/ . Embryol. exp. Morph. Vol. 20, 2, pp. 151-67, September 1968With 4 plates

Printed in Great Britain

Etude experimentale del'organogenese du poumon: nature et specificite des

interactions epithelio-mesenchymateuses

Par Fl. DAMERON1

Institut d'Embryologie experimentale du College de France etdu C.N.R.S. (Directeur: Professeur Et. Wolff)

On sait que l'organogenese pulmonaire (Dameron, 1961a, b) s'effectueseulement lorsque les deux constituants de l'ebauche, epithelium bronchique etmesenchyme pulmonaire, sont associes. Les interactions qui s'exercent entreles deux tissus sont indispensables pour la croissance et la differenciation del'epithelium.

Nous avons cherche a preciser la nature de ces interactions. Le mesenchymemaintient l'integrite de l'epithelium auquel il sert de tissu de soutien. Son roleest-il simplement physique ? ou bien son action est-elle veritablement inductriceet s'exerce-t-elle grace a l'elaboration de substances morphogenes comme il enexiste dans de nombreux types d'induction ?

Nous nous sommes egalement demandee quelle etait la specificite de cesinteractions. La differenciation de repithelium bronchique s'effectue-t-elleseulement sous l'influence du mesenchyme pulmonaire? Ou bien la presenced'un tissu mesenchymateux quelconque est-elle suffisante pour permettre l'evo-lution normale de la bronche?

Pour determiner la nature et la specificite des interactions entre l'epitheliumet le mesenchyme, nous avons cultive la bronche dans differentes conditionsexperimentales:

— separee du mesenchyme pulmonaire par une membrane filtrante;— associee a des mesenchymes soit de natures tres diverses soit d'une autre

classe zoologique.MATERIEL ET METHODES

1. Materiel

Nous avons etudie la morphogenese du poumon chez l'embryon de Poulet dela race Leghorn blanche (Gallus gallus). Le mesenchyme pulmonaire de Sourisassocie a la bronche de Poulet provient de la race Swiss.

1 Adresse de Vauteur: Laboratoire d'Embryologie Experimentale, 49 bis, avenue de la BelleGabrielle, 94-Nogent-sur-Marne, France.

152 FL. DAMERON

2. Methodes

(a) Methode de culture organotypique in vitro

Nous utilisons la methode de culture in vitro en milieu naturel mise au pointpar Wolff & Haffen (1952). Le milieu standard est enrichi par du serum (Wolff& Wolff, 1952). En voici la composition: gelose a 1 % dans du liquide de Gey,6 gttes; extrait embryonnaire dilue de moitie dans du liquide de Tyrode, 3 gttes;liquide de Tyrode, 1 gtte; serum de Poulain (Difco), 3 gttes. Le liquide deTyrode contient de la penicilline G (sel de Na) en solution dans le ' Subtosan'Specia a raison de 10 unites Oxford par milieu de culture.

Les explants, preleves a 5 jours d'incubation a l'aide de la loupe binoculaire,sont deposes sur un milieu de culture prealablement recouvert d'un fragment demembrane vitelline (Wolff, 1960). Cette derniere favorise l'etalement des explantset ameliore les conditions de culture.

(b) Methode de grejfe in ovo

Dans les associations de bronches avec des mesenchymes heterologues, unepartie des explants a ete greffee apres une courte periode de culture: bronche etmesenchyme sont associes sur un milieu ou ils sont laisses pendant 18 h afinqu'ils se soudent en un explant unique. L'explant est alors introduit dans lacavite coelomique d'un embryon receveur de 3 jours d'incubation. Tres viteirrigue, le greffon se developpe rapidement sans contact direct avec les autresorganes. Nous avons egalement fait quelques greffes sur la membrane chorio-allantoidienne d'embryons de 7 jours.

(c) Technique de separation des tissus embryonnaires

La bronche est separee de son manchon mesenchymal a l'aide de la trypsineselon une technique derivee de celle de Moscona (1952). Les poumons sontplonges pendant 11 min dans une solution de trypsine a 1 %, a la temperaturede la glace fondante. Nous utilisons la trypsine cristallisee Worthington dissoutedans une solution de Earle sans calcium ni magnesium, mais additionnee de pan-gestine a la concentration de 1 %. La pangestine evite la production de mucus parles cellules. Une dissociation mecanique a l'aide d'aiguilles montees tres fines estensuite necessaire pour completer la separation des tissus. La bronche enfin isoleeest seule conservee. Nous la rincons dans un melange a parties egales de solutionde Tyrode et de serum de poulain pour eliminer l'exces de trypsine, puis dansune solution de Tyrode pure.

Le mesenchyme pulmonaire utilise dans les reassociations est preleve parmicrodissection, sans trypsination. On le decoupe autour de la bronche a l'aidede scalpels fins, en prenant bien soin de ne pas entrainer d'epithelium.

(d) Techniques histologiques

En vue de leur etude histologique, la plupart des explants ont ete fixes en find'experience au liquide de Bouin. Coupes a une epaisseur de 5 /*, ils ont ete

V organogenese du poumon 153colores soit a l'hemalun et au Gabe (Gabe & Martoja-Pierson, 1957), soit auMallory. D'autres, fixes au liquide de Gendre, ont ete colores au reactif deSchiff (technique de Hotchkiss-MacManus).

