EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN

LEVADURAS

Dr. Víctor Blancato

Producción de proteínas

recombinantes en células eucariotas

Problemas que suelen a parecer cuando

proteínas eucarióticas son expresadas en células procariotas

inestables

sin actividad biológica

contaminantes procarioticos

Sistemas de expresión eucariotas

Para eliminar estos problemas se han desarrollado sistemas de expresión eucariotas

Necesidad de que tengan idénticas propiedades a la proteína natural: bioquímicas, biofísicas y funcionales

Especialmente importantes para proteínas

terapéuticas

Ventajas de producción de proteínas

recombinantes a gran escala en levaduras

utilización de cepas modificadas en su pared celular que permiten una fácil y eficiente liberación del producto intracelular

se puede acoplar a procedimientos de purificación en un solo paso

las levaduras son sistemas idóneos para mimetizar

funcionalmente a las células humanas

Sistemas de expresión eucariotas

Cual es la diferencia?

Modificaciones post-traduccionales de la mayoría

de las proteínas eucariotas no pueden ser llevadas

a cabo en células procariotas

Modificaciones post-traduccionales

Formación de uniones disulfuro correctas

Clivaje proteolítico del precursor inactivo

Glicosilación, agregado de residuos de azúcar

Modificación de aminoácidos:

fosforilación

acetilación

agregado de grupos sulfato

agregado de ácidos grasos

Sistemas de expresión en levaduras:

Ventajas

Organismo unicelular

Bien caracterizadas genética y fisiológicamente

Promotores fuertes disponibles

Eucariotas, ocurren modificaciones post-

traduccionales

Segregan algunas proteínas

No patógeno

Otras ventajas de la expresión en levaduras

Expresión de proteínas que solo expresan como cuerpos de inclusión insolubles en bacterias

Plegamiento correcto

La falta de contaminación por endotoxinas (producción de vacunas o drogas terapéuticas)

Desventajas ----- hiperglicosilación

Saccharomyces cerevisiae S288c

Primer genoma eucariota secuenciado (600

laboratorios) en 1997

Schizosaccharomyces pombe, 2002

Posee 16 cromosomas

12.01 millones de pb, 6275 genes

¾ de los ORFs identificados

DNA nuclear haploide solo 3,5 veces el de E. coli

Ventajas del uso de levaduras

Conservación de procesos celulares respecto

a otros eucariotas (Transcripción, traducción splicing, modif PT, etc.)

Organismo GRAS

Cultivo simple, económico y rápido (90 min td)

Contiene organelas como otros eucariotas

Modifica mRNA similar a otros eucariotas

Glucose 2 Pyr

2 CO2

2 Ethanol 2 Acetaldehyde

2ADP 2ATP

2NAD+ 2 NADH Fermentation

Medios para levaduras Pueden ser crecidas en medios líquidos o sólidos

Crecen en medio mínimo con glucosa, nitrógeno, fosforo y trazas de metales

Fuentes alternativas de carbono: rafinosa, maltosa, fructosa, galactosa

Galactosa se utiliza para inducir la transcripción de secuencias fusionadas al promotor Gal

Clonado en Levaduras

La era de la genetica molecular en levaduras comenzó en 1978,

cuando S. cerevisiae fue transformada con DNA heterólogo.

Hay muchos protocolos de transformación pero son como mínimo

tres órdenes de magnitud menos eficientes que los de E. coli.

El clonado y preparación de plásmidos de levaduras es muy

ineficiente

Entonces para el clonado en levadura se utiliza E. coli como

sistema de produccion:

Los plásmidos se construyen in vitro

Los plásmidos son transformados en E. coli y se confirma la construcción

Se producen los plasmidos en bacteria....

....y luego se transforman en levadura

Se trabaja con vectores shuttle levadura - E. coli

Por otro lado, las levaduras tienen un sistema muy eficiente de

recombinacion que se utiliza para el clonado

pUC18

2686 bp

APr

ALPHAP(BLA)

P(LAC)

ORI

Ava I (435)

BamH I (430)

Eco R I (451)

Hin d III (400)

Pst I (416)

Sma I (437)

Xma I (435)

Apa LI (178)

Apa LI (1121)

Apa LI (2367)

Vectores de levaduras

Replicación en E. coli y levaduras

Dos tipos de genes de selección

E. coli antibioticos

Levaduras genes involucrados en vías no biosintéticas

Marcadores de selección en

levadura

TRPl codifica la N-(5 'fosforri bosil) a ntranilato

isomerasa (síntesis de triptofano y metabolismo de la glutamina)

URA3 codifica Orotidine - 5 '- fosfato descarboxilasa (proteína de 267 aminoácidos que participa

en la biosíntesis de uracilo)

LEU2 codifica la beta isopropil malato

deshidrogenasa (cataliza la tercera etapa en la biosíntesis de leucina)

LVS2 codifica para una alfa-ami noadipato

reductasa (paso esencial en la biosíntesis de lisina)

