DNA Recombinante

DNA Recombinante

• Técnica utilizada para facilitar el estudio de los genes– Aislar– Amplificar

• Inserción del gen de interes en otra molécula de DNA que sirve como vector. Molécula de DNA recombinante

Historia del DNA Recombinante

Allan Campbell (1962)

Historia del DNA Recombinante

Historia del DNA Recombinante

• Salvador Luria: Resctricción y Modificación

• Restricción: Fagos solo crecen en un tipo especifico de bacteria.

• Moficación: Si un fago tiene la capacidad de crecer en dos varios tipos de bacterias.

• Sistema de Restricción: Arber and otros nucleasa que distingue entre DNA residente o extranjero.

• Meselson y Yuan caracterizan una enzima que cliva de manera especifica . Enzimas de restricción porque previenen la infeccion viral.

• Adición de grupos metilo.

Historia del DNA Recombinante• Hamilton Smith y otros. Enzimas de

restricción clivan secuencias especifícas de DNA

• Primer uso mapeo del virus SV40• Boyer, Cohen y Berg generan la primera

molécula recombinante entre el fago lambda y el virus SV40

• 1974 se clona el primer gen eucariotico (rDNA)

Como Cortar y Pegar el DNA

• Enzimas de restricción o endonucleasas de restricción:– Reconocen una secuencia específica, corta

de nucleótidos en hebra doble DNA denominada sitio de restricción.

• Enzima Ligasa: Une dos piezas de DNA mediante la formación de enlances fosfodiester.

Enzimas de Restricción• Tres clases

– Tipos de secuencias que reconocen– La naturaleza del corte que hacen en la hebra de DNA– Estructura de la enzima

Endonucleasas Tipo II

• Actividades de endonucleasa y de metilasa estan usualmente separadas en subunidades diferentes

• Nomenclatura: Denominadas teniendo en cuenta el organismo en el que fueron aisladas usando un sistema de letras y números. HindIII: Haemophilus influenza, cepa d, número de enzima aislada del mismo tipo

Endonucleasas Tipo II

Sitios de Reconocimiento de las Endonucleasas Tipo II

• Reconocen secuencias simetricas de DNA de 4-6pb

• Secuencias Palindromicas: secuencia 5’>3’ es la misma de la dirección 3’>5’

Sitios de Reconocimiento de las Endonucleasas Tipo II

Terminaciones

EscalonadosSticky cohesivos

RomosBlunt

Sitios de Reconocimiento de las Endonucleasas Tipo II

Union y Clivaje del DNA por Enzimas de Restriccion

DNA Ligasas• Catalizan la formación de un enlace fosfodiester entre el

fosfato 5’ de un nucleotido de un fragamento de DNA y el grupo 3’ hidroxilo de otro fragmento

• Requieren ATP como cofactor• Ligasa mas usada es del fago T4

DNA Ligasas

Clonación

• Generación de fragmentos de DNA usando enzimas de restricción

• Ligación de fragmentos de DNA a otra molécula de DNA denominada vector

• Tranferencia de la molécula recombinante a una célula hospedara

• Recuperación de los fragmentos de DNA clonados

• Purificación y Analisis.

Clonación

Vectores

• Moléculas transportadoras de DNA• Pueden replicarse de manera

independiente• Poseen sitios de restricción que estan

presentes una sola vez en el vector• Poseen un marcador de selección• Faciles de recuperar de la célula

hospedera

Tipos de Vectores/Aplicaciones

Plasmidos

• DNA circulares extracro;:mosomales que tienen un origen de replicación y que se replican de manera autonoma dentro de las bacterias

• pBR322: p:plasmido, BR: Bolivar & Rodriguez, 322:número de identificación.

• Poseen un gen de resistencia a antibioticos• Poseen un polylinker con multiples sitios de

restricción

Plasmidos

Plasmidos• Transformación: Introducir el DNA

– Como evitar la degradación del DNA foreaneo? E. coli DH5 bacterias deficientes en restricción y modificación

• Selección de Recombinantes:

Bacteriofago Lambda • Utilizados para preparar librerias genómicas porque pueden

albergar piezas largas de DNA

Cromosomas Artifciales

• BACs: Bacterial artificial chromosomes• YACs: Yeast artificial chromosomes• MACs: Mammalian artificial chromosomes• Importantes para mapeo y análisis

complejos de genomas• Pueden incorporar hasta 300kb de DNA

foraneo• YACs y MACs tienen autonomia replicativa y

de segregación en células de mamifero• Sistemas regulatorios• Pocas copias

YACs