NATURE DES INTERACTIONS EPITHELIO-MESENCHYMALES SE

PRODUISANT AU COURS DE L'ORGANOGENESE DU POUMON

L'interposition de membranes filtrantes entre deux tissus reagissants a dejapermis de mettre en evidence des systemes inducteurs ou le contact tissulaire estnecessaire pour que s'effectue la morphogenese (Lash, Holtzer & Holtzer,1957) et d'autres ou interviennent des substances inductrices diffusibles (Grob-stein, 19536; Auerbach, 1960). Ces resultats ont ete obtenus a l'aide des filtresMillipores. Par contre, il n'a pas ete signale d'activite morphogene a travers lamembrane vitelline de 1'ceuf de poule, la cellophane et le papier a cigarette(Holtfreter, 1933; Brachet, 1950; Moore, 1952).

Mb.Vit.

Mes.

Fig. 1. Schema illustrant la technique de culture avec interposition de membranefiltrante. Le mesenchyme, depose sur le milieu de culture, est recouvert de la mem-brane. L'epithelium est place sur celle-ci, juste au-dessus du mesenchyme. Br., epith6-lium bronchique; Mes., mesenchyme pulmonaire; Mb.Vit., membrane vitelline.

Pour connaitre le mode d'action du mesenchyme pulmonaire, nous avonscompare 1'evolution de l'epithelium lorsqu'il est cultive au contact direct de soninducteur a son evolution lorsque les deux tissus sont separes par une membranefiltrante. Nous avons utilise trois types de membrane, la membrane vitelline dePceuf de poule, la membrane de cellophane et les membranes Millipores.

Quel que soit le type de membrane utilise, nous la decoupons en petits frag-ments. Au moment de la mise en culture, nous deposons le mesenchyme pul-monaire sur le milieu de culture et le recouvrons de la membrane filtrante. Labronche est placee sur le filtre juste au-dessus du mesenchyme (ou inversement)comme le montre la figure 1. Les bronches controlaterales servant de temoinssont cultivees sur la membrane vitelline, soit seules, soit en association directeavec le mesenchyme pulmonaire.

154 FL. DAMERON

1. Resultats: evolution de la bronche separee du mesenchymepulmonaire par une membrane filtrante

(a) Membrane vitelline de Vceuf de Poule

La membrane vitelline de l'ceuf de Poule non incube constitue un filtreanhyste, de faible epaisseur (6 a 10 /i). Nous l'avons interposee entre epitheliumet mesenchyme pulmonaires dans 21 cas.

Treize bronches ont conserve leur structure tubulaire. De plus, elles ontdeveloppe quelques digitations. L'epithelium est sain, d'aspect palissadique;il a prolifere (planche 1, fig. 2).

Les 8 autres bronches se sont plus ou moins etalees sur la membrane vitelline.L'epithelium, de type palissadique, a forme cependant un certain nombre dereplis qui marquent une tendance a la tubulisation et indiquent une proliferationepitheliale assez importante. II est important de signaler que nous n'avonsjamais observe de regressions analogues a celles obtenues avec les bronchescontrolaterales cultivees seules. La figure (planche 1, fig. 3) est une illustration dece type devolution. Les quelques fibroblastes que Ton peut observer sur le bordde la membrane vitelline proviennent soit de cellules epitheliales dedifferenciees,soit de cellules mesenchymateuses qui n'ont pas ete eliminees par la trypsine.Mais meme si ces fibroblastes sont d'origine mesenchymateuse, leur trop petitnombre ne leur permet pas d'induire la differentiation de l'epithelium: lesbronches temoins cultivees isolement se dedifferencient dans tous les cas.

Dans l'ensemble, la bronche, separee du mesenchyme pulmonaire par unemembrane vitelline, est done capable d'operer une certaine morphogenese.Cette morphogenese rappelle celle que Ton obtient lorsque les deux tissus sontcultives en contact direct. Elle est toutefois plus faible et d'aspect legerementdifferent: la structure bronchique est moins caracteristique et les digitations

PLANCHE 1

L'6chelle des figures represente une valeur de 100/*.; e. epithelium bronchique; f.tn.,filtre Millipore; m., mesenchyme pulmonaire; m.v., membrane vitelline.

Fig. 2, 3. Interposition d'une membrane vitelline entre l'epithilium et le mesenchyme pul-monaires. Aspect histologique apres 5 jours de culture.Fig. 2. L'6pithelium bronchique s'est differencie, surtout du cot6 du mesenchyme, et aprolifere en formant des replis.Fig. 3. La structure tubulaire de la bronche n'est plus reconnaissable. Mais l'epithelium s'estdifferencie et a forme de nombreux replis.Fig. 4, 5. Interposition d'une membrane Millipore entre l'Spithelium et le mesenchymepulmonaires. Aspect histologique apres 5 jours de culture.Fig. 4. Filtre Millipore de type PH (epaisseur de 150/t, diametre des pores de 0,3/*). Labronche s'est etalee sur le filtre et n'a pas fait de morphogenese.Fig. 5. Filtre Millipore de type TH (epaisseur de 25 fi, diametre des pores de 0,45 /*). MemeEvolution.

