MUTACIÓNS E ENXEÑERÍA XENÉTICA

Profesor: Adán Gonçalves

1. AS MUTACIÓNS

As mutacións son os cambios aleatorios que se producen no ADN dun

organismo. Constitúen unha fonte de variabilidade xenética esencial no

proceso evolutivo.

As mutacións poden producirse de xeito natural (mutacións

espontáneas) ou poden ser inducidas por distintos axentes

mutaxénicos que poden ser físicos (radiacións) ou químicos (drogas e

fármacos).

En todo caso en xeral podríamos decir que as tasas de mutación son

baixas, aínda que depende de cada organismo e da rexión do xenoma

que se trate.

Por exemplo, en mamíferos establécese en 1 de cada 2,2 ∙ 109 bases

nucleotídicas.

Tipos de Mutacións

Segundo o efecto sobre o individuo

- Prexudiciais: confiren unha desvantaxe para a supervivencia.

- Beneficiosas: aumentan a probabilidade de supervivencia

proporcionando variabilidade á poboación.

- Neutras: non afectan a supervivencia.

Segundo as células afectadas

- Somáticas: afectan ás células somáticas e aínda que poden

xerar alteracións graves como o cancro non son herdables.

-Xerminais: afectan aos gametos ou ás células nai dos gametos.

Non se manifestan no individuo, pero sí na descendencia, son

herdables.

Tipos de Mutacións

Segundo a extensión do material xenético afectado

- Xénicas: afectan a secuencia de nucleótidos dun xene

determinado. Poden ser: por substitución (de unha base por

outra), por delección (perda dunha base), por inserción (adición

dunha base).

- Cromosómicas: afectan a amplas zonas dentro dun

cromosoma. Poden ser: por deleción, por duplicación, por

inversión ou traslocación.

- Xenómicas: afectan ao número total de cromosomas. Hai dous

tipos: aneuploidías (afectan ao nº, pero non atinxen ao xogo

completo) e euploidías (afectan alomenos a un xogo completo).

ANEUPLODÍAS máis importantes

Nulisomías: ningún cromosoma do xogo.

Monosomías: só un cromosoma do xogo. Síndrome de Turner.

Trisomías: hai tres cromosomas en lugar dun par. Síndrome de Down.

EUPLOIDÍAS

Monoploidías: un xogo

Poliploidías: máis de dous xogos. Adoita diferenciarse en aloploidías

(proceden de especies diferentes) e autoploidías (da mesma especie).

MUTACIÓNS CROMOSÓMICAS

Tipos de axentes mutaxénicos

Mutáxenos físicos: dous tipos.

• Non ionizantes: por exemplo son as radiacións ultravioleta.

• Ionizantes: rayos X e rayos γ, e corpusculares de partículas α e β.

Ambas pueden provocar entre otros efectos tautomería (cada base ten dúas

formas unha normal e outra anormal, se se produce este cambio o

emparrellamento entre bases non se produce).

Mutáxenos químicos: distintas substancias que provocan tres efectos

basicamente:

•Modificacións das bases nitroxenadas: por exemplo o HNO2 provoca a

eliminación de grupos amino.

•Substitución por un análogo de base: por exemplo o 5- bromuro uracilo

substitúe a timina.

•Intercalación de moléculas que modifican a pauta de lectura.

2. MUTACIÓN E CANCRO

ONCOXENES

Actualmente está claro que o cancro é un defecto xenético. Os cancros

teñen moitas causas, pero en última instancia todas elas exercen a súa

acción sobre unha clase especial de xenes coñecidos como xenes do cancro

ou oncoxenes xeralmente relacionados co control do ciclo celular.

O xene normal denomínase protooncoxene e a súa mutación é o oncoxene.

A alteración das funcións dun oncoxene produce as dúas principais

caraterísticas do cancro:

A división incontrolada que orixina un grupo de células de crecemento

excesivo chamado tumor.

