EVALUACIÓN DEL DETERIORO FISIOLÓGICO POSCOSECHA Y …disminución del deterioro fisiológico...
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1 EVALUACIÓN DEL DETERIORO FISIOLÓGICO POSCOSECHA Y MAPEO PRELIMINAR DE QTLs EN EL PRIMER RETROCRUZAMIENTO DERIVADO DEL HIBRIDO INTER-ESPECIFICO (CW429-1) ENTRE Manihot esculenta Crantz Y LA ESPECIE SILVESTRE Manihot walkerae Croizat CONSTANTINO ESTEVÃO CUAMBE UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS ESCUELA DE POSGRADO PALMIRA Diciembre, 2007
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EVALUACIÓN DEL DETERIORO FISIOLÓGICO POSCOSECHA Y MAPEO PRELIMINAR DE QTLs EN EL PRIMER RETROCRUZAMIENTO DERIVADO DEL HIBRIDO INTER-ESPECIFICO (CW429-1) ENTRE Manihot esculenta
Crantz Y LA ESPECIE SILVESTRE Manihot walkerae Croizat
CONSTANTINO ESTEVÃO CUAMBE
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
ESCUELA DE POSGRADO PALMIRA
Diciembre, 2007
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EVALUACIÓN DEL DETERIORO FISIOLÓGICO POSCOSECHA Y MAPEO PRELIMINAR DE QTLs EN EL PRIMER RETROCRUZAMIENTO DERIVADO DEL HIBRIDO INTER-ESPECIFICO (CW429-1) ENTRE Manihot esculenta
Crantz Y LA ESPECIE SILVESTRE Manihot walkerae Croizat
CONSTANTINO ESTEVÃO CUAMBE Trabajo de grado presentado como requisito para optar al título de Magíster en
Ciencias Agrarias, Área de Mejoramiento Genético de Plantas
Directores:
MARTIN FREGENE. Ph.D Genetista
HERNÁN CEBALLOS L. I.A. Ph.D
Fitomejorador Profesor Asociado Universidad Nacional de Colombia - Palmira
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
ESCUELA DE POSGRADO PALMIRA
Diciembre, 2007
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“La facultad y los jurados de tesis no se hacen responsables de las ideas emitidas por el autor de la misma”, (Artículo 24, Resolución 04 de 1974)
4
DEDICATORIA
A mi querida esposa Ana Domingas Matangue
A mis hijos Shelton y Shakil
A mis padres Estevão Chamuce Cuambe y
Leontina Constantino Nhantumbo
5
AGRADECIMIENTOS
El autor expresa sus más sinceros agradecimientos a:
Dr. Martin Fregene por brindarme la oportunidad de realizar la maestría en la
Universidad Nacional de Colombia y su valiosa participación en este proyecto en
el Centro Internacional de Agricultura Tropical.
Dr. Hernán Ceballos por permitirme realizar este trabajo de investigación y
depositar en mí su confianza.
A la Rockefeller Foundation por haber financiado mis estudios y al Instituto de
Investigação Agrária de Moçambique por incentivar a continuar mi formación
profesional.
Dr. Juan Carlos Pérez por su amistad y su acompañamiento durante el
desarrollo experimental del proyecto y orientación en el análisis de datos.
Dr. Chiedozie Egesi por su gran empeño y colaboración en la realización de este
trabajo.
A Teresa Sánchez y todos los integrantes del Laboratorio de Calidad de Raíces
de Yuca – CIAT, por su compañerismo y apoyo incondicional al desarrollo
experimental y colecta de datos.
A todos integrantes del Laboratorio de Genética de yuca, especialmente a Jaime
Marín, Janeth Gutiérrez y Paula Hurtado, por su gran colaboración.
6
A Yacenia Morillo, por su especial amistad, infinita paciencia, consejos, inmensa
colaboración y por los gratos momentos compartidos.
A mis grandes amigas Amparo Rosero y Ana Cruz Morillo por su gran acogida,
enseñanza, y por su inmensa voluntad para que este trabajo llegara a feliz
término.
A los Profesores de la Universidad Nacional de Colombia - Palmira,
especialmente al Dr. Franco Alirio Vallejo y la Dr. Sara Mejía, por su enseñanza
y valiosas sugerencias dadas al presente documento.
Al todo el personal del programa de mejoramiento de yuca, especialmente a
Jairo Valencia, Armando y A. López por su colaboración y brindarme el apoyo
necesario para la realización de este trabajo.
A la Universidad Nacional de Colombia-sede Palmira por haber propiciado ese
espacio para adquirir mayores conocimientos y experiencias.
A todos mis amigos y compañeros; todo el personal de CIAT y UNAL-Palmira
que de una u otra forma colaboraron en la realización de este trabajo, muchas y
muchas gracias.
7
TABLA DE CONTENIDO Página
1. INTRODUCCIÓN............................................................................................14
2. OBJETIVOS....................................................................................................16
2.1. Objetivo general .......................................................................................16
2.2. Objetivos específicos ...............................................................................16
3. MARCO TEORICO .........................................................................................17
3.1. Generalidades de la yuca.........................................................................17
3.1.1. Origen y distribución ..........................................................................17
3.1.2. Taxonomía.........................................................................................17
3.1.3. Importancia de la yuca.......................................................................17
3.1.4. Deterioro poscosecha en la yuca......................................................19
3.1.4.1. Deterioro fisiológico poscosecha en la yuca (DFP).........................19
3.1.4.2. Deterioro microbiano poscosecha en la yuca ..................................20
3.1.4.3. Factores que inciden en el deterioro fisiológico poscosecha en yuca....................................................................................................................21
3.1.4.4. Alternativas para minimizar el deterioro fisiológico poscosecha en yuca....................................................................................................................23
3.1.4.1.5. Genes expresados durante el deterioro fisiológico en yuca ........24
3.2. Marcadores Moleculares ..........................................................................25
3.2.1. Marcadores microsatélites en yuca ...................................................27
3.2.2. Mapas genéticos................................................................................28
3.2.2.1. Mapa genético de la yuca....................................................................29
3.2.2.2. Mapeo genético de loci de caracteres cuantitativos (QTL) ..............30
3.2.2.3. Construcción de mapas genéticos para caracteres cuantitativos ..31
3.2.2.4. Métodos para Mapeo genético de loci de caracteres cuantitativos 32
4. MATERIALES Y METODOS...........................................................................35
4.1. Localización del estudio ...........................................................................35
4.2. Material vegetal ........................................................................................35
4.3. Evaluación fenotípica del deterioro fisiológico poscosecha en yuca ........36
4.3.1. Cuantificación del deterioro fisiológico poscosecha en yuca .............38
8
4.4. Mapeo genético........................................................................................39
4.4.1. Extracción del DNA............................................................................39
4.4.2. Control de Calidad y Cuantificación del ADN....................................39
4.4.3. Amplificación y Visualización del ADN...............................................40
4.4.4. Prueba de amplificación y polimorfismo.............................................40
4.4.5. Evaluación genotípica........................................................................41
4.5. Análisis de los datos.................................................................................42
4.5.1. Análisis de Varianza (ANOVA) ..........................................................42
4.5.2. Análisis Descriptivo............................................................................42
4.5.3. Determinación del grado de resistencia al DFP.................................43
4.5.4. Análisis de Correlación ......................................................................43
4.5.5. Análisis de Regresión ........................................................................44
4.5.6. Mapeo genético del DFP ...................................................................44
4.5.7. Mapeo de QTLs .................................................................................45
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................47
5.1. Análisis de Variancia del DFP en las progenies F1RC1 ............................47
5.2. Variación intra-genotipo del DFP..............................................................47
5.3. Variación inter-genotipo del DFP..............................................................50
5.4. Grado de resistencia al DFP en la población segregante ........................51
5.5. Relación del DFP con algunas características de interés ........................52
5.6. Evaluación de polimorfismo......................................................................54
5.7. Construcción del mapa genético población F1RC1 (Familia B1PD284)....55
5.7.1. Segregación alélica de los marcadores microsatélites ......................55
5.7.2. Mapa de ligamiento de la Familia 284 ...............................................56
5.8. Mapeo de QTLs para DFP por análisis de marcador simple....................60
6. CONCLUSIONES ...........................................................................................62
7. RECOMENDACIONES...................................................................................64
8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS................................................................66
ANEXOS.............................................................................................................82
9
LISTA DE CUADROS PáginaCuadro 1. Población F1RC1 para la evaluación fenotípica y mapeo del
DFP
36
Cuadro 2. Análisis de varianza del DFP en progenies de dos familias de
la población F1RC1, en dos tiempos de almacenamiento (7 y
14 después de la cosecha)
47
Cuadro 3. Correlación fenotípica de Pearson en las dos familias
evaluadas
53
Cuadro 4. Distancia del grupo de ligamiento, no de marcadores, y
promedio del intervalo de marcadores (cM) por grupo de
ligamiento de la familia B1PD284
58
Cuadro 5. Loci marcadores asociados con el DFP, según análisis de
regresión con SAS y QGENE
61
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LISTA DE FIGURAS PáginaFigura 1. Síntomas de la Deterioración Fisiológica Poscosecha (izquierda) y
fuerte fluorescencia azul bajo luz ultra-violeta en yuca (derecha)
20
Figura 2. Síntomas del deterioro microbiano en la yuca 21
Figura 3. Esquema modificado de Retrocruzamiento Avanzado (Fase 1) 36
Figura 4. Lugar de almacenamiento de las raíces después de la cosecha 37
Figura 5. Ilustración de una escala para evaluar el deterioro fisiológico
Poscosecha
38
Figura 6. Diagrama de caja describiendo la variación del DFP en raíces de 5
clones susceptibles de cada familia evaluada. Los extremos
indican valores mínimo y máximo; el promedio representado por el
signo +; la línea que corta la caja indica la mediana; y los extremos
de la caja cuantil 0.25 y 0.75.
48
Figura 7. Variación promedio de DFP en secciones de raíces de los padres y
familias evaluadas.
49
Figura 8. Distribución de frecuencias de genotipos evaluados a los 7 (arriba)
y 14 días (abajo) en la familia B1PD284 (N=47).
51
Figura 9. Distribución de frecuencias de genotipos evaluados a los 7 (arriba)
y 14 días (abajo) en la familia B1PD289 (N=49).
51
Figura 10. Distribución de clases de resistencia al DFP en los genotipos
evaluados a los 14 días en la familia B1PD284 (N=61).
52
Figura 11. Distribución de la clase de resistencia al DFP en los genotipos
evaluados a los 14 días en la familia B1PD289 (N=53).
52
Figura 12. Relación entre DFP y materia seca en los genotipos evaluados a
los 14 días en la familia B1PD284 (N=60).
54
Figura 13. Relación entre DFP y materia seca en los genotipos evaluados a
los 14 días en la familia B1PD289 (N=52).
54
Figura 14. Prueba de amplificación y polimorfismo, en gel de poliacrilamida al
4%, con diferentes marcadores microsatélites, usando progenitores
y progenies: 1 – CW429-1; 2 – SM909-25; 3 – MTAI8; 4 a 9
55
11
corresponden a seis progenies segregantes.
Figura 15. Segregación alélica de los individuos de la familia B1PD284
usando el marcador SSRY45 (arriba) y el marcador SSRY250
(abajo), en gel de poliacrilamida al 4%
56
Figura 16. Mapa de ligamiento de la familia F1RC1 B1PD284 para la
disminución del deterioro fisiológico poscosecha en yuca
59
Figura 17. Mapa de posibles QTLs para DFP en los grupos de ligamiento E’, F
y G de la familia B1PD284, según análisis de marcador simple con
QGENE. Los colores denotan la probabilidad de asociación del
marcador con un QTL.
60
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RESUMEN Una nueva fuente de genes que disminuyen el deterioro fisiológico poscosecha (DFP) fue identificada en el híbrido inter-específico (CW429-1) entre Manihot esculenta y la especie silvestre M. walkerae. Este híbrido fue utilizado como padre fuente en el primer retro-cruzamiento con padres recurrentes susceptibles MTAI8 y SM909-25 para generar las familias B1PD284 (66 individuos) y B1PD289 (56 individuos) respectivamente, con el fin de identificar genotipos con resistencia al DFP y encontrar marcadores microsatélites con posible asociación con este carácter a través del mapeo genético. El ensayo fue establecido usando plantas provenientes de rescate de embriones. El método propuesto por Wheatley et al. 1985 (con algunas modificaciones) fue utilizado para la cuantificación del DFP. Cinco raíces por genotipo fueron evaluadas a los 7 y 14 días después de la cosecha, siguiendo una escala (0 – 100%). El diseño utilizado fue completamente al azar, considerando cada raíz como una repetición. El programa SAS fue usado para estimar la variación intra e inter-genotipos, grado de resistencia al DFP y correlación con algunas características de interés; el mapa genético se construyó con el programa de computador MapMaker 2.0; y el mapeo de QTLs a través de análisis de marcadores simples se hizo con QGENE. Se encontró una amplia y continua variación del DFP intra e inter-genotipos, con clara tendencia de aumento con el tiempo de almacenamiento. El 5% del total de los individuos de las familias obtuvieron alta resistencia al DFP a los 14 días poscosecha. Se construyó un mapa genético para la familia B1PD284 con 17 grupos de ligamiento cubriendo 363.7 cM, y una distancia promedio entre marcadores de 11.6 cM. Un grupo de ocho marcadores microsatélites fueron asociados a posibles QTLs (P<0.05) en tres grupos de ligamiento (E’, F, y G), con una varianza fenotípica explicada de 6 a 12.8%. No se encontraron QTLs con efecto mayor, lo que sugiere que falta analizar una larga porción del genoma o hay varios genes implicados en la expresión de este carácter, típico de un carácter cuantitativo.