HIS3 codifica la imidazol glicerolfosfato

deshidratasa (involucrada en la síntesis de histidina)

Vectores shuttle Levadura-E. coli

Plasmidos integrativos

(YIp) consisten de:

La estrructura de plasmidos de E. coli

vector como pBR322, pUC19, pBLUESCRIPT

Marcadores de selección de levaduras: URA3, HIS3, TRP1, LEU2

Pero carecen de origen de replicacion

para levaduras

Por lo tanto, se propagan solo por integración en el genoma

YIp5

5541bp

URA3

PMB1

Ava I (2541)

Bam H I (379)

Cla I (28)

Eco R I (2)

Hin d III (33)

Nco I (1867)

Sma I (2543)

Xma I (2541)

Pst I (1644)

Pst I (4795)

Apa LI (3473)

Apa LI (3971)

Apa LI (5217)

Amp-resistance

Tet-resistance

YIp5: pBR322 plus the URA3 gene

Vector shuttle E. coli - levadura

Los plásmidos replicativos

episomales (YEp) consisten

de:

La estrructura de plasmidos de E. coli vector

como pBR322, pUC19, pBLUESCRIPT

Marcadores de selección de levaduras: URA3, HIS3, TRP1, LEU2

Y poseen el origen de replicación del plásmido 2micron de levaduras

Entonces, se propagan relativamente estables a un alto número de copias, gralmente 20-50 por célula

YEp24: pBR322 plus the URA3 gene, plus 2micron origin

YEp24

7769bp

URA3

PMB1

2micron ORI

Bam H I (3785)

Cla I (2268)

Nco I (2705)

Sma I (3381)

Xma I (3379)

Eco R I (2)

Eco R I (2242)

Apa LI (7445)

Ava I (1391)

Ava I (3379)

Ava I (4835)

Hin d III (106)

Hin d III (2273)

Hin d III (3439)

Pst I (2001)

Pst I (2482)

Pst I (7023)

Amp-resistance

Tet-resistance

Los plasmidos replicativos

centroméricos (YCp) consisten de:

La estrructura de plasmidos de E. coli vector como

pBR322, pUC19, pBLUESCRIPT

Marcadores de selección de levaduras: URA3, HIS3, TRP1,

LEU2

Y poseen un origen de replicación

cromosomal para levaduras (ARS, for autonomously replicating sequence)

Poseen un centrómero CEN de un

cromosoma de levadura

Se propagan de forma estable a un

bajo número de copias, por lo general uno por célula.

Amp-resistance

Tet-resistance

YCp50 7950bp URA3

POLY

CEN4

ARS1

POLY

PMB1

Bam H I (379)

Cla I (28)

Eco R I (2)

Hin d III (33)

Nco I (1867)

Sma I (2543)

Xma I (2541)

Ava I (2541)

Ava I (4703)

Pst I (1644)

Pst I (7204)

Apa LI (7626)

YCp50: pBR322 plus the URA3 gene,

plus CEN4, plus ARS1

Vector shuttle E. coli - levadura

Promotores de levaduras

Promotor Condición

Acid phosphatase PHOS lnducible

Alcohol dehydrogenase I ADH I

Constitutivo

Alcohol dehydrogenase II ADH II lnducible

Galctokinase GAL 1 lnducible

Metallothionein Cup 1 lnducible

Phosphoglycerate kinase PGK Constitutivo

Triose Phosphate isomerase TPI Constitutivo

La mayoría de vectores de expresión actuales tienen promotores

inducibles, como los de shock térmico, o el GAL 1 y el GAL10 que se

inducen 1000 veces en presencia de galactosa.

Métodos artificiales para introducir

ADN exógeno en levaduras:

Electroporación

Obtención de protoplastos en medio hipertónico y mezclándolos con el ADN en presencia de una sustancia fusogénica como el polietilenglicol (PEG)

Tratamiento de células completas con sales de

litio, seguido de mezcla con PEG y ADN, con choque térmico para estimular la transformación

Sistemas de expresión en

levaduras:

Desventajas

Inestabilidad de plásmidos en gran escala

Vectores episomales

Superglicosilación de glicoproteínas

100 o más residuos manosa versus 8-13

puede alterar la actividad de la proteína

Proteínas secretadas quedan atrapadas en periplasma (entre la membrana y la pared

celular)

se usan señales peptídicas

Soluciones a los problemas en

sistemas de expresión en levaduras

Levaduras modificadas genéticamente para llevar a cabo glicosilación igual a humanos

Science Vol 301, p1244-1246 (29 Aug 2003)

Deleción de genes de glicosilación de levaduras

Agregado de genes de glicosilación de humanos

Soluciones a los problemas en

sistemas de expresión en levaduras

Usar otro tipo de levaduras

Pichia pastoris

Hansenula polymorpha

No solo Saccharomyces cerevisiae

Usar otros eucariotas

Células de insectos

Cultivos de células de mamíferos

Pichia pastoris Expression

system: Ventajas

Puede utilizar metanol como fuente de carbono en ausencia de glucosa.