A dispersión das células tumorais por todo o corpo ata formar novos

tumores coñecidos como metástase.

2. MUTACIÓN E CANCRO

XENES SUPRESORES DE TUMORES

Estes xenes codifican proteínas inhibidoras da mutación celular. A súa

mutación e ausencia destas proteínas estimula un aumento no ritmo

reprodutor das células.

PREDISPOSICIÓN XENÉTICA

Sábese que certos cancros teñen maior prevalencia en certas familias. Por

exemplo unha predisposición autosómica recesiva ao cancro de pel coñecida

como xeroderma pigmentosum débese unha mutación que afecta o sistema

de reparación do DNA, os individuos heterocigóticos presentan un alelo

“normal” capaz de codificar correctamente a proteína reparadora, pola

contra os homocigóticos co alelo mutado carecen desta capacidade e as súas

células epidérmicas exposta a uv non reparan os danos padecendo

numerosas lesións tumorais epidérmicas.

AXENTES CANCERÍXENOS

Hai moitos axentes mutaxénicos que poden favorecer a aparición dun

cancro, son os denominados axentes canceríxenos.

Hainos físicos ( como determinadas radiacións) ou químicos ( como

contaminates atmosféricos, aditivos alimentarios...)

A exposición a estes axentes aumenta a probabilidade da persoa de

padecer algún tipo de cancro. Son importantes no grao de risco o tempo de

exposición e a dose.

2. MUTACIÓN E CANCRO

A biotecnoloxía é a utilización de seres vivos, ou parte deles, para obter

produtos de interese (comercial, terapéutico…)

O termo é relativamente novo e foi empregado por primeira vez en 1919

polo agrónomo Karl Ereky no seu libro Biotecnoloxía na produción cárnica e

láctea.

Pero en realidade levamos facendo biotecnoloxía séculos, cando facemos

selección do gando ou producimos pan, queixo, cerveza ou viño.

3. BIOTECNOLOXÍA

Aplicacións da Biotecnoloxía

Produción de substancias terapéuticas como a insulina que é o

primeiro produto da Biotecnoloxía moderna que se comercializou.

Produción de alimentos mellorando algún aspecto do noso

interese, resistencia a plagas, crecemento rápido…

Biorremediación, utilización de fungos e bacterias para eliminar

substancias contaminantes do medio, como pesticidas ou

hidrocarburos.

Produción de enerxía, un exemplo é o bioetanol obtido pola

fermentación da cana de azucre.

3. BIOTECNOLOXÍA

A enxeñería son un conxunto de técnicas que permiten a

manipulación do ADN dun organismo para conseguir un obxectivo

concreto.

Lévase a cabo mediante transferencia dun ou máis xenes dun

organismo a outro sexan ou non da mesma especie. O organismo así

obtido denomínase organismo transxénico xa que o seu xenoma foi

modificado co doutro organismo.

O ADN obtido artificialmente pola unión de ADN de orixes diversos

denomínase ADN recombinante.

Por iso adoitamos referirnos ás técnicas de enxeñería xenética como

técnicas do ADN recombinante.

4. ENXEÑERÍA XENÉTICA

A TECNOLOXÍA DO ADN RECOMBINANTE

Cara aos anos 70 os coñecementos en Bioloxía Molecular permítennos ir avanzando

ata situación actual. Hoxe somos capaces de manipular os xenes a nosa vontade

grazas ás técnicas do ADN recombinante.

Ferramentas das técnicas do ADN recombinante:

Enzimas de restricción: proteínas especiais que nos permiten “cortar” o ADN en

lugares específicos (secuencias palindrómicas chamadas sitios de restricción)

ADN ligasas: permiten “pegar” fragmentos de ADN.