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ABSTRACT A new source of genes for delayed post-harvest physiological deterioration (PPD) was identified in an interspecific hybrid (CW429-1) between cassava (Manihot esculenta) and a wild relative M. walkerae. This inter-specific hybrid was used as donor parent to obtain two first backcross families, B1PD284 (66 individuals) and B1PD289 (56 individuals), with MTAI8 and SM909-25 as recurrent parents respectively to identify PPD resistance genotypes and candidate molecular markers associated with trait, through genetic mapping. The trial was established using plants recovered from in vitro cultures of embryo axes. To evaluate PPD, the method proposed by Wheatley et al. (1985) was used. Five cassava roots per genotype were evaluated 7 and 14 days after harvest, following a scale from 0 to 100% of PPD. A completely randomized design was used in this study, considering each root as a repetition. The SAS statistic program was used to detected variation within and between genotypes, level of PPD and correlation with traits of interest. The genetic mapping computer software package, MapMaker 2.0, was used to construct the linkage map and QGENE for mapping of QTLs, through single point marker analysis. Results showed high and continuous PPD variation within and between genotypes. About 5% of total individuals in the two families showed high PPD resistance 14 days after harvest. A linkage map was constructed for B1PD284 family having 17 linkage groups and covering 363.7 cM of the cassava genome, with average distance between markers of 11.6 cM. A set of 8 microsatelite markers with significant associations with putative QTLs for PPD were identified (P<0.05), located on the linkage groups E’, F and G. The SSR markers explained between 6 – 12.8% of phenotypic variance of PPD. Major QTL effects for PPD was not observed suggesting that a large portion of the cassava genome remains to be analyzed or that several QTL loci with small effects are implicated in the delayed PPD trait, typical of quantitative traits, typical of quantitative traits.
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1. INTRODUCCIÓN
La yuca (Manihot esculenta Crantz) es un cultivo nativo perenne de América
tropical (Allen, 1994; Olsen et al, 2001) y uno de los cultivos más importantes
que produce calorías en los trópicos (Kawano et al, 1998). Cerca de 70 millones
de personas obtiene más de 500 Kilocalorías por día de la raíces de yuca y más
de 500 millones de personas consumen 100 Kilocalorías por día (Cock, 1985;
Kawano et al, 1998, Kawano, 2003).
Uno de los mayores problemas para el desarrollo de la yuca, como cultivo, tanto
para los agricultores como para los procesadores es su rápido deterioro
fisiológico poscosecha (DFP) (Booth, 1976, Reilly et al, 2003), el cual puede
disminuir su palatabilidad y valor comercial después de 24-72 horas de haber
sido cosechadas (Rickard, 1985; Kato y Souza, 1987; Beeching et al, 1998;
Cortés, 2002; Reilly et al, 2003), debido a cambios fisiológicos, bioquímicos y de
ultra-estructura en la raíz (Rickard y Coursey, 1981; Wheatley, et al., 1985b). Se
inicia en la sección transversal de la raíz, con decoloración negro-azulosa en el
tejido vascular, seguida por una decoloración acastañada de los tejidos
parenquimáticos y una fuerte fluorescencia azul bajo luz ultra-violeta (Booth,
1976).
El deterioro fisiológico necesita oxígeno para su desarrollo e involucra
reacciones enzimáticas. Algunos estudios, reportaron que el DFP está
positivamente asociado con alto contenido de materia seca e inversamente con
carotenoides, esta última, por la acción de antioxidantes no-enzimáticos como el
β-caroteno y el ácido ascórbico (Iglesias et al, 1996 y Sánchez et al, 2005).
15
El mejoramiento en yuca ha sido exitoso para muchas características,
incluyendo la resistencia al Virus del Mosaico Africano de la yuca (ACMV). Sin
embargo, no se cuenta con fuentes de resistencia al DFP (Jennings y Iglesias,
2002). Estudios anteriores revelaron la existencia de variabilidad genética
limitada para DFP en la mayoría de las variedades teniendo poca vida útil
después de la cosecha. Recientemente, una nueva fuente de genes que
producen una rápida disminución al DFP fue identificada en un híbrido inter-
específico (CW429-1) resultante del cruzamiento entre la yuca cultivada y la
especie silvestre Manihot walkerae en el CIAT – Colombia (Fregene y Mba,
2004). Este híbrido inter-específico se está utilizando actualmente como padre
en un esquema avanzado de retrocruzamiento para desarrollar poblaciones
segregantes con el fin de identificar genotipos con resistencia al DFP y obtener
marcadores moleculares ligados a este carácter, a través del mapeo genético.
La identificación acertada de éstos facilitaría su mejoramiento, y podría ser
aplicado en la Selección Asistida por Marcadores para introgresar el carácter en
el germoplasma de yuca local adaptado a los más importantes ambientes donde
se la cultiva, lo que beneficiaría a los agricultores, procesadores y consumidores,
incidiendo positivamente las economías nacionales de los países menos
desarrollados.
16
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
Evaluar la reacción del primer retrocruzamiento (F1RC1) derivada del híbrido
inter-especifico entre Manihot esculenta y la especie silvestre M. walkerae, con
el fin de encontrar genotipos resistentes y marcadores moleculares asociados a
la disminución del Deterioro Fisiológico Poscosecha (DFP), usando el método de
mapeo genético de rasgos de características cuantitativas (QTLs su sinónimo en
inglés).
2.2. Objetivos específicos
- Determinar la reacción al DFP en los individuos de dos poblaciones
F1RC1.
- Identificar genotipos en dichas poblaciones F1RC1, con resistencia al DFP
14 días después de la cosecha.
- Correlacionar el DFP con caracteres como el contenido materia seca,
tamaño de la raíz y presencia de escopolatina.
- Identificar marcadores microsatélites asociados con este carácter, a
través de mapeo de QTLs en la población F1RC1 B1PD284.
17
3. MARCO TEORICO
3.1. Generalidades de la yuca
3.1.1. Origen y distribución
La yuca (Manihot esculenta Crantz) es originaria de América del Sur (Olsen y
Schael, 2001; Allen, 1994), con centros primarios de diversidad en Brasil y
América Central (Allen, 2002). Actualmente, es cultivada en zonas tropicales y
subtropicales del mundo, entre 30°N y 30°S, (Olsen y Schael, 2001; Ceballos y
Cruz, 2002).
3.1.2. Taxonomía
La yuca pertenece a la Clase Dicotyledoneae, Subclase Archichlamydeae,
Orden Euphorbiales, Familia Euphorbiaceae, Subfamilia Manihotae, Género
Manihot, y especies Manihot esculenta Crantz. La familia Euphorbiaceae
comprende 7200 especies, caracterizadas por tener vasos lactíferos compuestos
de células secretorias (Ceballos y Cruz, 2002). Este cultivo es perenne con porte
arbustivo, monoico, generalmente con 1 a 3 m de altura. La planta se puede
propagar vegetativamente, con finalidad comercial, y sexualmente, en
programas de mejoramiento y ocasionalmente en campos de agricultores.
3.1.3. Importancia de la yuca
La yuca es el cuarto cultivo más importante, proveedor de calorías alimenticias,
después del arroz, trigo y maíz al nivel mundial (Wenham, 1995; Ceballos et al,
18
2004). Es la fuente de calorías más importante para más de 250 millones de
africanos y 600 millones de personas a nivel del mundo (Zhang et al, 2003;
Sayre, 2006), y juega un papel importante en la seguridad alimentaria (Nweke et
al, 2002) y alivio de la pobreza en países poco desarrollados, sobretodo en
África.
Atributos específicos, como alta eficacia en la producción del hidrato de carbono,
tolerancia a sequía y diferentes calidades de suelo (Buschmann et al, 2000),
habilidad de resistir al ataque de plagas y enfermedades más importantes y
flexibilidad de cosechar cuando los agricultores necesitan (Ceballos et al, 2004);
hace que la yuca sea un cultivo importante, sobre todo a los agricultores de
pequeña escala y recursos limitados.
El almidón es el producto más importante en la yuca, con aproximadamente 85%
del tejido de raíz de reserva (Wenham, 1995). Las raíces de yuca y también las
hojas pueden proveer diversidad de usos para consumo humano y alimento
animal, por ejemplo, almidón nativo o fermentado, harinas, gari y casabe, y
también, producción del alcohol y jarabes de fructosa-glucosa (Ceballos et al,
2004).
Existe poca variación reportada para la calidad de almidón de yuca. Respecto a
su porcentaje de amilosa, puede ser cerca de 15% (Wheatley et al, 1993). Sin
embargo, recientemente se reportó la ocurrencia de una mutación natural para
almidón libre de amilasa en yuca (Ceballos et al, 2007). En ese trabajo los
autores reportan también que el contenido de amilosa en una muestra de más
de 2000 genotipos de yuca “normal” es ligeramente más alto (16.6%). La yuca
también se caracteriza por su producción de glucósidos cianogénicos (CG) que
se encuentran en todos los tejidos, excepto en la semilla. Las hojas de yuca
tienen volúmenes de proteína entre 20-22%, con base en peso seco (Chávez et
al, 2000), pero sus raíces son bajas en proteína (2-3% con base en peso seco),
aunque puede ser considerablemente más alto (6-8%) en algunas cultivares
19
criollos, particularmente de Centroamérica (CIAT, 2002; Ceballos et al, 2006)). El
contenido de carotenos varía de 0.102 a 1.040mg/100g tejido fresco; hierro
17.1mg/kg y zinc 7.5mg/kg (Chávez et al, 2005).
A pesar de su importancia económica, las raíces de yuca tienen pobre
capacidad de almacenaje comparado con otros cultivos de raíz, puesto que en
uno o dos días inicia el DFP (Beeching et al, 1998) que afecta su palatabilidad y
reduce su valor comercial con pérdidas que pueden alcanzar más de 90% de las
raíces cosechadas (Wheatley et al, 1985).
3.1.4. Deterioro poscosecha en la yuca
En general, se han reconocido dos tipos de deterioro, designados como
deterioro fisiológico o primario y microbiano o secundario de las raíces (Booth,
1976). 3.1.4.1. Deterioro fisiológico poscosecha en la yuca (DFP)
El DFP en yuca es una respuesta de estrés abiótico, que aparece 24 a 48 horas
después de la cosecha y se manifiestan por cambios fisiológicos, bioquímicos y
de ultra-estructura en la raíz (Rickard y Coursey, 1981; Wheatley, et al, 1985). El
DFP se inicia en la sección transversal de la raíz, con decoloración negro-
azulosa en el tejido vascular, seguida por una decoloración acastañada de los
tejidos parenquimáticos (Booth, 1976) y una fuerte fluorescencia azul bajo luz
ultra-violeta (Figura 1), debido a la producción de compuestos fenólicos,
incluyendo escopoletina, escopolina, esculina, hidroxicoumarinas (Wheatley y
Schwabe, 1985a), leucoantocianinas, cianidina, deltinidina (Akinrele, 1964),
flavan-3-ols, (+)-catequina y (+)-gallocatequina (Uritani, et al, 1984); tales que,
por deshidratación del tejido, pueden liberarse por lesión o sitios de daño
mecánico en las raíces. Asociado con la decoloración se forman oclusiones
20
coloreadas y tilosas en el xilema parenquimático que bloquea los vasos del
xilema adyacente (Rickard y Gahan, 1983).
Figura 1. Síntomas de la Deterioración Fisiológica Poscosecha (izquierda) y fuerte fluorescencia azul bajo luz ultra-violeta en yuca (derecha).
Además, el DFP se acompaña por un aumento en la respiración y movilización
de almidón a los azúcares; aumento de la producción de etileno (Hirose et al,
1984) y contenido cianogénico en las raíces; aumento de la actividad de varias
enzimas, tales como, deshidrogenasas, peroxidasas, catalasas, fenilalanina
amonioliasa (PAL) y fenol oxidasa (Plumbey et al, 1981; Rickard, 1982; Hirose,
1986); cambios en la composición de las membranas lipídicas (Lalaguna y
Agudo, 1989); y proceso activo involucrando cambios en la expresión de genes y
síntesis de nuevas proteínas, a través de inhibición del ciclohexamida (Uritani et
al, 1984; Beeching et al, 1995; Beeching et al, 1997).
3.1.4.2. Deterioro microbiano poscosecha en la yuca
El deterioro microbiano o secundario es causado por agentes patógenos
(hongos y/o bacterias), que inducen fermentación y ablandamiento de las raíces.
Este deterioro, ocurre después del deterioro fisiológico e implica pudrición
microbiana a los 5-7 días después de la cosecha (Booth, 1976). Se manifiesta
inicialmente por estriado vascular semejante al observado en deterioro
21
fisiológico; posteriormente, éste se convierte en una pudrición húmeda, con
fermentación y maceración de los tejidos (Figura 2) (Sánchez y Alonso, 2002).
Sin embargo, en algunos casos el deterioro secundario puede ser la causa inicial
de la pérdida de aceptabilidad; cuando esto sucede, frecuentemente el estriado
vascular y la decoloración de los demás tejidos radicales pueden ser casi
simultáneos (Booth, 1976).
El deterioro microbiano está asociado con la actividad de varios
microorganismos patógenos; se acelera, por tanto, en un ambiente en que la
humedad relativa y la temperatura son altas, especialmente en las raíces que
tengan daños físicos (Sánchez y Alonso, 2002). Por tanto, en estudios
etiológicos se han aislado del tejido afectado hongos de los géneros Penicillium,
Aspergillus, Rhizopus y Fusarium, y bacterias de Pseudomonas y
Corynebacterium (Booth, 1976; Noon y Booth, 1977; Wenham, 1995).
Figura 2. Síntomas del deterioro microbiano en la yuca
3.1.4.3. Factores que inciden en el deterioro fisiológico poscosecha en yuca
Los factores más importantes en la incidencia de ambos tipos de deterioro de las
raíces de yuca son los daños mecánicos, las diferencias entre variedades, las
22
condiciones edafoclimáticas y la poda de la parte aérea de la planta (Wheatley,
1983).
Daños mecánicos
El inicio y la intensidad del deterioro de las raíces de yuca están estrechamente
relacionadas con la presencia de daños físicos en las raíces (Booth, 1976). La
ocurrencia de daños mecánicos en las raíces es afectada por factores
relacionados con las características varietales tales como la forma de las raíces,
presencia de pedúnculos largos, adherencia de la cáscara, textura y grado de
compactación del suelo y del método de cosecha manual o mecánico. Una
práctica que permite reducir los daños causados por el deterioro asociado con
los daños mecánicos, consiste en someter las raíces a un proceso de curado
para tratar de sanar las heridas ocasionadas durante la cosecha e impedir así
que sean atacadas por microorganismos (Booth, 1976; Aristizábal y Sánchez,
2007).
Características varietales Varios estudios de susceptibilidad al deterioro fisiológico muestran amplia
variación entre y dentro de las variedades (Montaldo, 1973; CIAT, 1977; Pereira,
1977; Lozano et al., 1978; Wheatley et al., 1985; Cortés et al, 2002);
posiblemente por diferencias en la facilidad de cosecha y por la correlación
positiva entre el contenido de materia seca de las raíces y el grado de
deterioración fisiológica (CIAT, 1977; Wheatley et al, 1985).
