ENXEÑERÍA XENÉTICAENXEÑERÍA XENÉTICA

¿Que é a enxeñería xenética?¿Que é a enxeñería xenética?

Un conxunto de Un conxunto de técnicas que permiten técnicas que permiten manipular o xenoma manipular o xenoma dun ser vivo, é dicir:dun ser vivo, é dicir:

- Introducir- Introducir

- Eliminar- Eliminar

- Modificar- Modificar

Xenes dun xenomaXenes dun xenoma

¿Cales son as principais ¿Cales son as principais técnicas que emprega a técnicas que emprega a enxeñería xenética?enxeñería xenética?

A tecnoloxía do ADN recombinanteA tecnoloxía do ADN recombinante

A secuenciación do ADNA secuenciación do ADN

A reacción en cadea da polimerasa A reacción en cadea da polimerasa (PCR)(PCR)

A tecnoloxía do ADN recombinanteA tecnoloxía do ADN recombinante

Permítenos illar e manipular un fragmento de ADN, Permítenos illar e manipular un fragmento de ADN, ou sexa, un ou sexa, un xenexene dun organismo, para introducilo dun organismo, para introducilo noutro.noutro.

Require Require encimas de restricciónencimas de restricción, auténticas , auténticas tesouras moleculares utilizadas polas bacterias tesouras moleculares utilizadas polas bacterias para defenderse dos virus.para defenderse dos virus.

¿Como actúan as encimas de ¿Como actúan as encimas de restricción?restricción?

Recoñecen Recoñecen secuencias secuencias palindrómicaspalindrómicas

Cortan o ADNCortan o ADN Se o corte é Se o corte é

escalonado escalonado créanse extremos créanse extremos adhesivos ou adhesivos ou pegañentospegañentos

¿Que pasa se se corta ADN de ¿Que pasa se se corta ADN de especies diferentes coa mesma especies diferentes coa mesma encima de restricción?encima de restricción?

Que os extremos Que os extremos pegañentos únense pegañentos únense entre si e obtemos entre si e obtemos ADN ADN recombinanterecombinante : : ADN formado por ADN formado por unión de dúas unión de dúas moléculas de ADN moléculas de ADN de dous organismos de dous organismos distintosdistintos

Vale, ¿ pero que se fai despois Vale, ¿ pero que se fai despois co ADN recombinante?co ADN recombinante?

Pódense producir Pódense producir organismos organismos transxénicostransxénicos, é dicir, organismos que , é dicir, organismos que portan xenes doutros seres vivos.portan xenes doutros seres vivos.

¿Teñen algunha utilidade os ¿Teñen algunha utilidade os organismos transxénicos?organismos transxénicos?

Si, por exemplo, mediante microrganismos Si, por exemplo, mediante microrganismos modificados xeneticamente obtense:modificados xeneticamente obtense:- Insulina humanaInsulina humana- Hormona de crecemento humanaHormona de crecemento humana- InterferónsInterferóns- VacinasVacinas- Encimas de aplicación industrialEncimas de aplicación industrial

¿Por onde empezamos para ¿Por onde empezamos para obter un organismo obter un organismo transxénico?transxénico?

Primeiro hai que obter un Primeiro hai que obter un clono de clono de xenesxenes, é dicir un conxunto de xenes , é dicir un conxunto de xenes idénticos ó que nos interesa.idénticos ó que nos interesa.

¿Que pasos hai que seguir para ¿Que pasos hai que seguir para clonar un xene e obter o seu clonar un xene e obter o seu produto?produto?

1º) Identificar 1º) Identificar o xeneo xene que dirixe a produción que dirixe a produción da substancia desexada.da substancia desexada.

2º) Illar 2º) Illar o xene do xenoma.o xene do xenoma.

3º) Insertar 3º) Insertar o xene na molécula de ADN o xene na molécula de ADN axeitada: obter ADN recombinante.axeitada: obter ADN recombinante.

4º) Introducir 4º) Introducir o ADN co xene no organismo o ADN co xene no organismo hospedador apropiado.hospedador apropiado.

4ª) Detectar 4ª) Detectar os individuos que conteñen e os individuos que conteñen e expresan o xene.expresan o xene.

5ª) Purificar5ª) Purificar a substancia a substancia

¿Mais como buscamos ¿Mais como buscamos un xene nun un xene nun cromosoma?cromosoma?

Depende:Depende:- Se polo menos coñecemos parte - Se polo menos coñecemos parte da secuencia usaremos as da secuencia usaremos as técnicas de hibridación, con técnicas de hibridación, con sondas de ADN ou de ARN.sondas de ADN ou de ARN.- Tamen podemos partir dun - Tamen podemos partir dun xenoma completo e facer unha xenoma completo e facer unha biblioteca xénica.biblioteca xénica.

