UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

ESCUELA DE TECNOLOGÍA MÉDICAÁREA DE LABORATORIO CLÍNICO

CUARTO SEMESTRE BACTERIOLOGÍA 2014

TEMA:TOMA DE MUESTRAS, STAPHYLOCOCCUS Y STREPTOCOCCUS

1. OBJETIVOS

Identificar las características macromorfológicas de las colonias de Staphylococcus y Streptococcus en los medios de cultivo.

Determinar los diferentes tipos de hemólisis que se producen en el agar sangre por las especies del género Staphylococcus y Streptococcus.

Realizar pruebas bioquímicas para poder identificar y diferenciar las especies del Género Staphylococcus.

Realizar pruebas bioquímicas para poder identificar y diferenciar las especies del Género Streptococcus.

2. MARCO TEÓRICO

EXUDADO NASAL:

Esta muestra solo se utiliza para buscar portadores de S.aureus o en el diagnóstico etiológico de impétigo. No es útil para el diagnóstico etiológico en casos de rinitis, rinosinusitis ni en casos de otitis media ni cuadros respiratorios altos prolongados

Alrededor del 30% de la población es portadora de este microorganismo a nivel nasofaríngeo por lo cual su hallazgo no tiene habitualmente significancia clínica salvo en situaciones especiales. En el personal de salud sólo se realizará la búsqueda de portadores en el caso de brotes de infecciones en los que no se ha encontrado otra fuente de infección. Este tipo de investigación se realizará en coordinación con el

D. TRANSPORTE Y CONSERVACION.

Envío inmediato al laboratorio (no superior a 2 horas).

EXUDADO FARINGEO

Se utiliza para el diagnóstico de faringitis estreptocóccica. Excepcionalmente se pueden requerir búsqueda de otros patógenos (por ejemplo: Neisseria gonorrhoeae) consultar con el laboratorio.

D. TRANSPORTE Y CONSERVACION. Envío inmediato al laboratorio (no superior a 2 horas). Si no es posible, conservar en heladera a 4ºC hasta 12 horas. D. OBSERVACIONES. Se investigará rutinariamente la presencia de Streptococcus beta-hemolítico del grupo A (S. pyogenes) y otros grupos beta hemolíticos como C y G.

Género Staphylococcus

STAPHYLOCOCCUS AUREUS, STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS Y STAPHYLOCOCCUS SAPROPHYTICUS.

Los Staphylococcus que se asocian con infecciones humanas son colonizadores principalmente de superficies cutáneas y mucosas. El crecimiento de las colonias bacterianas son visibles casi sobre todos los medios de cultivo, en especial en agar sangre.

Son bacterias en forma de coco Gram positivas producen catalasa, son aerobios facultativos. La temperatura ideal de crecimiento es de 37ºC, Consumen lípidos, proteínas y fermenta una gran variedad de azucares, no es formadora de esporas y crecen en niveles de salinidad 7.5-10%.

Dentro del género Staphylococcus hay 52 especies, siendo las más importantes desde

el punto de vista clínico las siguientes:

Staphylococcus aureus (coagulasa positivo)

Staphylococcus epidermidis (coagulasa negativo)

Staphylococcus saprophyticus (coagulasa negativo)

Morfología colonial.

En agar sangre, nutritivo chocolate, soya tripticasa, etc, se ven colonias pequeñas, blanquecinas, de forma circular, bordes redondeados, superficie lisa y convexa. Algunas cepas producen un pigmento carotenoide que les da un color dorado (Staphylococcus aureus).

Cultivos

Los estafilococos crecen rápidamente en casi todos los medios bacteriológicos bajo condiciones aerobias o microaerofílicas.Se desarrollan con más rapidez a una temperatura de 37°C pero forman pigmento mejor a una temperatura ambiente (20 a 25°C). Las colonias en medios sólidos son redondas, lisas, elevadas y brillantes.

Staphylococcus aureus

Algunas cepas de S. aureus pueden producir un pigmento carotenoide que les da un color amarillo, el color es más evidente en agares nutritivos como agar sangre, agar chocolate, agar infusión cerebro corazón, agar nutritivo, entre otros.

