Xenética Molecular

ADN : O portador da mensaxe Xenética

A comezos do século XX descartouse que os Ácidos Nucleicos fosen as moléculas transportadorasda información xenética, debido á súa simplicidade estrutural (catro unidades repetidas) fronte á complexidade das proteínas (vinte unidades básicas).

En 1928 Frederick GRIFFITH realizou unha serie de experiencias coa bacteria que provocaba a pneumonía (Streptoccocus pneumoniae). Illou dúas cepas bacterianas diferentes :

• Bacterias tipo S (Smooth = Liso), que posuían unha grosa cápsula e representaban cepas virulentas, e

• Bacterias tipo R (Rough = Rugoso), que carecían de cápsula bacteriana e correspondíanse con cepas atenuadas

Experimentando con ratos observou que a inoculación de bacterias S vivas provocaba a morte destes animais e que o tratamento con bacterias tipo R vivas ou con bacterias tipo S mortas non afectaba en absoluto á saúde dos ratos.

Con todo, inoculando bacterias S mortas xunto con bacterias R vivas observou coma os ratos enfermaban e acababan morrendo, podéndose recoller dos cadáveres bacterias tipo S vivas.

GRIFFITH concluíu que algunha sustancia das bacterias S transformara ás bacterias R inocuas enbacterias S virulentas.

1 de 34

Xenética Molecular

En 1944 AVERY, McLEOD e McCARTY investigaron as transformacións bacterianas observadas por GRIFFITH en 1928 e demostraron que só os extractos de Bacterias S mortas que contiñan ADN eran capaces de producir a transformación das Bacterias R inofensivas en Bacterias S virulentas.

Con todo, dado que o coñecemento que se tiña da estrutura do ADN era aínda moi impreciso creuse que este podía ser o material hereditario en Bacterias e Virus pero que, por mor da súa aparente simplicidade estrutural, non parecía ser a molécula informativa dos seres vivos superiores.

En 1952 Alfred HERSHEY e Martha CHASE1 levaron a cabo unha serie de experimentos onde se confirmaba que o ADN era o material xenético, algo que xa demostrara en 1944 o experimento anterior de Avery-MacLeod-McCarty.

Hershey e Chase fixeron os seus experimentos no bacteriófago T2, un virus ao que se lle identificara a estrutura recentemente grazas ao microscopio electrónico. O bacteriófago consiste nunha soa cuberta proteica ou cápside que contén o material xenético, e infecta unha bacteria cando se adhire á súa membrana externa, inxecta o material e lle deixa acoplada a cápside. Como consecuencia, o sistema xenético da bacteria reproduce o virus.

Nun primeiro experimento, marcaron o ADN dos bacteriófagos co isótopo radioactivo fósforo-32 (P-32). O ADN contén fósforo, a diferenza dos 20 aminoácidos que forman as proteínas. Deixaron que os bacteriófagos infectasen as bacterias Escherichia coli e posteriormente retiraron as cubertas proteicas das células infectadas mediante unha licuadora e unha centrifugadora. Con iso descubriron que o indicador radioactivo era visible só nas células bacterianas, e non nas cubertas proteicas.

Nun segundo experimento, marcaron os bacteriófagos co isótopo xofre-35 (S-35). Os aminoácidoscisteína e metionina conteñen xofre, a diferencia do ADN. Trala separación, acharon que o indicador estaba presente nas cubertas proteicas, pero non nas bacterias infectadas, co que se confirmou que é o material xenético o que infecta as bacterias.

1 http://osulibrary.oregonstate.edu/specialcollections/coll/pauling/dna/papers/hershey-independent-39.html

2 de 34

Xenética Molecular

Hipóteses sobre o xeito de duplicación do ADN

A estrutura en dobre hélice do ADN permite comprender como dita molécula pode dar lugar a copias exactas sen perder a súa conformación. Para iso, as dúas febras deben separarse e, despois, mediante a acción de enzimas especiais, a partir de nucleótidos soltos e segundo a complementariedadedas bases nitroxenadas, poden ir construíndo as novas cadeas complementarias.

Para explicar este proceso propuxéronse tres hipótese :

1. Hipótese Conservativa ; propón que trala duplicación do ADN quedan, por unha banda, as dúas febras patrón xuntas e, por outro, as dúas novas cadeas formadas

2. Hipótese Semiconservativa (WATSON-CRICK). Segundo esta teoría, nas dúas moléculas de ADN de dobre hélice fillas unha das cadeas sería a antiga (molde) e outra a nova (copia)

3. Hipótese Dispersiva ; supón que as cadeas fillas están constituídas por fragmentos distintos de ADN patrón e de ADN copia

3 de 34

Xenética Molecular

Hoxe en día está comprobada a autenticidade da segunda das teorías, grazas ás experiencias de MESELSON e STAHL en 1958, analizando os resultados de cultivar bacterias Escherichia coli en medios con Nitróxeno pesado (N15) e con Nitróxeno normal (N14).

Cultivaron as bacterias en N15 e observaron a posición que o ADN das novas bacterias ocupaba nos tubos de Cloruro de Cesio tralo seu centrifugado.

A continuación cultivaron estas bacterias nun medio normal con N14 e analizando posteriormente os tubos de ClCs centrifugados observaron que o novo ADN tiña un peso intermedio ao observado paraN14 e N15. Isto descartaba por completo a Hipótese Conservativa.

Separando por desnaturalización as dúas cadeas dos novos ADN observaron que unha era lixeira ea outra pesada, o que eliminaba a Hipótese Dispersiva e confirmaba a natureza híbrida de devanditos ADN.

4 de 34

Xenética Molecular

Dirección de duplicación do ADN

Severo OCHOA, en 1954 illa a enzima polinucleótido fosforilasa, capaz de sintetizar ARN in vitro a partir de ribonucleósido-difosfatos. Este descubrimento deu lugar á preparación de polinucleótidos sintéticos de distinta composición de bases cos que o grupo de Severo Ochoa, en paralelo co grupo de Marshall NIREMBERG, chegaron ao desciframento da clave xenética.