Vectores de transferencia ou clonación: un exemplo son os plásmidos (pequenas

moléculas de ADN circular que nos permiten “copiar” as secuencias de ADN que nos

interesen). Podemos meter neles un fragmento de ADN que nos interese e coa

duplicación do plásmido tamén se farán copias do noso fragmento. Outros exemplos

de vectores son o ADN de certos virus (como o fago λ).

Un proceso chamado transformación permítenos insertar plásmidos en bacterias que

se copiarán cada vez que a bacteria se divide.

Vectores de clonación para procariotas

Plásmidos: moléculas de ADN circular dobre con replicación

independente do cromosoma bacteriano. Adoitase empregar plásmidos R

que levan resistencia a antibióticos para poder seleccionar as bacterias

que incorporaron o fragmento de interese.

Fagos: son virus que infectan bacterias. Manipúlase o seu ADN para

insertar o fragmento de interese. O máis empregado é o fago λ que infecta

a E. Coli.

Cósmidos: plásmidos sintéticos resultado da hibridación de plásmidos e

o fago λ. Pemiten insertar fragmentos máis grandes.

Vectores de clonación para eucariotas

Microinyección: cunha microagulla introducimos ADN que atravesa a membrana

celular ou nuclear.

Electroporación: introducimos ADN foráneo grazas ao aumento da permeabilidade

de membrana ao xerar un campo eléctrico. En células con parede debemos obter

previamente un protoplasto (células sen parede).

Plásmidos de fermentos e YAC´S: temos xerado plásmidos híbridos de fermentos e

bacterias e cromosomas artificiais de fermentos que se comportan normal na mitose.

Os YAC´S permiten a inserción de fragmentos de ADN máis grandes que nos

plásmidos ou cósmidos vistos antes e ademais como os fermentos son eucariotas

realizan os procesos de maduración do transcrito 1º indispensable en calquera

eucariota.

O plásmido Ti en vexetais: Agrobacterium tumefaciens de xeito natural provoca

tumores en plantas. Para facelo inserta este plásmido no ADN vexetal. Para aplicalo

retiramos esta facultade do plásmido e conservamos a súa capacidade de insertarse

no ADN vexetal co ADN foráneo que nos interesa.

TÉCNICA DO ADN COMPLEMENTARIO

Un dos obxectivos primordiais da enxeñería xenética é conseguir cultivar

bacterias que fabriquen masivamente xenes de interés de xeito rendible.

Moitos destes xenes proceden de células eucariotas que por suposto posúen

intróns.

As bacterias carecen de enzimas capaces de eliminalos, para resolver este

problema emprégase a técnica do ADN complementario:

1) Se ailla ARNm maduro da proteína que interesa

2) Se obtén unha febra de ADN complementario coa retrotranscriptasa a

partir de ARN.

3) Cunha ADN polimerasa sintetizamos a dobre febra a partir deste molde.

Obtendo un ADN de dobre febra (ADNc) sen intróns porque procede de

ARNm maduro.

Como se leva a cabo o proceso DA CLONACIÓN?

1. Localización e illamento do xene ou xenes a transferir: as enzimas de

restricción cortan en sitios específicos.

2. Selección do vector: depende do tamaño do fragmento cortado e das

enzimas de restricción utilizadas (deben ser as mesma as do vector que

as que cortan o fragmento que nos interesa).

3. Unión do ADN de interese ao ADN vector: facémolo a través das

enzimas ADN-ligasas. Formamos ADN recombinante.

4. Inserción deste ADN recombinante na célula hospedeira.

5. Multiplicación do organismo transxénico: a división da célula (que trae

consigo a anterior duplicación do ADN) permítenos obter copias (clons)

do ADN desexado.

O ADN recombinante podémolo

definir como ADN sintetizado

pola unión de ADN de diferente

orixes.

Como resultado de aplicar estas

técnicas á obtención de produtos

comerciais xurde en 1975 unha

nova industria: a Biotecnoloxía.

O primeiro produto que se

fabricou foi a insulina humana,

logo viñeron moitos máis avances

neste eido: a produción de

interferón ou da GH, o deseño de

plantas resistentes a plagas ou a

fabricación de células nai .