Las cepas de S. aureus son productoras de coagulasa y beta-hemolisinas (algunas cepas

carecen de hemolisina) presenta colonias de 1 a 3 mm de diámetro, lisas, levemente elevadas, de bordes enteros, levemente convexas.

Pruebas bioquímicas para la identificación de Staphylococcus aureus.

Agar sales y manitol: positivo (color amarilllo). Prueba de coagulasa: positivo. Sensisbilidad a vancomicina: positivo. Única especie de Staphylococcus que puede producir pigmentación

amarilla. DNAasa: positiva.

Staphylococcus saprophyticus.

Staphylococcus aureus en agar sangre a contra luz para observar la hemolisis beta.

Casi nunca se asocia a enfermedades nosocomiales, muchas cepas son manitol positivo, no producen beta-hemolisis en agar sangre, es causante de infecciones urinarias, carece de coagulasa y no produce ninguna pigmentación.

Bioquímicas para la identificación de Staphylococcus saprophyticus.

Agar sales y manitol: negativo o positivo (variable). Prueba de coagulasa: negativo. Sensibilidad a vancomicina: resistente. DNAasa: negativo.

Staphylococcus epidermidis. .

Las infecciones por S. epidermidis son oportunistas, nosocomiales y generalmente

está asociado a los implantes de prótesis, catéteres e intervenciones quirúrgicas.

Las colonias de S. epidermidis por lo

general son grises a blancas en el

aislamiento primario; muchas colonias

forman pigmento sólo tras una incubación

prolongada. No se produce pigmento en

condiciones anaerobias o en caldo y

presenta colonias generalmente de menor

tamaño y estas no presentan pigmentación.

Pruebas bioquímicas para la identificación de Staphylococcus epidermidis.

Agar sales y manitol: negativo (da un color rosa).

Prueba de coagulasa: negativo. Sensisbilidad a vancomicina: positivo..

Para identificar el género usamos las pruebas bioquímicas primarias.

Tinción de Gram: Cocos Gram positivos, agrupados en racimos. Catalasa: positiva. Oxidasa: positiva.

O/F: F

La prueba de O/F es la que diferencia Staphylococcus sp. Del género Micrococcus sp. Este último tiene metabolismo oxidativo.

Diferenciación de especies de Staphylococcus

Bacteria. Manitol. Coagulasa. Novobiocina. DNAasa.

S. aureus Positivo Positivo Sensible Positivo

S.saprophyticus Variable Negativo Resistente Negativo

S. epidermidis Negativo Negativo Sensible Negativo

GÉNERO STREPTOCOCCUS

El género Streptococcus es un grupo formado por diversos cocos grampositivos que normalmente se disponen en parejas o en cadenas. La mayoría de las especies son anaerobios facultativos, y algunos crecen únicamente en una atmósfera enriquecida con dióxido de carbono. Sus exigencias nutricionales son complejas, y su aislamiento requiere el uso de medios enriquecidos con sangre o suero. Son capaces de fermentar hidratos de carbono, proceso que produce ácido láctico, y son catalasa-negativos, a diferencia de las especies del género Staphylococcus

Un gran número de especies estreptocócicas destacan por su papel como patógenos humanos. Lamentablemente, la diferenciación de las especies que componen este género es complicada debido a que se utilizan los tres sistemas diferentes parcialmente coincidentes enumerados a continuación para clasificar a estos microorganismos:

1) Propiedades serológicas: grupo de Lancefield; 2) Patrones hemolíticos: hemólisis completa (beta), hemólisisincompleta (alfa) y ausencia de hemólisis, y

3) Propiedades bioquímicas (fisiológicas)

Rebeca Lancefield desarrolló en 1933 el sistema de clasificación serológica para diferenciar las cepas beta-hemolíticas. La mayoría de estas cepas y algunas de las alfa-hemolíticas y no hemolíticas poseen antígenos específicos de grupo, la mayoría de los cuales son hidratos de carbono de la pared celular. Estos antígenos se pueden detectar fácilmente con pruebas inmunológicas, y

han sido útiles para identificación rápida de algunos patógenos estreptocócicos. Por ejemplo, ´

La mayoría (pero no todos) de los estreptococos alfa-hemolíticos y no hemolíticos carecen de los antígenos de lapared celular específicos de grupo. Estos microorganismos se deben identificar a través de pruebas bioquímicas. Noobstante, estos sistemas de clasificación no son mutuamente excluyentes

STREPTOCOCCUS PYOGENES.