Arthur KORNBERG en 1956 illou en Escherichia coli a primeira enzima capaz de levar a cabo a síntese do ADN : a ADN-polimerase. Para a súa actuación, este enzima require a presenza de desoxirribonucleótidos 5'-trifosfato de Adenina, Guanina, Timina e Citosina, ións Magnesio (Mg2+), unha cadea de ADN que actúe como patrón e unha curta cadea de nucleótidos (a que se vai a alongar) que actúa como cebador ou Primer.

John CAIRNS en 1963, estudando esa mesma especie descubriu a existencia da chamada Forquilla de Replicación (forquita, forqueta, forcada ou garfo) , formada polas dúas novas cadeas de ADN copia que están sendo sintetizadas.

Erroneamente deduciuse que a replicación era unidireccional. Este descubrimento suscitou un novo problema, xa que si as dúas novas cadeas de ADN crecían en paralelo e unha delas facíao en sentido 5'──» 3', a outra tería que facelo no sentido 3'──» 5', o cal sería imposible de explicar, xa que ningunha ADN-polimerase traballa nesa dirección.

A solución obtívoa Reiji OKAZAKI2 en 1968, cando descubriu a existencia duns fragmentos constituídos por uns 50 nucleótidos de ARN e uns 1000 ou 2000 nucleótidos de ADN3. Estes fragmentos se sintetizan,respectivamente, pola ARN-polimerase e a ADN-polimerase en dirección 5'──» 3' sobre diferentes rexións da cadea patrón.

Devanditos fragmentos, tras perder a súa porción de ARN, fusiónanse entre si grazas á actuación da enzima ADN-Ligasa (a mesma enzima que reenche e solda as muescas durante a reparación do ADN), podendo dar a sensación de que a nova febra crece en dirección 3'──» 5'4.

En definitiva, a cadea que se sintetiza no sentido no que se abre a forquita de replicación faino de forma continua (5'──» 3'), mentres que a complementaria crece mediante Fragmentos de Okazaki.

2 Okazaki morreu de leucemia en 1975, debido a forte irradiación que sufriu en Hiroshima, tralo lanzamento da primeira bomba atómica

3 Devanditos fragmentos de ARN e ADN son coñecidos actualmente co nome de Fragmentos de Okazaki.4 Respecto diso podémonos imaxinar como a aglomeración de persoas camiñando cara a adiante en ringleira, diante dun

Cine, forman unha cola que medra cara a atrás.

5 de 34

Xenética Molecular

6 de 34

Xenética Molecular

Mecanismo xeral da duplicación do ADN

O proceso de replicación é similar tanto nos organismos Procariotas como nos Eucariotas : cada cadea da dobre hélice parental sepárase e actúa como molde ou patrón para a síntese dunha nova cadea,que posúe unha secuencia de Bases complementarias.

Desta forma, a dobre hélice desespiraliza as dúas cadeas de polinucleótidos que a configuran grazas á acción da enzima Helicasa; ademais, interveñen outros enzimas, Xirasas e Toposiomerases, que eliminan as tensións producidas nas febras ao desespiralizarse. Posteriormente, en presenza de ADN-polimerase, os nucleótidos libres dispóñense en forma adecuada.

Duplicación do ADN en Bacterias ( Escherichia coli ) 5

A síntese de dúas novas cadeas de ADN consta de tres etapas fundamentais :

1. Desenrolamento e apertura da dobre hélice

A dobre hélice ábrese como unha cremalleira grazas á acción da enzima Helicasa, pero para facilitar o seu desenrolamento interveñen as Xirasas e as Topoisomerases, quen eliminan as tensións xeradas pola torsión das dúas cadeas ao desenrolarse.

A separación das dúas cadeas comeza en puntos concretos do cromosoma chamados orixesde replicación, a partir dos cales fórmanse unhas estruturas, coñecidas como burbullas de replicación, que se estenden ao longo do cromosoma, dando lugar ás forquitas de replicación onde as dúas cadeas do ADN parental están separadas e actúan como patróns para a síntese de dúas novas cadeas de ADN.

2. Síntese de dúas novas cadeas de ADN

En primeiro lugar, unha ARN polimerase, denominada Primasa (ou ADN primasa), sintetiza unha pequena molécula de ARN que servirá posteriormente como cebador (ou primer)da copia de ADN que se vai a realizar. A actuación deste enzima (a diferenza do que lle ocorre á ADN polimerase) non precisa da existencia dunha curta cadea de ácido nucleico que actúe como primer ou cebador.

5 A diferenza fundamental entre a duplicación do ADN en Bacterias e en Eucariotas consiste na existencia nestes últimos de varios lugares diferentes que actúan á vez como orixes da replicación, de maneira que chegan a establecerse ata 100 Burbullas de Replicación distintas.

7 de 34

Xenética Molecular

A ADN-polimerase, utilizando como cebador devandito fragmento de ARN, percorre as cadeas molde e selecciona en cada momento o nucleótido complementario adecuado, catalizando a súa hidrólise e separando un resto pirofosfato (PP) do nucleótido trifosfato, quedando, en consecuencia, o nucleótido monofosfato quen se incorpora na cadea de ADN en formación mediante un enlace fosfodiéster, para o que se utiliza a enerxía desprendida na súa hidrólise.

Ademais de polimerizar, a ADN-polimerase é un autocorrector moi efectivo, pois en cada etapa do proceso de polimerización a enzima "mira" cara atrás antes de incorporar o nucleótido seguinte e, si detecta algún erro no apareamento, elimina o nucleótido erróneo e introduce o adecuado.

