Capitulo V

Enzimología Iván Paz Aliaga

CAPÍTULO V

CONTENIDO

Tipos de estrategias catalíticasMecanismo catalítico de las proteasasMecanismo catalítico de anhidrasa carbónicaMecanismo catalítico de endonucleasas de restricciónMecanismo catalítico de las nucleósido monofosfato quinasasMecanismo catalítico de lisozima

ESTRATEGIAS CATALÍTICAS

INTRODUCCIÓN

Cuando el sustrato se une a la enzima, debe existir una exquisita especificidad de unión lo que solo se consigue a través de un gran número de interacciones, si una de ellas no concuerda, lo mas probable es que no ocurra la catálisis; además, el complemento perfecto para dichas interacciones solamente se forma cuando el sustrato se encuentra en el estado de transición. De esta forma, las interacciones entre la enzima y el sustrato no solo favorecen la unión del sustrato sino que estabilizan al estado de transición; disminuyendo así la Energía de activación. La Energía de unión (Energía libre liberada en la formación de un gran número de interacciones débiles entre la enzima y el sustrato) puede promover también cambios estructurales tanto en la enzima como en el sustrato, que favorecen la catálisis (ajuste inducido).


TIPOS DE ESTRATEGIAS CATALÍTICAS

Para catalizar reacciones específicas, las enzimas normalmente emplean una o más de las estrategias siguientes:

1. Catálisis covalente:En este tipo, el centro activo contiene un grupo reactivo,

habitualmente un nucleófilo potente, que en el transcurso de la catálisis llega a ser modificado covalentemente de forma temporal; la proteasa quimotripsina es un ejemplo de este tipo.

2. Catálisis general ácido-base: Aquí, una molécula diferente al agua desempeña el papel de donador

o aceptor de un protón. La quimotripsina utiliza un residuo de histidina como un catalizador básico (acepta un protón) para incrementar el poder nucleofílico de la serina.

3. Catálisis por ión metálico:Los iones metálicos pueden funcionar catalíticamente de varias

formas, por ejemplo puede ser un catalizador electrofílico mediante la estabilización de una carga sobre un intermediario de la reacción. De igual forma, un ión metálico puede generar un nucleófilo cuando aumenta la acidez de una molécula cercana, como el agua (esto ocurre en anhidrasa carbónica). Finalmente un ión metálico puede unirse al sustrato, aumentando el número de interacciones con la enzima y así, aumenta también la energía de unión; las nicleótido monofosfato quinasasutilizan esta estrategia.

4. Catálisis por aproximación:En muchas reacciones participan dos sustratos diferentes,

aumentando la reacción si se atraen a los dos sustratos juntos sobre una misma superficie de unión de la enzima. Las nucleósido monofosfato quinasas atraen a dos nucleótidos a la vez para facilitar la transferencia de un grupo fosforilo desde un nucleótido al otro.

Vamos a ver a continuación la estrategia catalítica de cuatro enzimas, las cuales nos van a ejemplificar los tipos de estrategias desarrollados: algunas proteasas, anhidrasa carbónica, enzimas de restricción y las nucleósido monofosfato quinasas.


MECANISMO CATALÍTICO DE LAS PROTEASAS

Las reacciones proteolíticas se observan en algunos procesos metabólicos como la digestión, en el recambio de proteínas, en la regulación de la actividad de ciertas enzimas y de algunas proteínas. Las enzimas encargadas del proceso, conocidas como proteasas, rompen a las proteínas en el enlace peptídico mediante una reacción de hidrólisis. Este proceso es muy lento, en ausencia del catalizador se calcula que demora entre 10 a 1000 años, sin embargo, en presencia de las enzimas se realizan en milisegundos.

La resonancia que presenta el enlace peptídico, dotándolo de un carácter parcial de doble enlace, es la responsable de su estabilidad cinética, mostrando una fuerte resistencia a la hidrólisis. Asimismo, el enlace C-N se fortalece por su carácter de doble enlace y el átomo de carbono carbonílico es menos electrofílico y por tanto menos susceptible al ataque nucleofílico que los átomos de carbono carbonílicos de otro tipo de compuestos. Consecuentemente, para promover la rotura del enlace peptídico, la enzima debe facilitar el ataque nucleofílico sobre un grupo carbonilo normalmente no reactivo.