J. Embryol. exp. Morph., Vol. 20, Part 2 PLANCHE 1

8.V

I 1 I

FLDAMERON

-4

facing p. 154

J. Embryol. exp. Morph., Vol. 20, Part 2 PLANCHE 2

L'organogenese du poumon 155moins nombreuses. On peut conclure neanmoins, qu'a travers la membranevitelline, diffuse une substance permettant Forganisation de l'epitheliumbronchique, sa proliferation et sa ramification.

(b) Membrane de cellophane

Sur les 15 bronches separees du mesenchyme pulmonaire par un membrane decellophane, nous n'avons pas observe la moindre differentiation. Les bronchesregressent et se necrosent. Elles evoluent comme les bronches temoins cultiveesisolement.

(c) Membranes Millipores

Quatre types de filtres ont etc essayes (VF, VM, PH et TH). Differant par leurepaisseur et la dimension de leurs pores, ces membranes pourraient nousrenseigner sur la taille des molecules constituant l'agent inducteur et la distancelitnite entre les deux ebauches pulmonaires permettant encore l'induction.

Le tableau 1 indique le nombre de bronches experimentees dans chaquecategorie de filtre et leur type devolution.

Les filtres VF et VM aux pores les plus fins (0,01 et 0,05 ju) et relativementepais (150/t), ne permettent pas la morphogenese du bourgeon pulmonaire.Apres 5 jours de culture, l'epithelium est entierement etale sur le filtre; sanecrose est frequente. Le type PH, dont les pores sont beaucoup plus larges

Tableau 1. Evolution de la bronche separee du mesenchymepulmonaire par une membrane Millipore

Type de filtreMillipore

VFVMPHTH

Nombre debronches

188

3910

Type devolution de la bronche

Morpho-genese + +

;

Survie+

368

Regression

18832

PLANCHE 2

b. I, bronche primaire; b. II, bronche secondaire; c.h., cellules hSpatiques; e., epitheliumbronchique; m., mesenchyme pulmonaire; m.i., mesenchyme intestinal; m.pr., mesenchyme deproventricule; pb., parabronche.Fig. 7. Bronche associSe a du mesenchyme pulmonaire. Aspect histologique apres 18 h deculture et 6 jours de greffe. Morphogenese importante.Fig. 8. Bronche associSe a du mesenchyme intestinal. Aspect histologique apres 18 h deculture et 6 jours de greffe. Le greffon a un aspect intestinal.Fig. 9. Bronche associee a du m6senchyme de proventricule. Aspect histologique apres 18 hde culture et 6 jours de greffe. La bronche est pluristratifi6e; elle est envelopp6e par lescouches musculaires qui se sont differenctees dans le mesenchyme de proventricule.Fig. 10. Bronche associee a du foie jeune. Aspect histologique apres 5 jours de culture. Labronche dessine des villositds a la maniere d'une muqueuse intestinale.

156 FL. DAMERON

(0,3 /*), s'est montre a peine plus favorable que les precedents: la bronche s'estaussi completement etalee mais l'epithelium est reste sain et palissadique commeon le voit sur la figure (planche 1, fig. 4). Enfin, le type TH, moins epais que les3 autres filtres (epaisseur de 25 /i et diametre des pores de 0,45 /i) donne desresultats comparables a ceux que Ton obtient avec le filtre PH. L'epitheliumsurvit mais on n'observe ni differenciation ni structures caracteristiques. La figure(planche 1, fig. 5) nous montre revolution d'une bronche cultivee sur un filtreTH.

Les bronches sont done capables de survivre sur les filtres Millipores PH etTH mais non d'effectuer leur morphogenese.

2. Conclusions

Ces experiences montrent que le mesenchyme pulmonaire peut exercer sonaction a travers certains types de filtres. On peut done penser que, comme dansd'autres systemes embryonnaires, le poumon s'edifie, au moins en partie, sousl'influence d'une ou des substances inductrices elaborees par le mesenchyme.Ces substances diffusent vers l'epithelium pour en declencher la differenciation.

— Elles sont capables de filtrer a travers la membrane vitelline. Nous obtenonsdans ce cas differents degres devolution: ces substances peuvent diffuser plusou moins bien, en particulier s'il est reste de Palbumine sur la membranevitelline.

— Leur influence ne se manifeste pas ou se manifeste tres peu a travers lesfiltres Millipores. II est probable que la quantite de facteurs morphogenes quiparvient a traverser les filtres PH et TH est trop faible pour induire revolutionde l'epithelium bronchique. En outre, cette evolution peut etre genee en raisonde l'etalement de l'epithelium tres accuse sur ces filtres cellulosiques.

En conclusion, la morphogenese de la bronche peut s'effectuer en dehors detout contact direct avec le mesenchyme, pourvu que les substances morpho-genes qu'il elabore puissent atteindre l'epithelium.

