EXPRESION DE ROTEINAS RECOMBIANTES EN

LEVADURAS

Alfredo Lagares Guzmán QF, MSc

INTRODUCCION

La clonación en bacterias ha permitido obtener a escala industrial algunas

proteínas recombinantes, especialmente de interés terapéutico. Sin

embargo, no siempre las proteínas de origen eucariótico se producen

adecuadamente en huéspedes procarióticos, ya que a menudo son

inestables o carecen de actividad biológica. Por otro lado las proteínas

recombinantes obtenidas en bacterias, a pesar de haber sido

cuidadosamente purificadas, pueden venir acompañadas de pequeñas

cantidades de sustancias bacterianas contaminantes, que pueden tener

efectos pirogénicos (inducción de fiebre). Por todas estas razones, la

ingeniería genética ha desarrollado otros sistemas, principalmente

eucarióticos, que salven al menos algunos de estos obstáculos. En este

sentido, las levaduras presentan una serie de ventajas:

Son eucariotas, y por lo tanto más semejantes a las células de

los organismos superiores que los procariotas (por ejemplo, sus

mecanismos de secreción)

A diferencia de las bacterias, producen cierto tipo de

modificaciones postraduccionales en las proteínas

(glucosilaciones en ciertos aminoácidos, eliminación de la

metionina inicial, rotura proteolítica de un precursor inactivo,

etc.), lo que puede hacer que las proteínas heterólogas de

organismos superiores puedan alcanzar su actividad biológica

(aunque esto no siempre está garantizado)

A semejanza de ciertas bacterias, la levadura Saccharomyces

cerevisiae es muy fácil de manejar con métodos microbiológicos

S. cerevisiae está muy bien estudiada al nivel genético y

molecular. No sólo se puede realizar genética clásica

(mutagénesis y recombinación meiótica, alternancia de ciclo

haploide y diploide), sino que cuenta con herramientas

avanzadas de ingeniería genética, y su genoma se secuenció

totalmente en 1996

Desde hace decenios, las levaduras se cultivan a escala

industrial, y participan en multitud de procesos biotecnológicos.

Además, cuenta con la calificación oficial de “organismo

reconocido como seguro” (GRAS), indispensable para poder

usarlo en obtención de sustancias para consumo humano.

Por todo ello, las levaduras son los huéspedes eucarióticos de clonación

más fáciles de usar, y una buena alternativa para intentar la producción

industrial de proteínas de interés. (Sin embargo, debido a que las

levaduras poseen un sistema de splicing diferente y menos efectivo que el

de eucariotas superiores, si queremos expresar estos genes, hay que

recurrir no a la versión genómica, sino al cADN tras retrocopia del

correspondiente ARNm maduro).

Existe multitud de tipos diferentes de vectores, cada uno con una serie de

características apropiadas para fines concretos. En general, los vectores

de levadura, aparte de secuencias de levadura, contienen también

secuencias de vectores bacterianos, previstas para su amplificación y

manejo sobre todo en E. coli. Por esta razón se suelen calificar como

vectores bifuncionales o “lanzadera” (porque permiten pasar del huésped

bacteriano a la levadura, y viceversa).

1. SINTESIS DE PROTEINAS RECOMBINANTES EN

LEVADURAS

Cuando las células bacterianas son incapaces de modificar

correctamente, una proteína recombinada, se procede a la producción de

la misma en organismos eucariota. Las levaduras constituyen a menudo

el primer recurso en el que se pueden expresar genes eucariotas que son

incorrectamente expresados en bacterias.

Las levaduras están bien caracterizadas desde el punto de vista

genético. Su genoma mide 1.4 x 107 nucleicos.

Las levaduras se utilizan como vectores de expresión para exprimir

proteínas de mamíferos glicosiladas. El uso de levaduras también permite

entre otros de analizar la función de esas proteínas en un medio eucariota

e utilizar las señales de secuencia intracelulares que permiten enviar esas

proteínas a un organito.

1.1. TIPOS DE LEVADURAS

Levaduras Auxótrofas

Un auxótrofas en un organismo que requiere uno o más factores

orgánicos (como aminoácidos, nucleicos o vitaminas) que no le son

necesarios al tipo salvaje.