Mecanismo catalítico de la quimotripsina:

Esta enzima proteolítica del tracto intestinal de los mamíferos, rompe enlaces peptídicos donde el grupo carboxilo de los mismos es aportado por aminoácidos voluminosos e hidrofóbicos como el triptófano, la tirosina, la fenilalanina y la metionina.

La enzima emplea un nucleófilo potente para atacar al grupo carbonilo no reactivo del sustrato; este nucleófilo se une covalentemente al sustrato por un tiempo en el transcurso de la catálisis. Este nucleófilo es la serina, lo cual se determinó tratando a la enzima con di isopropil fluoro fosfato, el cual la inactivaba de forma irreversible (como sabemos este compuesto se une a los residuos de serina). A pesar de que la enzima posee 28 residuos de serinas, solo uno, la serina 195, se modificó y esto condujo a la pérdida total de la actividad enzimática.

Para estudiar el mecanismo se utilizó un análogo del sustrato el cual al ser escindido, forma un producto coloreado; este es el ester p-nitrofenílico de N-acetil-L-fenilalanina, este sustrato es un éster en lugar


de una amida, uno de los productos formados por la hidrólisis de este sustrato por la quimotripsina es el p-nitrofenolato de color amarillo. Ver figura 5.1.

Figura 5.1.- Sustrato cromogénico: El ester p-nitrofenílico de N-acetil-L-fenilalanina produce un producto amarillo, el p-nitrofenolato, después de ser atacado por quimotripsina.

Al monitorear la reacción, al comienzo se observa una etapa explosiva de producción rápida de producto coloreado; después, cuando la reacción alcanza el estado estacionario, el producto se generaba más lentamente. Estos resultados sugieren que la hidrólisis tiene lugar en dos pasos: en el primero, reacciona el residuo nucleófilo de serina con el sustrato para formar el intermediario enzima-sustrato enlazado covalentemente (ver figura 5.2); el grupo hidroxilo de la serina 195 sumamente reactiva ataca al grupo carbonilo del sustrato para formar el intermediario acil-enzima y se libera el alcohol p-nitrofenol. En segundo lugar, el intermediario acil-enzima se hidroliza para liberar el componente ácido carboxílico del sustrato y regenerar el enzima libre. Así, al añadir sustrato, el p-nitrofenolato se produce rápidamente cuando se forma el intermediario acil-enzima, pero necesita mas tiempo para que la enzima pueda reiniciar un nuevo ciclo catalítico, para lo cual requiere la hidrólisis del intermediario acil-enzima.

Pero la serina no actúa sola, forma parte de una triada catalítica que incluye también a histidina y aspartato y actúan de la siguiente manera: La quimotripsina es aproximadamente esférica y consta de tres cadenas peptídicas enlazadas por puentes disulfuro; se sintetiza como un polipéptido único y se activa por la ruptura proteolítica del polipéptido para proporcionar tres cadenas. El centro activo de la quimitripsina señalado por la serina 195, se encuentra en una hendidura sobre la superficie de la enzima.


Figura 5.2.- Catálisis covalente: La hidrólisis por quimotripsina tiene lugar en dos etapas: la acilación para formar el intermediario acil-enzima y la desacilación para regenerar el enzima libre.

El análisis estructural reveló la reactividad de la serina 195; este aminoácido forma un puente de hidrógeno con el anillo imidazol de la histidina 57. El grupo –NH de este anillo imidazol se encuentra a su vez formando un puente de hidrógeno con el grupo carboxilo del aspartato 102; a este trio se le llama triada catalítica.

Esta triada funciona de la siguiente manera, la histidina posiciona a la cadena lateral de serina para polarizar a su grupo hidroxilo. Actuando así, los residuos funcionan como un catalizador básico general, aceptando un ión hidrógeno, porque el grupo hidroxilo polarizado del residuo de serina se balancea para su desprotonación. La retirada del protón del grupo hidroxilo genera un ión alcóxido, que tiene mucho mayor mayor poder nucleofílico que un alcohol. El residuo de aspartato ayuda a orientar a la histidina y lo convierte, a través de interacciones eléctricas en un mejor aceptor de protones. Ver figura 5.3.

