 millones de aiios en ellinaje humane:' el genoma tiene hoy en su mayor parte restos:nactivos de los retrovirus endogenos.

Las LINES y SINES constituyen una parte im­ortante del genoma animal. En un principio se

definieron por la existencia de un gran numero de

22.9 Los retroposones son de tres clases 563

.. .Elemento Organizaci6n Longilud (Kb) Genoma humano

Numero Fracci6n

<0,3 1 500 000

~ :. Transposasa ~ 2-3 300 000

Retrovirus /retropos6n

LINES (aut6nomo). p, ej, L1

SINES (no aut6nomo), p, ej,. Alu

Transpos6n de DNA

• ,gag pol '~'mi!iii1[i

ORF1 "7p'ol) - .1-11 450 000

6-8 850 000

8%

17%

15%

3%

FTr.LJ A 27. 18 Cuatro tipos de elementos de transposici6n constituyen casi la mitad del genomahumano.

de elementos de longitud total suele ser pequeno(-50) y el resto de las copias son truncas. Se pue·den encontrar productos de transcripcion. Como 10indica su presencia en el DNA repetitivo, la familiaLINES muestra variacion de secuencias entre miem­bros individuales. Sin embargo, los integrantes dela familia dentro de una especie son relativamentehomogeneos en comparacion con la variacion ob·servada entre dos especies. Ll es ellmico miembrode la familia LI.I\TES que ha estado activo en los lina­jes de raton 0 humano. Parece haber permanecidomuy activo en el raton, pero ha declinado en ellinaje humano.

Solo ha habido una SINES activa en el linajehumano, el elemento comun Alu. El genoma deraton tiene una contraparte de este elemento, B1, Ytambien otros SINES (B2, ill, B4) que han presenta·do actividad. El Alu humano y el SINES BIde ratontal vez provengan del RNA 7SL (vease la seccion22.10, La familia Alu tiene muchos miembros muydispersos). El otro SINES de raton parece haberseoriginado de un producto de transcripcion inversade RNAt. Es probable que la transposicion de SThTESse deba a que un elemento activo Ll las reconocecomo sustratos.

fDD La familia Alu tiene muchosmiembros muy dispersos

Concepto principal

• Una parte importante del DNA repetitivo en genomasde mamiferos consta de repeticiones de una solafamilia, organizadas como transposones y derivadas deproductos de transcripci6n de la polimerasa III de RNA.

Las SINES mas notorias incluyen miembros de unasola familia, Su breve longitud y alto grado de repe­ticion las hacen comparables al DNA de secuenciassimples (satelitej, excepto que los miembros indi­viduales de la familia estan dispersos en el genomaen lugar de confinados a grupos seriados. De nuevo,

564 CAPITULO 22 Retrovirus y retroposones

hay similitud significativa entre los miembro;;una especie en comparacion con la variacion e­especies.

En el genoma humano, una gran parte del~,

moderadamente repetitivo se encuentra cornecuencias de - 300 bp que estan entremezcladas :DNA no repetitivo. Al menos la mitad del marcdoble desnaturalizado es fragmentado por la ede restriccion AluI en un solo sitio localizado 17:adelante en la secuencia. Las secuencias fragn::=­tadas pertenecen todas a una sola familia con ..=.como familia Alu, de acuerdo con los medi :identificacion. Hay - 300 000 miembros en e: ~.

noma haploide (equivalentes a un miembro .:kb de DNA). Las secuencias individuales Alu tie- _dispersion amplia. Hay una familia de secuer:­relacionadas presente en el raton (donde los 50:miembros se denominan familia B1) en el cn ':.zchino (donde se llama familia equivalente All;en otros mamiferos.

Cada uno de los miembros de la familia .'_tiene relacion mas que ser identicos. La familia :::._mana parece haberse originado por una duplica . ­en serie de 130 bp con una secuencia no relacio ~'

de 31 bp insertados en la mitad derecha del dimeLas dos repeticiones a veces se denominan "rn:-­izquierda" y "mitad derecha" de la secuencia ,~_

Cada integrante de la familia Alu tiene una ide:-­dad promedio de 87% con la secuencia de conse=.:La unidad de repeticion BIde raton tiene 13C :0­

de longitud y corresponde a un monomero deunidad humana. Tiene homologfa de 70 a 80% .la secuencia humana.