PROYECTO DE INGENIERÍA GENÉTICA

Plásmido híbrido

ADN vírico

Plásmido bacteriano

Virus de la hepatitis B

Proteínas víricas

Plásmido híbrido

introducido en la célula

Las proteínas

inducen la producción

de anticuerpos

La vacuna

produce inmunidad

contra la hepatitis B

A REACCIÓN EN CADEA DA POLIMERASA (PCR)

É unha técnica para replicar ADN in vitro en grandes cantidades

empregando ADN polimerasas de microorganismos termófilos.

Foi desenvolvida por Kary Mullis en 1986.

Consiste na repetición de ciclos de replicación. Cada ciclo consta de:

1. Desnaturalización do ADN que se vai clonar (DNA diana) mediante altas

temperaturas para que se separe a dobre hélice.

2. Hibridación con cebadores (DNA monocatenario específico) a ambolos

dous lados do segmento que queremos clonar (copiar).

3. Elongación da cadea. A ADN polimerasa sintetiza unha cadea sinxela de

ADN en dirección 5´-3´ en cada febra de ADN.

ANTICORPOS MONOCLONAIS

Cando un axente estrano (que porta un antíxeno) entra no corpo o sistema

inmunitario o detecta e os linfocitos B producen anticorpos específicos

contra el.

Nos 80 conseguimos obter os denominados anticorpos monoclonais,

anticorpos moi específicos contra un só tipo de antíxeno. Obtivémolos

fusionando linfocitos B con células tumorais (hibridomas). Os hibridomas

producen Ig e se dividen incesantemente. Son moi empregados en

investigación e diagnóstico (con anticorpos fluorescentes), pero cada vez

máis en tratamentos sobre todo contra o cancro ao producir Ig específicas

contra os marcadores que presentan nas membranas as células tumorais.

APLICACIÓNS DA ENXEÑARÍA XENÉTICA

Como vimos, a enxeñería xenética permítenos fabricar ADN recombinante

que transferido a unha célula en cultivo pode expresar o xene que nos

interese.

As principais aplicacións son:

Obtención de fármacos: como a insulina, moitas vacinas, factores

coagulantes…

Mellora na produción agrícola e animal:

- En plantas xenes resistentes a plagas ou a herbicidas; xenes

que aumentan o valor nutricional; xenes de crecemento rápido; de

resistencia a sequía; atraso na maduración…

- En animais, xenes de crecemento, de produción hormonal…

Terapia xénica: tratamento de enfermidades provocadas por unha

alteración xenética: parkinson, diabetes, algúns tipos de cancro… Unha

das primeiras aplicacións foi no tratamento dos “nenos burbulla”.

A terapia xénica permite substituir

o xene defectuoso por un normal

que producirá a proteína correcta

correxindo a alteración. Para a

inserción empréganse retrovirus.

Pode realizarse de dous xeitos: “in vivo” (introdúcese no paciente o vector co

xene normal) ou “ex vivo” (extráense células do paciente co xene defectuoso

e transfírense os xenes desexados, depois introdúcense de novo no

paciente)

APLICACIÓNS DA ENXEÑARÍA XENÉTICA

OS TRANSXÉNICOS

A nosa especie selecciona organismos dende hai miles de anos mediante a

domesticación de animais e o cultivo de plantas; é o que denominamos

selección artificial.

Agora, ademais a Biotecnoloxía permítenos obter variantes de interese

mediante a introdución na especie dun xene foráneo orixinando os

chamados organismos modificados xenéticamente (OMX) ou transxénicos.

A utilidade dos transxénicos é indudable como acabamos de ver, pero o

uso da Biotecnoloxía tamén ten os seus riscos:

A perda da Diversidade Xenética, sobre todo coas plantas transxénicas.