Figura 5.3.- La triada catalítica: esta triada convierte a la serina 195 en un potente nucleófilo, a través de la formación de un ión alcóxido.


El mecanismo de acción de quimotripsina seria el mostrado en la figura 5.4; después de la unión del sustrato (paso 1), la reacción comienza con el grupo hidroxilo de la serina 195 que lleva a cabo un ataque nucleofílico al átomo de carbono carbonilo del sustrato (paso 2).

Figura 5.4.- Mecanismo de hidrólisis de quimotripsina sobre una proteína: el proceso permite observar dos tipos de estrategias, catálisis ácido base y covalente. La interacción del aspartato sobre la histidina hace que esta última se convierta en una base más fuerte.

El ataque nucleofílico cambia la geometría alrededor de este átomo de carbono, transformándolo de trigonal plano a tetraédrico. La inestabilidad inherente al intermediario tetraédrico formado mantiene una carga negativa formal sobre el átomo de oxígeno derivado del grupo carbonilo. Esta carga se estabiliza mediante interacciones con grupos –NH de la proteína en un centro denominado cavidad del oxianión (se forman 2 puentes de hidrógeno con el oxígeno del carbonilo, uno de la propia serina 195 y otro con una glicina de posición 193). Estas interacciones ayudan también a estabilizar el estado de transición que precede a la formación del intermediario tetraédrico. Después, este intermediario tetraédrico se colapsa para generar el acil-enzima (paso 3). Este paso se facilita mediante la transferencia de un protón desde el residuo de


histidina cargado positivamente al grupo amino formado por la ruptura del enlace peptídico. El componente amino se encuentra ahora libre para apartarse de la enzima (paso 4) y se sustituye por una molécula de agua (paso 5).

El grupo éster del acil-enzima se hidroliza ahora mediante un proceso que es esencialmente la repetición de los pasos 2, 3 y 4. La molécula de agua ataca al grupo carbonilo mientras que simultáneamente, el residuo de histidina separa un protón que actúa como un catalizador ácido general formando un intermediario tetraédrico (paso 6). Esta estructura se descompone para formar el producto ácido carboxílico (paso 7). Finalmente la liberación del producto ácido carboxílico (paso 8) pone nuevamente a la enzima lista para iniciar un nuevo ciclo catalítico.

Este mecanismo explica la forma de ruptura del enlace peptídico pero no explica la especificidad de esta enzima por residuos de aminoácidos grandes e hidrofóbicos.

El examen de la estructura tridimensional de la quimotripsina con análogos del sustrato e inhibidores enzimáticos reveló la presencia de un profundo bolsillo hidrofóbico, llamado bolsillo S1 en el cual pueden acomodarse largas cadenas hidrofóbicas de aminoácidos; la unión de una cadena lateral apropiada en el interior de este bolsillo coloca el enlace peptídico adyacente en el centro activo para su ruptura; la especificidad de quimotripsina depende de qué aminoácido se coloca en este bolsillo hidrofóbico.

Otras proteasas tienen especificidades mas complejas y en ellas, la ruptura no solamente depende de los aminoácidos que aportan el enlace peptídico sino de algunos mas dentro de la cadena del sustrato; es decir, estas enzimas tienen bolsillos adicionales sobre su superficie para el reconocimiento de otros residuos aminoacídicos del sustrato. Ver figura 5.5. Los residuos sobre el lado amino terminal del enlace escindible se denominan P1, P2, P3 y así sucesivamente; los subíndices indican su posición con respecto al enlace escindible. Igualmente, los residuos vecinos al lado C terminal del enlace peptídico a romperse se denominan P1’, P2’, P3’ respectivamente. De modo análogo, los centros correspondientes en la enzima (bolsillos receptores) se nombran S1, S2 o S1’, S2’; los subíndices y así sucesivamente.


Figura 5.5.- Nomenclatura para la especificidad de las interacciones proteasa-sustrato: Los centros de interacción de los sustratos con la enzima se designan como P y los correspondientes centros de unión en la enzima se designan como S.