La mayoría de las cepas de levadura que se utilizan en la actualidad son

autótrofas, c-a-d deficiente en una o mas encimas implicadas en la

biosíntesis de un aminoácido o un nucleico, las levaduras autótrofas no se

reproducen en medio que permiten el crecimiento de la especie salvaje;

ellas necesitan un medio que contenga el producto final de la vía

metabólica afectuosa. Por ejemplo, una levadura autótrofa por la histidina

necesita la presencia de histidina en el medio.

Los plasmidos que contienen el gen H153 que codifica la enzima

deshidrataza imidazole glicerol fosfato pueden ser introducidos en

proteínas auxótrofas a la histidina mediante un procedimiento análogo a la

transformación bacteriana. El gen HIS3 codifica la enzima necesaria a la

levadura auxótrofa y le permite reproducirse en un medio desprovisto de

histidina.

Saccharomyces Cerevisiae y Pichia Pastoris

La levadura Saccharomyces Cereisiae ha incrementado su utilización en

los últimos 10 años para la obtención de proteínas heterologas.

El Saccharomyces Cerevisiae fue desarrollado como el primer sistema de

expresión eucariota ya que al ser un organismo unicelular podía

manipularse genéticamente utilizando la mayoría de las técnicas

comúnmente empleadas para E.coli y como organismos eucariótico es un

huésped apropiado para la producción de proteínas eucarióticas idénticas.

Saccharomyces Cerevisiae es además adecuado por su seguridad para la

producción de productos farmacéuticos recombinares por que a diferencia

del E. coli no produce pirogenos o endotoxinas y tiene un amplio historial,

con un grado de seguridad elevado cuando se emplea en procesos de

fermentación a gran escala en la industria.

La producción de proteínas humanas en células de organismos inferiores

mediante tecnología recombinante es una muy prometedora

aproximación de tratamiento de muchas enfermedades producidas por la

deficiencia de una proteína en particular.

Aunque la E.coli fue el primer hospedero empleado con éxito para

expresar proteínas humanas, recombinates, tuvo algunas limitaciones,

causadas principalmente por su inhabilidad para hacer algunas

modificaciones postranduccionales, como la glycosilación.

Debido a esto la levadura Saccharomyces Cerevisiae, fue considerada y

usada al comienzo para tales propósitos.

Sin embargo la Saccharomyces Cerevisiae glicosila proteínas de manera

muy diferente a las células humanas y produce proteínas bastante

antigénicas; por este motivo algunas otras levaduras no-convencionales

con Pichia Pastoris, han sido usadas recientemente.

En este sistema la expresión de proteínas humanas no esta asociada al

crecimiento; puede crecer a altas densidades celulares, aumentando la

productividad y el crecimiento de la proteína heterólogas, tiene un

promotor muy eficiente, inducible por adición de metanol, el cual puede

ser usado como única fuente de Carbono y energía.

Las modificaciones postranduccionables, parecen más semejantes a las

células humanas que a los de otros sistemas no mamíferos usados para

la producción de glicoproteinas humanas y no secretan considerables

cantidades de proteínas endógenas, del cual simplifica la purificación de

las proteínas expresadas.

1.1.2. Levadura Protótrofa

Las levaduras se convierten en protótrofas cuando el marcador

metabólico es expresado.

El gen HIS3 puede entonces utilizarse para relacionar las levaduras

transformadas del mismo modo que el gen de resistencia a la ampicilina

presente en un plasmado bacteriano permite relacionar bacterias

transformadas.

1.2. PLASMIDOS ADAPTADOS

Una segunda aplicación de técnicas de A.D.N recombinates en levaduras

ha sido en la construcción de plasmidos con buena capacidad de

replicación en levaduras.

Tales vectores permiten la ampliación de plásmidos recombinados en

bacterias antes de ser introducidas en las levaduras. Esos vectores son

especiales pues contienen un segmento de ADN plásmidico bacteriano,

para permitir la manipulación y preparación de ADN a gran escala y

además un marcador adecuado de levadura.

Para seleccionar las transformantes.