El S. pyogenes (también conocido como GAS) pertenece al GRUPO A y es el agente causal en las infecciones estreptocócicas del Grupo A, (GAS) incluyendo faringitis estreptocócica ("amigdalitis"), fiebre reumática aguda, fiebre escarlata, glomerulonefritis aguda y fascitis necrotizante

El hidrato de carbono específico de grupo, es el antígeno del grupo A, es un dímero de N-acetilglucosamina y de ramosa.

La infección por Estreptococo Grupo A es diagnosticada generalmente con una Prueba Rápida de Estreptococos o mediante Cultivo.El método más comúnmente empleado en los laboratorios clínicos para la identificación presuntiva en cultivos de Streptococcus Beta-hemolítico del grupo A (Streptococcus pyogenes) es la prueba de susceptibilidad a la bacitracina o Taxo A. Otra manera es detectar el antígeno A mediante enzimoinmunoanálisis o inmunoaglutinación.

STREPTOCOCCUS AGALACTIAE

Características generales

S. agalactiae, o GBS, pertenece al grupo B y causa neumonía y meningitis en neonatos y en las personas más jóvenes, con bacteremia sistémica ocasional.

Estos también pueden colonizar los intestinos y el tracto reproductor femenino, incrementando el riesgo de ruptura prematura de membranas y la transmisión al infante.

Es un coco grampositivo, catalasa y oxidasa negativo, anaerobio facultativo, que se presenta formando cadenas de longitud variable. En medios suplementados con sangre o suero se favorece su crecimiento. Tras 18-24 h de incubación en agar sangre, las colonias son de unos 2 mm de diámetro, lisas y rodeadas por un halo de ß-hemólisis, aunque existen algunas cepas no hemolíticas.

El empleo de medios selectivos favorece la recuperación del EGB. Como agentes selectivos se emplean, gentamicina, ácido nalidíxico, colistina o cristal violeta.

IDENTIFICACIÓN

Las pruebas bioquímicas más utilizadas son el CAMP-test, la hidrólisis del hipurato y la resistencia a discos debacitracina y cotrimoxazol, aunque ninguna de ellas es específica. En medios de cultivo especiales, el EGB produce un pigmento de color rojo naranja, que es característico, y que permite su identificación directa, sin necesidad de otras pruebas.

STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE

Se trata de una bacteria Gram. Positiva que presenta una forma oval y el extremo distallanceolado. Es inmóvil, no forma endosporas, y es un miembro alfa hemolítico del género Streptococcus. Generalmente, se presenta en forma de diplococo, aunque existen algunos factores que pueden inducir la formación de cadenas. Neumococo es un patógeno casi exclusivamente humano causante de un gran número de infecciones como neumonía, endocarditis y de procesos invasivos severos como meningitis, septicemia, etc. particularmente

en ancianos, niños y personas inmunodeprimidas. El hábitat natural de neumococo es la faringe

El estreptococo pneumoniae se puede diferenciar del estreptococo viridans en que solo el primero es soluble en bilis,el viridans no. Y la otra diferencia es que el estreptococo pneumoniae se inhibe en la presencia de optoquina. Elestreptococo viridans no se inhibe con la optoquina

Resistente a la optoquina (S. viridans),

Sensible a la optoquina (S. pneumonae)

Actividad Hemolítica

La hemólisis observada en los aislamientos de Streptococcus y Enterococcus en diferentes muestras clínicas es una de las primeras características sugestivas de posibles especies. Algunas especies muestran una hemólisis completa (hemólisis ß) alrededor de las colonias en agar sangre, como S. pyogenes, S. agalactiae (aunque algunos aislamientos aparecen como no-hemolíticos), Streptococcus de los grupos C, F y G, así como algunas cepas de Enterococcus,

Otras especies pueden mostrar una hemólisis incompleta (hemólisis alfa) alrededor de las colonias en agar sangre, incluyendo S. pneumoniae, Streptococcus del grupo D y del grupo viridans.