Existen muchas proteasas que muestran estas triadas catalíticas, como tripsina y elastasa; estas tienen cerca de 40% de similitud en cuanto a su contenido aminiacídico con quimotripsina pero tienen especificidades diferentes para el sustrato. Recordemos que tripsina rompe enlaces peptídicos donde el aminoácido que aporta el grupo carboxilo para el mismo es positivo y de gran tamaño como lisina y arginina; en el caso de elastasa, este aminoácido debe ser pequeño, como alanina y serina. Si comparamos los bolsillos S1 de las tres proteasas encontramos: en el bolsillo de tripsina existe un aspartato 189 en lugar de la serina 195 que hay en la quimotripsina, mientras que la elastasa, hay en el fondo del bolsillo dos valinas, 216 y 190, las cuales disminuyen el tamaño de S1

permitiendo solo el ingreso de aminoácidos pequeños. Esto es lo que determina la especificidad de la enzima. Ver figura 5.6.

Figura 5.6.- Bolsillos S1 de quimotripsina, tripsina y elastasa.

Ser 195

Quimotripsina Tripsina Elastasa

Asp 189 Val 216

Val 190

O- O-


Las similitudes en cuanto al proceso catalítico de las proteasas ha permitido catalogarlas en diferentes familias y asimismo, determinar líneas de evolución convergentes.

La triada catalítica de la subtilisina, una proteasa de bacterias, está conformada por aspartato 32, histidina 64 y serina 221. Para saber sobre el rol catalítico de estos aminoácidos dentro de la enzima, se ha convertido individualmente cada residuo de estos en alanina, a través de una mutagénesis dirigida y luego se ha examinado la actividad de cada mutante para romper un sustrato modelo, ver figura 6.7. Como se esperaba, la sustitución de la serina 221 del centro activo por alanina disminuyó drásticamente el poder catalítico (cerca de un millón de veces menos) respecto a la enzima salvaje; el valor de KM prácticamente no varió, indicando que la unión del sustrato no está afectada.

La mutación de histidina 64 por alanina, tuvo efectos muy similares como puede verse en la figura 5.7; estas observaciones apoyan la idea de que la pareja serina-histidina actúan conjuntamente para generar un nucleófilo de suficiente potencia para atacar al grupo carbonilo de un enlace peptídico.

La conversión del aspartato 32 en alanina tuvo un efecto menor sobre la actividad de la enzima (cerca de 50000 veces menos que la enzima salvaje). Pero la conversión simultánea de los tres residuos en alanina, no fue más perjudicial que solo la serina o la histidina. La primera letra de cada barra corresponde a la abreviación de una letra de los aminoácidos mutados, el número identifica la posición del residuo dentro de la enzima y la última letra es la abreviatura de una sola letra del aminoácido que sustituye al original.

Es importante indicar que subtilisina tiene en la cavidad del oxianión una asparragina 155, si esta la mutamos por una glicina, la actividad de la enzima disminuye al 0,2% de su valor en el tipo salvaje, pero aumentó el valor de KM en solo 2 veces; estas observaciones, demuestran que el grupo –NH de asparragina desempeña un papel importante en la estabilización del intermediario tetraédrico y del estado de transición que se produce.


Figura 5.7.- Mutagénesis dirigida en la subtilisina: Los residuos de la triada catalítica se mutaron por alanina en forma independiente, observando una drástica disminución en la actividad catalítica de la enzima; el eje “y” corresponde a una escala logarítmica de la Kcat.

Existen otras proteasas que utilizan otro compuesto en lugar de serina para su catálisis, estas son las cisteínproteasas, las aspartilproteasas y las metaloproteasas; en cada caso, la estrategia genera un nucleófilo que ataca al grupo carbonilo del péptido, ver figura 5.8. Son cisteinproteasas la papaína, la catepsina y caspasas.

Las aspartilproteasas tienen una pareja de aspartatos en el centro activo los cuales actúan juntos; son representantes de este grupo la renina y la pepsina; estas enzimas muestran simetría bilateral sugiriendo que dos enzimas idénticas se unieron en algún momento de la evolución y que cada copia del gen contribuye con un residuo de aspartato en el centro activo del gen. El VIH y otros retrovirus contienen una aspartil proteasa dimérica no fusionada similar a la proteína fusionada, pero las cadenas individuales no están unidas para hacer una única cadena; esta observación concuerda con la idea de que la enzima existió al principio como unidades separadas.