Localización de fragmentosLocalización de fragmentos de de ADN mediante unha sonda para ADN mediante unha sonda para hibridaciónhibridación

Construción dunha biblioteca Construción dunha biblioteca xénicaxénica

¿Hai outras maneiras de obter o ¿Hai outras maneiras de obter o fragmento de ADN que contén o fragmento de ADN que contén o

xene?xene?

Hainas:Hainas:- A partir de ADN sintéticoA partir de ADN sintético

- Sintetizando ADNc a partir dun Sintetizando ADNc a partir dun ARNm extraído da célulaARNm extraído da célula

¿Cómo se pode obter ¿Cómo se pode obter ADN a partir do ARN ADN a partir do ARN mensaxeiro?mensaxeiro? Mediante unha Mediante unha

encima presente encima presente nos retrovirus:nos retrovirus:

A A transcriptasa transcriptasa inversa.inversa.

¿Que nome recibe o ¿Que nome recibe o ADN obtido?ADN obtido?

ADN ADN complementariocomplementario

(ADNc)(ADNc)

¿Como debe ser o ADN¿Como debe ser o ADN no que no que se inserta o xene?se inserta o xene?

Este ADN transportador, chamado Este ADN transportador, chamado VECTOR debe cumprir os VECTOR debe cumprir os seguintes requisitos:seguintes requisitos:

- Posuír unha orixe de replicación- Posuír unha orixe de replicación

- Levar xenes marcadores Levar xenes marcadores

¿Que ADNs se usan como ¿Que ADNs se usan como vectores?vectores?

- Plásmidos (de orixe bacteriana)- Plásmidos (de orixe bacteriana)

- ADN vírico- ADN vírico

- Cromosomas artificiais - Cromosomas artificiais (eucariotas)(eucariotas)

¿Qué células serven de ¿Qué células serven de hospedadoras?hospedadoras?

- BacteriasBacterias- LévedosLévedos- Células animaisCélulas animais- Células vexetaisCélulas vexetais

¿E como se introduce o vector ¿E como se introduce o vector na célula hospedadora?na célula hospedadora?

- Por transformaciónPor transformación- Por transduciónPor transdución- Por electroporaciónPor electroporación- Por inxecciónPor inxección- Mediante liposomasMediante liposomas- Mediante “pistola de xenes”Mediante “pistola de xenes”

¿Como comprobamos que o ¿Como comprobamos que o ADN recombinante entrou?ADN recombinante entrou?

Grazas os xenes marcadores:Grazas os xenes marcadores:

Por exemplo xenes de resistencia Por exemplo xenes de resistencia a antibióticos ou xenes de a antibióticos ou xenes de bioluminiscenciabioluminiscencia..

Selección de células Selección de células hospedadoras que ñevan o hospedadoras que ñevan o xene clonadoxene clonado

A secuenciación do ADNA secuenciación do ADN

Permítenos saber a orde ou Permítenos saber a orde ou secuencia dos nucleótidos que secuencia dos nucleótidos que forman parte dun xene.forman parte dun xene.

Protocolo inventado por Protocolo inventado por Frederick Sanger para Frederick Sanger para secuenciar ADNsecuenciar ADN

Secuenciación do ADN

A reacción en cadea da A reacción en cadea da polimerasa (PCR)(Kary Mullis, polimerasa (PCR)(Kary Mullis, 1985)1985)

Permite duplicar un fragmento de Permite duplicar un fragmento de ADN, un número ilimitado de ADN, un número ilimitado de veces, nun tubo de ensaioveces, nun tubo de ensaio

¿E iso para que serve?¿E iso para que serve?

Para conseguir, a partir dunha Para conseguir, a partir dunha mínima cantidade de mostra de mínima cantidade de mostra de ADN, toda a que se necesite para ADN, toda a que se necesite para un determinado estudo. un determinado estudo.

¿Cómo é a reacción?¿Cómo é a reacción?

Un proceso cíclico que pode Un proceso cíclico que pode resumirse nestes pasos:resumirse nestes pasos:

1)1) QuentarQuentar

2)2) CopiarCopiar

3)3) QuentarQuentar

4)4) CopiarCopiar

Asi os ciclos que sexan Asi os ciclos que sexan necesariosnecesarios

1) Quentar a molécula de ADN 1) Quentar a molécula de ADN para desnaturalizalopara desnaturalizalo

2) Cada febra será copiada pola 2) Cada febra será copiada pola Taq polimerasa (ADN Taq polimerasa (ADN polimerasa da bacteria polimerasa da bacteria Thermus aquaticus)Thermus aquaticus)

Resume da técnica de PCRResume da técnica de PCR

¿Qué necesita a Taq para ¿Qué necesita a Taq para realizar a súa función?realizar a súa función?

Cadea molde de Cadea molde de ADNADN Mestura de desoxirribonucleótidos Mestura de desoxirribonucleótidos

trifosfatotrifosfato Cebador (primer): pequeno fragmento Cebador (primer): pequeno fragmento

de de ADNADN complementario dun dos complementario dun dos extremos da cadea moldeextremos da cadea molde