Al realizar la determinación de los patrones hemolíticos de los aislamientos de Streptococcus y Enterococcus es importante considerar que muchas de sus citolisinas (hemolisinas) son lábiles al O2, por lo que las bacterias deben ser inoculadas dentro del agar para proporcionar un ambiente relativamente anaeróbico.

PRUEBA DE CAMP

La prueba de CAMP se utiliza para la identificación presuntiva de S. agalactiae (grupo B de Lancefield). En esta prueba se observa un efecto sinérgico que se produce al interactuar el factor CAMP producido por cepas de S. agalactiae con la hemolisina β de Staphylococcus aureus. Ambos son productos extracelulares

que difunden en el medio de cultivo para producir dicho efecto en forma de flecha cuando se utilizan placas de agar sangre preparada con eritrocitos ovinos o bovinos. Una vez inoculados, los medios de cultivo deben ser incubados a 35-37°C por 18-24 horas. Algunos autores recomiendan no incubar las placas de agar sangre para la prueba de CAMP en una atmósfera enriquecida con CO2 debido a un probable efecto inhibitorio sobre el sinergismo. 

PRUEBA DEL DISCO DE OPTOQUINA

Prueba de resistencia al optoquina. La prueba de resistencia a la optoquina (hidrocloruro de hidrocupreína) permite la diferenciación de Streptococcus pneumoniae (sensible al optochin) de otros Streptococcus α- hemolíticos como los Streptococcus del grupo viridans (resistentes al optochin). Para la realización de esta prueba el microorganismo en estudio debe ser inoculado densamente en una placa de agar sangre y sobre el inóculo se coloca un disco conteniendo optochin (rotulado con una P) , el cual se presiona levemente para que se adhiera a la superficie del medio. Las placas de agar sangre son posteriormente incubados a 35-37oC por un período de 18-24 horas en una atmósfera enriquecida con CO2. La mayoría de los discos conteniendo optochin disponibles comercialmente tienen un diámetro de 6 mm. Utilizando estos discos de 6 mm para la prueba de resistencia al optochin, un resultado se considera negativo (susceptible) cuando el halo de inhibición mide al menos 14 mm de diámetro. Sin embargo, algunas pocas casas comerciales tienen a disposición discos conteniendo optochin de 10 mm de diámetro. En este caso, unhalo de inhibición igual o superior a 16 mm de diámetro se debe interpretar como un resultado negativo (susceptible)

 Prueba de hidrólisis de esculina.Esta prueba se utiliza para la identificación presuntiva de Streptococcus del grupo D, como S. bovis y S. equinus, y de las especies de Enterococcus, todos los cuales dan esta prueba positiva. Esta prueba se realiza utilizando un medio llamado agar bilis-esculina, el cual contiene 4% de sales biliares y 1% de esculina. La hidrólisis de la esculina resulta en la formación de glucosa y esculetina. La esculetina en presencia de Fe3+ forma un complejo de color negro. Por lo tanto, las bacterias que crecen en presencia de las sales biliares e hidrolizan esculina tornan el medio de color negro, generalmente en un periodo de incubación de 18-24 horas a 35-37°C. La presencia de crecimiento pero sin la formación delcolor negro se considera como una prueba negativa.

3. RECURSOS

Toma de muestra

Hisopo de algodón con medio de transporte.

Bajalenguas Agar Sangre, chocolate

STAPHYLOCOCCUS Bacitracina 0.04 Pinza Asas bacteriológicas Regla milimetrada Microscopio Estufa a 35oC Cajas con agar (sangre,

chocolate, Muller-Hinton) Caldo de Tripticase soya

Estándar de turbidez Macfarland 0.5

Colorantes para coloración Gram

Peróxido de hidrógeno al 3% Discos de Novobiocina 5mcg

STREPTOCOCCUS Microscopio Estufa a 35oC Bilis esculina Cloruro de sodio al 6.5% Disco de optoquinina Regla milimetrada Asas bacteriológicas Cajas

con agar (sangre) Discos de bacitracina 0.04u Peróxido de hidrogeno Cepa de Staphylococcus

aureus

4. PROCEDIMIENTO

Exudado nasalTomar muestra profunda de ambas fosas nasales con el mismo hisopo, previamente embebido en suero fisiológico estéril.