O “salto” de xeito accidental dos xenes transferidos a especies silvestres

ou tradicionais.

Prexuícios para a saúde, polo do agora só se detectaron problemas

alérxicos, pero as consecuencias de introducir xene alleos teñen un risco

potencial todavía imposible de determinar.

A modificación xenética permite que o OMX teña algunha característica

desexable ou produza unha substancia de interese.

Nos alimentos as melloras habituais son:

Atraso na maduración o que aumenta a durabilidade do produto. Por

exemplo o tomate Flavr Svr.

Mellora das cualidades organolépticas, por exemplo café máis aromático

e con menos cafeína.

Produción de substancias, por exemplo patacas que imunizan contra o

cólera ou as diarreas bacterianas.

Resistencia a herbicidas e plagas, que favorecen o rendemento nas

colleitas e diminúen o uso de plaguicidas que poden xerar problemas

medioambientais. Por exemplo millo resistente a insectos.

OS TRANSXÉNICOS

O cigoto é unha célula que ten o potencial

de rexenerar un individuo completo. Esta

célula divídese ata dar lugar a novas

células que se diferencian e especializan,

adquirindo forma e funcións particulares.

Á vez que se especializan, perden a

capacidade de dividirse.

O termo células nai emprégase para facer

referencia a células non especializadas,

con capacidade para:

•Multiplicarse orixinando novas células

non especializadas.

•Dar lugar a células que se diferencien e

orixinen células especializadas.

CÉLULAS NAI E CLONACIÓN

Tipos de células nai

As células nai poden clasificarse en:

•Totipotentes. Son as que poden dar lugar a un

individuo completo. Son células totipotenciais o cigoto e

as oito primeiras células que resultan da súa división.

•Pluripotentes. Son as que non poden dar lugar a un

individuo completo, pero si orixinar calquera dos tipos

de células que o forman. As células do interior do

blastocisto tardío son pluripotentes.

•Multipotentes. Son as que poden orixinar algúns

tipos de tecidos, pero non todos. As células da medula

ósea son multipotentes.

•Oligopotentes. Só poden orixinar un ou uns poucos

tipos de células. Un exemplo de células oligopotentes

son as células nai da pel ou do tecido nervioso.

Segundo a súa procedencia, existen

diferentes tipos de células nai:

•Células nai embrionarias,

procedentes de embrións excedentes

de fertilizacións in vitro.

•Células nai procedentes de cordón

umbilical ou de adultos.

•Células nai inducidas. Son células

obtidas de células adultas e

modificadas para transformalas en

células nai. Están aínda en fase de

investigación, xa que a súa obtención

é moi recente (2007).

1. Obtense unha célula diferenciada

do individuo que se quere clonar

(ovella de cara branca).

2. Extráese un óvulo dunha femia

doadora (ovella de cara negra).

3. Elimínase o núcleo do óvulo.

4. Transfírese o núcleo da célula

diferenciada ao óvulo sen núclo.

5. Cultívase a célula ata que se

desenvolva o embrión.

6. Despois de que acada o estadio de

mórula, transfírese ao útero da nai

receptora (ovella de cara negra).

7. Despois do período de xestación,

nace un novo individuo, que é un

clon do que proporcionou o núcleo

(ovella de cara branca).

A clonación da ovella Dolly por transferencia nuclear (1996) Nacemento de Dolly

CLONACIÓN REPRODUTIVA E TERAPÉUTICA

Posibles aplicacións da clonación

•Agricultura e gandería. Obtención de animais ou plantas que

posúan algunha característica de interese.

•Investigación. Dispoñer de animais idénticos é interesante para

poder utilizalos como modelo de enfermidades humanas.

•Ecoloxía. Conservación de especies en perigo de extinción ou

recuperación de especies extintas.

•Medicina. Obtención de órganos para transplantes.

•Ningunha lexislación permite a clonación humana con fines reprodutivos. Nos

se considera éticamente aceptable, xa que atentaría contra a dignidade e

individualidade das persoas.

