DNA RECOMBINANTE E DNA RECOMBINANTE E INGIENIERINGIENIERÍAÍAGENÉTICAGENÉTICA

INGENIERÍA GENÉTICA

MANIPULACIÓN DEL DNA DE LOS ORGANISMOS VIVOS

1) INVESTIGACIÓN BÁSICA (ESTUDIO DE LA ORGANIZACIÓN, EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DE GENES EN LOS ORGANISMOS VIVOS).

2) APLICACIÓN DE ESTE CONOCIMIENTO EN LA MANIPULACIÓN CONSCIENTE DE LOS GENES EN SALUD, EN LA INDUSTRIA DE ALIMENTOS, EN LA AGRICULTURA, ETC.

PIEDRAS ANGULARES DE LA INGIENIERÍA GENÉTICA

1. CONSTRUCCIÓN DE LIBRERÍASDE cDNA Y GENÓMICAS

2. DESCUBRIMEINTO DE LAS ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN (ENZIMAS DE RESTRICCIÓN)

3. DESCUBRIMIENTO DE LA REACCIÓNDE POLIMERIZACIÓN DE CADENA OPCR (POLYMERASE CHAIN REACCTION)

Técnicas de DNA Recombinante

El problema: ¿Qué material genético vamosa manipular y cómo lo vamos a hacer?

• Aislar secuencias de DNA

• Obtener múltiples copias de ellos

TECNICAS

• Clonamiento Molecular

• PCR (reacción en cadena de la polimerasa)

ANALISIS DE GENES

Se requiere:

CLONAMIENTO MOLECULAR HERRAMIENTAS BASICAS

• Enzimas de restricción

• Vectores

• DNA ligasa

• Células huésped

*

Enzimas de Restricción

DIGESTION DEL DNA POR ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

Sitio de corte

ESENZIMAS de RESTRICCION Sitio de corte de enzimas de restricción Sitios de corte de endonucleasas de restricción

Las flechas indican los enlaces fosfodiester sobre los que actúa cada enzima

CLONAMIENTO MOLECULAR HERRAMIENTAS BASICAS

• Enzimas de restricción

• Vectores

• DNA ligasa

• Células huésped

Características básicas de un vector de clonamiento

• Origen de replicación autónomo

• Gen marcador de selección

• Sitios únicos de restricción

Componentes básicos de un vector de clonamiento plasmidial que puede replicar en una célula de E.coli

Caja de clonaje múltiple

codifica proteína de resistencia a

ampicilina

Origen de replicación

Región de inserción de DNAExógeno

CromosomaFragmento de

DNA libre

1» divisi—n celular

2» divisi—n celular

Fragmento de DNA insertado en un plasmidio

1ª división celular

2ª división celular

¿PORQUE EL USO DE UN VECTOR ?

TIPOS DE VECTORES

kpb

inserto

Plasmidios 3-5bacteriofagos 15BACS 300 YACS 2000

CLONAMIENTO EN PLASMIDIO

EcoRI PvuII

Sitio de corte Sitio de corte

Extremos cohesivos Extremos romos

Vector plasmidial cortado con EcoR1 y PvuII

DNA cromosomal cortado con EcoR1 y PvuII

CLONAMIENTO MOLECULAR HERRAMIENTAS BASICAS

• Enzimas de restricción • Vectores

• DNA ligasa

• Células huésped

Unión de fragmentosde restricción que poseen extremos cohesivos

Fragmentos de DNA genómico

b + c

CLONAMIENTO EN PLASMIDIO

EcoRI PvuII

Sitio de corte Sitio de corte

Extremos cohesivos Extremos romos

Vector plasmidial cortado con EcoR1 y PvuII

DNA cromosomal cortado con EcoR1 y PvuII

CLONAMIENTO MOLECULAR HERRAMIENTAS BASICAS

• Enzimas de restricción • Vectores

• DNA ligasa

• Células huésped

PROPAGACION EN CELULA HUESPED

RESUMEN DE CLONAMIENTO

Enzimas de restricción

DNA Ligasa

Vector

Célula huésped

CLONES que contienen diferentes fragmentos del genoma = GENOTECA

CONSTRUCCIÓN DE LIBRERÍAS DE cDNAY DE DNA GENÓMICO

USO DE VECTORES -PLASMIDIOS-DNAs DE FAGOS-OTROS (BACs, COSMIDIOS, YACs, ETC).

GENOTECAS O LIBRERÍAS

Genoteca de cDNA

Obtención :

Clonamiento de cDNA obtenido mediante transcripción reversa de mRNA total.

vectores

+

ligación

transformación

Genoteca de DNA genómico

Obtención :

1. Fragmentación de todo el genoma mediante enzimas de restricción

2. Clonamiento de fragmentos en vectores

¿Cómo aislar un fragmento de DNA

de interés?

Aislamiento de un clon

-Uso de sondas radiactivas

- PCR

Identificación de un fragmento de DNA específico en las colonias transformadas

mediante HIBRIDIZACION CON SONDAS

MARCADAS

Clonamiento por PCR

CLONAMIENTO DE UN PRODUCTO DE PCR

libreria

Combinación de la transcripción reversa con PCR

RT-PCR

Cloning by RT-PCR

TTTTTTT PCR

cDNA

Corte con enzimas de restricción y ligación a un plasmidio

CLONAMIENTO DE UN PRODUCTO DE PCR

libreria

SECUENCIACION DEL DNA

Estudio de la función de un gen

Vectores de expresión

Vector de expresión en bacteriasVector de expresión en bacterias

Vectores de expresión en eucariotes

FUNCIÓN DE UN GENFUNCIÓN DE UN GEN

Herramientas de Estudio:

1. Análisis computacional en banco de datos: homología de secuencia con un gen de otro organismo cuya función se conoce.

2. Animales transgénicos y knock out.