1 TEJIDOVECTORES TEJIDO VECTORES mRNA DNA cDNA DNA digerido cDNA DNA digerido (doble cadena...

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1 TEJIDO TEJIDO VECTORES VECTORES mRNA DNA mRNA DNA cDNA DNA digerido cDNA DNA digerido (doble cadena metilado) (doble cadena metilado) DNA CLONABLE LIGACI DNA CLONABLE LIGACI DNA-VECTOR DNA-VECTOR DNA RECOMBINANTE DNA RECOMBINANTE INTRODUCCION EN CELULA HUESPED INTRODUCCION EN CELULA HUESPED LIBRARY LIBRARY cDNA o genómica cDNA o genómica Bibliotecas Bibliotecas Bibliotecas cDNA BM 2009

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TEJIDOTEJIDO VECTORESVECTORES

mRNA DNAmRNA DNA

cDNA DNA digeridocDNA DNA digerido(doble cadena metilado)(doble cadena metilado)

DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR

DNA RECOMBINANTEDNA RECOMBINANTE

INTRODUCCION EN CELULA HUESPEDINTRODUCCION EN CELULA HUESPED

LIBRARYLIBRARY cDNA o genómicacDNA o genómica

Bibliotecas Bibliotecas

Bibliotecas cDNA BM 2009

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Vectores usadosVectores usados:gt10gt11ZAPTriplEx

Bibliotecas cDNA BM 2009

Paso 1Paso 1

Paso 2Paso 2

Paso 4Paso 4

Paso 5Paso 5

Paso 6Paso 6

Paso 8Paso 8Paso 7Paso 7

Paso 3Paso 3

Paso 9Paso 9

Estrategia general construcción biblioteca de expresiónEstrategia general construcción biblioteca de expresión

Paso 10Paso 10

(if necessary)

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3Bibliotecas cDNA BM 2009

Pasos 1 y 2: Fuente y purificación del mRNA Pasos 1 y 2: Fuente y purificación del mRNA

Preparación de poliA+ mRNA

T T T(30)

•Fuente de mRNA:

Alta relación secuencia interés/ mRNA total.

Baja tasa de degradación.

•Métodos de enriquecimiento:

Uso de drogas para selección de líneas celulareso estímulos específicos.

Fraccionamiento del mRNA o cDNA.

Clonado sustractivo. 3´A A A

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4Bibliotecas cDNA BM 2009

Paso 3: Síntesis de la primera cadena de cDNA Paso 3: Síntesis de la primera cadena de cDNA

Transcriptasas reversas (RT): DNA pol RNA dependiente ALV (Avian leukemia virus) y MoMLV (Moloney strain of murine leukemia virus)

AAAAAA(A)nA

AAAAAA(A)nA

5´cap

mRNA

Transcriptasa reversa

dATP

dTTP

dGTP

dCTP

AAAAAA(A)nA 3´

AAAAAA(A)nA

cDNA:mRNA

TTTTTT(n)T

Oligo dT

5´cap

mRNA

Transcriptasa reversa

dATP

dTTP

dGTP

dCTP

AAA(A)nA 3´

AAA(A)nA

AAA(A)nA

AAA(A)nA

cDNA:mRNA

Random primers

Random primers

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Paso 4: Síntesis de la segunda cadena de cDNA Paso 4: Síntesis de la segunda cadena de cDNA

RNAasa H: nicks mRNA en mRNA:DNA

DNA pol

dNTPs

cDNA doble cadena

AAAAAA(A)nA AAAAAA(A)nA

RT con oligo dT

AAAAAA(A)nATTTTTTTTTT

TTTTTTTTTT

Degradación RNA

TTTTTTTTTT

Transferasa terminal dCTP

CCCCC

Fragmento KlenowdNTP´s + oligo G

TTTTTTTTTTCCCCCGGGGG

cDNA doble cadena

AAAAAAAAA

Transferasa terminalPor reemplazo

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6Bibliotecas cDNA BM 2009

Paso 3,4 y 6: Síntesis de cDNA clonado. Uso de adaptadores. Paso 3,4 y 6: Síntesis de cDNA clonado. Uso de adaptadores.

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7Bibliotecas cDNA BM 2009

Paso 3,4 y 6: Síntesis de cDNA clonado direccionado. Oligo dT-primer adaptador. Paso 3,4 y 6: Síntesis de cDNA clonado direccionado. Oligo dT-primer adaptador.