Condiciones edafo-climáticas
El deterioro fisiológico necesita oxígeno para su desarrollo e involucra
reacciones enzimáticas; se puede evitar impidiendo el acceso de oxígeno a los
tejidos parenquimatosos o inhibiendo las reacciones enzimáticas (Zapata, 2001;
Aristizábal y Sánchez, 2007). La luz no influye en el proceso de deterioro. La
humedad en la raíz es importante en la conservación y mantenimiento del peso
de la misma (Cenóz et al, 2001). Evaluaciones de varios cultivares de yuca en
diferentes condiciones edafo-climáticas y épocas del año han mostrado una
23
amplia variación del deterioro poscosecha de las raíces. Se ha encontrado que
el comportamiento de un mismo cultivar al deterioro puede variar en el
transcurso del año, posiblemente como consecuencia de los cambios climáticos
(Wheatley et al, 1985).
Efectos de poda antes de la cosecha
El nivel de deterioro fisiológico de las raíces se reduce mediante la poda de la
parte aérea de las plantas. Cuando el período entre la poda y la cosecha es de
1-2 semanas, las raíces adheridas al tallo se deterioran menos que las raíces
sueltas; y cuando el período es de tres semanas las raíces mantenidas, en una u
otra forma, fueron resistentes al deterioro (Lozano et al, 1978). Los rebrotes en
los tallos después de la poda no tienen un efecto en la disminución del deterioro;
plantas cosechadas después de cinco meses de realizada la poda presentan
resistencia al deterioro. Sin embargo, las podas y rebrotes sucesivos reducen el
contenido de almidón y afectan la textura y calidad culinaria de las raíces
(Wheatley et al, 1985).
3.1.4.4. Alternativas para minimizar el deterioro fisiológico poscosecha en yuca
Actualmente, no hay una técnica universal para conservar raíces de yuca a nivel
comercial, debido al rápido deterioro (Sánchez y Alonso, 2002). Sin embargo,
algunas condiciones de almacenamiento permiten reducir los factores que
favorecen el deterioro de las raíces, como el almacenamiento en atmósfera de
nitrógeno o al vacío, lo que reduce el oxigeno ambiental; cubrir las raíces con
capas delgadas de parafina, lo que impide la penetración del oxígeno a los
tejidos; almacenar las raíces en condiciones de temperaturas bajas (2oC), que
inhibe la enzima de polifenoloxidasa y otras enzimas que forman los pigmentos
típicos del deterioro fisiológico; curación de las heridas de las raíces;
refrigeración; empaque de las raíces en bolsas de polietileno y su tratamiento
24
inmediato con un fungicida; y podas dos semanas antes de la cosecha (CIAT,
1987; Zapata, 2001).
3.1.4.1.5. Genes expresados durante el deterioro fisiológico en yuca
Varios genes involucrados en el proceso de DFP se han clonado, incluyendo
catalasa (Reilly et al, 2001), 1-aminociclopropano-1-ácido carboxílico (ACC)
oxidasa (Li et al, 2000); y un compuesto serina/treonina proteína kinasa de una
librería de cDNA relacionada con DFP (Han et al, 2000). Componentes de
respuesta defensiva han sido identificados, por ejemplo, metabolitos secundarios
con las propiedades anti-microbianas y antioxidantes los cuales han sido
caracterizados (Buschmann et al, 2000); además de la β-1,3-glucanasa (Han et
al, 2000), tres genes para Fenilalanina Amonia Liasa (PAL), y una importante
enzima de entrada para generar metabolismo del Fenilpropanoico, se ha
clonado durante DFP (Beeching et al, 2000).
Los genes o proteínas expresados durante DFP, como Fenilalanina Amonia
Liasa (PAL), β-glucanasa, Glicoproteínas Ricas en Hidroxiprolina (HRGPs) y 1-
aminociclopropano-1-acido carboxilico (ACC) oxidasa; se relacionan con
defensa y curación de lesiones; aunque proteasas, inhibidores de proteasas y
otros genes asociados a la senescencia se relacionan con respuestas de muerte
celular programada (Han et al, 2001; Reilly, 2001; Taylor et al, 2001); y catalasa
MecCAT1 y peroxidasa MecPX1 se relacionan con modulación antioxidante y
curación de lesiones (Reilly et al, 2003). Por otra parte, la expresión alterada de
la PAL, podría afectar la síntesis de los componentes curativos de lesiones,
como lignina y suberina, la síntesis de lesiones o stress de metabolitos
secundarios relacionados, incluso la escopoletina y ácido salicílico (Reilly et al,
2003).
Por otro lado, se han identificado en la estructura molecular del mapa genético
de yuca, la región del genoma con genes de respuesta a lesiones que se
25
expresaron durante el DFP de yuca, tales como Fenilalanina Amonia Liasa
(PAL), β-1,3 glucanasa, hydroxiprolina rica en glicoproteína, catalasa, 1-
aminociclopropano 1-carboxilate, inhibidor de cisteina proteasa, aspártico
proteasa, un cDNA parcial para serina/treonina proteína kinasa y peroxidasa
(Cortés et al, 2002).
3.2. Marcadores Moleculares
Un marcador molecular es cualquier proteína o ADN cuya expresión permite un
efecto fenotípico que puede ser detectado fácilmente y su herencia monitoreada
(Ferreira y Gattapaglia, 1998; Valadez y Kahl, 2000). Los marcadores del ADN
se basan fundamentalmente en el análisis de las pequeñas diferencias en
pequeñas secuencias del ADN entre individuos.
Los primeros marcadores moleculares utilizados en la caracterización genética y
taxonómica fueron las isoenzimas. El polimorfismo de la longitud de los
fragmentos de restricción (RFLP) fue el primer marcador (basado en ADN)
usado en los programas de investigación, inicialmente empleado para el mapeo
físico de los adenovirus (Grodzicker et al. 1974) y en la construcción de un mapa
genético de ligamiento para humanos (Botstein et al. 1980), y posteriormente
usados para varios estudios genéticos en plantas. El principio de su utilización
consiste en el corte del ADN por enzimas de restricción, separación de los
fragmentos vía electroforesis y posterior hibridización con sondas marcadas (que
posee una secuencia homóloga a uno o más fragmentos de restricción) por
radioactividad o fluorescencia. Las enzimas actúan como “tijeras moleculares”
altamente específicas, que reconocen y cortan secuencias de ADN de cuatro,
cinco o seis nucleótidos de longitud en sitios específicos. Los marcadores RFLP
son codominantes y presentan mayor nivel de variación alélica en poblaciones
naturales de plantas, pero es considerada una técnica compleja, costosa y exige
gran cantidad de ADN.
26
Con el surgimiento de la técnica basada en reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) (Saiki et al, 1985), amplió el uso de los marcadores moleculares, como
por ejemplo; los RAPDs, SSR, AFLPs, regiones amplificadas de secuencias
caracterizadas (SCARs), SNPs, etc.
Amplificación aleatoria del ADN polimórfico (RAPD) fue descrito por Williams et
al. (1990) y Welsh y McClelland (1990). La técnica utiliza un iniciador corto, de
aproximadamente 10 nucleótidos de longitud y de secuencia arbitraria, con la
capacidad de amplificar secuencias al azar de un patrón complejo de ADN y
unirse a regiones específicas en el genoma. La técnica es rápida y sencilla para
detectar polimorfismos, aunque la mayoría de los cebadores comerciales dan
lugar a varios fragmentos, algunos cebadores pueden fallar en la amplificación
de fragmentos de algunos materiales. Son de herencia dominante y poco
reproducibles (Munthai et al., 1992; Lowe et al. 1996).
Polimorfismo en la longitud de los fragmentos amplificados (AFLPs) es una
combinación de las tecnologías de RFLP y de PCR. La técnica combina la
digestión con enzimas de restricción y amplificación vía PCR; donde son
agregados a los fragmentos de restricción adaptadores específicos, de 20 a 30
pares de bases, de secuencias homólogas a los fragmentos. El polimorfismo es
detectado empleando radioisótopos, colorantes fluorescentes o tinción de plata
(Zabeau y Vos, 1993). Son marcadores muy sensibles y de alta eficacia,
permiten el análisis de un elevado número de loci sin requerir información previa
sobre su secuencia, son en su mayoría dominantes y altamente reproducibles,
sin embargo, requieren una mayor cantidad de ADN (Karp et al, 1997). Se
pueden emplear, por ejemplo, en la construcción del armazón de los mapas
genéticos, para discriminar individuos cercanamente relacionados y para
localizar genes específicos en genomas complejos.
27
Los microsatélites o secuencias simples repetidas (SSR) son regiones de
secuencias pequeñas repetidas (2 a 10 pares de bases), arregladas en serie,
que están distribuidas aleatoriamente por todo el genoma de hongos, plantas y
animales, pueden o no estar asociadas con genes, y son útiles para medir el
polimorfismo entre especies o genotipos muy relacionados. La detección del
polimorfismo SSR se realiza mediante PCR con iniciadores diseñados a partir de
la región del ADN adyacente a la repetición, y la separación de los productos
mediante electroforesis en geles de agarosa, poliacrilamida o geles de
secuenciación. Las variaciones detectadas por los SSR son el resultado de
cambios en el número de unidades repetidas (Hajeer et al, 2000; Lowe et al,
2004).
3.2.1. Marcadores microsatélites en yuca
Los marcadores microsatélites constituyen una generación de marcadores
escogidos para mapeo genético y selección asistida por marcadores en yuca y
otros cultivos (Mba et al, 2001; Okogbenin et al, 2006), debido a la detección de
alto nivel de polimorfismo, co-dominancia, alta reproducibilidad, poco exigencia
en calidad y cantidad de ADN, tiempo y costo de mapeo QTLs para caracteres
agronómicos de interés (Roa et al, 2000; Spooner et al, 2005).
Los microsatélites han sido usados para la construcción de mapa de ligamiento
en yuca (Okogbenin et al, 2006); confirmación del alto nivel de apomixis en
clones mejorados (Nassar y Collevatti, 2005), asociación con una nueva fuente
de resistencia al mosaico africano (Akano et al, 2002; Lokko et al, 2005);
evaluación del germoplasma y diversidad genética (Chavarriaga et al, 1998;
Chavarriaga et al, 1999); e investigación del origen geográfico y evolutivo de
este cultivo (Olsen y Schaal, 2001).
28
3.2.2. Mapas genéticos
El mapeo genético es una herramienta que muestra la distribución linear de un
grupo de genes y marcadores en los cromosomas de cualquier especie, basado
en el concepto clásico de ligamiento. El fundamento del mapeo genético reside
en la relación directa entre la frecuencia de recombinación (%) y la distancia
física (cM) entre los loci. Aunque, esta relación es distorsionada por diferencias
entre organismos, entrecruzamientos no aleatorios, presencia de sitios de alta
frecuencia de recombinación y la evidencia de control genético de la
recombinación (Carrera et al, 2004).
En el contexto del mejoramiento vegetal los mapas genéticos posibilitan la
cobertura y análisis de genomas completos; descomposición de caracteres
genéticos complejos (QTLs) en componentes mendelianos; localización de
regiones genómicas que controlan caracteres de importancia agronómica;
cuantificación del efecto de estas regiones en la característica estudiada;
identificación rápida de genotipos únicos en poblaciones segregantes, a través
de selección asistida por marcadores moleculares e incorporación de varios
genes de interés en un fondo genético o “piramidización” de genes. También
generan información básica sobre la estructura y organización de un genoma tal
como reordenamientos cromosómicos (inversiones, translocaciones,
duplicaciones) e identifican regiones con alta densidad de genes. Por otro lado
un mapa genético constituye el punto de partida para proyectos de clonado
posicional de genes, o sea, utilización de información genética (disposición
espacial de genes), molecular (secuencia nucleotídica de genes) y del
funcionamiento (expresión de los genes) de un genoma (conjunto de genes)
para identificar al gen responsable de un carácter particular (Paterson, 1996;
Ferreira y Grattapaglia, 1998; Carrera et al, 2004).
29
3.2.2.1. Mapa genético de la yuca
A través de progenitores geográficamente divergentes, fue desarrollado el primer
mapa genético de yuca, usando una población F1 constituida por 150 individuos
y marcadores moleculares, tales como: 132 RFLPs, 30 RAPDs, 3 SSR
(microsatélites) y 3 marcadores isoenzimáticos, del parental femenino; y 107
RFLPs, 50 RAPDs, 1 SSR (microsatélites) y 1 marcador isoenzimático, del
parental masculino (Fregene et al, 1997).
Adicionalmente, fue construido otro mapa de ligamiento en yuca usando 122
marcadores SSR y una población F2 constituida por 268 individuos, derivada de
auto-cruce del genotipo K150 (progenie F1 del cruzamiento de variedades élite,
TMS 30572 y CM 2177-2). En este mapeo, cerca de 100 marcadores cubrieron
la medida de 1236.7 cM, asignados en 22 grupos de ligamiento (LG1 – LG22)
con un promedio de distancia de los marcadores de 17.92 cM (Okogbenin et al,
2006).
El mapa genético de yuca esta siendo usado para el mapeo de características
de interés agronómico, como la resistencia al añublo bacterial (Jorge et al.,
2000); asociación con una nueva fuente de resistencia al mosaico africano
(Akano et al, 2002; Lokko et al, 2005) y mapeo de varias características
asociadas con el rendimiento, arquitectura de planta y precocidad (Okogbenin y
Fregene, 2002 y 2003).
Para identificar la región del genoma mejor relacionada con genes de respuesta
a lesiones involucradas al DFP en yuca se utilizaron los siguientes marcadores
moleculares: 240 RFLP, 100 RAPD, 85 SSR y 5 marcadores isoenzimáticos; en
144 individuos F1 resultantes del cruce entre TMS30572 x CM2177-2, y como
resultado se obtuvieron ocho QTLs localizados en el grupo de ligamiento G, P, L,
U, y X del mapa estructural femenino que explicaron entre 5-12% de la variación
30
fenotípica del DFP, mientras que en el mapa estructural masculino, dos QTLs
localizados en el grupo de ligamiento C y L explicaron el 13% y el 11% de esta
variación, respectivamente; tales resultados sirven de base o herramientas para
la identificación de genes relacionados con este carácter (Cortés et al, 2002).