Las metaloproteasas constituyen la última clase de enzimas que rompen péptidos, en el centro activo hay un ión metálico unido, casi siempre Zinc, que activa a una molécula de agua para actuar como nucleófilo; la enzima bacteriana termolisina y la carboxipeptidasa A son representantes de esta clase de enzimas.


g

Figura 5.8.- Las estrategias de activación por tres clases de proteasas: todas atacan al grupo carbonilo del enlace peptídico por romper, las cisteinproteasas actúan directamente mientras que las aspartilproteasas y las metaloproteasas requieren de una molécula de agua.

Existen muchos compuestos tanto naturales como artificiales que por su parecido estructural a los sustratos proteicos de algunas proteasas, actúan como inhibidores de las mismas; así tenemos al captopril, inhibidor artificial de la metaloproteasa convertidora de la angiotensina, que es utilizado en la hipertensión. Asimismo el crixivan, inhibidor de la proteasa del VIH, el cual se emplea en el tratamiento del SIDA (la proteasa del VIH tiene la función de hidrolizar las proteínas víricas multidominio para hacerlas activas, el bloqueo de este proceso impide que el virus sea infeccioso).

MECANISMO CATALÍTICO DE LA ANHIDRASA CARBÓNICA:

El CO2, producto del metabolismo aeróbico, es liberado hacia la sangre y transportado por esta hacia los pulmones. Mientras esta en la sangre, reacciona con el agua formando ácido carbónico el cual por tener un pK de 3,5 se transforma luego en bicarbonato. Esta reacción que es reversible, a pesar de ser muy favorable desde un punto de vista termodinámico (sucede espontáneamente a velocidades razonables en ausencia de catalizador), es catalizada por las enzimas anhidrasas carbónicas, dada la necesidad de que el proceso se lleve a cabo a gran velocidad. Estas enzimas son tan importantes en humanos (hay por lo menos siete distintas), que las mutaciones en algunas causan osteoporosis, anemia y retraso mental.


En 1940 se determinó que la anhidrasa carbónica contenía Zinc en su estructura (fue la primera vez que se encontró que este metal podía actuar como cofactor, ahora se sabe que son cientos de enzimas las que lo requieren). Los estudios cristalográficos de rayos X mostraron el lugar de unión del zinc con la enzima. Ver figura 5.9.

Figura 5.9.- Estructura de la anhidrasa carbónica II humana y su centro de unión al zinc; en rojo se representan las histidinas y el Zinc en plomo.

El zinc en los seres vivos solo puede encontrase en el estado de oxidación +2, por lo tanto, un átomo de este metal puede estar unido a 4 o mas ligandos; en la anhidrasa carbónica, tres centros de coordinación están ocupados por anillos imidazol de tres residuos de histidina y un centro de coordinación adicional está ocupado por una molécula de agua (la carga del complejo permanece como +2).

Al estudiar el efecto del pH sobre la actividad de anhidrasa carbónica se encontró que a pH 8 la reacción se encontraba cerca de su velocidad máxima; al disminuir el pH, la velocidad de reacción también cae,


llegando a un nivel de cero, cerca del pH 6. El punto medio de esta transición está cerca del pH de 7 (ver figura 5.10); por lo cual, se asumió que un grupo ionizable de pK cercano a 7 estaba involucrado en el proceso (se pensó inicialmente que se trataba de una histidina). Estudios posteriores determinaron que era el agua unida al zinc la responsable de este pK. Pero como imaginar esto si el pK del agua es de 15,7, la explicación fue que las cargas positivas del Zinc disminuyen el pK de esa molécula de agua a un valor cercano a 7.

Figura 5.10.- Efecto del pH sobre la actividad de anhidrasa carbónica.