SPECIFICITE DES INTERACTIONS EPITHELIO-MESENCHYMALES:EVOLUTION DE LA BRONCHE AU CONTACT DE MESENCHYMES

HETEROLOGUES

Des associations heterologues d'ebauches epitheliales et mesenchymateusesont ete pratiquees par un certain nombre d'auteurs. Elles ont apporte denombreux renseignements sur le probleme de la specificite de deux tissus l'unpar rapport a l'autre dans un systeme inducteur. Ellles ont montre, en particulier,que la reponse du tissu competent a l'inducteur heterologue est variable. Selonl'organe considere:

— ou bien l'effecteur continue a evoluer selon sa propre nature, quelquefoisavec un certain retard (e'est le cas du mesenchyme metanephrique, Grobstein,1955; de l'epithelium thymique, Auerbach, 1960; de l'endoderme hepatique,Le Douarin, 1964).

Vorganogenese du poumon 157— ou bien l'effecteur est incompetent envers l'inducteur et reste indifferencie:

comme, par exemple, l'epithelium salivaire (Grobstein, 1953 a), l'epitheliumureteral de Souris (Grobstein, 1955).

— ou bien, enfin, la differenciation de l'effecteur subit l'influence de l'induc-teur heterologue: c'est le cas de Pepiderme (MacLoughlin, 1961), de l'epi-thelium pancreatique (Golosow & Grobstein, 1962), de l'epithelium de proven-tricule (Sigot, 1963), de l'epithelium ureteral de Poulet (Calame-Bishop, 1966).

En ce qui concerne le poumon, il est done interessant de savoir si la bronchepeut poursuivre son evolution au contact d'un mesenchyme heterologue. Dans cecas, sa differenciation sera-t-elle conforme a sa destinee propre d'arbre bronchial ?Sera-t-elle modifi.ee en fonction de la nature du mesenchyme associe ?

Nous avons eprouve l'influence de mesenchymes tres divers par leur origine,leur nature et leur situation (Dameron, 1961a, b, 1966):

— des mesenchymes specialises, de meme parente embryologique que lemesenchyme pulmonaire, tels que les mesenchymes du tube digestif (proventri-cule, gesier, intestin, foie).

— des mesenchymes specialises venant d'organes quelconques tres differents,comme la peau, le metanephros, le mesonephros, la tete et l'allantoide.

— un mesenchyme tres jeune, le mesenchyme somitique.— un mesenchyme xenoplastique pro venant d'une autre classe zoologique:

le mesenchyme pulmonaire de Souris.Enfin, nous nous sommes demandee si, comme le mesenchyme pulmonaire, les

mesenchymes heterologues agissaient par l'intermediaire d'une substancediffusible. Nous avons done, dans certains cas, cultive le mesenchyme hetero-logue et la bronche de part et d'autre d'une membrane vitelline.

A. Techniques utilisees

1. Preparations des ebauches mesenchymales

— Nous prelevons la plupart des mesenchymes heterologues par micro-dissection a l'aide de scalpels extremement fins, sans trypsination. Des culturescontroles nous permettent de verifier si nous n'avons pas entraine par megardede l'epithelium avec ces mesenchymes.

— Dans le cas du derme, preleve a 6,5 jours d'incubation, un passage a latrypsine est necessaire pour bien decoller l'epiderme (traitement de 15 min dansla trypsine).

— Pour isoler le mesenchyme mesonephrique, on doit recourir a la techniqueutilisee par Calame-Bishop (1961, 1966). Sur un embryon de 15 a 25 somites,on arrete, par un obstacle ou une excision (figure 6 A), la progression en arrieredu canal de Wolff, inducteur normal du mesonephros. On empeche ainsil'induction du mesenchyme mesonephrique et sa differenciation en tubules. Ongreffe alors la bronche a une distance de quelques somites presomptifs, caudale-ment par rapport a l'obstacle ou a l'excision, dans le territoire du mesenchymemesonephrique.

II J E E M 20

158 FL. DAMERON

— Pour empecher la colonisation du mesenchyme hepatique par les cordonshepatiques, nous nous sommes rapportee a la technique de Le Douarin (1964).Aux stades de 9 a 15 somites, on excise une bande transversale sur une longeurde 3 a 4 somites, depuis l'axe somitique jusqu'a l'aire opaque, entre le 3eme et le6eme somites (figure 6B). Au 5 ou 6eme jours d'incubation, ce mesenchymehepatique forme un petit lobe globulaire rose fonce, accole au tube digestifreste ouvert depuis le niveau de l'excision jusqu'a l'ombilic intestinal. Nousavons preleve le mesenchyme a ce moment pour l'associer a la bronche enculture.

z.m.h.

Fig. 6. A: Technique de greffe d'une bronche dans le territoire mesonephrogene. Operationsur un embryon de 15 a 25 somites (d'apres Calame-Bishop, 1961, 1966). B: Technique quipermet d'isoler le mesenchyme hepatique. Operation sur un embryon de 9 a 15 somites(d'apres Le Dourain, 1964). br., bronche; mes.meso., territoire du mesenchyme mesone'phrique;z.exc, zone excisee; z.f., zone du foie; z.m.h., zone du mesenchyme hepatique.