3.2.2.2. Mapeo genético de loci de caracteres cuantitativos (QTL)
Cuando más de dos genes están involucrados en la variación fenotípica total, los
loci son comúnmente descritos loci de caracteres cuantitativos (QTLs) y el
procedimiento de mapeo es denominado mapeo de QTLs. Esta técnica es útil
para detectar regiones del genoma ligados a características de interés
agronómico. La principal dificultad en el mapeo de QTLs es el hecho intrínseco
que tanto factores genéticos como ambientales afectan la expresión final del
fenotipo. Por otra parte, es importante notar que un QTL puede en realidad estar
constituido por varios genes que funcionan en conjunto en una especie de
complejo genético co-adaptado (Ferreira y Grattapaglia. 1998).
A pesar del reducido número de estudios de mapeo de QTLs en yuca, utilizando
progenies relativamente pequeñas se ha detectado un número significativo de
asociaciones entre marcadores y QTLs; como por ejemplo en el mapeo para
resistencia al añublo bacterial, empleando 90 individuos F1 que generaron el
mapa genético de la yuca y 60 individuos suplementarios (Jorge et al., 2000); y
en el mapeo de QTLs para varios caracteres asociados con el rendimiento,
arquitectura de planta y precocidad usando 144 individuos F1 (Okogbenin y
Fregene, 2002 y 2003).
31
3.2.2.3. Construcción de mapas genéticos para caracteres cuantitativos
Para incorporar un carácter de interés agronómico en un mapa genético es
fundamental desarrollar una población segregante proveniente de progenitores
fenotípicamente contrastantes con suficiente variación genética. El tamaño
poblacional debe ser lo mayor posible para incrementar la eficiencia y capacidad
para detectar QTLs. Se debe caracterizar la población segregante utilizando
marcadores moleculares polimórficos (con diferencias en la secuencia de ADN
entre los progenitores). Generalmente se utilizan poblaciones F2 (intercruzas),
híbridos F1, retrocruzas (F1RC1), dobles-haploides, o líneas endocriadas
recombinantes (Olmos y Echenique, 2004). Para construir un mapa lo más
deseable es disponer de al menos cuatro marcadores moleculares por cada
cromosoma del genoma en estudio. Cuanto mayor sea el número de
marcadores incorporados al mapa, obviamente mayor será su resolución y la
probabilidad de identificar algún marcador ligado al carácter agronómico de
interés. La evaluación fenotípica del carácter de interés en la población
segregante, se considera fundamental y debe ser hecha con sumo cuidado para
reducir al máximo el error experimental al evaluar el carácter cuyo mapa
genético se desea desarrollar.
Por lo tanto, con el cumplimento de los requisitos para el mapeo, se pueden
identificar marcadores ligados al carácter agronómico, buscando asociaciones
entre marcadores polimórficos y el carácter de interés; una asociación
significativa indica que el QTL está cercano al marcador; y con la selección de
este marcador resultan altas probabilidades de selección indirecta del gen de
interés, fundamento de la selección asistida por marcadores moleculares
(Carrera et al, 2004). Para la construcción del mapa genético, se pueden utilizar
herramientas informáticas específicas, tales como los programas Mapmaker,
MapmakerQTL (Lander et al, 1987), GMENDEL (Liu y Knapp, 1990), QTL
Cartographer (Basten, Weir y Zeng, 1995), MAPQTL (Van Ooijen y Maliepaard,
1996), QGene (Nelson, 1997), etc.
32
3.2.2.4. Métodos para Mapeo genético de loci de caracteres cuantitativos
Existen varios métodos para detectar genes mayores y QTLs, que incluyen el
uso y no uso de marcadores genéticos. Algunas estrategias que no usan
marcadores genéticos están basadas en análisis de segregación, distribución
multimodal, desvío de la distribución normal, heterogeneidad de varianzas
(Falconer y Mackay, 1996; Hill y Knott, 1990). La principal limitación de estos
métodos es que no proporcionan ninguna información sobre el número,
magnitud de efecto, y la posición del gen (o genes) responsable(s) de la
variación del carácter cuantitativo.
Alternativamente, métodos como el de mapeo de marcadores simples, mapeo
por intervalos simples y mapeo por intervalos compuestos, fueron desarrollados
con uso de marcadores genéticos para probar asociaciones entre éstos y
caracteres cuantitativos (Lynch y Walsh, 1998).
El mapeo de marcadores simples es basado en la asociación de la expresión del
QTL a la presencia de un marcador. El análisis consiste en la diferencia entre los
promedios fenotipos del carácter para cada una de las clases genotípicas de un
dado marcador, que pueden poseer segregación tipo 1:2:1 o 1:1,
correspondiente a las poblaciones F2 y retrocruzas, respectivamente. A través de
procedimientos estadísticos, como test t, análisis de variancia, regresión linear
simples y método de la máxima verosimilitud; se puede inferir que un QTL está
significativamente ligado al marcador (Zeng, 1994). Este método tiene la
limitante de no detectar marcadores ligados a más de dos QTLs
simultáneamente; confunde el efecto y la posición de los QTLs, además los
efectos genéticos del QTLs son subestimados (Botstein, 1989)
El mapeo por intervalo simple fue desarrollado para solucionar los problemas del
análisis de marcadores simples. Este método considera pares de marcadores
33
adyacentes; y la detección de la presencia y la estimación de los efectos de los
QTLs son hechas dentro de cada intervalo entre marcadores. Cada intervalo es
analizado separadamente, utilizando el método de máxima verosimilitud. A
través de este método se puede detectar con claridad la presencia de QTLs a lo
largo del genoma, mostrando la posición estimada utilizando la tasa de
verosimilitud. Este método tiene la limitante de no aprovechar la información de
marcadores fuera del intervalo de mapeo en el mismo cromosoma, que pueden
estar asociados al carácter. Además considera QTLs inexistentes o fantasmas
(Zeng, 1994).
El mapeo por intervalos compuestos (MIC) se caracteriza por controlar los
efectos de QTLs situados fuera del intervalo en mapeo, a través de regresión
múltiple entre el fenotipo del carácter y el conjunto de marcadores (Zeng 1993 y
1994). Con este método, se puede identificar la posición y obtener los estimados
de los parámetros genéticos relativos a un QTL dado, sin influencia de otros
QTLs ligados o no. Si el desequilibrio de ligamiento (LD por las siglas del Inglés
Linkage Disequilibrium) está presente entre un marcador y un QTL, marcadores
con efecto significativo pueden encontrarse por análisis estadísticos (Dekkers y
Hospital, 2002). El modelo estadístico para análisis MIC en progenies de
retrocruzamiento es el siguiente (Liu, 1997):
yj = bo + biXij + ∑+≠ 1,iik
bkXkj + εj
donde yj es el valor del carácter del individuo j; bo intercepto del modelo, bi efecto genético del QTL putativo localizado entre el marcador i e i+1; Xij variable
aparente con valor de 1 para el genotipo marcador AABB, 0 para AaBb, 1 con
probabilidad de 1 - r1/r = 1 – ρ y 0 con probabilidad r1/r = ρ para el genotipo
marcador AaBB, 1 con probabilidad de ρ y 0 con probabilidad de 1 – ρ para el
genotipo marcador AABb; r la recombinación entre el primer marcador y el QTL
putativo; bk coeficiente de regresión parcial del carácter en el marcador k; Xkj
34
variable aparente para el marcador k y el individuo j, con 1 si el marcador tiene
genotipo AA y 0 para Aa; y εj corresponde al error del modelo.
En este método, se alcanza mayor resolución y precisión en el mapeo y control
de la varianza genética residual, pues varios marcadores son incluidos en el
modelo, además de los que tienen mayor asociación con el carácter,
denominados flanqueadores o cofactores (Zeng, 1994; Liu, 1997). Para la
selección de cofactores, diversos métodos pueden ser utilizados, como el
“forward” (hacia delante), “backward” (hacia atrás) y el “stepwise” (paso a paso).
El “stepwise” es el más utilizado y consiste en la adición individual de los
marcadores por orden de asociación con el carácter, mediante coeficiente de
correlación o regresión linear simples. Por lo tanto, los marcadores con efectos
no significativos o menos informativos son eliminados, quedando solamente un
conjunto de cofactores, que explican mejor la variación del carácter siguiendo el
modelo de regresión múltiple. De este modo, el mapeo puede ser efectuado,
mediante el estimado de máxima verosimilitud para sus efectos. Otro aspecto
importante para el mapeo de QTLs es la determinación del límite crítico o
“threshold” a ser usado en el análisis, que corresponde al valor de la tasa de
verosimilitud, debajo del cual el QTL será declarado presente. Este valor puede
ser expresado en forma de “LOD score”, que indica la hipótesis de ocurrencia
del QTL, dado por la siguiente formula (Lander et al, 1987; Botstein, 1989):
10ln2militudTasaVerosiLOD =
Varias referencias de mapeo genético de caracteres cuantitativos en yuca,
consideran límites críticos con valores de “LOD scores” entre 3 a 4, que indican
la hipótesis de que el QTL es 1000 a 10000 veces probable de ocurrencia.
35
4. MATERIALES Y METODOS
4.1. Localización del estudio
La población F1RC1 fue sembrada en Abril de 2006, en un lote perteneciente a
Corpoica-Palmira, Departamento del Valle del Cauca, Colombia, a 900 msnm,
latitud 03o 31’ Norte y longitud 76o 19’ Oeste, con precipitación media anual de
1000 mm y suelos con textura franco arcillosa. La evaluación fenotípica del
deterioro fisiológico en raíces de yuca fue realizada en Marzo de 2007, en el
Laboratorio de calidad de raíces de yuca, ubicado en el CIAT - Palmira, Valle del
Cauca a 965 msnm, latitud 03o 30’ Norte y longitud 76o 30’ Oeste, con 24oC de
temperatura media. Los análisis moleculares fueron realizados en el laboratorio
de genética de yuca del CIAT.
4.2. Material vegetal
Se usaron 122 individuos de la población F1RC1 para este estudio. Esta
población fue derivada del primer retrocruzamiento a partir del híbrido inter-
específico CW429-1 resistente al DFP, usando como padres recurrentes
susceptibles 2 genotipos élite, MTAI8 desarrollado en Tailandia (y liberado como
Rayong 60) y SM909-25, desarrollado en CIAT (Figura 3); que generaron las
familias BIPD284 (66 individuos) y BIPD289 (56 individuos), respectivamente
(Cuadro 1). El híbrido CW429-1 resultó del cruzamiento entre un genotipo élite
de yuca SM909-25 y la especie silvestre Manihot walkerae (Wae001), originario
de Gran México (Rogers y Appan, 1973). Los individuos de la población en
estudio fueron sometidos al rescate de embriones y propagados
36
vegetativamente para obtener de 4 a 6 plantas por genotipo, con las cuales se
estableció el ensayo.
Figura 3. Esquema modificado de Retrocruzamiento Avanzado (Fase 1).
Cuadro 1. Población F1RC1 para la evaluación fenotípica y mapeo del DFP.
Familia Madre Padre Genotipos obtenidos Observación de DFP
B1PD284 CW 429-1 MTAI 8 66 Resistente x Susceptible B1PD289 CW 429-1 SM909-25 56 Resistente x Susceptible
TOTAL 122
4.3. Evaluación fenotípica del deterioro fisiológico poscosecha en yuca
Se evaluó el deterioro fisiológico en raíces de yuca usando el método
desarrollado originalmente por Wheatley et al (1985b), con algunas
modificaciones. El método consiste en seleccionar por lo menos 10 raíces
comerciales de cada genotipo con un tamaño mínimo de 18cm, sin daños
mecánicos y sin pudrición precosecha; descartar los extremos distal y proximal
cortándolos con un cuchillo, de manera que la sección de raíz quede de 15cm de
largo; cubrir el lado distal con una película de PVC para mantener la humedad y
1. Producción del híbrido inter- específico
Clon elite(SM909-25)
Especie silvestre: Manihot walkerae (Wae001)
x
2. Retrocruzamiento (RC1)
x
F1RC1
3. Selección de progenies tolerantes al DFP y Mapeo de QTLs
CW429-1 MTAI 8 y
SM909-25
F1
x (…..)
Población F1RC1: - 122 Individuos
37
evitar que el deterioro fisiológico comience desde esta superficie, y así forzar
que el deterioro fisiológico se desarrolle desde el extremo proximal; almacenar
las raíces en un lugar protegido del sol y de la lluvia, pero expuesto al aire libre
(Figura 4); evaluar después de 3 días de almacenamiento, a través de corte de 7
secciones transversales en cada 2cm de cada raíz.
En cuanto a las modificaciones fue considerado, en primer lugar, un tamaño de
raíz menor al normalmente utilizado para este tipo de estudio, teniendo en
cuenta el tipo de población evaluada, de manera que el número de secciones
transversales varió de 3 a 7 de acuerdo al tamaño de cada raíz, pero
conservando la distancia de 2cm de corte de cada sección. En segundo lugar, se
realizaron dos evaluaciones a los 7 y 14 días después de la cosecha por
genotipo dentro de cada familia. Se evaluaron 5 raíces por genotipo en cada día
de evaluación. El diseño utilizado fue completamente al azar, considerando cada
raíz como una repetición.
Figura 4. Lugar de almacenamiento de las raíces después de la cosecha
38
4.3.1. Cuantificación del deterioro fisiológico poscosecha en yuca
Las raíces fueron evaluadas a los 7 y 14 días, para dar la oportunidad a que los
genotipos mostraran su reacción al DFP, a lo largo de ese período de tiempo. Se
seleccionaron por lo menos 5 raíces por genotipo en cada día de evaluación.
Cortando las secciones transversales, a partir del extremo proximal, y asignando
valores numéricos de acuerdo a una escala de 0 a 10. Los valores de la escala
corresponden en porcentaje a (0=0%, 1=10%, 2=20%, 3=30%,…,10=100%)
(Figura 5).
Figura 5. Ilustración de una escala para evaluar el deterioro fisiológico poscosecha.
La cuantificación fue mediante el cálculo de promedios del DFP en porcentaje de
cada raíz, de acuerdo con lo descrito por Wheatley et al (1985b), usando
Microsoft Excel, a través de siguiente fórmula:
100*70
(%)raizDFPs
DFPtraíz ∑= ,
Donde, DFPtraíz (%) es el promedio porcentual del DFP de la raíz; DFPsraiz el
valor de DFP de cada sección de la raíz.