Con el pH neutro se genera un ión oxidrilo unido al zinc el cual es lo suficientemente nucleofílico para atacar al CO2, mucho más rápidamente de lo que lo hace el agua. Esto sugiere un mecanismo que se resume en los siguientes pasos: (ver figura 5.11)

1. el zinc facilita la liberación de un protón de la molécula de agua, lo que genera un oxidrilo o hidroxilión.

2. el CO2 se une al centro activo de la enzima y se orienta para reaccionar con el hidroxilión

3. el oxidrilo ataca al dióxido de carbono convirtiéndolo en ión bicarbonato

4. el centro catalítico se regenera con la liberación del ión bicarbonato y la unión de otra molécula de agua.


Figura 5.11.- Mecanismo de la anhidrasa carbónica.

Medidas directas revelaron que la molécula de agua tiene un valor de pK de 8,7. A pH de 9,2, el complejo acelera más de 100 veces la hidratación del CO2 respecto a pH 8,7.

MECANISMO CATALÍTICO DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Las endonucleasas de restricción son sintetizadas por las bacterias para actuar sobre el DNA de los bacteriófagos, como un mecanismo de protección; estas reconocen secuencias concretas de bases llamadas centros de reconocimiento e hidrolizan el DNA en posiciones definidas. La clase de estas enzimas mejor estudiada comprende a aquellas conocidas como enzimas de restricción tipo II, que escinden el DNA dentro de sus secuencias de reconocimiento, otras escinden al DNA en posiciones algo distantes de su centro de reconocimiento.

Las enzimas de restricción muestran una gran especificidad y solo escinden los DNAs que tienen los centros de reconocimiento, pero estas secuencias pueden estar presentes también en el DNA de la propia bacteria; para evitar su acción sobre ellas, estas son metiladas. Por ejemplo, la endonucleasa EcoRV de E. coli, corta las moléculas de DNA vírico de doble cadena que contienen la secuencia 5’-GATATC-3’, pero dejan intacto al DNA del hospedador que tiene cientos de secuencias semejantes; el DNA hospedador se protege mediante otras enzimas


llamadas metilasas, las que metilan las bases de adenina dentro de las secuencias de reconocimiento del hospedador.

Las endonucleasas rompen el enlace entre el oxígeno 3’ y el átomo de fósforo; los productos de esta hidrólisis son las cadenas de DNA con un grupo hidroxilo libre en 3’ y un grupo fosforilo en 5’ (ver figura 5.12)

Figura 5.12.- Hidrólisis de un enlace fosfodiéster: todas las enzimas de restricción catalizan la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster del DNA.

El proceso puede ocurrir de dos formas diferentes, a través de un intermediario covalente, empleando un nucleófilo potente, el cual se une al átomo de fósforo y forma un estado de transición pentacoordinado, el cual termina liberando el grupo desplazado; o mediante hidrólisis directa.

En el primer mecanismo un nucleófilo de la enzima (análogo a la serina 195 de la quimotripsina) ataca al grupo fosforilo para formar un intermediario covalente que luego se hidroliza para producir los productos finales; aquí la configuración final del átomo de fósforo queda retenida debido a que tienen lugar dos desplazamientos consecutivos (la configuración esteroquímica del átomo de fósforo se invertirá de nuevo). En el segundo tipo, análogo a los llevados a cabo por las aspartil proteasas y metalo proteasas, una molécula de agua activada ataca directamente al átomo de fósforo; en este mecanismo, sólo ocurre una reacción de desplazamiento, por lo que la configuración estereoquímica del fósforo tetraédrico se invierte ( el monitoreo de estos cambios puede servir para determinar el mecanismo de acción de las endonucleasas). Ver figura 5.13.


Figura 5.13.- Tipos de mecanismos para la acción de las endonucleasas de restricción. A) intermediario covalente. B) hidrólisis directa. Nu = nucleófilo.

Las enzimas de restricción necesitan magnesio, al igual que muchas enzimas que actúan sobre sustratos que contienen fosfato. En la EcoRV se ha visto que el ión magnesio se encuentra unido a seis ligandos, tres son moléculas de agua, dos son grupos carboxilatos de residuos de aspartato de la enzima y el último es el átomo de oxígeno del grupo fosforilo en el centro de escisión. El ión magnesio mantiene mantiene una molécula de agua en una posición tal que pueda atacar al grupo fosforilo y con la ayuda de los aspartatos, polariza la molécula de agua hacia su desprotonización. Estudios adicionales han demostrado que se requiere de un segundo ión magnesio presente en un centro adyacente para poder cortar el sustrato.