2. Culture des ebauches reassociees

L'evolution des associations heterologues est etudiee dans deux situationsdifferentes:

— en culture in vitro prolongee (pendant 5 a 7 jours);— en culture de courte duree (pendant 18 h) suivie de greffe (pendant 4 a

6 jours). Ceci permet d'obtenir un developpement plus important des explants.Les resultats fournis par ces associations sont compares a 1'evolution des

bronches controlaterales isolees ou reassociees au mesenchyme pulmonaire.

U organogenese du poumon 159

Nous considerons comme favorables les mesenchymes qui permettent l'evo-lution de la bronche, c'est-a-dire:

— la proliferation de l'epithelium entrainant la ramification ou, a defaut, laformation de replis de la paroi bronchique;

— la differentiation histologique de l'epithelium.Nous qualifions de non inducteurs les mesenchymes qui provoquent la

resorption de la bronche ou un ballonnement excessif, accompagne de degeneres-cence de l'epithelium.

B. Resultats

1. Influence du mesenchyme pulmonaire sur la morphogenese de la bronche

En ce qui concerne revolution des temoins, nous savons deja que la bronchereassociee au mesenchyme pulmonaire en culture in vitro (Dameron, 1961a, b,1966) effectue une bonne morphogenese.

Lorsqu'une association analogue est greffee apres 18 h de culture, le greffonse vascularise rapidement et acquiert tres vite une taille importante. La bronchese ramifie abondamment. Les divers ordres de bronches se trouvent le plussouvent represented (planche 2, fig. 7). La croissance equivaut approximative-ment a cell d'un poumon developpe dans les conditions naturelles mais dont leplan morphologique est atypique.

2. Influence des mesenchymes de meme parent e embryologique que lemesenchyme pulmonaire

(a) Mesenchymes du proventricule, du gesier et de Vintestin

Vingt-sept bronches ont ete associees au mesenchyme de proventricule, 26 aumesenchyme de gesier et 42 au mesenchyme intestinal. Parmi celles-ci, 27, 19et 40 ont respectivement evolue. Ces experiences ont ete faites soit en culture,soit en culture suivie de greffe.

L'observation histologique montre que l'epithelium et le mesenchyme mis enpresence s'associent etroitement et reagissent l'un par rapport a l'autre (planche 2,fig. 8, 9). Les mesenchymes differencient une double ceinture musculaireautour de la bronche. A l'interieur de celle-ci, le bourgeon pulmonaire dessinedes replis ou villosites. II prend l'aspect d'une muqueuse pluristratifiee, surtoutau contact des mesenchymes de proventricule et de gesier.

Ainsi ces explants ou ces greffons ont l'allure d'un tube digestif: la transforma-tion de la bronche peut etre due soit a des raisons mecaniques, les nappesmusculaires qui enveloppent la bronche genant son evolution, soit a 1'influenceinductrice propre au mesenchyme associe. Ces modifications morphologiquesde la bronche correspondent-elles a un changement du metabolisme cellulaire ?

Differenciation histochimique. Sigot (1963) a montre que la differentiation dugesier s'accompagne d'une accumulation de glycogene dans les cellules epi-theliales. Dans l'epithelium bronchique par contre, cette substance n'existe pasnormalement ou seulement a l'etat de traces. Nous nous sommes demandee si le

160 FL. DAMERON

mesenchyme de gesier, qui influence la morphologie de la bronche en associationheterologue, modifie aussi son metabolisme en provoquant la synthese deglycogene comme il le fait avec l'epithelium de proventricule.

Nous avons done recherche le glycogene dans des associations cultivees ougreffees a l'aide de la reaction au P.A.S. Nous n'en avons jamais detecte.L'epithelium bronchique, place sous l'influence du mesenchyme de gesier,n'acquiert pas la capacite de synthetiser du glycogene.

(b) Mesenchyme hepatique et foie jeune

Vingt-six bronches ont ete associees a du mesenchyme hepatique et 28 a dufoie jeune de 3,5 jours d'incubation. Dix-sept d'entre elles dans le premier caset 25 dans le second cas ont evolue.

Dans les deux types d'associations in vitro, l'epithelium bronchique prolifereet forme soit des replis et villosites, soit des digitations (planche 2, fig. 10). II sedifferencie et s'epaissit beaucoup. Lorsque la bronche est cultivee au contact dufoie jeune, les cellules hepatiques s'associent tres etroitement a la bronche ets'incorporent a elle: il est difficile d'apprecier la limite entre les tissus pulmonaireset hepatiques.

L'evolution des greffons, par contre, est moins bonne qu'/ra vitro. II estpossible que se produisent in ovo certaines inhibitions qui n'existent pas enculture ou les tissus sont soustraits aux influences du reste de l'organisme.

(c) Conclusions

En conclusion, les mesenchymes issus du tube digestif ou de son annexehepatique stimulent le developpement de la bronche mais en modifient l'organisa-tion architecturale. L'influence du mesenchyme dans les conditions de cultureque nous avons utilisees ne semble cependant pas atteindre le metabolisme pro-fond de la cellule pulmonaire.

PLANCHE 3

d., derme; e., epithelium bronchique; g., glomerule; m.c, marques de charbon; m.m.,mesenchyme metanephrique; m.v., membrane vitelline; t.s., tubules secreteurs.