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Paso 3,4,5 y 6: Síntesis de cDNA clonado direccionado. Metilación. Uso de adaptadores. Paso 3,4,5 y 6: Síntesis de cDNA clonado direccionado. Metilación. Uso de adaptadores.

Bibliotecas cDNA BM 2009Fosforilación de los fragmentos antes de ligar al vector

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9Bibliotecas cDNA BM 2009

Paso 3 y 4: Síntesis de la primera y segunda cadena de cDNA Paso 3 y 4: Síntesis de la primera y segunda cadena de cDNA

Esquema para la construcción de una biblioteca full-length

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10Bibliotecas cDNA BM 2009

Fago Fago Mapa génicoMapa génico

Cos Cos

Brazo izquierdo Región central Brazo derecho

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Fago Fago Ciclo de vida Ciclo de vida

C2 proteinActivates

Baja [C1]Alta [C1]

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Fago Fago Formación placas de lisis

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Ensamblado del bacteriófago

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13Bibliotecas cDNA BM 2009

Construcción de vectores

Vectores: dejaron el 60 % del genoma salvaje (crecimiento lítico)Tamaños que se empaquetan eficientemente: 105-78 % del genoma (10-20 kpb)

Elección del vector:• ER empleada.•Tamaño del fragmento a ser insertado.•Expresión del cDNA en bacterias.•cDNA debe ser “rescatado” del vector en forma de plásmido.

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Pasos 7 y 8: Esquema preparación biblioteca en vectores derivados de fago Pasos 7 y 8: Esquema preparación biblioteca en vectores derivados de fago

Vector desfosforiladoRelación molar alta [Vector / inserto]Extremos no compatibles

Ligación

Selección-Screening

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CI

Bibliotecas cDNA BM 2009

gt10: 5-11 kbgt10: 5-11 kb

Cepas E. coli hfl – (mutantes proteasa Hfl) NO degrada CII S! CI lisogenia

Fagos CI forman placas de lisis en cepas hfl-

Marcador de selección de fagos recombinantes: CI

CI

Lisogenia Lisis

gen CI

cDNA- EcoRIgt10-EcoRI

Ligación

Empaquetamiento in vitro

Infección E. coli hfl-

Plaqueo en top agar Formación placas de lisis

Screening hibridización sondas

Esquema:

(amplificación)

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Screening biblioteca: Hibridización con sondas

Plaqueo en top agar y formación placas de lisis

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gt11: 7 kbgt11: 7 kb

Screening biblioteca de expresión: Inmunodetección

Bibliotecas cDNA BM 2009

plac lacZ

EcoRI

Inserción cDNA en EcoRI

Proteína de fusiónCI 857: mutante inactivo del represor a 45ºCS 100: mutación ambar en el gen S lisis

Infección cepa E. coli SupF Incubación 10-15´ a 45ºC

Inducción ciclo lítico

cDNA- EcoRIgt11-EcoRI

Ligación

Empaquetamiento in vitro

Infección E. coli

Plaqueo en top agar. Incubación a 42ºC Formación placas de lisis

Screening inmunodetección-Hibridización sondas

Screening recombinantesIPTG/X-gal

Esquema:

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ZAP: 7 ZAP: 7 kbkb pBluescript SK- cDNA (EcoRI/XhoI)ZAP (EcoRI/XhoI)

Ligación

Empaquetamiento in vitro

Infección E. coli

Plaqueo en top agarFormación placas de lisis

Screening inmunodetecciónClones positivos

Esquema:

EcoRI

XhoI

Recuperación de los clones positivos:

Clon recombinante positivo + M13 fago helper mutante

XL1-blue MRF´ SupE

IT

LB-Amp

SupE- R

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Bibliotecas cDNA BM 2009

TriplEx: TriplEx: expresión en tres marcos de lecturaexpresión en tres marcos de lectura

UAAGGAGGAUUCCUCC

AUG5’ 3’

mRNA

3’ 5’

16S rRNA small ribosomal subunit

Ribosome Binding Site (RBS)

Secuencia 6-8 nt a -10 nt del AUG

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20Bibliotecas cDNA BM 2009

Pasos 9 y 10: Screening e identificación de los clones.Pasos 9 y 10: Screening e identificación de los clones.