Vectores de clonación de la levadura; integradas de levadura (YIP). Replicador de levadura (YRp). Centromerico de levadura (YCp) y episoma de levadura (Yep) Vectores indicadores del gen procariotica con resistencia a la ampicilina (Amp2), de origen replicativo procariótico (oris), marcador auxótrofico de levadura (HIS3), de la secuencia autónoma replicativa (ARS), del centrómero de la levadura (CEN), y de las secuencias de 2 u de DNA. Secuencias adicionales del ADN bacterianas ( ) y de la levadura ( ).

1.2.1. Plásmido replicativo de levadura YRp (plásmido levadura

replicante)

Son vectores que incluyen una secuencia autónoma de reproducción

(ARS) de origen cromosómico, además de los elementos encontrados en

YIps.

Los YRps son capaces de replicar de forma autonoma y estan presentes

en un número de 3 – 30 copias por célula.

Los vectores YRp actualmente se utilizan en casos aislados como

consecuencia de su inestabilidad.

1.2.2. Plásmido episomales de levadura YEp

Los vectores YEp (plasmado levadura episomal) se basan en secuencias

ARS procedentes de plásmidos endógenos de levadura 2µ que contiene

la información genética para su propia replicación y segregación.

Ellas son capaces de replicarse de manera autónoma, son diez veces

más estables que los YRps y bajo condiciones selectivas aparecen entre

el 60% y el 95% de la población celular.

Estos plásmidos son empleados más frecuentemente como vectores de la

levadura y son ampliamente utilizados en sistemas para la expresión de

levaduras.

1.2.3. Plasmidos centroméricos de levadura YCp (levadura

centromerico plasmido)

Incluyen un ARS y un centrómero de levadura.

Los YCps pueden replicarse sin estar integrados en un cromosoma y son

estables durante la división celular.

Además de su empleo como vectores generales de clonación de

levaduras, estas formas de plásmido son la base de un tipo muy

especializado de vectores para la clonación de levaduras, el cromosoma

artificial de levadura.

1.2.4. promotor inducible y gen de selección:

El gen de interés se clona a menudo adelante del promotor

inducible, GAL1 o GAL 10, ó los dos. El promotor es reprimido en

presencia de glucosa e inducido en presencia de la galactosa.

Los genes GAL producen enzimas responsables del metabolismo

de la galactosa. Los promotores des genes GAL1 y GAL10 se

activan cuando el factor de transcripción GAL4 se fija en la

secuencia UAS (Upstream Activating Sequence), que es la

equivalente del enhancer en la levadura. La proteína GAL80 no

permite esta activación cuando se une a GAL4.

Los genes GAL son inducidos por la galactosa, puesto que estos

al unirse con GALBO liberan el factor de transcripción GAL4.

El inserto debe terminarse mediante un terminador de levadura.

1.3. PRODUCCIÓN DE PROTEINAS A PARTIR DE S. CEREVISIAE

El S. Cerevisiae se convirtió en una contribución muy valiosa a la

biotecnología moderna.

Sin embargo y a pesar de la versatilidad de los sistemas de expresión de

levaduras, la recuperación obtenida referida a niveles altos de proteínas

heterólogas autenticas y biológicamente activas es todavía materia de

ensayo y error.

La recuperación satisfactoria de proteinas heterologas depende de una

variedad de vectores entre los que se incluyen: La fuente del DNA, el nivel

total de mRNA presente en la célula y la naturaleza del producto

requerido.

1.4. EXPRESIÓN EN P. PASTORIS

Otra especie de levadura, Pichia Pastoris, es capaz de producir

cantidades importantes de proteína recombinada, a veces del

orden de gramo por litro. Pichia Pastoris es una levadura

metilotrofa.

En ausencia de glucosa como fuente de carbono, ésta levadura

es capaz de utilizar el metanol. El promotor de la alcohol oxidasa

(AOX1) controla la expresión de alcohol oxidasa, que cataliza la

primera etapa de la vía metabólica del metanol. Como la enzima

posee una actividad específica débil, ella es producida en la

levadura en grandes cantidades.

El sistema original de expresión en P. pastoris está basado en el promotor

de uno de los genes de la alcohol-oxidasa. La alcohol-oxidasa cataliza la

primera reacción de la ruta de degradación del metanol, al oxidarlo hasta

formaldehido y peróxido de hidrógeno. La reacción tiene lugar en el

peroxima, orgánulo que secuestran el peróxido del resto de la célula. La

alcohol-oxidasa tiene poca afinidad por el metanol, pero esto lo compensa

esta levadura sintetizando grandes cantidades de la enzima, determinada

por dos genes, AOX1, AOX2. El producto del primero representa más del

90% de la actividad total. El promotor de AOX1 está fuertemente regulado

e inducido por metanol, pero está reprimido en otras condiciones, como

hambre de carbono.