A ADN-polimerase só é capaz de sintetizar ADN no sentido 5'──» 3'. A cadea que se sintetiza no sentido en que se abre a forquita de replicación faino de forma continua, mentres que na cadea complementaria vanse sintetizar Fragmentos de Okazaki.

3. Corrección dos erros

A selección de nucleótidos pola ADN-polimerase e a súa actividade autocorrectora (exonucleasa) constitúen mecanismos de prevención de erros, pero, aínda así, cométese un erro de apareamento por cada 10 millóns de bases nitroxenadas. Esta precisión podería ser suficientepara unha Bacteria, cuxo xenoma contén uns tres millóns de pares de bases, pero resulta insuficiente para o xenoma humano, que contén uns 3 mil millóns de pares de bases.

É dicir, un erro por cada 10 millóns de bases supoñería, para o xenoma humano, 300 equivocacións en cada duplicación do ADN, e tendo en conta que durante o desenvolvemento embrionario a partir do cigoto o xenoma duplícase case mil billóns de veces, produciríase a acumulación de 300 mil billóns de erros !!.

Por iso, é evidente pensar na existencia de mecanismos correctores moito máis eficaces, que aseguren unha duplicación do ADN o máis fiel posible. Desta forma existe un complexo multienzimático moi especializado que asegura unha corrección postreplicativa, de maneira que se produce tan só un erro por cada 10 mil millóns de bases unidas.

8 de 34

Xenética Molecular

9 de 34

Xenética Molecular

Telómeros

O telómero é a rexión terminal do cromosoma, composta por ADN moi repetitivo, que non codifica proteínas. Xoga un papel fundamental para evitar a perda de información durante a duplicación do cromosoma. A enzima que replica o ADN, a ADN polimerase, non pode replicar o cromosoma ata o seu extremo, polo que se perde unha parte dese extremo en cada replicación; pero a parte que se perde é a dos telómeros, que non son codificantes, e que por iso se fan máis curtos en cada replicación. Hai probas de que este acurtamento dos telómeros está asociado co envellecemento da célula e do organismo.

Os telómeros acórtanse a causa do mecanismo de replicación do filamento ou fibra retardada ou descontinua do ADN. O ADN en replicación presenta unha fibra líder ou condutora e unha fibra retardada ou descontinua. Isto débese a que a replicación do ADN non comeza polo seu extremo senón en varias rexións máis centrais á vez (orixes de replicación) e todas as ADN polimerases polimerizan en dirección 5'→3' (movéndose sobre o ADN en dirección 3'→5').

Na fibra líder a ADN polimerase pode producir un filamento complementario sen atopar obstáculos, porque avanza de 5' a 3' conforme os enzimas desenredadores da dobre hélice van desenredando o ADN. Polo contrario, na outra fibra, que é antiparalela, a replicación orixina a fibra retardada, porque a enzima debe avanzar pola fibra no sentido contrario en que esta se desenreda, polo que a replicación se fai por fragmentos, chamados fragmentos de Okazaki, xa que despois de sintetizar cada fragmento hai que esperar a que se desenrede outro tramo para facer o seguinte (de aí o retardo). Cada fragmento de Okazaki empézase sintetizando por un primer ou cebador de ARN feito por unha ARN polimerase, porque a ADN polimerase só pode colocar os nucleótidos sobre unha cadea xa existente (non pode colocar o primeiro nucleótido dunha cadea, empezándoa); pero unha vez feito o primer despois a ADN polimerase fai a replicación colocando nucleótidos de ADN a partir do primer.

Os fragmentos de Okazaki teñen pois, inicialmente, unha parte de ARN e outra de ADN. A parte de ARN é substituída por ADN enzimaticamente en cada fragmento (os cebadores desaparecen) e seguidamente unha ADN ligase une por enlace fosfodiéster os fragmentos de Okazaki separados, convertendo a fibra retardada ou descontinua nunha fibra continua. Isto sucede sen problemas en todos os fragmentos de Okazaki, pero non onde aparece o último cebador de ARN. Nesta rexión o ARN do fragmento é destruído por ARNases, pero non se substitúe por ADN coma nos outros, polo que se perde ese cacho de ADN. Isto xera un continuo proceso de acurtamento nesta rexión terminal próxima ao telómero.

A telomerase é unha ribonucleoproteína que contén na súa molécula a secuencia AAUCCC, que ten a capacidade de crear e inserir os fragmentos TTAGGG que se perden en cada división e funciona como unha transcriptasa inversa ou reversotranscritasa, que sintetiza ADN a partir dun molde de ARN.

Moitas células cancerosas derivan de células somáticas, e comprobouse a presenza de telomerase no 75-80% das liñas tumorais. Isto non quere dicir que a telomerase induza o cáncer. De todas formas, sábese que a agresividade das células tumorais está relacionada cos seus niveis de telomerase e que niveis altos deste enzima son indicativos da malignidade do tumor

A presenza dun límite no número de divisións celulares, debido ao acurtamento dos telómeros, foi descuberto por primeira vez por Leonard HAYFLICK. As súas observacións levárono a hipotizar un número máximo preciso de división mitóticas posibles, coñecido como límite de Hayflick.

10 de 34

Xenética Molecular

A correlación entre senescencia celular e o número de Hayflick non foi probada ata 1998, cando se puxeron a punto técnicas que podían ampliar os telómeros, que orixinaban unha notable ralentización da senescenza da célula. O alongamento dos telómeros recibiu moita atención desde entónpola posibilidade de idear técnicas que aumenten a duración da vida. Isto podería facerse coa indución temporal (por vía farmacolóxica) ou permanente (por terapia xénica) da telomerase.

Un estudo feito no verme nematodo Caenorhabditis elegans indica que a extensión dos telómeros pode alongar a vida. Estudáronse dous grupos de vermes distintos, que tiñan como única diferenza a lonxitude dos telómeros. O verme cos telómeros máis longos mostrou, como media, unha esperanza de vida un 20% superior ca a do que non tiña os telómeros modificados.