Exudado faríngeo

Bajo visión directa, con la ayuda del bajalengua, se tocará con el hisopo en todas las partes con exudado, membranas o inflamación. Se deben frotar las criptas tonsilares y la faringe posterior. En lo posible no tocar la mucosa oral, lengua, úvula ni dientes.

STAPHYLOCOCCUSTinción de Gram

Con medios de cultivos ya crecidos realizamos la práctica correspondiente a Sthaphylococcus

Cogemos un asa de siembra, la esterilizamos en el mechero de Bunsen y con dicha asa cogemos una colonia del agar sangre.

Con la ayuda de la asa realizamos un extendido sobre un portaobjetos de la colonia que cogimos.

Realizamos la tinción de Gram y esperamos que se seque la placa. Observamos la placa en el microscopio con la lente de 100x con la

ayuda del aceite de inmersión. Observamos y anotamos la micromorfología de la colonia.

Prueba de la catalasa Colocamos en un portaobjetos limpio una gota de Peróxido de

Hidrógeno Cogemos un asa de siembra, la esterilizamos en el mechero de Bunsen

y con dicha asa cogemos una colonia del agar sangre. Mezclamos la colonia con la gota de Peróxido de Hidrógeno que se

encuentra en la placa y observamos que sucede.

Prueba de la coagulasaRealizar la prueba de la coagulasa la ligada y la libre

En la C. Ligada: Colocamos en un portaobjetos limpio dos gotas de solución salina (una

como prueba y la otra como control). Cogemos un asa de siembra, la esterilizamos en el mechero de Bunsen

y con dicha asa cogemos una colonia del agar sangre. Mezclamos la colonia con la gota de solución salina de prueba que se

encuentra en la placa y colocamos una gota de plasma citratado. Agitamos 10 segundos y observamos que sucede.

En la C. Libre Colocamos plasma citratado en un tubo de ensayo pequeño.

Cogemos un asa de siembra, la esterilizamos en el mechero de Bunsen y con dicha asa cogemos una colonia del agar sangre.

Mezclamos la colonia con el plasma citratado. Agitamos y el resultado se leerá en una hora.

Prueba de sensibilidad Cogemos con el asa de siembra una colonia de Staphylococcus. Introducimos en un tubo con solución salina y homogenizar esta

dilución, debe estar 0,5 en la escala de Macfarland Procedemos a hisopar en el agar Muller-Hinton, el mismo que debe ser

bipetri ya que en el otro lado hisoparemos la dilución del Micrococcus. Colocamos el disco de Bacitracina (0.04 u) y la Novobiocina(30 mct) en

el Micrococcus, también colocamos la Novobiocina(30 mct) en el Sthaphylococcus.

Prueba de Manitol Cogemos con el asa estéril una colonia Realizamos la picada en el tubo con manitol y la estriación.

Guardamos los agares en la estufa a 35oC por 24horas para observar los resultados al día siguiente.

STREPTOCOCCUS

Conseguir muestras de Streptococcus beta-hemolíticos Las muestras que necesitamos son Streptococcus beta- hemolíticos Cogemos una agar sangre y con el asa de siembra esterilizada la

dividimos en la mitad y la parte inferior la dividimos en la mitad, de tal manera que el agar se divide en tres partes

Prueba de CAMP Con un asa estéril cogemos una colonia se Staphylococcus aureus beta-

hemolítico y de manera vertical en la primera división inoculamos. Esterilizamos el asa y cogemos una colonia de Streptococcus beta-

hemolítico del grupo A e inoculamos de manera horizontal al otrolado de la línea verical.

Esterilizamos el asa y cogemos una colonia de Streptococcus beta- hemolítico del grupo B e inoculamos de manera horizontal a un lado de la línea verical.

Prueba de sensibilidad a la optoquina

Usamos la segunda división del agar en la cual mediante un asa estéril, seleccionamos tres o cuatro colonias bien aisladas del microorganismo a probar y estriarlas en la mitad de la división.