Fig. 11. Bronche associee a du derme. Aspect histologique apres 5 jours de culture. Dif-ferentiation et ramification de l'epithelium bronchique.Fig. 12. Bronche associee a du derme mais avec une membrane vitelline interposee entre lesdeux tissus. Aspect histologique apres 5 jours de culture. Le derme agit a distance sur l'epi-thelium bronchique qui s'est differencie et ramifie.Fig. 13. Bronche associee a du mesenchyme metanephrique. Membrane vitelline interposeeentre les deux tissus: le mesenchyme metanephrique agit a distance sur l'epithelium bron-chique qui s'est differencie et a prolifere.Fig. 14. Bronche associee a du mesenchyme metanephrique. Aspect histologique apres 18 hde culture et 5 jours de greffe. La bronche forme un tube simple bord6 d'un Epithelium palis-sadique ou pseudostratifie. Noter la differentiation de tubules secr&eurs et de glomerules dansle mesenchyme metanephrique.

J. Embryol. exp. Morph., Vol. 20, Part 2 PLANCHE 3

14

FL DAMERON facing p. 160

J. Embryo/, ex p. Morph., Vol. 20, Part 2 PLANCHE 4

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U organogenese du poumon 161

3. Mesenchymes issus d'organes quelconques eloignes du territoire pulmonaire

(a) Mesenchyme dermique

Au contact du derme, la bronche se ramifie et se differencie dans tous les cas(28) en culture. La morphogenese est importante. La paroi epitheliale, tresepaissie, forme des replis et des digitations nombreuses (planche 3, fig. 11). Labronche se cloisonne parfois en plusieurs compartiments, des travees recoupantcompletement ou partiellement la lumiere: il est possible que le derme, sedeveloppant dans un plan, perturbe la structure tubulaire de la bronche.

Dans 6 cas, nous avons separe les deux ebauches par une membrane vitelline.Les 6 explants ont evolue; 2 ont restes bien structures, 4 se sont etales partielle-ment. Dans tous les cas, l'epithelium s'est differencie; il a prolifere et forme desramifications (planche 3, fig. 12). Le derme peut done agir a distance sur l'epi-thelium bronchique.

(b) Mesenchyme mttanephrique

En presence du mesenchyme metanephrique, en culture, l'epithelium bron-chique prolifere et developpe des digitations dans 17 cas sur 23. II s'amincitassez nettement.

Dans 21 cas, nous avons interpose une membrane vitelline entre la broncheet la mesenchyme metanephrique. Neuf bronches se sont etalees, 12 ont con-serve leur structure. L'epithelium, d'aspect cubique ou palissadique, a prolifereet forme des replis ou, dans 6 cas, de petites digitations (planche 3, fig. 13).

Lorsque culture et greffe sont combinees (12 cas), la bronche suit une evolu-tion un peu differente. Dans 7 cas, elle apparait sous forme d'un tube simpleconstitue d'un epithelium cubique ou palissadique et pouvant rappeler d'assezloin un uretere. Le mesenchyme metanephrique est lui-meme induit par l'epi-thelium pulmonaire a former des ilots de tubules secreteurs et des glomerulesdans 11 cas sur 12 (planche 3, fig. 14). II se produit done une induction reciproquedes deux ebauches associees: la structure de la bronche se simplifie, repitheliums'amincit; la differentiation des tubules au contact de cet epithelium montre

PLANCHE4

e., Epithelium bronchique; m.c, mesenchyme cephalique; m.p., mesenchymepulmonaire de souris; m.v., membrane vitelline.

Fig. 15. Bronche associee a du mesenchyme cephalique. Aspect histologique apres 5 jours deculture. Ballonnement de la bronche.Fig. 16, 17. Bronche associee a du mesenchyme pulmonaire de souris.Fig. 16. Aspect histologique apres 18 h de culture et 5 jours de greffe. L'epith61ium bron-chique de poulet est pluristratifie\ II a forme de nombreux bourgeons.Fig. 17. Aspect histologique apres 18 h de culture et 5 jours de greffe. Detail montrant, versla droite, des bourgeons dichotomiques et, vers la gauche, un bourgeon monopodique. Lesbourgeons ont un aspect typiquement pulmonaire.

162 FL. DAMERON

que le mesenchyme metanephrique est determine et qu'il evolue selon sanature propre.

(c) Mesenchyme mesonephrique

Vingt-huit bronches ont ete cultivees en association avec du mesonephros de3 a 5 jours; 6 bronches ont ete greffees directement dans le territoire presomptifdu mesenchyme mesonephrique et laissees en place pendant 5 jours.

Dans tous les cas, le bourgeon pulmonaire se dilate en vesicule plus ou moinsvolumineuse, a paroi mince. L'epithelium est quelquefois cubique et le plussouvent aplasique et dediffereneie.

(d) Mesenchyme cephalique

Dans les 21 associations realisees in vitro, la bronche s'est dedifferenciee et aregresse presque completement ou a forme une vesicule a paroi mince (planche 4,fig. 15).