La secuencia Alu tiene relacion con el RNA -; =­un componente de la partkula de reconocimientC' ­senal (vease la seccion 10.9, La SRP interactua :el receptor SRP). El RNA 7SL corresponde a la Ill:::':'izquierda de una secuencia Alu con una inserc ­en medio. Asl, las 90 bases terminales 5' del ~. ,7SL son homologas con el extremo izquierdAlu, las 160 bases centrales del RNA 7SL no tie;:homologfa con Alu y las 40 bases terminales 3'

RNAm

RNA nuclear

RNA de 7SL son homologas con el extrema derechode Alu. EI RNA 7SL es codificado por genes que lapolimerasa III de RNA transcribe de manera activa.Es posible que estos genes (u otros relacionados conellos) den origen a las secuencias inactivas Alu.

Los miembros de la familia Alu se asemejan atransposones porque estan flanqueados por repe­ticiones directas cortas. Muestran, no obstante, lacuriosa caracterfstica de que las longitudes de re­peticion son diferentes para cada miembro de lafamilia. Se derivan de productos de transcripcionde la polimerasa III de RNA y, como resultado, esposible que cada miembro porte promotores activosinternos.

Se ha encontrado una diversidad de propieda­des de la familia Alu, y su ubicuidad ha originadomuchos indicios respecto de su funcion. No obstan­te, aun no es posible discernir su fundon real.

Al menos algunos miembros de la familia Alupueden transcribirse en RNA independientes. En elcriceto chino algunos (aunque no todos) miembrosde la familia equivalente a Alu parecen tener trans­cripcion in vivo. Se encuentran unidades de transcrip­cion de ese tipo en la vecindad de otras unidades detranscripcion.

Los miembros de la familia Alu pueden incluir­se dentro de unidades de transcripcion de genes es­tructurales, segun se observa por su presencia en elRNA nuclear largo. La presencia de copias multiplesde la secuencia Alu en una sola molecula nuclearpuede generar la estruetura secundaria. De hecho,la presencia de miembros de la familia Alu en formade repeticiones invertidas se encarga de la mayorparte de la estructura secundaria que se encuentraen el RNA nuclear de los mamfferos.

filii Los seudogenes procesadosse originaron como sustratospara ta transposici6n

Concepto principal

• Un seudogen procesado proviene de una secuencia deRNAm por transcripci6n inversa.

Cuando una secuencia generada por transcripcioninversa de un RNAm se inserta en el genoma, sepuede reconocer su relacion con el gen a partir delcual se transcribio el RNAm. Tal secuencia se deno­mina seudogen procesado para reflejar el hechode que se proceso a partir del RNA y es inactivo.En la FIGURA 22.19 se comparan las caracterfsticasespedficas de un seudogen procesado con las delgen original y el RNAm. La figura muestra todas las

..Ex6n 1 Intr6n Ex6n 2 Intr6n Ex6n 3

~~e~rumPidO~O\J'J\.~~ ~

l~AAAAAAAAEI extrema 5' corresponde EI extrema 3' tienecon el RNAm un segmento A-T

Seudogen ~~YJ\.IO\.W\.W\.~~~~'f1~~«h\procesado I - Tira continua de exones ...... I

Repetici6n corta directa Repetici6n carta directadel DNA diana del DNA diana

FIGURA 22.19 Pueden surgir seudogenes por transcripci6n inversa apartir del RNA para formar DNA duplex, que se integran al genoma.

caracterfsticas diagnosticas impartantes, de las quesolo algunas se encuentran en cualquier ejemploindividual. Cualquier producto de transcripcionde la polimerasa II de RNA pudiese, en principio,dar origen a tal seudogen y hay muchos ejemplosque incluyen los seudogenes procesados de globi­na, que fueron los primeros en descubrirse (veasela seecion 3.11, Los seudogenes son callejones sinsalida de la evolucion).