•Nalgúns países está permitida a clonación con fins terapéuticos (para a

obtención de células nai).

•Para moitas persoas, estas prácticas son inadmisibles por razóns relixiosas.

•En España non está permitida a clonación humana reprodutiva, pero sí a

terapéutica con moitas restriccións (Lei de investigación Biomédica de 2007). Si

se permite a investigación con ovocitos ou preembrións sobrantes de procesos de

reprodución asistida, coa finalidade de obter células nai con fins terapéuticos. A

normativa é moi estrita e inclúe a autorización, caso por caso, da investigación

proposta.

Os avances na obtención de células nai inducidas a partir de células diferenciadas

permite salvar o rexeitamento por parte do sector da sociedade que condena a

utilización de embrións.

Aspectos éticos relacionados coa clonación e a obtención de células nai

O Proxecto Xenoma Humano comezou en 1990 liderado por James Watson

(codescubridor da dobre hélice de ADN) e levado a cabo pola colaboración internacional.

Perseguía dous obxectivos:

•Identificar os xenes e en que cromosoma se atopaban.

•Determinar a secuencia exacta de nucleótidos de cada xene para saber a proteína

codificada e as súas alteracións.

Tamén se estableceu como parte do proxecto un Programa sobre as implicacións éticas

e sociais desta labor.

Watson desvinculouse do proxecto por filtracións dun dos fundadores do proxecto,

Craig Venter.

C. Venter fundou a empresa Celera Genomics de capital privado e iniciou a

secuenciación en 1999 cunha nova estratexia e obtendo un “borrador” xa no 2000.

Esto acelerou o traballo do consorcio público e en 2003 o PXH anunciou a

secuenciación completa. O PHX tamén permitíu secuenciar o xenoma doutros

organismos (M. musculus, Drosophila melanogaster…)

5. O PROXECTO XENOMA HUMANO

Actualmente practicamente todo o xenoma humano está secuenciado. Os

resultados máis destacados son:

O noso xenoma ten uns 25000 xenes (menos dos que estimabamos), un

número comparable ao existente en xenomas máis pequenos. Por tanto, non

hai unha relación directa entre a complexidade dun organismo e a cantidade

de ADN.

Moitos dos xenes que posuímos parecen proceder de virus e bacterias.

Todos nós compartimos o 99,99% do noso xenoma, polo que non ten

sentido falar de razas.

Numerosos xenes están implicados na síntese de moitas proteínas, non

dunha soa ( a teoría un xene-unha proteína quedou xa anticuada).

Só o 2% dos xenes participa na síntese proteica; o resto son interrupcións

na secuencia, teñen funcións de regulación e de outros descoñecemos a súa

función.

5. O PROXECTO XENOMA HUMANO

6. PROTEÓMICA E XENÓMICA

A Xenómica é unha das áreas con maior proxección na Bioloxía Molecular

e ten por obxecto predecir a función do xenoma (o conxunto de xenes dun

organismo) en base a súa secuencia e a interacción con outros xenes.

Actualmente sabemos que non só importa a secuencia, senón tamén a

posición dos xenes, o grao de conservación entre especies, as interaccións

entre xenes.

De feito, moitas características, incluidas enfermidades son polixénicas, é

dicir débense a interacción de varios xenes.

A Proteómica é un punto de vista similar a Xenómica, pero aplicado ao

proteoma (o conxunto de proteínas). Porén, o proteoma varía co tempo

segundo as condicións do organismo e a comparación en diferentes

situacións dun mesmo organismo ou de organismos diferentes pode

aclarar que presenza, ausencia... de proteínas podería influir nunha

determinada alteración ou estado fisiolóxico de dito organismo.

GRAZAS POR ATENDERME

WEBGRAFÍA

https://www.unocero.com/2014/04/01/nueva-tecnica-correctora-de-mutaciones-geneticas/