A principal prevención que mostra a comunidade científica con respecto a este tipo de estratexias é que tales fármacos poderían supoñer un risco canceríxeno. O alongamento da vida dunha célula está, de feito, intrinsecamente correlacionado cun aumento da vulnerabilidade ao cancro.

Por outra parte, o mantemento da lonxitude dos telómeros é un signo distintivo de moitos tipos de cancro nos mamíferos. No home por exemplo, numerosos tumores teñen a capacidade de aumentar a actividade da telomerase, conseguindo unha capacidade de replicación case infinita. Outros tipos de carcinoma, polo contrario, teñen a capacidade de iniciar vías alternativas de alongamento dos telómeros, coñecidas como ALT (do inglés alternative lengthening of telomeres), que implican a transferencia de repeticións teloméricas en tándem entre cromátidas irmás. O mecanismo de activación de ALT non está aínda ben definido.

As técnicas seguras de extensión dos telómeros serán útiles sobre todo no campo da enxeñaría de tecidos, xa que permitirían producir grandes cantidades de células sás e non canceríxenas para utilizalascomo substitutas de tecidos danados, como, por exemplo, tecidos danados por queimaduras.

11 de 34

Xenética Molecular

12 de 34

Xenética Molecular

Expresión da Mensaxe Xenética

CRICK propuxo a denominada Hipótese da Colinearidade na que establecía unha correspondencia entre a secuencia de nucleótidos dun xene6 e a secuencia de aminoácidos da enzima que o xene codificaba.

Diferentes experimentos demostraron que no mecanismo polo cal pasábase dunha secuencia á outra se podían diferenciar dous procesos : un que se realizaba no Núcleo e outro nos Ribosomas.

Transcrición Tradución

ADN ────────────────» ARN mensaxeiro ─────────────» Proteínas

Mecanismo de Transcrición

A Transcrición representa o paso dunha secuencia de ADN a unha secuencia de ARN, xa sexa ARNm, ARNr ou ARNt. Para iso interveñen o ADN, que actúa como molde, ribonucleótidos trifosfato (ATP, GTP, CTP e UTP) e ARN-polimerases7.

O mecanismo da transcrición varía segundo se trate de células eucariotas ou de células procariotas, xa que en eucariotas os xenes están formados por fragmentos nos cales altérnanse rexións carentes de información directa, Intróns, con rexións que posúen información, denominadas Exóns 8.

Ademais, nos Procariotas os procesos de transcrición e tradución teñen lugar á vez e no mesmo lugar (debido á carencia de membrana nuclear), mentres que nos eucariotas son procesos separados tanto temporal como espacialmente.

6 Xene : Segundo unha definición clásica un xene é un factor hereditario que consta dun fragmento curto de ADN cromosómico e que ten un efecto particular sobre o fenotipo. Considérase que devandito fragmento de ADN contén a información para a síntese dunha Proteína.

7 En Eucariotas existen varios tipos de ARN polimerases, como, por exemplo : a ARN-polimerase I, que cataliza a síntese de ARNr, a ARN-polimerase II, que cataliza a síntese do precursor do ARNm, e a ARN-polimerase III, que cataliza a síntese de ARNt, entre outras pequenas moléculas de ARN

8 “ Following their initial discovery, introns and RNA splicing were considered, along with the nuclear envelope, as characteristics that distinguish eukaryotes from prokaryotes (the eubacteria, referred to simply as bacteria, and the archaebacteria,referred to as archaea). This dogma became shaky with the identification of putative introns in tRNA genes of archaea and finally crumbled with the discovery of self-splicing group I introns in the phages of purple bacteria, which was followed by the discovery of group I and group II introns in bacterial cells.” Prokaryotic introns and inteins: a panoply of form and function (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC177115/pdf/1773897.pdf )

13 de 34

Xenética Molecular

Un intrón é unha secuencia de nucleótidos dentro dun xene que se elimina durante a maduración (=splicing 9) do ARN e non está presente no ARN maduro. O termo intrón pode referirse tanto a unha secuencia no ADN dun xene coma á secuencia correspondente nos transcritos de ARN. As secuencias que se unen durante o “splicing” e forman parte do ARN maduro chámanse exóns.

Os intróns atópanse nos xenes da maioría dos organismos e en moitos virus, e están presentes nunha ampla gama de xenes, entre os que están os que xeran proteínas, ARN ribosómico e ARN transferente. Cando as proteínas se xeran a partir de xenes que conteñen intróns, o splicing do ARN ten lugar como unha parte do procesamento do ARN posterior á súa transcrición e anterior á súa tradución. Poden atoparse intróns nos ARN eucarióticos e nos ARNr e ARNt procarióticos.

Tradicionalmente dicíase que os intróns eran fragmentos de ADN carentes de información. Non obstante, esta afirmación é hoxe cuestionada e actualmente ten poucos partidarios. Algúns intróns dos grupos I e II son ribozimas con capacidade de catalizar o seu propio “splicing” fóra do ARN.

Transcrición en Eucariotas

Pódense distinguir unha serie de etapas diferenciadas na síntese do ARNm :

• Iniciación. No proceso de iniciación a ARN polimerase recoñece e únese a unha rexión específica do ADN denominada Rexión Promotora ou Promotor. Ditas secuencias están representadas por TATA 10, a 25 pares do inicio da transcrición cara ao extremo 5', e CAAT, algo máis afastada.

• Alargamento. O proceso de síntese continúa no sentido 5'──» 3', e ao cabo duns 30 nucleótidos engádese unha carapucha formada por 7-Metil-Guanosina-Trifosfato ao extremo 5'.

• Finalización. A finalización da síntese do ARNm parece ser que está relacionada coa secuencia TTATTT. A continuación intervén a enzima poli-A-polimerase que engade ao extremo final 3' un segmento duns 150 a 200 nucleótidos de Adenina, denominado cola de Poli-A.