Utiliza el promotor AOX1 (alcohol oxidasa)

Las proteínas producidas suelen ser plegadas correctamente y secretadas en el medio.

Bastante fáciles de crecer en un frasco con agitación y manipuladas genéticamente

Son GRAS

Capaz de expresar un alto nivel de proteínas heterólogas

La existencia de una señal de secreción para una fácil purificación del sobrenadante.

Ventajas de Pichia pastoris sobre

Saccharomyces cerevisiae

El gen de alcohol oxidasa (AOX1) es inducible por metanol

El metanol es la fuente de carbono e inductor

AOX1 : gen altamente regulado que se reprime en ausencia de metanol

evita los efectos tóxicos de la expresión de proteínas heterólogas hasta que la expresión es inducida por el metanol.

Pichia puede crecer hasta densidades mayores que S.

cerevisiae (150 g / litro)

Mayor rendimiento reportado en Pichia (12 g/L para el fragmento de la toxina tetánica C)

Puede utilizar también promotor GAP (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa), un promotor constitutivo con crecimiento en glucosa, glicerol o metanol.

Otros promotores: AOX2, FLD (formaldehído deshidrogenasa), ICL 1 (Isocitrato liasa)

Posibilidad de utilizar métodos estándar de S. cerevisiae

para su manipulación genética.

Otras ventajas

Metabolismo preferentemente respiratorio, lo que permite grandes densidades celulares

Mejores modificaciones postraduccionales que S. cerevisiae: procesamiento proteolítico, glicosilación y formación de puentes disulfuro

Grandes rendimientos de proteína (mayor que

baculovirus y mamífero)

Altos niveles de secreción de proteína heteróloga casi sin secreción de proteínas nativas

Fácilmente escalable en industria y mas barato y rápido que los sistemas de eucariotas superiores.

Modificaciones post-traduccionales:

S. cerevisiae vs. Pichia

Pichia no hiperglicosila

Polisacáridos tipo manosa

S. cerevisiae agrega 50-150 residuos de manosa y Pichia agrega 8- 14 residuos de manosa (+ cortos que S. cerevisiae)

Pichia hace poca O-glicosilación

S. cerevisiae termina en alfa-1,3 glucanos (alta actividad antigénica)

Pichia no termina en alfa-1,3,y por ello, poseen mayor

similitud con proteínas humanas

Proteínas expresadas en

Pichia

Proteinas expresadas en

Pichia

Producción de proteínas

recombinantes en Pichia pastoris

Quimosina recombinante: clonado del gen de la quimosina bovina en Pichia. Se usa en la coagulación de la caseína, en la obtención de quesos.

Hormona de crecimiento humana (E. coli y levaduras)

Vacuna contra la Hepatitis

Limitaciones del sistema de

expresión en Pichia pastoris

El metanol que se necesita para la inducción implica riesgo por su toxicidad y puede no ser adecuado para producir proteínas alimentarias. Se necesitan promotores fuertes no inducibles por metanol

Promotor del gen de la gliceraldehído-3-fosfato

deshidrogenasa (GAP). Alto nivel constitutivo de expresión

en glucosa o glicerol. Desventaja: constitutivo.

Promotor del gen FLD1 de P. pastoris, codifica para la

glutatión deshidrogenasa dependiente de formaldehído.

Se puede inducir por metanol o metilamina (una fuente

inocua de N) en medios con glucosa. Los niveles

inducidos de expresión con este promotor son parecidos a

los del gen AOX1 en metanol.

Se necesitan promotores de expresión moderada:

El gen PEX8, que codifica una proteína de biogénesis del

peroxisoma. Bajo nivel de expresión con glucosa, y se induce

moderadamente (unas 10 veces) cuando las células se pasan

a metanol.

El gen YPT1: confiere expresión baja pero constitutiva en

glucosa, metanol o manitol.

Carencia de mas genes marcadores para seleccionar los recombinantes.

Hasta hace poco, solo se disponía de HIS4, ARG4 y Sh ble

(resistencia a zeocina). Ahora hay otros marcadores: ADE1,

URA3.

Pichia methanolica Expression System

designed for high-level production of recombinant proteins

•posttranslational modifications offered by eukaryotic hosts

•strong AUG1 promoter for rapid, high-level protein expression

•Transcription from the AUG1 promoter is tightly repressed in medium

containing glucose or glycerol as a carbon source

•When cells are shifted to medium with methanol as the sole carbon source,

transcription is rapidly induced to very high levels (better than P. pastoris)

• suitable for high-level production of toxic recombinant proteins

•pMET vectors offer the following features:

Strong AUG1 promoter for high-level, tightly-regulated expression

alpha -factor signal sequence for secretion

C-terminal V5 epitope (detection with an Anti-V5 Antibody) and (6xHis)

tag

gene for auxotrophic selection on drop-out medium

3 reading frames relative to the C-terminal fusion tag

3 reading frames relative to the secretion signal sequence.

EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN

LEVADURAS

Dr. Víctor Blancato