Pero lo sorprendente de estas enzimas es su especificidad; las secuencias de reconocimiento son repeticiones invertidas, este ordenamiento proporciona una simetría rotacional binaria (figura 5.14) a la estructura tridimensional del centro de reconocimiento. La enzima de restricción tiene una simetría conveniente para facilitar el reconocimiento, se trata de un dímero cuyas dos subunidades están también relacionadas mediante una simetría rotacional binaria; la enzima rodea al DNA y forma interacciones muy específicas: las bases G y A en el extremo 5’ de cada cadena, dentro de la secuencia 5’-GATATC-3’, y sus bases complementarias, se ponen en contacto directamente con la enzima mediante puentes de hidrógeno que se entablan entre glicina 182, glicina


184 y asparagina 185 con el par CG; mientras que el par AT forma puentes con treonina 186 y la misma asparagina 185 (ver figura 5.15).

Figura 5.14.- Estructura del centro de reconocimiento de la endonucleasa EcoRV

Figura 5.15.- Interacciones por puentes de hidrógeno entre la endonucleasaa EcoRV y su sustrato DNA.

La característica más importante de este complejo es la distorsión del DNA en su parte central; los dos pares centrales de bases TA, producen el quiebre (figura 5.16). Las secuencias 5’-TA-3’ son conocidas por encontrarse en la mayor parte de pares de bases fácilmente deformables. Esta distorsión tiene efectos importantes sobre la especificidad de la acción enzimática.


Figura 5.16. Distorsión en el centro de reconocimiento del DNA. El DNA debería ser recto

Los estudios de unión de la EcoRV a su sustrato, llevados a cabo en ausencia de magnesio han demostrado que la enzima se une a todas las secuencias, afines y no afines, con una afinidad aproximadamente idéntica. Sin embargo, las estructuras de los complejos formados con DNA no afín son extraordinariamente diferentes de los formados con DNA afín, es decir, la conformación del DNA no afín no se distorsiona sustancialmente (ver figura 5.17). Esta carencia de distorsión determina que ningún fosfato se sitúe lo suficientemente próximo a los residuos de aspartato del centro activo para completar un centro de unión para el ión magnesio (fig. 5.18)

Figura 5.18. Centro de unión para el ión magnesio en la endonucleasa EcoRV. El magnesio favorece la activación de una molécula de agua y la coloca de tal forma que pueda atacar al fosfato.

Por lo tanto, los complejos inespecíficos no enlazan al ión magnesio y el aparato catalítico completo nunca llega a formarse. La distorsión del


sustrato y la unión posterior del ión magnesio explican la especificidad catalítica de más de 106 veces que se observa para la endonucleasa EcoRV, a pesar de que posee una preferencia muy pequeña a nivel de su unión al sustrato.

El DNA se distorsiona de tal manera en la unión a la enzima, que se realizan contactos adicionales entre la enzima y el sustrato, aumentando la energía de unión. Sin embargo, este incremento se anula mediante el coste energético de la distorsión del DNA desde su conformación relajada (figuras 5.19 y 5.20)

Figura 5.19. La endonucleasa EcoRV enlazada al DNA afín posee una energía de unión mayor que la correspondiente al DNA inespecífico; ese adicional sirve para impulsar la distorsión del DNA, necesaria para formar el complejo catalítico.

Figura 5.20. DNA afín e inespecífico en la endonucleasa EcoRV. El DNA afín en claro y el DNA inespecífico en oscuro. Obsérvese que el DNA inespecífico se encuentra lejos de los centros de unión con el ión magnesio.

ENZIMA+

DNAESPECÍFICO

ENZIMA+

DNA AFÍN

EN

ER

GÍA

LIB

RE

DISTORCIÓN DEL DNA


Este ejemplo ilustra como las enzimas pueden utilizar la energía de unión disponible para deformar a los sustratos y predisponerlos para su transformación química; las interacciones que tienen lugar dentro del complejo enzima-sustrato distorsionado, estabilizan al estado de transición que conduce a la hidrólisis del DNA.