39
4.4. Mapeo genético
4.4.1. Extracción del DNA
Para la extracción de ADN se siguió el protocolo descrito por Dellaporta (1983),
con modificación para yuca, que consistió en secar al horno (70oC) por 72hrs
hojas jóvenes; macerar el tejido y adicionar 1 - 2 gr del tejido macerado a tubos
eppendorf de 1.5 ml, 800ul de Buffer de extracción y 50ul de SDS (20%); y
transferir a baño María (65oC) por 15-20min y agitar cada 5min; enfriar las
muestras a temperatura ambiente (2min) y adicionar 250ul de Acetato de
Potasio 5M frío (pH 5.2), mezclar por inversión e incubar en hielo por 20min.
Después, centrifugar a 14000 rpm (20min) y al sobrenadante adicionar
isopropanol frío (500ul) e incubar a -20oC (1hora o toda la noche). Volver a
centrifugar a 12000rpm (10min), para descartar el sobrenadante y obtener el
pellet. Lavar el pellet con 1ml de etanol (70%) y centrifugar (5-10min) a
10000rpm; descartar el sobrenadante y adicionar 100ul TE (10:1) + 2ul de
RNAsa al pellet final.
4.4.2. Control de Calidad y Cuantificación del ADN
Para evaluar la calidad del ADN se utilizó un gel de agarosa al 0.8% (1.6gr de
agarosa en 200ml TBE 0.5x), con bromuro de etidio (0.5ul/ml). La muestra fue
de 10 ul (2ul de ADN, 5ul de agua HPLC y 3ul de blue juice), corrido a 100 volt
durante 45 min, observada en luz ultravioleta y fotografiada (cámara Polaroid
Photo/UV 21-USA). La cuantificación del ADN fue mediante el uso del
fluorómetro de ADN modelo DYNA QUANT 200 marca Hoefer, utilizando buffer
TNE 10x pH 7.4 (Tris Base, EDTA-Na2, NaCl) y estándar de calibración ADN
Lambda a 100ng/µl. Después de establecer la concentración de cada muestra se
hizo una dilución para llevar cada ADN a una concentración final de 10 ng/µl.
40
4.4.3. Amplificación y Visualización del ADN
Para la amplificación del ADN se emplearon 423 marcadores microsatélites, con
una cobertura de todo el genoma de yuca, siendo 98 NS y 159 SSRY generados
por ADN genómico, y 166 ESTs generados por cDNA (Mba et al, 2001; CIAT,
2002 y CIAT, 2006). El cóctel de amplificación se preparó en un tubo Eppendorf
(1.5ml), en el cual se adicionaron los reactivos para PCR (Anexo 1), hasta
completar un volumen final de 17µl. Los volúmenes de agua HPLC y MgCl2
(mM) fueron estimados de acuerdo con la concentración de Mg requeridos para
cada primer. Se usó el termociclador MJ research Inc PTC-100, programa
YUCADIV-; con las siguientes etapas: denaturación inicial (95oC – 2min),
denaturación (94oC – 1min), “annealing” (45-55oC de acuerdo con el primer por
2min) y extensión (72oC – 2min) por 30 ciclos, extensión final (72oC – 5min), y
finalización del PCR (14oC – tiempo indefinido). Los productos amplificados
(PCR), se visualizaron por electroforesis en un gel de poliacrilamida al 4%
(Archilamida 40%, TBE 10x buffer, Urea 5M), usando una cámara vertical OWl a
100W/cm3, y tinción con plata. El tiempo de corrida dependió del peso del
primer.
4.4.4. Prueba de amplificación y polimorfismo
Para la prueba de amplificación y polimorfismo, se usaron los progenitores
(CW429-1 y MTAI8) y sus progenies B1P284a-18, B1P284a-19, B1P284b-28,
B1P284b-33, las cuales fueron escogidas a la azar, para evaluar un total de 423
“primers” disponibles en el banco genómico de yuca del CIAT.
41
4.4.5. Evaluación genotípica
La familia B1PD284 fue tomada como población de mapeo y sus individuos
fueron evaluados genotípicamente utilizando los marcadores previamente
seleccionados en la prueba de amplificación y polimorfismo. En esta evaluación,
además de los progenitores fueron incluidos como control los genotipos MNig2 y
CM2177-2.
Matriz de datos
La matriz de datos fue construida usando las filas para cada marcador y las
columnas para cada individuo. La segregación alélica en la población de estudio
fue leída de acuerdo con la proporción 1:1 (ausencia y presencia), usando el
método para mapeo de poliploides basado en la segregación de SDRFs (Single-
Dose Restriction Fragments) (Wu et al, 1992). La presencia de la banda
seleccionada fue codificada por H (representa el alelo del CW429-1) y ausencia
por A.
42
4.5. Análisis de los datos
4.5.1. Análisis de Varianza (ANOVA)
El análisis de varianza fue usado para determinar los efectos del tiempo de
almacenamiento, diferencia entre genotipos y su interacción con respecto al
deterioro fisiológico de las raíces, considerando el modelo descrito por Gomez y
Gomez (1984) sobre mediciones en el tiempo, en un diseño completamente al
azar, usando el procedimiento SAS GLM. Se transformaron los datos de DFP
expresados en porcentaje, a 5.0)100/%( +x , con el fin de cumplir con el primer
postulado de la varianza, el cual requiere que las observaciones respondan a
una distribución normal y no binomial, como ocurre cuando se trabaja con
porcentaje (Gomez y Gomez, 1984; Steel y Torries, 1960). En este análisis
fueron considerados solamente clones evaluados a los 7 y 14 días poscosecha,
para las familias B1PD284 (N=47) y B1PD289 (N=49), correspondientes al
retrocruzamiento del progenitor CW429-1 con los progenitores MTAI8 y SM909-
25, respectivamente.
4.5.2. Análisis Descriptivo
La variación del DFP entre los individuos de las dos familias a los 7 y 14 días
poscosecha, fue medida usando la distribución de frecuencias mediante el
procedimiento SAS UNIVARIATE. En este análisis como en el anterior (ANOVA)
sólo se consideraron genotipos evaluados en ambas épocas (7 y 14 días),
correspondiente a la familia B1PD284 (N=47) y familia B1PD289 (N=49). Se
excluyeron de este análisis genotipos que presentaron a los 7 días precoz
susceptibilidad al deterioro microbiano (3 y 5 genotipos en las familias B1PD289
y B1PD284, respectivamente); y aquellos que presentaron un número reducido
de raíces y que fueron evaluados solamente a los 14 días (14 genotipos en la
familia B1PD284 y 4 genotipos en la familia B1PD289). Adicionalmente, se
construyó un diagrama de caja con los valores de DFP a los 14 días poscosecha
43
de 5 genotipos susceptibles seleccionados al azar de cada una de las familias
evaluadas, con el fin de estudiar la variación a nivel de raíz dentro de cada
genotipo.
4.5.3. Determinación del grado de resistencia al DFP
Para estimar el grado de resistencia de los individuos en las poblaciones
segregantes, se consideraron únicamente los genotipos con datos a los 14 días
poscosecha, para las familias B1PD284 (N=61) y B1PD289 (N=53). Los
genotipos faltantes en las dos familias, fueron excluidos porque presentaron
precoz susceptibilidad al deterioro microbiano. Muestras de raíces con síntomas
de deterioro microbiano fueron eliminadas para evitar confusión y aumentar el
error experimental. Así mismo, debido al número reducido de raíces (en 14
genotipos de la familia B1PD284 y 4 de la familia B1PD289), las evaluaciones se
hicieron solamente a los 14 días. Para determinar el grado de resistencia al
DFP, los individuos de cada familia fueron clasificados por intervalo de escala,
con la siguiente categoría:
Escala (%) Niveles de resistencia del DFP
< 5 Muy resistente
5 a 35 Resistente
35 a 65 Moderadamente resistente
65 a 95 Susceptible
95 a 100 Muy susceptible
4.5.4. Análisis de Correlación
El DFP fue correlacionado con el tamaño de raíz y presencia de escopoletina,
usando el procedimento SAS CORR. Los datos de tamaño de raíz fueron
obtenidos a través del promedio de las secciones transversales de raíces con la
44
siguiente escala: 1 - pequeña (Diámetro < 5cm); 2 - Mediana (Diámetro 5 –
8cm); 3 - Grande (Diámetro > 8cm). El valor de escopoletina fue obtenido de
forma cualitativa, observando las raíces bajo luz ultravioleta, usando la siguiente
escala: 1 – Bajo; 2 – Medio; 3 – Alto.
4.5.5. Análisis de Regresión
El análisis de regresión se utilizó para estudiar la relación de dependencia entre
el deterioro fisiológico a los 14 días poscosecha y el contenido de materia seca,
a través de Microsoft Excel. Los datos de contenido de materia seca fueron
obtenidos a partir de muestras de yuca fresca, colocadas en un horno con
ventilación forzada, a 60oC por 48 horas. El contenido de materia seca se
determinó mediante la fórmula desarrollada por Brainbrid et al (1996):
100*(%)PmhPmsMS =
Donde, MS (%) es el porcentaje del contenido de materia seca; Pms el peso de
muestra seca en gramos; y Pmh el peso de muestra fresca en gramos.
4.5.6. Mapeo genético del DFP
La familia B1PD284 fue utilizada como población para el mapeo genético. Se
realizó usando el programa de computador MapMaker versión 2.0 (Lander et al,
1987). El análisis permitió determinar la segregación alélica de cada marcador
utilizando la prueba de Chi-cuadrado (P<0.05); la detección de grupo de
ligamiento, bajo el cálculo de la frecuencia de máxima recombinación,
probabilidad de ligamiento (LOD), estimación del mejor orden de los loci en el
mapa y distancias físicas entre marcadores (Lander et al, 1992).
45
Análisis de ligamiento Para definir el ligamiento entre marcadores se fijó un LOD crítico de 3.0 y una
frecuencia de máxima recombinación de 0.4, utilizando el comando “compare” el
cual calcula la máxima probabilidad de cada orden posible de los marcadores.
Los marcadores en cada grupo fueron ordenados usando el comando de orden
con LOD>2.0. El orden resultante de los marcadores fue examinado usando el
comando “Ripple” para certificar el orden correcto. Las unidades de distancia en
el mapa de ligamiento fueron convertidas en centimorgans (cM) usando la
función de Kosambi, que asume presencia de interferencia en los eventos de
recombinación (Kosambi, 1944). Se utilizó el comando “try” para incluir en los
grupos de ligamiento aquellos marcadores que no fueron agrupados.
4.5.7. Mapeo de QTLs
El mapeo de QTLs fue basado en el modelo de análisis de marcador simple,
usando regresión simple, mediante el programa QGENE (Nelson, 1997). Un QTL
se declaró significativo cuando la P<0.05 y el resultado del coeficiente de
determinación (R2) representó la proporción de la varianza fenotípica explicada
por la diferencia alélica del marcador. También se usó el procedimiento PROC
REG de SAS, para identificar en todos los marcadores que formaron grupos de
ligamiento, asociaciones potenciales con el deterioro fisiológico.
Para el análisis de QTLs, el programa QGENE, necesita dos matrices de datos,
la primera con la información genotípica de los individuos de la población de
mapeo con respecto a cada marcador, junto con los valores observados para
cada genotipo con respecto a la variable cuantitativa evaluada (DFP). La otra
matriz está constituida con la información del mapa, o sea, la ubicación de los
marcadores en los grupos de ligamiento, con sus respectivas distancias entre
marcadores. Empleando el comando “single point” se realizó el análisis de
regresión simple entre marcadores y datos fenotípicos del DFP, en donde la
variable dependiente fue la característica cuantitativa y la variable independiente
46
el número de alelos en el locus marcador, dependiendo de la segregación del
individuo. El comando "multiplot" permitió visualizar los resultados de la
regresión simple.
47
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1. Análisis de Variancia del DFP en las progenies F1RC1
El análisis de varianza (Cuadro 2) mostró diferencias altamente significativas
(p<0.01) para el DFP entre tiempo de almacenamiento y genotipos para las dos
familias evaluadas. Sin embargo, la interacción genotipos x tiempo de
almacenamiento sólo fue significativa (p<0.05) para la familia B1PD284;
concordando con lo obtenido por otros autores donde el grado de resistencia al
DFP fue muy variable y los genotipos se comportaron de forma muy distinta con
relación al tiempo de almacenamiento (Montaldo, 1973; CIAT, 1977; Pereira,
1977; Lozano et al., 1978; Wheatley et al., 1985b; Cortés et al, 2002).
Cuadro 2. Análisis de varianza del DFP en progenies de dos familias de la población F1RC1, en dos tiempos de almacenamiento (7 y 14 después de la cosecha)
Familia B1PD284 Familia B1PD289 Fuente de variación
gl Cuadrado Medio gl Cuadrado Medio Genotipo 46 0.055** 48 0.088** Error (a) 143 0.011 168 0.014 Almacenamiento 1 0.274** 1 0.554** Genotipo x Almacenamiento 46 0.022* 48 0.011ns
Error (b) 84 0.012 120 0.014 Total corregido 320 385 Promedio 35.3 38.7 CV (%) 12.2 12.6 * y ** indica diferencia significativa a probabilidad de 5% y 1%, respectivamente; ns – no significativo a prob. < 5% NB: En este análisis fueron considerados solamente los genotipos con datos de DFP a los 7 y 14 días después de la cosecha.
5.2. Variación intra-genotipo del DFP
En la Figura 6, se presenta un diagrama de caja construido con valores de DFP
a los 14 días poscosecha de 5 genotipos susceptibles seleccionados al azar de
cada una de las familias evaluadas. En este diagrama, se puede observar una
variación significativa en el porcentaje del DFP en la raíces de la mayoría de los
48
genotipos. Por ejemplo, en el genotipo B1PD284a-2 se encontraron raíces con
5% hasta 100% de DFP, lo cual demuestra que además de factores genéticos
existen otros factores que influyeron en el deterioro fisiológico. Aunque, en la
cosecha se tuvo cuidado para no dañar las raíces, el grado de compactación del
suelo y raíces golpeadas pueden tener efecto en las amplias diferencias
encontradas. De acuerdo a Montaldo (1973) y Booth (1976) el grado de DFP es
variable no sólo entre cultivares sino también dentro de un mismo cultivar, es
decir, algunas raíces se pueden deteriorar mas rápidamente que otras. Por otro
lado, Wheatley et al (1985b) en sus estudios mencionan que mientras los
factores genéticos no sean los únicos que determinen la susceptibilidad o
resistencia varietal, es difícil expresar el grado absoluto de susceptibilidad. Sin
embargo, Cortés et al, (2002), no encontraron diferencias significativas para el
DFP intra-genotipo cuando evaluaron progenies del cruzamiento entre MNga y
CM2177-2 en Santander de Quilichao y Palmira.