• Maduración. A maduración do ARNm vén representada pola eliminación dos Intróns grazas á actuación da Ribonucleoproteína Pequena Nuclear (RNPpn). A continuación interveñen ARN-Ligasas específicas que empalman os Exóns.

9 O termo inglés splicing utilízase internacionalmente para referirse ao corte e empalme ou, simplemente, empalme de fragmentos cortados dunha molécula, que se volven a unir cataliticamente, xeralmente eliminando algúns deles. O termoúsase fundamentalmente para referirse aos procesos que teñen lugar durante a maduración do ARN, pero pode falarse desplicing nos seguintes tres casos: splicing de ARN, splicing de proteínas e splicing de ADN.

10 A caixa TATA (tamén chamada TATA box ou caixa de Goldberg-Hogness) é unha secuencia de ADN que se encontra na rexión promotora dos xenes de eucariotas e arqueas. Aproximadamente o 24% dos xenes humanos conteñen unha caixa TATA na parte central do seu promotor. A caixa TATA considérase que é a secuencia promotora central, e constitúe o sitio de unión do factor de transcrición xeral ou de histonas (a unión do factor de transcrición bloquea a unión alí dunha histona e viceversa) e está implicado nos procesos de transcrición da ARN polimerase.

14 de 34

Xenética Molecular

15 de 34

Xenética Molecular

Tradución ou Biosíntese de Proteínas 11

Na biosíntese das Proteínas podemos distinguir diferentes etapas :

1. Activación dos Aminoácidos

Os aminoácidos en presenza da enzima Aminoacil-ARNt-sintetasa e de ATP, son capacesde asociarse a un ARNt específico e dar lugar a un Aminoacil-ARNt, liberándose AMP e PPi, e quedando libre a enzima, que volve actuar.

2. Iniciación da síntese

O ARNm únese á subunidade menor dos Ribosomas; a estes asóciase o Aminoacil-ARNt, grazas a que posúe un triplete de nucleótidos (Anticodón) que se asocia ao primeiro triplete do ARNm (Codón). A este grupo de moléculas úneselles a subunidade maior, formándose o Complexo Ribosómico ou Complexo Activo.

Todos estes procesos están catalizados polos chamados Factores de Iniciación e precisa gasto de GTP. O primeiro triplete que se traduce é o AUG, quen se corresponde coa formilMetionina.

11 Pódese analizar con detalle este proceso empregando o programa gratuíto Codi Genètic, descargable no enderezo http://www.xtec.cat/~jllort1/codi_genetic_castella.htm

16 de 34

Xenética Molecular

3. Elongación da Cadea Polipeptídica 12

O Complexo Ribosómico posúe dous sitios de unión : o denominado Centro Peptidil (centro P), onde se sitúa o primeiro Aminoacil-ARNt, e o Centro Aminoacil (centro A) que representa o lugar de unión de novosAminoacil-ARNt.

A continuación, o radical carboxilodo aminoácido iniciador únese coradical amino do aminoácido seguinte,grazas á actuación da enzima peptidil-transferase.

Desta forma, o Centro P queda cunARNt sen aminoácido; a continuacióndevandito ARNt abandona o Ribosoma.Neste momento prodúcese o proceso de translocación , mediante o cal odipeptidil-ARNt que ocupaba o Centro A pasa agora a ocupar o Centro P,grazas ao movemento do Ribosomasobre o ARNm.

Neste proceso interveñen oschamados Factores de Alongamento,sendo o GTP o encargado de aportar a enerxía necesaria.

12 A lectura do ARNm ten lugar desde o extremo 5' cara ao extremo 3'. O aminoácido que inicia a síntese da proteína (Metionina) representa o extremo Amino da mesma, mentres que o último aminoacido incorporado ao polipéptido representa, xa que logo, o extremo Carboxilo

17 de 34

Xenética Molecular

18 de 34

Xenética Molecular

19 de 34

Xenética Molecular

4. Finalización da síntese

O final da síntese proteica ven condicionado pola presenza dos chamados tripletes sen sentido, que son UAA, UAG e UGA, xa que non existe ningún ARNt cuxo anticodón sexa complementario deles.

Con todo, estes tripletes son recoñecidos polos denominados Factores de Liberación (RF), quen actúan mediante un gasto enerxético (GTP).

Estes factores deliberación instálanse sobre oCentro A e provocan que apeptidil-transferase fagainteraccionar o último grupocarboxilo coa auga, co quequeda liberada a cadeapolipeptídica.

A continuaciónsepáranse as dúassubunidades ribosómicas e oARNm.

En ocasións, moitos Ribosomas podentraballar á vez traducindo unha única moléculade ARNm, para producir, casesimultaneamente, un elevado número demoléculas de proteína.

Así, axiña que o primeiro ribosoma queinicia a síntese desprazouse unha distanciasuficiente sobre o ARNm un segundo complexo de iniciación pode formarse, edespois un terceiro e así sucesivamente.

Esta particular disposición ribosómicaconstitúe os denominados Polirribosomas ou Polisomas.

20 de 34

Xenética Molecular

En RESUME :

21 de 34

Xenética Molecular

O Código Xenético

O Código Xenético reflicte a correspondencia que existe entre determinados tripletes de nucleótidos e os aminoácidos aos que codifican.

Dado que o número de Aminoácidos diferentes nas Proteínas é de 20 13 e os Nucleótidos son tan só 4, é lóxico supoñer que debe producirse a agrupación de polo menos tres nucleótidos por cada aminoácido codificado, xaque :

• Tomando osnucleótidos de dousen dous só se poderíancodificar 16aminoácidos (42)

• Se tomásemos osnucleótidos de tres entres poderíansecodificar 64aminoácidosdiferentes. É dicir, naclave xenética pódeseobservar que paraalgúns aminoácidoshai varios tripletes

13 Os aminoácidos proteicos, canónicos ou naturais son aqueles que están codificados no xenoma; para a maioría dos seres vivos son 20: alanina, arxinina, asparaxina, aspartato, cisteína, fenilalanina, glicina, glutamato, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, prolina, serina, tirosina, treonina, triptófano e valina.Con todo, hai excepcións: nalgúns seres vivos o código xenético ten pequenas modificacións e pode codificar outros aminoácidos. O aminoácido número 21 é a selenocisteína, que aparece tanto en eucariotas como procariotas e arqueas, e o número 22 é a pirrolisina que aparece só en arqueas.