El seudogen puede inieiarse en el punto equi­valente al extrema 5' del RNA, circunstancia queserfa de esperar solo si el DNA se hubiese ariginadodel RNA. Varios seudogenes constan de secuenciasexanicas unidas de manera precisa; no se conocenmecanismos para reconocer intrones en el DNA, por10 que esta circunstancia constituye un argumen­to a favor de una etapa mediada pOl' el RNA. EIseudogen puede terminal' en un segmento corto depares de bases A-T al parecer derivadas de la colapoli(A) del RNA. A cada lado del seudogen hay unarepeticion corta directa que parece haberse genera­do por un episodio similar a la transposicion. Losseudogenes procesados residen en localizaciones norelacionadas con sus sitios de origen supuestos.

Los seudogenes procesados no portan ningunainformacion que pudiera servir para respaldar unsuceso de transposicion (0 llevar a cabo la transcrip­cion inversa precedente del RNA). Esto hace pensarque el RNA era sustrato para otro sistema y codifi­cado par un retroposon. De hecho, parece que loselementos LINES activos proveen gran parte de laactividad de transcriptasa inversa y que se encarganno solo de su propia transposicion, sino tambien deactuar sobre las SINES y generar seudogenes pro­cesados.

22.11 Los seudogenes procesados se originaron como sustratos para la transposici6n 565

...

Inserci6n deuna copiade un DNAen un sitionuevo

CITOSOL ~

CI:::) ...~

EI DNA",,,,,p,~n. ­de 3'·OHEIRNAesel~

molde ~

~/-"RlIN,nA

~

_/~EI DNA sustituye~ Ial RNA t

Se crea un intr6npor recombinacion ...;=~~~~~~~~

La hendidura proporcionaun extrema de cebaci6n

~l" f • Se transcribe una LINES hacia un RNA que ;:traduce en proteinas que se ensamblan en un complejo e­el RNA. El complejo se transloca al nucleo, donde inserta U~

copia de DNA en el genoma.

:G ~ 2 2' La retrotransposici6n de elementos diferente.=a LTR ocurre por formaci6n de una hendidura en La diana c ­el fin de proveer un cebador para la sintesis de DNAc sobre ­molde de RNA. Las puntas de flecha indican extremos 3'.

Los elementos de LINES y algunos otros no terminanen las LTR caracteristicas de los elementos retrovl­ricas. Esto lleva a la interrogante: (. Como se cebala transcripcion inversa? No comprende la reaccioncomun donde el cebador de RNAm se aparea conel LTR (vease la Figura 22.6). Los marcos de lecturaabierta en estos elementos carecen de muchas de lasfunciones retroviricas, como dominios de proteasao integrasa, pero par 10 general tienen secuenciassimilares a la transcriptasa inversa y codifican unaactividad de endonucleasa. En la LINES LI humana,ORFI es una proteina unida a DNA y ORF2 tieneactividades tanto de transcriptasa inversa como deendonucleasa; ambos productos son indispensablespara la transposicion.

La Fl RA 22 2 muestra como estas actividadessostienen la transposicion. Se hace una hendiduraen el sitio diana del DNA pOl' actividad de una endo­nucleasa codificada pOl' el retroposon. El productoRNA del elemento se vincula con la proteina unidaen la hendidura. La hendidura provee un extre­mo 3'-OH que ceba la sintesis de DNAc sobre elmolde de RNA. Se requiere un segundo episodiode escision para abrir la otra cadena de DNA, y elhlbrido RNA/DNA se vincula con el otro extremo dela hendidura en esta etapa, 0 despues de que se haconvertido en una cadena doble de DNA. Algunosintrones moviles utilizan un mecanismo semejante(vease la Figura 27 .12 ).

Cuando se originan elementos a partir de latranscripcion de la polimerasa II de RNA, las se­cuencias genomicas son necesariamente inactivas:carecen del promotor que se encontraba en un sitioascendente respecto del punto de arigen inicial detranscripcion. Estos suelen poseer las caracteristicasde un producto de transcripcion maduro, par 10 quese denominan seudogenes procesados.