Cuando las células son incubadas en presencia de grandes

cantidades de metanol, la alcohol oxidasa constituye más del

30% de proteínas solubles. En ausencia de metanol, no se

detecta la presencia de la alcohol oxidasa.

Se han construido vectores que permiten clonar genes de interés

a lo largo del promotor AOX1.

Este promotor, inactivo en presencia de glucosa, es metanol

inducible. Ciertos vectores también contienen una secuencia

señal, a menudo aquella de una feromona ó de un factor que le

permite el acoplamiento a levaduras.

Las proteínas que contienen esas señales son las que se secretan

en el medio.

Las ventajas de este sistema son las siguientes:

Ventajas derivadas de las características metabólicas de esta

levadura:

Gran preferencia por el metabolismo respiratorio, lo que

permite cultivos más densos que otras levaduras

Modificaciones postraduccionales mejores que los de S.

cerevisiae: procesamiento proteolítico, glucosilación y

formación de puentes disulfuro

Muy altos niveles de secreción de proteína heteróloga, con

apenas secreción de proteína nativa

Sistema fácilmente escalable a escala industrial

Sistema más barato y más rápido que los de eucariotas superiores

A pesar de lo anterior, este sistema de expresión presenta ciertas

limitaciones, algunas de las cuales se están resolviendo en los últimos

años:

1. El metanol que se necesita para la inducción supone cierto riesgo

de fuego y puede no ser adecuado para producir proteínas

alimentarias. Por lo tanto, se necesitan promotores fuertes que no

necesiten metanol para su inducción. Ya se cuenta con algunos:

a. Promotor del gen de la gliceraldehido-3-fosfato

deshidrogenasa (GAP). Suministra un alto nivel constitutivo

de expresión en glucosa o glicerol. El inconveniente es que

al ser constitutivo, puede no ser adecuado para expresar

proteínas que supongan efectos negativos para el

hospedador.

b. Promotor del gen FLD1 de P. pastoris, codificador de una

glutatión-deshidrogensasa dependiente de formaldehido. Se

puede inducir por metanol o por metilamina (una fuente

inocua de N) en medios con glucosa. Los niveles inducidos

de expresión con este promotor son parecidos a los del gen

AOX1 en metanol.

2. Se necesitan promotores de expresión moderada. Algunos

ejemplos:

a. Del gen PEX8, que codifica una proteína de biogénesis del

peroxisoma. Suministra expresión a bajo nivel sobre

glucosa, y se induce moderadamente (unas 10 veces)

cuando las células se pasan a metanol.

b. Del gen YPT1: confiere expresión baja pero constitutiva en

glucosa, metanol o manitol

3. Otra limitación era la carencia de más genes marcadores para

seleccionar los recombinantes. Hasta hace poco, solo se disponía

de HIS4, ARG4 y Sh ble (resistencia al antibiótico zeocina). Ahora

contamos con otros marcadores: ADE1, URA3.

1.5. VENTAJAS

La principal ventaja para la producción de proteinas recombinantes a gran

escala, es la utilización de cepas modificadas en su pared celular que

permite una fácil y eficiente liberación del producto intracelular.

Este sistema de recuperación del producto se puede acoplar a

procedimientos de purificación en un solo paso.

Además, las levaduras son sistemas idóneos para mimetizar

funcionalmente a las células humanas cuando expresan proteinas

desde ese origen. De esta manera se pueden obtener también levaduras

humanizadas y utilizarlas en bioensayos para la identificación de

moléculas con actividad farmacológica.

1.6. PURIFICACIÓN

1.6.1. Cromatografía de afinidad

La generación de proteínas hibridas de fusión a un péptido con capacidad

de unión a matrices específicas, mediante cromatografía de afinidad,

permite un elevado grado de purificación en un solo paso.

La expresión en levaduras de proteínas diana permite la realización de

procesos de “Screening” de fármacos, mediante la detección de las

alteraciones fisiológicas a nivel celular causados por la interferencia de las

moléculas bioactivas sobre la funcionalidad de la proteína.