22 de 34

Xenética Molecular

Regulación da Expresión Xenética

As células non están continuamente sintetizando todos os tipos de proteínas sobre as cales teñen información; é evidente, pois, que ten que existir un sistema de regulación eficaz.

Como a cantidade de proteínas sintetizadas depende directamente da cantidade de ARNm presenteno Citoplasma, e como a vida media deste é moi curta (minutos), a cantidade de ARNm sintetizado regula os niveis enzimáticos no medio. É dicir, en principio sería suficiente con regular a síntese de ARNm.

Como en moitas outras áreas de investigación bioquímica, o estudo da regulación da expresión xenética do xene avanzou antes e máis rapidamente en bacterias que noutros organismos experimentais.Moitos dos principios da regulación de xenes en bacterias tamén son relevantes para a comprensión da expresión xénica en células eucarióticas.

Regulación da Expresión Xenética en Bacterias

As células procarióticas teñen secuencias lineais de ADN chamadas operóns. O operón está composto dunha secuencia promotora, seguida por un operador do xene, seguidos dun ou máis xenes estruturais que actúan como modelos para as proteínas.

O operón está controlado por un xene regulador que se pode atopar en outra parte do cromosoma.

Os operóns poden ser de tipo inducido (activados por un substrato) ou represor (desactivado por un produto).

23 de 34

Xenética Molecular

Exemplo : Operón LAC.

En 1961 JACOB e MONOD propuxeron un modelo que explica como se efectúa o control da síntese proteica en Bacterias : o operón . Neste modelo diferéncianse varios tipos de xenes :

• Xene Regulador do operón (Xene I); non ten por que encontrarse en contacto físico co resto dos xenes implicados no proceso. Codifica a síntese dunha proteína represora que pode presentarse en forma activa ou inactiva, e que é o auténtico axente que controla a expresión xénica

• Xene Promotor (Xene P), onde se fixa a ARN-polimerase que determina o inicio da transcrición nos Xenes Estruturais

• Xene Operador (Xene O), ao cal únese o represor . Atópase en contacto físico cos xenesestruturais

• Xenes Estruturais, codifican as proteínas estruturais e as proteínas enzimáticas

O operón lactosa (LAC) é un exemplo de operón inducido. O xene operador está bloqueado por unha proteína represora cando a célula non está en presenza de Lactosa. Cando a lactosa está presente actúa como un inductor, uníndose á proteína represora e impedindo, deste xeito, que este represor actúe sobre o operador.

En ese momento a ARN polimerase pode conectarse ao operador e transcribir a molécula de ARNm e, finalmente, procederase á síntese proteica.

Cando toda a lactosa na célula é catabolizada a proteína represora se conecta de novo ao operador e cesa a produción das proteínas correspondentes.

En definitiva, no caso concreto do operón LAC existe un só xene regulador (Xene I) e tres xenes estruturais : Z (da Galactosidasa), E (da Permeasa) e A (da Transacetilasa).

Cando os niveis de Lactosa son baixos o represor producido polo xene regulador I asóciase ao xene operador O e impide que a ARN-polimerase, que está no xene promotor P, transcriba os xenes estruturais Z, E e A .

Con todo, en presenza de Lactosa o Represor producido polo xene I altérase, de maneira que perde afinidade polo xene operador, e deste xeito lévase a cabo a actuación da ARN-polimerase e, finalmente, a síntese dos enzimas necesarias para provocar a degradación da Lactosa (Galactosidasa, Permeasa e Transacetilasa).

24 de 34

Xenética Molecular

O operón TRP (do triptófano) de Escherichia coli, descuberto en 1953 por Jacques Monod e os seus colegas, foi o primeiro operón represible que se descubriu. Mentres que o operón LAC pode ser activado pola alolactosa, o operón TRP é inhibido polo triptófano. Este operón contén cinco xenes estruturais: trp E, trp D, trp C, trp B, e trp A, que codifican a triptófano sintetase. Tamén contén un promotor ao que se une a ARN polimerase e un operador que bloquea a transcrición cando se une a el aproteína sintetizada polo xene represor (trp R). No operón LAC a alolactosa únese ao represor e impideque este reprima a transcrición dos xenes, mentres que no operón TRP, o triptófano únese ao represor eisto permite que o represor reprima a transcrición dos xenes

25 de 34

Xenética Molecular

AMP Cíclico : o segundo mensaxeiro.

Ademais do control da síntese proteica a cargo do operón, describiuse outro tipo de regulación debida ao AMP cíclico, quen se forma a partir do ATP grazas á acción da enzima Adenilato Ciclasa, que está situada na cara interna da Membrana Citoplasmática.

O AMPc favorece a actividade da ARN-polimerase, de maneira que sen a súa presenza a ARNp ten grandes dificultades para asociarse á súa rexión no xene promotor P.

O adenosín monofosfato cíclico, AMP cíclico ou AMPc (cAMP en inglés) é un nucleótido que funciona como segundo mensaxeiro en varios procesos biolóxicos. É un derivado do ATP, xa que se orixina a partir deste por acción daenzima adenilato ciclase.

No AMPc o seu fosfato nonestablece só un enlace fosfodiéster coOH en posición 5' da ribosa, senóntamén outro co OH en posición 3',creando un ciclo na molécula entre ofosfato e a ribosa, polo que o AMPctamén se chama adenosínmonofosfato-3',5' cíclico.