Uno de los motivos pOl' 10 que los elementos deLINES son tan eficaces radica en su metodo de pro­pagacion. Cuando se traduce un RNAm de LINES,los productos proteinicos muestran una preferenciacis para unirse al RNAm a partir del cual se tradu­jeron. La ) muestra que el complejo de

• Las LINES no tienen LTR y para cebar la transcripci6ninversa requieren que el retropos6n codifique unaendonucleasa que genere una hendidura.

Concepto principal

ED Las LIN ES utilizanuna endanucleasa para generarun extrema can actividadcebadara

566 CAPITULO 22 Retrovirus y retroposones

NUCLEO

~Yj\.¥1\.(l~.Transpos6n

~

CITOSOL

~co

GURA 22 "" Un transpos6n se transcribe hacia un RNA que,e traduce en proteinas que se desplazan de manera indepen­-iente hacia el nucleo, donde actuan sobre cualquier par de-epeticiones invertidas con la misma secuencia que en el trans-::os6n original.

~ibonueleoprotefnas se traslada entonces al nueleo,donde las protefnas insertan una copia del DNA enel genoma. La transcripcion inversa a menudo noavanza par completo hasta el finaL de modo que lacopia es inactiva. Sin embargo, hay posibilidades deinsercion de una copia activa parque las protefnasactuan sobre un producto de transcripcion del ele­mento activo original.

En contraste, las protefnas producidas por lostransposones de DNA deben importarse al nueleodespues de su sfntesis en el citoplasma, pero nocuentan con metodos para distinguir entre trans­posones de longitud completa y transposones inac­tivos con delecion. La :G' 2 muestra que enlugar de distinguir estos dos tipos de transposones,las protefnas reconoceran de manera indiscriminadacualquier elemento par virtud de las repeticionesque marcan sus extremos. Esto disminuye muchosu posibilidad de actuar sobre un elemento de lon­gitud completa en contraposicion a uno que ha te­nido delecion. La consecuencia es que los elementosinactivos se acumulan y, en un momenta dado, lafamilia desaparece porque una transposasa tienepocas posibilidades de hallar una diana que sea untransposon por completo funcional.

<'.Estan ocurriendo en la actualidad sucesos detransposicion en estos genomas, 0 solo se observanvestigios en sistemas antiguos? Esto varfa con la es­pecie. Hay solo unos cuantos transposones activosen la actualidad en el genoma humano pero, encontraste, se conocen varios transposones activosen el genoma de raton. Esto explica el hecho deque las mutaciones espontaneas causadas par in­serciones de LINES se presentan con una tasa de

-3% en el raton, pero de solo 0.1 % en el hom­bre. Parece haber de -lOa 50 elementos activos deLINES en el genoma humano. Se pueden sefialaralgunas enfermedades humanas como resultado dela transposicion de LI a los genes y otras derivadasde episodios no equivalentes de entrecruzamiento,donde participan copias repetidas de LI. Un sistemamodelo en el que ocurre la transposicion de LINESen celulas de cultivo hfstico hace pensar que unsuceso de transposicion puede introducir varios ti­pos de dafio colateraL asf como la insercion en unnuevo sitio; el dafio comprende reestructuracionesy deleciones cromosomicas. Dichos sucesos podrfanconsiderarse como agentes del cambio genetico. Nilos transposones de DNA ni los retroposones cua­si retrovfricos parecen haber tenido actividad en elgenoma humano durante 40 a 50 millones de afios,pero se encuentran ejemplos activos de ambos enel raton.

Notese que para que las transposiciones persis­tan deben presentarse en la Unea germinativa. Alparecer, episodios sirnilares tienen lugar en celulassomaticas, pero estas no sobreviven mas de una ge­neracion.

flII ResumenLa transcripcion inversa es el mecanismo unificadorde la reproduccion de retrovirus y perpetuacion deretroposones. El cielo de cada tipo de elemento esen principio similar, aunque los retrovirus suelenconsiderarse desde la perspectiva de la forma vfricalibre (RNAm), en tanto los retroposones se consi­deran desde el punto de vista de la forma genomica(DNA doble).