(e) Allanto'ide

Quinze associations ont ete cultivees et 8 bronches ont ete greffees sur lamembrane chorio-allantoiidienne. Ces deux series ont donne les memes resultats.Le bourgeon pulmonaire est reste sain mais n'a pas evolue.

(/) Mesenchyme somitique

Le mesenchyme somitique, preleve sur des embryons de 2,5 a 3 jours d'incuba-tion, a ete associe a la bronche dans 56 cas en culture. Nous n'avons observeaucune evolution. La bronche s'est vesiculisee.

(g) Conclusions

La bronche est capable de reagir a l'induction de quelques mesenchymesheterologues ne provenant pas du tube digestif: elle evolue au contact du dermeet du mesenchyme metanephrique. Par contre, elle ne se developpe pas enpresence des mesenchymes mesonephrique, cephalique, allantoidien et somitiqueCes differences devolution sont-elles dues a une inegalite dans le degre d'acti-vite morphogene de ces mesenchymes ? ou a l'antagonisme de certains d'entreeux envers l'epithelium bronchique ?

Le derme et le mesenchyme metanephrique sont capables, comme le mesen-chyme pulmonaire, d'induire la differenciation de la bronche a travers unemembrane vitelline. Des substances actives, elaborees par ces mesenchymes,diffusent done vers l'epithelium pour en declencher la morphogenese.

4. Mesenchyme issu d'une autre classe zoologique

Nous avons essaye d'obtenir la differenciation de la bronche de Poulet sousl'influence d'un mesenchyme xenoplastique, le mesenchyme homologue pul-monaire de Souris. Les explants survivent parfois assez difficilement car lestissus de Souris tendent a se necrosser rapidement.

V organogenese du poumon 163

Toutefois, la bronche de Poulet poursuit sa morphogenese au sein du mesen-chyme pulmonaire de Souris de 11 jours de gestation dans 11/17 cas en culture et4/5 cas en greffe. L'observation macroscopique des cultures montre une evolu-tion comparable a celle des reassociations des deux ebauches pulmonaires dePoulet. Une partie des cellules mesenchymateuses se condense en manchonautour de la bronche de Poulet. L'epithelium, de type pseudostratifie, prolifereet se ramifie. De nombreux bourgeons dont l'aspect est typiquement pulmonaire,se sont formes en particulier dans les greffons (planche 4, figs. 16, 17). Le modede bourgeonnement est soit monopodique comme dans le poumon de Poulet,soit dichotomique comme dans le poumon de Souris. Ce type de morphogeneseintermediate a aussi ete obtenu par Taderera (1967) dans les associationsd'epithelium pulmonaire de Souris et de mesenchyme pulmonaire de Poulet.

Ces resultats indiquent que des constituants differents d'un meme organe maisde classes differentes se reconnaissent et collaborent. Comme le suggereWolff (1957), 'aux homologies morphologiques doivent correspondre deshomologies profondes de nature biochimique'.

Tableau 2. Influence des mesenchymes heterologues sur lamorphogenese de la bronche

Mesenchymes dememe origineembryologique

Mesenchymesspecialisesquelconques

M6senchyme tres jeuneM6senchyme d'une autreclasse zoologique

"^Jo+iii"^ /"InJLNdlUlC VILI

mesenchymePulmonaire

de proven Ir.de gesier

IntestinalHepatiqueDermiqueMetanephriqueMesonephriqueCephaliqueAllantoidienSomitiquePulmonaire

de souris

Nombre de casevolues

en culture

49/50

18/1810/1527/2942/5428/2817/230/280/210/150/56

12/17

en greffe

42/52

9/9 >9/11

13/138/8

10/12 >1/6 •

—4/5

Tfifln&YI{*(* /"InJ.1111UCJ1LC UU

mesenchymeInducteurnormal

Favorables

• Defavorables

Favorable

C. Conclusions

1. L'ensemble de ces resultats, resume dans le tableau 2, montre la specificitedu mesenchyme pulmonaire dans la differenciation caracteristique de l'epi-thelium bronchique. Cette specificite existe malgre les differences de parentezoologique entre les tissus puisque le mesenchyme pulmonaire de Souris estcapable d'induire l'epithelium bronchique de Poulet a former des bourgeonstypiquement pulmonaires.

164 FL. DAMERON

2. Les associations entre bronche et divers mesenchymes heterologuesmontrent aussi que des interactions sont possibles dans un systeme epithelio-mesenchymateux inhabituel.

(a) Grace a la stimulation de repithelium bronchique, les mesenchymes sedifferencient en structures caracteristiques et evoluent selon leur destineenormale: ils sont deja determines au moment de l'explantation.

(b) La bronche peut se developper au contact de certains mesenchymesheterologues (mesenchymes provenant du tube digestif, de la peau et du metane-phros) mais ceux-ci modifient son organisation architecturale: l'epitheliumbronchique n'est pas determine.

L'influence des mesenchymes heterologues sur la bronche peut s'exercer:— par leur texture: en ce qui concerne les mesenchymes digestifs tres denses,

la differenciation des couches musculaires peut gener la ramification de labronche qui fait alors des replis ou des villosites;

— par l'intermediaire d'une substance morphogene diffusible: nous avonsvu que les mesenchymes dermique et metanephrique agissent a distance. II estprobable que ceci est vrai pour d'autres mesenchymes.