O AMPc é un segundomensaxeiro, empregado nas rutas detransdución de sinais nas células comoresposta a un estímulo externo ouinterno, como pode ser unha hormonacomo o glicagón ou a adrenalina, quenon penetra na célula e se une a unreceptor de membrana. Adoita estarrelacionado coa activación de diversasproteína-quinases. Regula o paso deCa2+ polos canles iónicos da membrana.

En bacterias, é un regulador catabólico que controla a expresión de xenes regulados por un operónrelacionados coa degradación de azucres en función da concentración de glicosa.

En humanos O AMPc e as súas quinases asociadas funcionan en varios procesos bioquímicos, como a regulación do metabolismo do glicóxeno, azucres e lípidos.

26 de 34

Xenética Molecular

Regulación da Expresión Xenética en Eucariotas

A Iniciación da transcrición é un punto de regulación importante para a expresión dos xenes en todos os organismos. A pesar de que eucariotas e bacterias usan algúns mecanismos básicos de regulación comúns, a regulación da transcrición nos dous grupos é fundamentalmente diferente.

En bacterias, a ARNpolimerase en xeral ten acceso a todos os promotores e poden conectarse e iniciar a transcrición, cun certo nivel de eficiencia, en ausencia de activadores ou represores. O estado fundamental da transcrición é, polo tanto, non restritivo.

En eucariotas, con todo, os promotores están xeralmente inactivos in vivo en ausencia de proteínasreguladoras, é dicir, o estado fundamental é transcricional restritivo.

Esta diferenza fundamental da orixe a, polo menos, catro importantes características que distinguen a regulación da expresión xénica en eucariotas e en bacterias.

1. En primeiro lugar, o acceso aos promotores eucarióticos é restrinxida pola estrutura da cromatina, e a activación da transcrición é asociada con moitas alteracións na estrutura da cromatina na rexión transcrita

2. En segundo lugar, a pesar de que as células eucarióticas teñen mecanismos reguladores tanto positivos como negativos, os mecanismos positivos predominan en todos os sistemas caracterizados ata o de agora. Así, dado que o estado fundamental de transcrición é restritiva, practicamente todos os xenes eucarióticos requiren activación a fin de ser transcritos

3. En terceiro lugar, as células eucarióticas teñen proteínas reguladoras moito máis complexas que as existentes nas bacterias

4. Por último, a transcrición ten lugar no núcleo eucariótico, separadamente da tradución, que acontece no citoplasma

27 de 34

Xenética Molecular

Reacción en cadea da Polimerase (= PCR)

A reacción en cadea da polimerase,coñecida como PCR (do inglés polymerasechain reaction), é unha técnica de bioloxíamolecular desenvolvida en 1987 por Kary MULLIS que ten como obxectivo obter ungrande número de copias dun fragmento deADN particular, partindo dunha cantidademínima. En teoría abondaría partir dunha únicacopia dese fragmento orixinal, ou molde.

Esta técnica serve para amplificar unfragmento de ADN. A súa utilidade é que tralaamplificación é moito máis fácil identificarcunha moi alta probabilidade, virus ou bacteriascausantes dunha enfermidade, identificarpersoas (cadáveres) ou facer investigaciónscientíficas sobre o ADN amplificado. Estes usosderivados da amplificación fixeron que seconverta nunha técnica moi utilizada, o quesupuxo o abaratamento do equipo necesario paralevala a cabo.

Esta técnica fundaméntase na propiedadenatural das ADN polimerases de replicar fibrasde ADN, para o cal se empregan ciclos de altase baixas temperaturas alternadas para separar asdúas cadeas do ADN acabado de formar trascada fase de replicación e, seguidamente, deixarque as fibras de ADN volvan a unirse para poderduplicalas novamente.

Inicialmente a técnica era lenta, xa que aspolimerases se desnaturalizaban ao realizar oscambios de temperatura e era necesario engadirnovas polimerases en cada ciclo.

Como as temperaturas ás que funcionaba ociclo (95 °C nas fases de desnaturalización doADN) supoñen a inmediata desnaturalizacióndas proteínas hoxe en día empréganse ADNpolimerases termoestables, extraídas demicroorganismos (Arqueas) adaptados a vivir aesas temperaturas, restritivas para a maioría dosseres vivos.

28 de 34

5'

5'3'

3'

1 Denaturation

5'

5'3'

3'

+

5'

3'

3'

5'

2 Annealing

5'3' 5'

3'

3

Elongation

5'

3'

3'

5'3' 5'

3'5'

15' 3'

3' 5' 3' 5'

3'5'

2

+ +

&

3

5' 3'

3' 5'

3' 5'

3'5'

3'5'

3' 5'

3' 5'

3'5'

1 32 &,

1 32 &,

Exponential growth of short product

Xenética Molecular

MUTACIÓNS

Tanto durante a duplicación do ADN como durante os procesos de transcrición e tradución ocorreun indeterminado número de erros. De forma particular os erros ocorridos durante a replicación do ADN no proceso de formación de gametos son cruciais para explicar os mecanismos evolutivos, de forma que si non existisen as mutacións (cambios herdables na información xenética) non habería evolución.

Pequenas alteracións no material xenético con frecuencia conducen a cambios observables na forma e/ou función do individuo. É dicir, a detección dunha mutación depende da nosa habilidade para observar os seus efectos fenotípicos.

Todas as mutacións, sexan ou non facilmente detectables, son alteracións da secuencia de nucleótidos do ADN.

Dependendo da extensión da alteración podemos distinguir dous tipos fundamentais de mutacións :

➢ Mutacións Puntuais ou Xénicas

◦ Moitas mutacións puntuaisconsisten na substitución dunhabase por outra no ADN e, porconseguinte, no ARNm. Confrecuencia, esta substitucióncambia a mensaxe xenética deforma que un aminoácido écambiado por outro na proteínafinal. Unha mutación deste tipopode causar a total inactividade daproteína sintetizada, aínda que confrecuencia o efecto é só reducir aeficiencia da mesma.