Los retrovirus tienen genomas de RNA de cade­na unica que se replican mediante un intermediariode DNA de doble cadena. Un retrovirus individualcontiene dos copias de su genoma. El genoma con­tiene los genes gag, pol y env, que se traducen en po­liprotefnas, cada una de ellas fragmentada en pro­tefnas funcionales mas pequefias. Los componentesGag y Env se encargan del empaquetamiento delRNA y la generacion del virion; los componentesPol participan en la sfntesis de acidos nueleicos.

La transcriptasa inversa es el principal compo­nente de Pol y se encarga de la sfntesis de una copiade DNA (cadena negativa) del RNA vfrico (cadenapositiva). El producto de DNA es mas largo que elmolde de RNA; mediante el cambio de moldes, latranscriptasa inversa copia desde la secuencia de 3'de RNA hasta el extrema 5' del DNA y desde lasecuencia 5' del RNA hasta el extremo 3' del DNA,10 que genera las LTR caracterfsticas (repeticionesterminales largas) del DNA. Ocurre un cambio simi-

22.13 Resumen 567

lar de moldes cuando se sintetiza la cadena positivadel DNA utilizando la cadena negativa como molde.EI DNA doble lineal se inserta en el genoma de unhospedador gracias a la participacion de la enzimaintegrasa. La transcripcion del DNA integrado desdeun promotor en la LTR izquierda genera mas copiasde la secuencia de RNA.

Los cambios de molde durante la sfntesis deacidos nueleicos permiten que ocuna la recombi­nacion por seleccion de copias. Durante un cieloinfeccioso, un retrovirus puede intercambiar partede su secuencia habitual por una secuencia celular.EI virus resultante suele tener defectos de replica­cion, pero puede perpetuarse durante la evolucionde una infeccion conjunta con un virus auxiliar.Muchos de los virus defectuosos han adquirido unaversion RNA (v-onc) de un gen celular (c-onc). La se­cuencia onc puede ser de cualquiera de varios genescuya expresion en la forma v-onc hace que la ((~lula

se transforme hacia un fenotipo tumorigenico.EI episodio de integracion genera repeticiones

diana (como transposones que se desplazan a travesdel DNA). Por 10 tanto, un provirus insertado poseeterminaciones directas repetidas de LTR, flanquea­das por repeticiones cortas de DNA diana. Los geno­mas de mamfferos y aves tienen provirus endogenos(inactivos) con dichas estructuras. Se han encon­trado otros elementos con esa organizacion en unadiversidad de genomas, de manera mas notoria enS. cerevisiae yD. melanogaster. Los elementos Ty de laslevaduras y los elementos de copia de las moscas tie­nen secuencias de codificacion con homologfa conla transcriptasa inversa y se desplazan a traves deuna forma de RNA. Pueden generar partfculas quesimulan virus pero no tienen capacidad infectante.Las secuencias LINES de los genomas de mamiferosse retiran aun mas de los retrovirus, pero conser­van diferentes similitudes que sugieren un origencomun. UtiLizan un tipo diferente de aetividad ceba­dora para iniciar la accion de la transcriptasa inver­sa, donde una actividad de endonueleasa vinculadacon la transcriptasa inversa forma una hendiduraque provee un extrema 3'-OH para la sfntesis decebacion sobre un molde de RNA. La frecuenciade transposiciones de LINES aumenta porque susproductos proteinicos tienen actividad en cis; se vin­culan con el RNAm del que fueron traducidas paraformar un complejo ribonueleoprotefnico que setransporta al nueleo.

Los miembros de otra elase de retroposonescuentan con todos los puntos calientes de la trans­posicion a traves de RNA, pero no tienen secuen­cias de codificacion (0 al menos ninguna que simulefunciones retrovfricas). Pueden haberse originadocomo pasajeros en un episodio de transposicion se-

568 CAPITULO 22 Retrovirus y retroposones

mejante a la retrovfrica, donde un RNA fue dianade una transcriptasa inversa. Los seudogenes proce­sados surgen POl' dichos episodios. Una familia par­ticularmente notoria que parece haberse originadopOl' un suceso de procesamiento es la familia Alu.Algunos RNAsn, incluido el RNAsn 7SL (un compo­nente de SRP) tienen relacion con esta familia.

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