— II faut peut-etre ajouter un certain effet trophique qui peut se produireentre deux tissus etrangers anormalement en contact.

(c) Cependant si de tels mesenchymes peuvent devier la bronche de sadestinee morphologique normale, il ne semble pas que le metabolisme del'epithelium bronchique soit modifie: n'ayant pas normalement la capacite desynthetiser du glycogene, cet epithelium ne Facquiert pas au contact du mesen-chyme de gesier. II est interessant de remarquer que l'endoderme hepatique(Le Douarin, 1967) perd cette capacite au contact d'un mesenchyme heterologuemais la retrouve si on reassocie cet endoderme avec son propre mesenchyme.

3. En conclusion, l'organogenese pulmonaire s'effectue grace a des inter-actions entre l'epithelium et le mesenchyme. Ce dernier elabore une substancemorphogene qui diffuse vers l'epithelium pour en declencher la differenciation.L'activite inductrice du mesenchyme sur repithelium bronchique est specifique.La bronche peut neanmoins evoluer au sein de certains mesenchymes heterologuesmais ces derniers modifient sa morphologie.

Ceci nous amene a nous interroger sur la nature de la substance morphogenesynthetisee par le mesenchyme. Nous pouvons nous demander s'il existe un ouplusieurs facteurs. Dans ce cas, peut-on distinguer un facteur de croissancegenerale propre a tous les tissus et un facteur specifique responsable de ladifferenciation pulmonaire, limitant ou orientant Faction du premier facteur ? Lesresultats que nous avons obtenus jusqu'ici ne nous permettent pas encore derepondre a ces questions.

RESUME

1. Nous avons etudie la nature et la specificite des interactions epithelio-mesenchymales au cours de l'organogenese du poumon chez l'embryon de

Vorganogenese du poumon 165Poulet. Nous avons suivi revolution des bronches a partir du moment ou ellescommencent a se ramifier (114 a 120 h d'incubation). La plupart des experiencesont ete faites en culture in vitro selon la methode mise au point par Wolff &Haffen.

2. L'interposition de membranes filtrantes entre les deux constituants pul-monaires a permis de determiner la nature des interactions s'effectuant entre cesdeux tissus. Les interactions peuvent s'exercer a distance par l'intermediaired'une substance inductrice elaboree par le mesenchyme. Cette substance estcapable de diffuser a travers la membrane vitelline. Elle est arretee par lacellophane. Elle n'a que peu d'influence a travers une membrane Millipore.Elle est active a faible distance (inferieure a 25 /*).

3. Des associations entre bronche et divers mesenchymes heterologues mon-trent que certains d'entre eux (mesenchymes mesonephrique, cephalique, allan-toidien et somitique) ne sont pas favorables a la morphogenese de la bronche.D'autres mesenchymes heterologues, au contraire, permettent son evolution:les uns ont la meme parente embryologique que le mesenchyme pulmonaire(ils proviennent du tube digestif); d'autres sont tres differents (c'est le cas duderme et du mesenchyme metanephrique); enfin, un mesenchyme xenoplastique,le mesenchyme pulmonaire de Souris, est tout a fait favorable. Ces mesenchymesheterologues favorables modifient l'organisation architecturale de la bronche.Seul, le mesenchyme pulmonaire induit specifiquement la differentiation carac-teristique de la bronche. Le mesenchyme pulmonaire de Souris est, lui aussi,capable d'induire l'epithelium bronchique de Poulet a former des bourgeonstypiquement pulmonaires.

SUMMARY

An experimental study of the organogenesis of the lung: the nature andspecificity of the epithelio-mesenchymatous interactions

1. The nature and specificity of epithelio-mesenchymal interactions have beenstudied during chick lung organogenesis. The evolution of bronchi has beenobserved from the moment when they begin to branch out (after 114-120 h ofincubation). Most of the experiments have been made in culture using Wolff &Haffen's method.

2. Filter membranes laid between the epithelium and mesenchyme of the lungallowed the determination of the nature of interactions which take place betweenthese two tissues. The interactions can occur at a distance, through an inductivesubstance elaborated by the mesenchyme. This substance is able to diffuseacross the vitelline membrane of a hen's egg. It is stopped by a cellophanefilter. It has only slight influence across a Millipore filter. It is active at distancesof less than 25 /*.

3. Associations between bronchus and various heterologous mesenchymesshow that some of them (mesonephric, cephalic, allantoic and somitic mesen-chymes) are unfavourable to bronchial morphogenesis. Others, on the contrary.

166 FL. DAMERON

allow its evolution: among these, some have the same embryologic origin asthe lung mesenchyme (they come from the digestive tract); others are verydifferent (like dermic and metanephric ones); finally, a xenoplastic mesenchyme,the mouse lung one, is quite favourable. These favourable heterologous mesen-chymes influence the bronchial architectural organization. Only lung mesen-chyme specifically induces the characteristic differentiation of the bronchus. Themouse pulmonary mesenchyme is also able to induce the chick lung epitheliumto develop typically pulmonary buds.

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