Colocamos un disco de optoquinina en el centro del área sembrada Presionamos suavemente el disco sobre el agar Incubamos en la estufa a 35oC durante 24 horas.

Prueba de sensibilidad a la bacitracina

Usamos la tercera división del agar sangre y cogemos tres o cuatro colonias aisladas de Streptococcus beta hemolítico y estriamos el inóculo hasta el centro de la mitad del agar sangre.

Con un hisopo estéril diseminados por la división del agar sangre. Colocamos un disco de bacitracina en el centro del área sembrada Presionamos suavemente el disco con pinzas flameadas sobre el agar. Incubar en la estufa a 35oC durante 24 horas.

Prueba de bilis esculina

Cogemos una colonia del agar sangre con el asa esterilizada Realizamos la picada en el tubo y la estriación.

Resistencia al NaCl Cogemos una colonia homogenizamos bien en el cloruro de sodio al

15%

Guardamos los agares en la estufa a 35oC por 24horas para observar los resultados al día siguiente.

5. RESULTADOS

STAPHYLOCOCCUS

Prueba de Catalasa

Resultado: debido a la aparición de burbujas el resultado es positivo, ya que el peróxido de hidrógeno (H2O2) se convierte en agua y oxígeno.

Prueba de ManitolResultado: la prueba es positiva debido al cambio de color de rojo a amarillo.

Prueba de Coagulasa Ligada

Resultado: La presencia de aglutinación en el portaobjetos a los 20 segundos nos indica que la prueba es positiva.

Prueba de Coagulasa Libre

Resultado: La reacción positiva en tubo se considera cuando se forma el coágulo después de 4 horas.

Resultado: En el agar Muller-Hinton obtuvimos como resultado resitente para la Novobiocina la cual presenta un halo de inhibicion <16 mm y sensible para la bacitracina

STREPTOCOCCUS

Prueba de Bilis esculinaResultado: La prueba es positiva debido al cambio de color a marrón obscuro.

Resultado: El tubo con cloruro de sodio no presenta turbidez se mantiene claro.

Resultado del CampResultado: Se formó las flechas positivo para Beta Hemolítico.

Resultado de la sensibilidad Sensible a la Bacictracina (Halo >18). Resitente a la Optoquinina

6. CONCLUSIONES

Se diferenció la micromorfología de los Staphylococcus (racimos) con los Streptococcus (cadenas) con la ayuda del microscopio.

Se conoció que para diferenciar entre Staphylococcus y Streptococcus debemos realizar la prueba de la catalasa, ya que los Staphylococcus son catalasa positiva, mientras que los Streptococcus son catalasa negativos.

La prueba de coagulasa ya sea ligada o libre es fundamental para la identificación de Staphylococcus

Se determinó que con la prueba de Bilis esculina se identifica Streptococcus y Enterococcus

Se concluyó que una prueba para la diferenciación rápida del Staphylococcus aureus es mediante la prueba de la coagulasa, ya que el S. aureus es el único coagulasa positivo.

7. RECOMENDACIONES

Debemos leer la prueba de la coagulasa a su debido tiempo, ya que si pasa mucho tiempo el coágulo puede disolverse.

Al coger la colonia con el asa de siembra no se debe tomar parte del agar sangre porque la catalasa presente en los eritrocitos pueden producir falsos positivos

Siempre antes de coger una colonia de los diferentes agares se debe esterilizar el asa de siembra para evitar contaminación.

8. BIBLIOGRAFÍA

Pabón, L. (2009). Manual en Prácticas en Bacteriología. Fussion.

Manual of Clinical Microbiology. 7th edition. Edited by Murray P, Baron E.J, Pfaller M, Tenover F, Yolken R. 1999. ASM Press, Washington Pag. 273

Struthers Kelth . (2005). Bacteriologia Clinica. Masson. Capitulos Streptococcus y Sthaphylococcus

http://s-pneumoniae.blogspot.com/

http://es.slideshare.net/kevinemmelarroyogarrafa/11streptococcus

http://www.bvsops.org.uy/pdf/laboratorio.pdf