Figura 6. Diagrama de caja describiendo la variación del DFP en raíces de 5 genotipos susceptibles de cada familia evaluada. Los extremos indican valores mínimo y máximo; el promedio representado por el signo +; la línea que corta la caja indica la mediana; y los extremos de la caja cuantil 0.25 y 0.75.
49
La Figura 7, presenta la evolución del DFP a largo de la raíz considerando el
promedio de los padres y las progenies dentro de cada familia. Por lo tanto, se
puede observar una variación similar decreciente de deterioro fisiológico en las
secciones de las raíces cuando se aleja del extremo proximal en los padres y las
familias evaluadas; lo que indica que el deterioro se inicia desde el extremo
proximal de la sección de la raíz. Los padres susceptibles mostraron síntomas
con mayor grado de deterioro fisiológico en todas las secciones de la raíz en
comparación con las progenies, indicando que la población segregante posee
individuos con niveles reducidos de DFP. El padre donante (CW429-1) no
presentó síntoma alguno de DFP en ninguna de las secciones de raíz,
mostrando su alta resistencia al DFP.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2 4 6 8 10 12 14
Distancia del extremo proximal en cm
Esca
la D
FP(1
-10)
SM909-25MTAI8
B1PD289
B1PD284
CW429-1
Figura 7. Variación promedio del DFP en secciones de raíces de los padres y las familias evaluadas.
50
5.3. Variación inter-genotipo del DFP
El análisis descriptivo del DFP en las progenies dentro de cada familia a los 7 y
14 días, mostró una distribución continua, con una variación de 0 a 100%, típico
de un carácter cuantitativo. Las dos familias mostraron promedios de DFP
menores que sus padres susceptibles, sobresaliendo la familia B1PD289 que
presentó cerca del 86% de clones por debajo del promedio de sus padres
susceptibles a los 14 días después de la cosecha (Figuras 8 y 9).
En estos diagramas es clara la tendencia en el aumento del DFP con el tiempo,
lo que también ha sido observado por diferentes autores (Averre, 1967;
Montaldo, 1973; Booth, 1976; Pumbley et al, 1981; Wheatley et al, 1985b; Reilly
et al, 2003). Para la familia B1PD289, se observó un incremento promedio para
el DFP del 17.9% al pasar de 7 a 14 días de almacenamiento poscosecha, y
para la familia B1PD284 el incremento fue de 21.7%. Aunque existe una
tendencia al mayor deterioro de las raíces con el tiempo, hay un porcentaje
considerable de genotipos que se mantuvo estable durante el período de
almacenamiento. Para la familia B1PD289 cerca del 24% de los genotipos
mantuvieron su nivel de resistencia (<35% DFP) de 7 a 14 días poscosecha,
presentando el 4% de los genotipos niveles de DFP inferiores al 5%; mientras
que en la familia B1PD284 cerca del 39% de los genotipos mantuvieron su nivel
de resistencia (<35% DFP) en el mismo período de almacenamiento, con un 4%
de los genotipos presentando valores para DFP inferiores al 5%.
51
5.4. Grado de resistencia al DFP en la población segregante
De acuerdo con los resultados (Anexo 2), se puede afirmar que cerca del 33%
de los individuos de la población en estudio, presentaron menor grado de
deterioro fisiológico (<35% DFP), donde el 5% corresponden a individuos
altamente resistentes (<5% DFP), demostrando que el carácter fue
“introgresado” exitosamente en las poblaciones segregantes. Se observó un
mayor número de individuos con menor grado de DFP en la familia B1PD284 en
relación a la familia B1PD289. En la familia B1PD284 cerca del 36% de los
genotipos mostraron resistencia y 7% alta resistencia al DFP, mientras que en la
familia B1PD289 cerca del 19% y 4% mostraron resistencia y alta resistencia al
DFP, respectivamente (Figura 10 y 11).
µ = 45.5 ± 23.9 Min = 0 Max = 100 Kurtosis = -0.52 Skewness = 0.15
Cw429-1 DFP= 0%
MTAI8 DFP= 41%
µ = 23.8 ± 16.2 Min = 0 Max = 56.5 Kurtosis = -0.64 Skewness = 0.47
Cw429-1 DFP= 0%
MTAI8 DFP= 34.7%
µ = 31.3 ± 21.0 Min = 0 Max = 94.5 Kurtosis = 0.60 Skewness = 0.71
Cw429-1 DFP= 0%
SM909-25 DFP= 76%
µ = 49.2 ± 24.3 Min = 0 Max = 100 Kurtosis = -0.22 Skewness = 0.35
Cw429-1 DFP= 0%
SM909-25 DFP= 77%
Figura 8. Distribución de frecuencias de genotipos evaluados a los 7 (arriba) y 14 días (abajo) en la familia B1PD284 (N=47).
Figura 9. Distribución de frecuencias de genotipos evaluados a los 7 (arriba) y 14 días (abajo) en la familia B1PD289 (N=49).
52
En síntesis, los genotipos que mostraron alta resistencia al deterioro fisiológico a
los 14 días poscosecha fueron: B1PD284b-42 (0%), B1PD284b-49 (0%),
B1PD284a-13 (1%), B1PD284a-19 (1%), B1PD289-30 (0%), B1PD289-42 (2%),
proporcionando la posibilidad en el futuro de lograr avances importantes con el
uso de estos genotipos en los programas de mejoramiento de la yuca.
4
22 23
11
1
0
5
10
15
20
25
0-5% 5-35% 35-65% 65-95% 95-100%
Clase DFP (%) - 14D
Nr.
Indi
vidu
os
2
10
26
11
4
0
5
10
15
20
25
30
0-5% 5-35% 35-65% 65-95% 95-100%
Clase DFP (%) - 14D
Nr.
Indi
vidu
os
5.5. Relación del DFP con algunas características de interés
Correlación del DFP con escopoletina y tamaño de la raíz
De acuerdo con los datos cualitativos de escopoletina, en las dos familias
evaluadas se encontró una correlación moderadamente significativa con relación
al deterioro fisiológico en las raíces, demostrando que las raíces resistentes al
deterioro acumulan menos escopoletina que las raíces susceptibles (Wheatley,
1982; Wheatley y Schwabe, 1985a). El tamaño de raíz tuvo una asociación
diferencial con el DFP en las dos familias, encontrándose en la familia B1PD289
una baja correlación pero significativa, en contraste con lo obtenido para la
familia B1PD284 (Cuadro 3).
Figura 10. Distribución de clases de resistencia al DFP en los genotipos evaluados a los 14 días en la familia B1PD284 (N=61).
Figura 11. Distribución de clases de resistencia al DFP en los genotipos evaluados a los 14 días en la familia B1PD289 (N=53).
53
Cuadro 3. Correlación fenotípica de Pearson en las dos familias evaluadas. Familia Variables DFP (r)
Escopoletina 0.47** B1PD284 Tamaño de la raíz -0.02ns
Escopoletina 0.45** B1PD289 Tamaño de la raíz 0.11*
** Diferencia significativa a una probabilidad del 1%; ns – no significativo a una probabilidad < 5%
Relación del DFP con la materia seca
En general, el promedio de materia seca para la familia B1PD284 fue del
37±4.5% que osciló de 28.1 – 49.9% y para la familia B1PD289 fue del 35±3.4%
con una variación que fluctuó entre 29.4 y 42.8%. En este estudio, se encontró
en la familia B1PD289 una relación positiva entre la materia seca de las raíces y
DFP (R2=16.2%) (Figura 12 y 13). En la familia B1PD284, la relación no fue
significativa posiblemente debido a que varios genotipos mostraron un grado
mínimo de deterioro. En estudios con germoplasma del CIAT también se ha
encontrado una correlación positiva entre el contenido de materia seca de las
raíces y el grado de DFP (CIAT, 1977; Sánchez et al, 2005), lo cual dificulta el
mejoramiento genético simultáneo de ambas características.
Más del 50% de los genotipos evaluados superaron el contenido promedio de
materia seca de la población en estudio por familia (Figura 12 y 13). De estos
genotipos, cerca del 20% en la familia B1PD284 y 6% en la familia B1PD289
presentaron resistencia al DFP a los 14 días poscosecha. Por lo tanto, estos
genotipos pueden servir de material para el continuo trabajo de mejoramiento.
54
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
25 30 35 40 45 50 55
Materia Seca (%)
DFP
(%) -
14
días
y = 2.9665x - 55.805R2 = 0.1623
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
27 29 31 33 35 37 39 41 43 45
Materia seca (%)
DFP
(%) -
14
días
5.6. Evaluación de polimorfismo
En la prueba de amplificación y polimorfismo evaluada en los progenitores
CW429-1, MTAI8 y algunas progenies se obtuvo cerca del 45% de polimorfismo
de un total de 423 microsatélites evaluados. De estos, cerca de 151 marcadores
(36%) mostraron polimorfismo en el progenitor CW429-1 y 39 marcadores (9%)
en el progenitor MTAI8. Los microsatélites evaluados presentaron un 100% de
amplificación bajo diferentes condiciones de MgCl2 y temperatura de
alineamiento entre 45 – 55oC. El alto nivel de polimorfismo observado en los
microsatélites en este estudio, es comparable al encontrado por Zárate (2002)
con 38% de polimorfismo, por Okogbenin et al (2006) con 32% de polimorfismo,
y también concuerda con resultados en otras especies cultivadas (Gonzalo et al,
2005; Billotte et al, 2005). En la Figura 14, se presentan los patrones de
amplificación de algunos marcadores seleccionados.
Figura 12. Relación entre DFP y materia seca en los genotipos evaluados a los 14 días en la familia B1PD284 (N=60).
Figura 13. Relación entre DFP y materia seca en los genotipos evaluados a los 14 días en la familia B1PD289 (N=52).
55
Figura 14. Prueba de amplificación y polimorfismo en gel de poliacrilamida al 4%, con diferentes marcadores microsatélites, usando progenitores y progenies: 1 – CW429-1; 2 – SM909-25; 3 – MTAI8; 4 a 9 corresponden a seis progenies segregantes.
El método usado (SDRFs) para la lectura de los alelos (Wu et al, 1992), sólo
permitió considerar el polimorfismo del progenitor CW429-1, la fuente del gen de
resistencia al DFP, por eso fueron excluidos para el mapeo los microsatélites
con polimorfismo en el progenitor recurrente (MTAI8). Después de “genotipear”
la población de mapeo también fueron excluidos 69 marcadores microsatélites,
por presentar polimorfismo sólo en los progenitores, quedando para la
construcción del mapa de ligamiento 82 marcadores SSR, correspondientes a 18
NS y 42 SSRY generados por ADN genómico, y 23 ESTs generados por cDNA
(Mba et al, 2001; CIAT, 2002 y CIAT, 2006).
5.7. Construcción del mapa genético población F1RC1 (Familia B1PD284)
5.7.1. Segregación alélica de los marcadores microsatélites
De los 82 marcadores microsatélites evaluados en la prueba de Chi-cuadrado
(P<0.05), cerca de 71 microsatélites (87%) segregaron de acuerdo con la
proporción esperada (1:1) y 11 microsatélites (13%) mostraron distorsión en la
segregación, observándose casos extremos de distorsión con el marcador
NS341 con 18 individuos (alelo A), y 14 individuos (alelo H) para el marcador
NS40 (Anexo 3). Varios estudios reportan una alta frecuencia de marcadores
con segregación distorsionada (Dettori et al, 2001; Hanley et al, 2002; Liebhard
et al, 2002). Estos marcadores con segregación distorsionada o desviación de
SSRY180
SSRY114 SSRY319
SSRY322 SSRY102 SSRY240
1 2 3 4 5 6 7 8 9
56
las proporciones mendelianas esperadas también fueron usados para construir
el mapa de ligamiento, debido a que existen factores biológicos relacionados con
selección natural gametofítica para genes letales, por ejemplo, genes que
controlan la viabilidad del polen, zigoto o semilla; también puede ser atribuida a
la introgresión de genes de especies silvestres (Xu et al, 1996; Yan et al, 2005).
En la Figura 15, se presenta los patrones de segregación alélica de los
marcadores microsatélites SSRY45 y SSRY250.
Figura 15. Segregación alélica de los individuos de la familia B1PD284 usando el marcador SSRY45 (arriba) y el marcador SSRY250 (abajo), en gel de poliacrilamida al 4%
En cuanto a la composición del genoma de la familia B1PD284, se presentó
cerca del 53.5% de individuos homocigotos para el alelo A y el 46.5% de
individuos heterocigotos para el alelo H, con una variación alélica del 38 –
96.3%, y del 3.8 – 62%, respectivamente.