1.6.2. Cromatografía de exclusión o filtración en gel

La cromatografía de exclusión o filtración en gel es una clase de

cromatografía sólido-líquido que permite la separación de dos o más

sustancias en función de su tamaño molecular. 

Mecanismo de la separación  

En la cromatografía de filtración en gel, se rellena una columna con

partículas muy pequeñas de una sustancia inerte que contiene pequeños

poros (éste es el gel). Para realizar la separación de moléculas de distinto

tamaño, se aplica sobre el lecho del gel la muestra con estas moléculas.

Al ir realizando la elución, las moléculas con un tamaño mayor que el de

los poros del gel se moverán sólo en el espacio que queda entre las

partículas, no sufriendo, por lo tanto, retraso en su recorrido a través de la

columna (se dice que quedan excluidas del gel. Por el contrario, las

moléculas con un tamaño menor que el de los poros difunden hacia el

interior y el exterior de éstos, con mayor probabilidad cuanto menor es su

tamaño molecular. Por lo tanto, las moléculas eluyen de la columna por

orden de tamaño decreciente.

Se define el intervalo de fraccionamiento de un determinado tipo de gel

como los valores extremos (máximo y mínimo) de pesos moleculares

entre los cuales el gel tiene capacidad de separar.

El volumen de elución es el volumen necesario para eluir un compuesto

de una columna.

Se llama volumen de exclusión de la columna al volumen al que eluyen

las moléculas de tamaño superior al intervalo de

fraccionamiento del gel. Corresponde a la suma del volumen de los

huecos entre las partículas de gel. 

Materiales para la filtracion en gel

Un gel es una red tridimensional cuya estructura está entrecruzada al

azar. Los geles utilizados como tamiz molecular son polímeros hidrofílicos

e insolubles cuyas cadenas poliméricas se entrecruzan hasta formar una

red tridimensional.

Propiedades de algunos geles de Sephadex (gel dextrano)

Peso molecular, límites de fraccionamiento agua retenida vol. de gel hidratado

Tipo polisacáridos péptidos/proteínas (g/g gel seco) (ml/g gel seco)

G10   hasta     700   hasta     700 1.0 2

G15   hasta   1 500   hasta   1 500 1.5 3

G25   100  -  5 000 1 000 -   5 000 2.5 5

G50   500 -  10 000 1 500 -  30 000 5.0 10

G75 1 000 -  50 000 3 000 -  80 000 7.5 12-15

G100 1 000 - 100 000 4 000 - 150 000 10.0 15-20

G150 1 000 - 150 000 5 000 - 400 000 15.0 20-30

G200 1 000 - 200 000 5 000 - 800 000 20.0 30-40

Los geles normalmente utilizados son de tres tipos: dextrano, agarosa y

poliacrilamida. En esta práctica se utilizará el gel dextrano.

El gel de dextrano (polímero ramificado de glucosa, entrecruzado y

formado en pequeñas bolitas) se comercializa con el nombre de

SEPHADEX. Existen distintos tipos, según el tamaño de poro,

proporcionando límites de exclusion comprendidos entre 1 y 200 000

daltons. Estos geles se identifican por una denominación de G-10 hasta

G-200, lo que se refiere a la capacidad de retención de agua gel

multiplicada por 10. 

 

Aplicaciones de la filtración en gel  

Además de utilizarse para la separación de sustancias de distintos pesos

moleculares o para la purificación de proteínas, se emplea para la

determinación de pesos moleculares de proteínas.

Para una gran variedad de tipos de geles se ha comprobado que existe

una relación lineal entre el volumen de elución y el logaritmo del peso

molecular de las proteínas.

Por lo tanto, es suficiente medir el volumen de elución de una proteína

desconocida para llevarlo a una recta de calibrado (preparada con

proteínas puras de peso molecular conocido) y deducir aproximadamente

su peso molecular. 

Esta técnica puede también proporcionar un método para el tratamiento

de una proteína con un determinado reactivo.

Este será uno de los aspectos a ensayar en el presente experimento.

 En esta práctica se emplea una columna rellena con Sephadex G-25

(dextrano de alto entrecruzamiento, pequeño tamaño de poro).