◦ Outro tipo de mutacións puntuaisconsisten na inserción ou eliminación de pares de bases, o que provoca, normalmente, unha grave alteración da mensaxe xenética, de maneira que un organismo que leve unha mutación deste tipo só poderá sobrevivir si o produto do xene afectado non é unha parte esencial da maquinaria celular ou ben si posúe outra copia intacta de devandito xene.

Por outra banda, ademais destas mutacións, producidas de forma normal cando se leva a cabo a duplicación do ADN, poden producirse mutacións análogas debidas á presenza de sustancias estrañas, denominadas mutáxenos.

29 de 34

Xenética Molecular

➢ Mutacións Cromosómicas

Ademais das mutacións puntuais que afectan á disposición dun número reducido de pares de bases existe outro tipo de mutacións que poden alterar de xeito moi importante a estrutura dos cromosomas e, como consecuencia, poden afectar de forma significativa a viabilidade do individuo portador.

◦ Delecións; representan unha eliminación de parte do cromosoma, causando a morte a non ser que esta perda afecte a xenes non imprescindibles para o metabolismo ou ben si está presente outra copia intacta de devanditos xenes na mesma célula.

◦ Duplicacións, que poderían ocorrer si as moléculas irmás producidas durante a replicación do ADN rompesen en diferentes posicións e despois, estes fragmentos, se uniran por sitios equivocados. Desta forma, unha das moléculas producidas por este mecanismo perdería un segmento de ADN e a outra presentaría unha dobre copia da información perdida pola anterior.

◦ Inversións, producidas pola separación dun fragmento de cromosoma e a súa unión posterior no mesmo cromosoma pero de forma invertida. Está claro que si unha inversión seproducira nun segmento de ADN que codifique para unha proteína esta verase drasticamente afectada.

◦ Translocacións; ocorren cando un cromosoma perde un fragmento e este vai parar a outro cromosoma. Inicialmente non hai cambio na dotación xenética, salvo a redistribución dos xenes. Con todo as translocacións poden provocar sinapses durante a Meiose, podendo conlevar Aneuploidías de irreparables consecuencias.

30 de 34

Xenética Molecular

31 de 34

Xenética Molecular

32 de 34

Xenética Molecular

➢ Mutacións Xenómicas ou Numéricas

As mutacións xenómicas ou numéricas consisten na alteración do número de cromosomas dunha especie, xa sexa por exceso ou por defecto, polo que se poden detectar facilmente ao estudar o cariotipo14 dun individuo. Estas mutacións producen sempre alteracións graves xa quecada cromosoma é portador dun elevado número de xenes. As máis tolerables son as que afectan a cromosomas pequenos.

Distínguense dous tipos de mutacións xenómicas : euploidías e aneuploidías. A ploidía é onúmero de conxuntos de cromosomas nunha célula.

A maioría dos organismos eucariotas teñen células haploides e diploides. As haploides teñen a metade de cromosomas ca as diploides. Por exemplo, os humanos producimos células sexuais ou gametos (espermatozoides e óvulos) haploides, que teñen un xogo completo de cromosomas, que no ser humano son 23. Durante a fecundación os gametos fusiónanse formando o cigoto, que levará o conxunto de 23 cromosomas do espermatozoide e o conxunto de 23 cromosomas do óvulo; estes conxuntos son iguais ou homólogos (porén, no home os cromosomas X e Y non son totalmente idénticos). O cigoto ten 46 cromosomas (23 pares de homólogos) e orixinará todas as células somáticas do novo individuo, que serán diploides. O número haploide (n) é o número de cromosomas presente nos gametos. Unha célula somática normalmente ten o dobre de cromosomas ca o número haploide, polo que é 2n (diploide).

O número monoploide (x) é o número de cromosomas distintos nun conxunto completo de cromosomas. En especies como a humana, o número haploide (n) coincide co número monoploide (x), polo que n = x = 23. Polo contrario, nas especies poliploides ou que se orixinaron como híbridos doutras especies anteriores os números haploide e monoploide son distintos.

◦ Euploidías; correspóndense cunha alteración no número de “xogos” cromosómicos.

▪ Monoploidía , unicamente existe un xogo cromosómico completo, é dicir n cromosomas

▪ Poliploidía , a anomalía consiste na existencia de máis de dous xogos cromosómicos. Porexemplo, triploidías (3n) ou tetraploidías (4n)

◦ Aneuploidías. Non existe alteración do número de xogos cromosómicos completos. Só faltaou sobra algún cromosoma.

As aneuploidías prodúcense pola fusión dun gameto normal (con n cromosomas) con outro que posúe n – 1 , n + 1, ou n + 2 cromosomas.

14 O cariotipo (do grego karyon = gran, semente, núcleo) é o número e aparencia dos cromosomas no núcleo dunha célula eucariótica. O termo tamén se usa para designar o conxunto de cromosomas dunha especie, ou un determinado individuo. Os cariotipos describen o número de cromosomas e a forma, tamaño e caracterísitcas morfolóxicas de cada unvistas ao microscopio. É especialmente importante o tamaño, a posición do centrómero, patrón de bandas, diferenzas entre os cromosomas sexuais, e outras características físicas como a existencia de constricións secundarias e porcións satélites

33 de 34

Xenética Molecular

As aneuploidías poden ser :

▪ Nulisomía , (2n – 2) cromosomas. Falta unha parella cromosómica, polo que esta alteración ten efectos letais

▪ Monosomía (2n -1) cromosomas. Falta un cromosoma dunha determinada parella

▪ Trisomía (2n + 1) cromosomas. Un cromosoma aparece por triplicado

▪ Tetrasomía (2n + 2) cromosomas. Existen catro exemplares dun determinado cromosoma

34 de 34