5.7.2. Mapa de ligamiento de la Familia 284
Cerca de 82 marcadores SSR fueron empleados en el análisis de ligamiento
para la familia B1PD284, donde se formaron 17 grupos de ligamiento (LG B –
LG DC), según grupos establecidos previamente por Fregene et al (1997) y
posteriormente por Okogbenin et al (2006) (Figura 16). Los 3 últimos grupos
(LGDA – LGDC) son desconocidos. Los grupos de ligamiento formados, fueron
nominados de acuerdo con Fregene et al (1997). Poseen entre 2 – 6
NIG
CM
CW
429-
1
MTA
I8B1
PD
284b
-4
B1P
D28
4b-5
B1P
D28
4b-6
B1P
D28
4b-7
B1P
D28
4b-8
B1P
D28
4b-9
B1P
D28
4b-1
0
B1P
D28
4b-1
1
B1P
D28
4b-1
2
B1P
D28
4b-1
3
B1P
D28
4b-1
4
B1P
D28
4b-1
5
B1P
D28
4b-1
6
B1P
D28
4b-1
7
B1P
D28
4b-1
8
B1P
D28
4b-1
9
B1P
D28
4b-2
0
B1P
D28
4b-2
1
B1P
D28
4b-2
2
B1P
D28
4b-2
3
B1P
D28
4b-2
5
B1P
D28
4b-2
6B1
PD
284b
-27
B1P
D28
4b-2
8
B1P
D28
4b-2
9
B1P
D28
4b-3
0
B1P
D28
4b-3
1B1
PD
284b
-32
B1P
D28
4b-3
3
B1P
D28
4b-3
4
B1P
D28
4b-3
5
B1P
D28
4b-3
6B1
PD
284b
-37
B1P
D28
4b-3
8
B1P
D28
4b-3
9
B1P
D28
4b-4
0B1
PD
284b
-41
B1P
D28
4b-4
2
B1P
D28
4b-4
3
B1P
D28
4b-4
4
B1P
D28
4b-4
5
B1P
D28
4b-4
6
B1P
D28
4b-4
7
B1P
D28
4b-4
8
NIG
CM
CW
429-
1
NIG
CM
CW
429-
1
MTA
I8B1
PD
284b
-4
B1P
D28
4b-5
B1P
D28
4b-6
B1P
D28
4b-7
B1P
D28
4b-8
B1P
D28
4b-9
B1P
D28
4b-1
0
B1P
D28
4b-1
1
B1P
D28
4b-1
2
B1P
D28
4b-1
3
B1P
D28
4b-1
4
B1P
D28
4b-1
5
B1P
D28
4b-1
6B1
PD
284b
-17
B1P
D28
4b-1
8B1
PD
284b
-19
B1P
D28
4b-2
0
B1P
D28
4b-2
1
B1P
D28
4b-2
2
B1P
D28
4b-2
3
B1P
D28
4b-2
5B1
PD
284b
-26
B1P
D28
4b-2
7B1
PD
284b
-28
B1P
D28
4b-2
9
B1P
D28
4b-3
0
B1P
D28
4b-3
1
B1P
D28
4b-3
2
B1P
D28
4b-3
3B1
PD
284b
-34
B1P
D28
4b-3
5
B1P
D28
4b-3
6
B1P
D28
4b-3
7
B1P
D28
4b-3
8
B1P
D28
4b-3
9
B1P
D28
4b-4
0
B1P
D28
4b-4
1
B1P
D28
4b-4
2
B1P
D28
4b-4
3B1
PD
284b
-44
B1P
D28
4b-4
5
B1P
D28
4b-4
6
B1P
D28
4b-4
7
B1P
D28
4b-4
8
NIG
CM
CW
429-
1
57
marcadores, con una extensión por grupo que varió de 7.5cM (LG E’ y LG F’’) a
74.7cM (LG G). El mapa de ligamiento presentó diferentes grados de saturación,
siendo el grupo O el más densamente poblado con 6 marcadores, con una
distancia genética de 40.4cM. El mapa de ligamiento cubrió una distancia
genética total de 363.7cM, con una distancia promedio entre marcadores de
11.6cM y el intervalo entre loci varió de 3.8 a 19.6cM (Cuadro 4), excluyendo la
distancia 0cM encontrada en el LG M, que indica que los marcadores están
completamente ligados o tienen similar secuencia del primer. Se presentaron 34
microsatélites desligados, lo que indica que el mapa falta por saturar. Cerca de 5
marcadores con desviación a las proporciones mendelianas esperadas se
presentaron ligados a los grupos de ligamiento C, F, O y DC.
En el grupo de ligamiento G, se ubican el marcador NS158 que ha sido
reportado como una región del genoma asociada a la resistencia al mosaico
africano (Zarate, 2002); los marcadores de cDNA de genes específicos, ACCOx
de la enzima 1-aminociclopropano-1-acido carboxilico (ACC) oxidasa
relacionada con defensa y mecanismos de respuesta a lesiones en la raíz de
yuca (Li et al, 2000 y Cortés et al, 2002) y AGbaseB de la enzima adenosin
glucosa pirofosforilasa implicada en el proceso de biosíntesis del almidón. Otros
marcadores de cDNA relacionados también con defensa y mecanismos de
respuesta a lesiones, se encuentran ubicados en los grupos de ligamiento E
(HRGP - Glicoproteínas Ricas en Hidroxiprolina), LG F y L (MePAL y PAL,
respectivamente - Fenilalanina Amonialiasas) (Cortés et al, 2002).
58
Cuadro 4. Distancia del grupo de ligamiento, no de marcadores, y promedio del intervalo de marcadores (cM) por grupo de ligamiento de la familia B1PD284. Grupo ligamiento Distancia (cM) No marcadores Promedio intervalo marcador (cM)
B 13.8 2 13.8 C 10.8 2 10.8 D 39.1 3 19.6 E 27.6 3 13.8 E' 7.5 2 7.5 F 21.4 3 10.7 F' 9.5 2 9.5 F'' 7.5 3 3.8 G 74.7 5(+1) 18.7 K 35.2 3 17.6 K' 7.8 2 7.8 M 0* 3 0* O 40.4 6 8.1 L 15.4 2 15.4
DA 13.6 2 13.6 DB 13.2 2 13.2 DC 26.2 3 13.1
Σ/Promedio 363.7 48 12.3 Mínimo 7.5 2 3.75 Máximo 74.7 6 19.55 * Marcadores con semejante secuencia del primer; (+1) marcador con información insuficiente para ser incluido en el grupo de ligamiento G.
59
Figura 16. Mapa de ligamiento de la familia F1RC1 B1PD284 para la disminución del deterioro fisiológico poscosecha en yuca
Rec Dist Marker
Frac. cM Id Name
SSRY182( 0.0 %) 0.0
NS170( 0.0 %) 0.0
NS207
Grupo M
Rec Dist MarkerFrac. cM Id Name
EST93( 4.6 %) 4.6
NS53
(16.4%) 17.1
SSRY68
Grupo F
Rec Dist MarkerFrac. cM Id Name
NS717
(22.2 %) 23.8
SSRY66
(14.8 %) 15.3
rNS1045
Grupo D
Rec Dist Marker Frac. cM Id Name
SSRY112 (13.4 %) 13.8
rSSRY50
Grupo B Rec Dist MarkerFrac. cM Id Name
rSSRY171(10.6 %) 10.8
EST65
Grupo C Rec Dist Marker Frac. cM Id Name
NS217 (19.0 %) 20.1
NS319 ( 7.5 %) 7.5
NS74
Grupo E
Rec Dist Marker Frac. cM Id Name
SSRY19 ( 6.0 %) 6.0
rNS210 ( 1.5 %) 1.5rSSRY78
Grupo F’’
Rec Dist MarkerFrac. cM Id Name
EST41( 7.5 %) 7.5
SSRY330
Grupo E’ Rec Dist MarkerFrac. cM Id Name
EST43( 9.4 %) 9.5
rSSRY179
Grupo F’
Rec Dist MarkerFrac. cM Id Name
SSRY100
(16.2 %) 16.8
rSSRY88
(17.6 %) 18.4
rSSRY39
Grupo K
Rec Dist Marker Frac. cM Id Name
EST92 ( 7.7 %) 7.8
SSRY29
Grupo K’ Rec Dist MarkerFrac. cM Id Name
EST271( 7.5 %) 7.5
NS158(10.1 %) 10.2
SSRY106
(24.2 %) 26.4 rSSRY103
(27.3 %) 30.6 rSSRY303
rSSRY67
Grupo G
Rec Dist Marker Frac. cM Id Name
NS584 ( 7.7 %) 7.8
EST100 ( 1.7 %) 1.7EST288
(11.6 %) 11.8
rNS781 ( 3.2 %) 3.2rSSRY177
(15.4 %) 15.9
rNS128
Grupo O
Rec Dist MarkerFrac. cM Id Name
EST62
(14.9 %) 15.4
SSRY250
Grupo L
Rec Dist MarkerFrac. cM Id Name
SSRY123
(13.2 %) 13.6
rSSRY180
GRUPOD A
Rec Dist MarkerFrac. cM Id Name
EST81
(12.9 %) 13.2
rEST94
GRUPOD B
Rec Dist MarkerFrac. cM Id Name
EST266( 9.7 %) 9.8
SSRY152
(15.9 %) 16.4 SSRY151
GRUPOD C Marcadores desligados : EST111, EST209, EST275, EST280, EST287, EST37, EST292, EST44, EST64, EST82, NS159, NS341, NS37, NS40, NS905, SSRY205, SSRY240, SSRY272, SSRY319, SSRY108, SSRY122, SSRY150, SSRY25, SSRY42, SSRY45, SSRY52, SSRY57, SSRY63, SSRY64, SSRY67, SSRY72, SSRY74, SSRY82, SSRY96
60
5.8. Mapeo de QTLs para DFP por análisis de marcador simple
Con base en el mapa de ligamiento de la familia B1PD284 previamente
construido, se estableció una localización aproximada de QTLs asociados con el
DFP. Los resultados obtenidos con el análisis de marcador simple, indican que
3 grupos de ligamiento presentaron marcadores asociados con posibles QTLs
para deterioro poscosecha con un efecto significativo (P<0.05). Estos QTLs
identificados se ubicaron en los grupos de ligamiento E’, F y G (Figura 17). Se
observó que todos los marcadores con posibles QTLs asociados al DFP
presentaron como fuente el parental resistente CW429-1, con aditividad positiva;
indicando que la disminución de DFP se debe a la presencia de alelos de
CW429-1, y sugiriendo que existe una influencia significativa de factores
genéticos para la reducción de la característica (deterioro fisiológico).
Figura 17. Mapa de posibles QTLs para DFP en los grupos de ligamiento E’, F y G de la familia B1PD284, según análisis de marcador simple con QGENE. Los colores denotan la probabilidad de asociación del marcador con un QTL.
De acuerdo con estos resultados, se puede constatar que cerca de 8
marcadores presentaron asociación significativa con un posible QTL para DFP
(P<0.05), con un rango de varianza fenotípica explicada que osciló entre 6.2 y
12.8%. El grupo de ligamiento E’ presentó dos marcadores ligados a un posible
QTL, con cerca del 8% (SSRY330) y 10.2% (EST41) de varianza fenotípica
explicada; el grupo F presentó tres marcadores (SSRY68, EST93 y NS53)
ligados a un posible QTL, con un rango del 6.6 a 9.6% de varianza fenotípica
explicada; mientras que el grupo ligamiento G presentó los marcadores EST271,
NS158 y SSRY106 ligados a un posible QTL para DFP, con cerca del 8.6, 5.2 y
12.6% de varianza fenotípica explicada, respectivamente (Cuadro 5).
61
Cuadro 5. Loci marcadores asociados con el DFP, según análisis de regresión con SAS y QGENE. Marcadores Grupo Ligamiento Fuente R2 Probabilidad Aditividad SSRY106 G CW429-1 0.1277 0.0068 17.15 EST41 E' CW429-1 0.102 0.0129 15.48 NS53 F CW429-1 0.0959 0.0160 15.09 EST93 F CW429-1 0.0939 0.0192 14.86 EST271 G CW429-1 0.0869 0.0222 14.36 SSRY330 E' CW429-1 0.0802 0.0270 13.64 SSRY68 F CW429-1 0.0664 0.0448 12.91 NS158 G CW429-1 0.0626 0.0517 12.11
De acuerdo con los resultados, los marcadores NS53, EST41, SSRY106 se
presentaron con mayor posibilidad de asociación con posibles QTLs para DFP
(Figura 17). Cortés et al. (2002) en busca de marcadores moleculares de genes
implicados en el DFP, encontraron marcadores que explicaron un rango de
variación fenotípica entre 5 y 12%. Según Tanksley (1993), no es común
encontrar QTLs individuales que tengan una contribución superior al 20% a la
varianza fenotípica en una población.
En el grupo de ligamiento G, el cual se encuentra ligado un posible QTL para
DFP con el marcador NS158, también ha sido una región del genoma asociada
a la resistencia al mosaico africano (Zarate, 2002). Al grupo en mención se ha
reportado que en la región entre el marcador SSRY106 y NS158, en el cual se
encuentra un posible QTL para DFP, se ubican marcadores de genes
específicos ACCOx relacionado con defensa y mecanismos de respuesta a
lesiones en la raíz y AGbaseB implicado en el proceso de biosíntesis del
almidón. Mientras que, en el grupo de ligamiento E entre el marcador EST41 y
SSRY330, con un posible QTL para DFP, se ubica el marcador HRGP también
relacionado con defensa y mecanismos de respuesta a lesiones en la raíz
(Cortés et al, 2002).
62
6. CONCLUSIONES
- Se encontró una variación amplia y continua del DFP intra e inter-
genotipos de la población en estudio, con clara tendencia de aumento
con el tiempo almacenamiento de las raíces (de 7 a 14 días).
- El DFP presenta variación decreciente en las secciones de las raíces
cuando se aleja del extremo proximal.
- Se observó en los individuos de la población estudiada niveles de DFP
menores con respecto a sus padres susceptibles.
- El 5% del total de los individuos de cada familia evaluada correspondió a
genotipos altamente resistentes al DFP a los 14 días poscosecha,
proporcionando la posibilidad en el futuro de lograr avances importantes,
con el uso de estos genotipos en los programas de mejoramiento de la
yuca.
- Hay una relación positiva entre el contenido de materia seca de las raíces
y su grado de deterioro fisiológico, lo cual constituye un desafío para el
mejoramiento genético simultáneo de ambas características; sin
embargo, se observaron individuos con bajo o nulo deterioro fisiológico
pero contenidos de materia seca que variaron desde adecuados hasta
excelentes.
63
- Un número considerable de genotipos resistentes al DFP (14 días
poscosecha) superó el contenido promedio de materia seca de la
población en estudio, 20% en la familia B1PD284 y 6% en la familia
B1PD289.
- Se construyó un mapa genético para la familia B1PD284 basado en
microsatélites, con 17 grupos de ligamiento cubriendo un total de
distancia genética de 363.7cM, con una distancia promedio entre
marcadores de 11.6 cM, lo que indica que el mapa necesita una mejor
saturación.
- Mediante el análisis de marcador simple se encontraron tres posibles
QTLs asociados con marcadores microsatélites (NS53, EST41,
SSRY106) en tres grupos de ligamiento (E’, F, y G).
- No se encontraron QTLs con efecto mayor, lo que sugiere que falta
analizar una larga porción del genoma o hay varios genes implicados en
la expresión del DFP, típico de un carácter cuantitativo.
64
7. RECOMENDACIONES
De acuerdo con las experiencias obtenidas con el desarrollo de este trabajo de
investigación se sugiere que:
- La evaluación fenotípica de DFP debe hacerse en período no lluviosos
para evitar la influencia del deterioro microbiano, el cual puede dificultar la
cuantificación del DFP.
- Se debe tomar en consideración por lo menos dos evaluaciones de DFP,
con el fin de confirmar los datos obtenidos. Además se debe hacer
evaluaciones de DFP teniendo en cuenta toda la raíz y con el mayor
número de muestras posibles.
