E. coli para la clonación de DNA y expresión de proteína recombinante.

17 de marzo de 2015Semestre 2015-II

Bioquímica Experimental

Nomenclatura

Por convención en el genotipo solo se indican los genes mutantes, sin embargo los símbolos “-” y “+” (superíndice) se usan redundantemente para enfatizar un locus silvestre.

• Los Fenotipos se indican en mayúscula y son seguidos por un superíndice “+” o “-”, y algunas veces “r” (resistente) o “s” (sensible)

• Mutación en un locus conocido o desconocido

rpsL (Strr)Mutación en el gen que codifica para la proteína ribosomal S12.

Resistencia a estreptomicina.

hsdR17 arg-3Mutación lugar

específicaSe desconoce el

locus exacto

Nomenclatura

• Una mutación amber es indicada como am y una mutación sensible a la temperatura se denota como ts.

• Una mutación constitutiva se indica con un superíndice q

• Las deleciones son indicadas con Δ

• Las inserciones se indican con ::

trpC22::Tn10

Sitio de la inserción DNA insertado

lacIqExpresión constitutiva del gen que codifica para el

represor lac.

Δ (lac-pro) Los genes entre lac y pro también están deletados.

Nomenclatura

La posición de la inserción en el mapa se puede indicar por un código de tres letras.

Una fusión se indica con el símbolo Φ seguido de los genes fusionados dentro de un paréntesis.

F+, y Hfr son indicados al principio del genotipo, si la cepa es F’ entonces esto es indicado al final del genotipo con los genes llevados por el plásmido F listados en corchetes. Plásmidos y fagos lisogénicos llevados por la cepa, son mencionados en paréntesis al final del genotipo.

Thus,zgh::Tn10

Siempre es z

Intervalos de 10 minutos

Intervalos de 1 minuto

(letras a-i)

Φ (ompC’-lacZ+)

Deleción en 3’ Indica un operon

Propiedades generales de los hospederos para

clonación

1.- Auxotrofia

2.- Mutaciones supresoras:

Existen vectores que contienen mutaciones sin sentido en genes esenciales como medida preventiva para evitar su propagación a poblaciones naturales de bacterias.

3.- Sistemas de restricción modificación:

Previene el intercambio genético entre grupos de bacterias permitiendo al hospedero reconocer y destruir DNA foráneo.

Propiedades generales de los hospederos para

clonación

3.1.1.- Metilación Dam y Dcm.

La mayoría de cepas usadas para clonación son Dam+ y Dcm+. Cepas que son recA-, siempre son dam+

GATC CC(A/T)GG

El genotipo recA- dam- es letal.

• La presencia de Dam o Dcm puede afectar la eficiencia de transformación para un plásmido.

• Las cepas con mutaciones en Dam- Dcm son mutagénicas.

3.1.2.- Sistema EcoK

• Modifica el residuo de adenina (AACN6GTGC)

• Esta codificado por el locus hsdRMS (hsdR codifica para la nucleasa, hsdM codifica para la metilasa y hsdS la subunidad de reconocimiento)

• Cepas utilizadas para clonación generalmente son hsdR- (rK- mK+) o hsdS- (rK- mK-)

Propiedades generales de los hospederos para

clonación

DNAmetE. Coli dam-

Ventaja: Transformación eficiente de DNA generado por PCR

3.1.2.- Sistemas de restricción dependientes de metilación McrA, McrBC, y Mrr.

• McrA y McrBC cortan metilcitocinas en las secuencias CG y (A/C)G respectivamente, Mrr corta metiladeninas.

• McrA-, McrBC-, o Mrr-.

4.- Recombinación

• Los sistemas de recombinación del hospedero pueden catalizar el rearreglo del DNA recombinante.

• Mutaciones en el hospedero que suprimen la recombinación, pueden ayudar a mantener la integridad del DNA clonado

RecA-

Propiedades generales de los hospederos para

clonación

Ventaja: Permite la clonación de DNA altamente metilado

Ventaja: Incrementa la estabilidad del DNA plasmídico.

5.- α-complementación; Δ(lac-proAB) complementado con lacZΔM15 presente en el profago Φ80 o el plásmido ´F’

Propiedades generales de los hospederos para

clonación

Hospederos para clonación

Ventaja: Mejora el rendimiento y la calidad del plásmido obtenido.

endA1: mutación en una endonucleasa inespecífica

gal E: Bloquea la producción de UDP glucosa, esto provoca que los lipopolisacáridos de membrana estén truncos, lo cual facilita la entrada de DNA.

TOP10= DH10B+ Resistencia a estreptomicina

Propiedades generales de los hospederos para

expresión

1.- Represores

• Los promotores, lac, lacUV5 y tac (comúnmente utilizados para regular la expresión en el vector) requieren al represor lacIq. Plásmidos con alto número de copia requieren que lacIq sea suplido en trans en un plásmido compatible.

• lacY: Previene el transporte activo de IPTG

• Sistema basado en la RNApol T7

La síntesis de la RNApol es regulada por el promotor lacUV5 (inducible por IPTG), ésta se encuentra en trans del lisógeno λ(DE3).

Plásmidos pLysS o pLysE, expresan la lizosima T7

Ventaja: El IPTG entra a la célula dependiendo de su concentración; la proteína recombinante se expresa uniformemente en todas las células.

Ventaja: Control muy astringente de la expresión (Proteínas tóxicas)

2.- Estabilidad

• Proteasas

Ion: mutación en la secuencia que Codifica para la proteasa mayoritaria dependiente de ATP en E. coli.

rpoH: disminuye la velocidad con que se degradan las proteínas

OmpT: Deficiencia de una proteasa de la membrana externa

• RNAsa

rne: abate la actividad de la RNAsa E

Propiedades generales de los hospederos para

expresión

Ventaja: Purificación de proteína recombinante intacta

Ventaja: Incrementa la disponibilidad de mRNA para la traducción

Propiedades generales de los hospederos para

expresión

3.- Uso de codones

• La frecuencia de utilización de codones varia entre organismos; los genes que contienen una alta proporción de codones raros casi no son expresados.

• Existen cepas de E. coli que contienen plásmidos con copias extras de tRNAs raros, particularmente argU (AGA/AGG), ileY (AUA), glyT (GGA), leuW (CUA), y proL (CCC)

4.- Solubilidad

DnaK-DnaJ y GroES-GroEL ayudan a E. coli (silvestre) a plegar proteínas correctamente; existe evidencia que la co-sobrexpresión aumenta la proporción de proteína soluble.

trxB y gor (los cuales codifican para una tioredoxina y glutatión reductasa respectivamente) facilitan la formación de puentes disulfuro.

Ventaja: Permiten la expresión de genes provenientes de genomas ricos AT o GC.

Ventaja: Útiles cuando la producción de proteína soluble depende de una oxidación adecuada.

Hospederos para expresión

Methods in Molecular Biology, Vol. 235:E. coli Plasmid Vectors Edited by: N. Casali and A. Preston © Humana Press Inc., Totowa, NJ

Referencia