- Los individuos identificados como resistentes representan un gran
potencial ya que pueden ser usados en los programas de mejoramiento
tendientes a mejorar la calidad de la yuca.
- Estos individuos identificados como resistentes al DFP deben seguir para
generaciones avanzadas de retrocruzamiento 2 y 3 para poder concentrar
características deseadas de yuca incluyendo el carácter de resistencia
conferida por el padre donante (CW429-1).
- Se debe también considerar la transformación genética como alternativa
para el bloqueo de las rutas metabólicas tendentes la aceleración del
deterioro fisiológico de la yuca.
65
- A partir del mapa de ligamiento construido se recomienda saturar con
marcadores que hayan sido previamente mapeados, y concentrándose en
aquellas regiones ubicadas en los grupos de ligamiento E’, F y G, pues se
ha demostrado tanto en estudios anteriores como en el presente trabajo
estar asociadas a posibles QTLs para DFP en yuca.
- Sería conveniente considerar la información molecular obtenida con la
familia B1PD289 y a la vez poder hacer un solo mapa para el DFP
teniendo en cuenta las dos familias.
- Al tener un mapa más saturado, la información obtenida con las dos
familias y teniendo evaluaciones fenotípicas en diferentes ambientes,
permitirá un mapeo de QTLs por intervalos, elucidar mejor la naturaleza
de este carácter, confirmar los marcadores asociados a QTLs para DFP, y
proponer marcadores para selección asistida.
66
8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Akano A. O.; Dixon, A. G. O.; Mba, C.; Barrera E.; y Fregene M. (2002). Genetic
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ANEXOS
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Anexo 1. Condiciones de PCR para Marcadores Microsatélites en Yuca
Si la [f] del Mg es de 1 mM Reactivos [Ci] [Cf] 1X 10X 50X 55X 100X Agua 8.4 84 420 462 840 Buffer 10X 10 1 1.5 15 75 82.5 150 MgCl2 25 1 0.6 6 30 33 60 dNTPs 2.5 0.1 0.6 6 30 33 60 Primer R 10 0.2 0.3 3 15 16.5 30 Primer F 10 0.2 0.3 3 15 16.5 30 TAQ 0.3 3 15 16.5 30 DNA 10 ng/ul 5 Si la [f] del Mg es de 1.5 mM Reactivos [Ci] [Cf] 1X 10X 50X 55X 100X Agua 8.1 81 405 445.5 810 Buffer 10X 10 1 1.5 15 75 82.5 150 MgCl2 25 1.5 0.9 9 45 49.5 90 dNTPs 2.5 0.1 0.6 6 30 33 60 Primer R 10 0.2 0.3 3 15 16.5 30 Primer F 10 0.2 0.3 3 15 16.5 30 TAQ 0.3 3 15 16.5 30 DNA 10 ng/ul 5 Si la [f] del Mg es de 2.0 mM Reactive [Ci] [Cf] 1X 10X 50X 55X 100X Agua 7.8 78 390 429 780 Buffer 10X 10 1 1.5 15 75 82.5 150 MgCl2 25 2 1.2 12 60 66 120 dNTPs 2.5 0.1 0.6 6 30 33 60 Primer R 10 0.2 0.3 3 15 16.5 30 Primer F 10 0.2 0.3 3 15 16.5 30 TAQ 0.3 3 15 16.5 30 DNA 10 ng/ul 5 Si la [f] del Mg es de 2.5 mM Reactivos [Ci] [Cf] 1X 10X 50X 55X 100X Agua 7.5 75 375 412.5 750 Buffer 10X 10 1 1.5 15 75 82.5 150 MgCl2 25 2.5 1.5 15 75 82.5 150 dNTPs 2.5 0.1 0.6 6 30 33 60 Primer R 10 0.2 0.3 3 15 16.5 30 Primer F 10 0.2 0.3 3 15 16.5 30 TAQ 0.3 3 15 16.5 30 DNA 10 ng/ul 5
84
Anexo 2. Resultado promedio de DFP y materia seca de los individuos de las familias B1PD284 y B1PD289
Familia B1PD284 Familia B1PD289 DFP (%) MS (%) DFP (%)
Nr Genotipos 7 días 14 días Nr Genotipos 7 días 14 días MS(%) 1 B1PD284b-42 0.0 0.0 39.2 1 B1PD289-30 0.0 0.0 33.5 2 B1PD284b-49 - 0.0 33.2 2 B1PD289-51 0.0 2.3 33.0 3 B1PD284a-13 0.7 1.0 43.4 3 B1PD289-33 0.0 16.3 33.7 4 B1PD284a-19 - 1.3 47.1 4 B1PD289-14 8.3 16.7 38.1 5 B1PD284b-30 - 5.8 38.9 5 B1PD289-53 5.7 18.9 35.3 6 B1PD284b-36 - 6.1 36.2 6 B1PD289-42 20.5 24.1 33.2 7 B1PD284b-45 0.0 6.1 28.3 7 B1PD289-19 23.1 24.7 33.2 8 B1PD284b-57 1.5 6.4 36.2 8 B1PD289-47 24.0 25.2 31.5 9 B1PD284b-35 - 12.1 37.8 9 B1PD289-18 17.5 25.7 31.9
10 B1PD284b-46 - 15.0 36.4 10 B1PD289-40 18.3 27.7 37.7 11 B1PD284b-52 - 19.2 34.5 11 B1PD289-1 19.6 29.1 34.4 12 B1PD284b-1 13.1 20.9 32.0 12 B1PD289-8 24.3 34.0 - 13 B1PD284b-6 16.3 21.7 36.0 13 B1PD289-6 8.3 35.9 31.2 14 B1PD284b-13 11.3 21.8 40.0 14 B1PD289-16 1.1 36.7 38.4 15 B1PD284b-19 14.7 22.5 43.1 15 B1PD289-15 24.2 37.1 39.2 16 B1PD284b-66 3.3 23.6 34.5 16 B1PD289-26 25.0 37.4 38.9 17 B1PD284a-15 - 24.0 29.5 17 B1PD289-38 19.8 37.4 34.2 18 B1PD284b-31 23.3 25.7 41.7 18 B1PD289-37 27.3 37.4 36.4 19 B1PD284b-51 20.0 26.1 41.0 19 B1PD289-45 30.7 37.5 33.7 20 B1PD284b-29 16.3 26.3 34.8 20 B1PD289-21 - 39.8 35.1 21 B1PD284b-37 18.0 27.7 - 21 B1PD289-52 18.4 40.6 39.0 22 B1PD284b-63 28.8 29.0 40.2 22 B1PD289-29 18.6 41.1 31.9 23 B1PD284b-44 0.0 29.5 34.8 23 B1PD289-44 23.1 41.6 37.0 24 B1PD284b-17 13.8 30.2 40.3 24 B1PD289-22 35.5 44.6 31.7 25 B1PD284b-61 29.9 30.8 44.8 25 B1PD289-54 25.8 45.3 34.2 26 B1PD284a-1 27.3 34.9 28.1 26 B1PD289-4 8.4 46.7 29.4 27 B1PD284b-65 - 36.5 30.1 27 B1PD289-57 29.0 47.3 36.7 28 B1PD284b-14 20.0 37.3 42.5 28 B1PD289-17 28.3 48.6 38.6 29 B1PD284b-16 21.0 39.9 38.6 29 B1PD289-20 38.5 49.2 35.5 30 B1PD284b-23 23.3 40.0 37.4 30 B1PD289-56 49.0 50.0 36.8 31 B1PD284b-47 22.0 43.0 36.6 31 B1PD289-48 38.0 51.1 35.7 32 B1PD284b-5 13.1 43.8 45.7 32 B1PD289-24 25.0 51.3 38.6 33 B1PD284b-18 19.0 44.4 41.6 33 B1PD289-7 - 51.7 35.8 34 B1PD284b-38 - 44.7 39.6 34 B1PD289-11 47.2 53.6 37.2 35 B1PD284b-62 7.5 44.8 34.6 35 B1PD289-41 27.5 54.0 29.9 36 B1PD284b-48 37.7 46.7 31.7 36 B1PD289-5 44.7 55.0 33.1 37 B1PD284b-64 40.0 47.3 36.3 37 B1PD289-9 42.1 61.7 40.5 38 B1PD284b-34 30.7 50.0 34.1 38 B1PD289-2 0.0 62.9 33.8 39 B1PD284b-59 20.0 50.0 38.4 39 B1PD289-27 42.5 67.1 34.5 40 B1PD284a-17 - 50.6 35.7 40 B1PD289-35 42.1 67.8 36.6 41 B1PD284b-4 4.5 54.4 36.2 41 B1PD289-31 35.0 70.8 34.7 42 B1PD284a-2 47.8 56.3 34.6 42 B1PD289-36 - 72.5 42.7 43 B1PD284b-10 24.4 56.7 38.3 43 B1PD289-28 58.6 73.0 42.5 44 B1PD284b-40 20.0 58.8 31.7 44 B1PD289-32 50.0 73.3 38.5 45 B1PD284b-15 52.5 59.9 38.0 45 B1PD289-55 72.5 74.4 33.9 46 B1PD284b-7 18.0 60.8 38.6 46 B1PD289-39 50.2 77.5 41.7 47 B1PD284b-32 32.5 62.8 41.7 47 B1PD289-46 65.4 79.3 34.0 48 B1PD284b-55 - 64.4 38.0 48 B1PD289-25 43.7 85.0 39.1 49 B1PD284b-39 9.3 64.6 38.5 49 B1PD289-12 42.3 92.0 41.6 50 B1PD284b-33 56.2 67.2 40.4 50 B1PD289-10 69.2 100.0 42.8 51 B1PD284b-43 - 68.0 33.8 51 B1PD289-43 94.5 100.0 36.0 52 B1PD284a-3 - 72.5 32.5 52 B1PD289-49 69.0 100.0 31.7 53 B1PD284b-2 55.8 72.8 42.0 53 B1PD289-50 - 100.0 39.4 54 B1PD284b-8 39.8 73.4 40.9 54 B1PD289-13 35.3 - - 55 B1PD284b-26 42.5 74.2 13.9 55 B1PD289-23 28.4 - 56 B1PD284b-22 14.3 75.5 42.7 56 B1PD289-3 40.8 - 57 B1PD284b-12 37.1 76.9 31.8 57 B1PD289-34 - - 58 B1PD284b-9 51.6 77.9 37.9 59 B1PD284b-50 50.0 82.0 40.6 60 B1PD284a-18 20.8 91.1 49.9 61 B1PD284b-20 50.5 100.0 36.9 62 B1PD284b-21 - - - 63 B1PD284b-25 92.5 - 37.1 64 B1PD284b-27 0.0 - 33.6 65 B1PD284b-54 53.3 - 36.2 66 B1PD284b-56 - - - 67 B1PD284b-60 18.3 - 28.1 68 B1PD284b-67 46.7 - 32.1
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Anexo 3. Segregación alélica de los marcadores microsatélites en la familia B1PD284 Segregación alelica
Marcadores A H Chicalculado ChiTab (5%) = 3.84 EST100 33 35 0.06 Nsig EST111 32 33 0.02 Nsig EST209 38 29 1.21 Nsig EST266 35 32 0.13 Nsig EST271 37 30 0.73 Nsig EST275 31 34 0.14 Nsig EST280 37 31 0.53 Nsig EST287 39 26 2.60 Nsig EST288 30 31 0.02 Nsig EST292 38 28 1.52 Nsig EST37 42 22 6.25 Sig EST41 34 33 0.01 Nsig EST43 33 32 0.02 Nsig EST44 37 31 0.53 Nsig EST62 39 28 1.81 Nsig EST64 46 22 8.47 Sig EST65 42 25 4.31 Sig EST81 37 30 0.73 Nsig EST82 36 27 1.29 Nsig EST92 36 30 0.55 Nsig EST93 30 35 0.38 Nsig EST94 30 32 0.06 Nsig NS1045 34 34 0.00 Nsig NS128 44 20 9.00 Sig NS158 38 30 0.94 Nsig NS159 32 36 0.24 Nsig NS170 37 31 0.53 Nsig NS207 37 30 0.73 Nsig NS210 39 27 2.18 Nsig NS217 36 27 1.29 Nsig NS319 38 30 0.94 Nsig NS341 18 49 14.34 Sig NS37 29 38 1.21 Nsig NS40 47 14 17.85 Sig NS53 29 37 0.97 Nsig NS584 37 28 1.25 Nsig NS717 39 29 1.47 Nsig NS74 32 35 0.13 Nsig NS781 38 28 1.52 Nsig NS905 40 28 2.12 Nsig SSRY205 33 35 0.06 Nsig SSRY240 38 30 0.94 Nsig SSRY250 42 26 3.76 Nsig SSRY272 35 31 0.24 Nsig SSRY303 32 34 0.06 Nsig SSRY319 33 31 0.06 Nsig SSRY330 36 32 0.24 Nsig SSRY100 37 31 0.53 Nsig SSRY103 32 35 0.13 Nsig SSRY106 34 29 0.40 Nsig SSRY108 34 34 0.00 Nsig SSRY112 31 37 0.53 Nsig SSRY122 36 31 0.37 Nsig SSRY123 39 29 1.47 Nsig SSRY150 32 34 0.06 Nsig SSRY151 41 26 3.36 Nsig SSRY152 41 24 4.45 Sig SSRY171 30 37 0.73 Nsig SSRY177 41 25 3.88 Sig SSRY179 39 28 1.81 Nsig SSRY180 32 36 0.24 Nsig SSRY182 36 30 0.55 Nsig SSRY19 32 36 0.24 Nsig SSRY25 29 36 0.75 Nsig SSRY29 38 29 1.21 Nsig SSRY39 30 38 0.94 Nsig SSRY42 27 40 2.52 Nsig SSRY45 42 23 5.55 Sig SSRY50 41 26 3.36 Nsig SSRY52 37 31 0.53 Nsig SSRY57 44 21 8.14 Sig SSRY63 32 34 0.06 Nsig SSRY64 28 37 1.25 Nsig SSRY66 38 28 1.52 Nsig SSRY67 31 31 0.00 Nsig SSRY68 24 44 5.88 Sig SSRY72 38 30 0.94 Nsig SSRY74 32 36 0.24 Nsig SSRY78 40 26 2.97 Nsig SSRY82 38 30 0.94 Nsig SSRY88 36 32 0.24 Nsig SSRY96 34 34 0.00 Nsig
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