Asimismo, la distorsión del DNA explica como la mutilación bloquea la catálisis y protege al DNA de la célula hospedadora. Cuando un grupo metilo se añade al grupo amino del nucleótido de adenina en el extremo 5’ de la secuencia de reconocimiento, la presencia de este grupo metilo excluye la formación de un puente de hidrógeno entre el grupo amino y el grupo carboxilo de la cadena lateral de la asparagina 185. Este residuo de Asn se encuentra estrechamente enlazado a otros aminoácidos que forman los contactos específicos con el DNA. La ausencia del puente de hidrógeno interrumpe otras interacciones entre la enzima y el sustrato DNA y por lo tanto, no ocurrirá la distorsión.

La comparación de la secuencia de aminoácidos de una serie de endonucleasas de restricción de tipo II revela semejanzas significativas; se observa la presencia de un núcleo estructural conservado: cadenas de tipo β que incluyen a los residuos aspartato (o en algunos casos glutamato), que conforman los centros de unión para el ión magnesio. Estas observaciones indican que muchas enzimas de restricción del tipo II están relacionadas evolutivamente; un análisis más detallado de las secuencias de aminoácidos sugiere que las bacterias pueden haber obtenido los genes de estas enzimas a partir de otras especies, mediante transferencia horizontal de genes (plásmidos); esto debido a que bacterias que no están relacionadas evolutivamente muestran entre si mucha concordancia de aminoácidos (50%) para estas enzimas.

MECANISMO CATALÍTICO DE NUCLEÓSIDO MONOFOSFATO QUINASAS

Estas enzimas catalizan la transferencia del grupo fosfato terminal desde un nucleósido trifosfato (NTP), normalmente el ATP, al grupo fosforilo de un nucleósido monofosfato (fig. 5.21). La acción enzimática consiste en transferir ese fosfato desde el NTP al NMP, evitando la transferencia de este al agua. Para esto las enzimas usan el encaje inducido además de un metal el cual se une al sustrato inicialmente.


Figura 5.21. Transferencia del grupo fosforilo por las nucleósido monofosfato quinasas.

Por cristalografía de rayos X se obtuvo la estructura tridimensional de algunas NMP quinasas, tanto libres como unidas a sus sustratos. Al comparar estas estructuras se ve que estas enzimas forman una familia de proteínas homólogas (fig. 5.22), por la presencia en todas ellas de un dominio de unión del NTP, el cual consiste en una hoja β central, rodeada por hélices α por ambos lados; otro rasgo común es un bucle entre la primera cadena β y la primera hélice α. Este bucle, que típicamente posee la secuencia de aminoácidos gli-X-X-X-X-gli-lis, suele denominarse bucle P, porque interacciona con los grupos fosforilo del nucleótido enlazado.

Figura 5.22. Estructuras de la adenilato quinasa y de la guanilato quinasa


Estudios con NMP quinasas, así como de otras enzimas que tienen como sustrato al ATP u otros nucleósidos trifosfato, revelan que estas enzimas son prácticamente inactivas en ausencia de iones metálicos divalentes tales como el Mg2+ y el Mn2+, pero adquieren su actividad normal cuando se adicionan estos iones. El metal aquí no es componente del centro activo, mas bien, los nucleótidos se unen a ellos y el complejo nucleótido-ión metálico es el auténtico sustrato para estas enzimas. Podemos decir que prácticamente todos los nucleósidos trifosfato se encuentran presentes como complejos NTP-Mg2+.

El ión magnesio neutraliza algunas de las cargas negativas presentes en la cadena polifosfato, lo que reduce las interacciones iónicas inespecíficas entre la enzima y el grupo polifosfato del nucleótido. Asimismo, las interacciones entre el ión magnesio y los átomos de oxígeno del grupo fosforilo mantienen al nucleótido en la conformación apropiada para que se una específicamente a la enzima (fig. 5.23). Los iones magnesio están normalmente coordinados a seis grupos químicos (optando una forma octaédrica); dos átomos de oxígeno se encuentran coordinados directamente, las posiciones restantes están ocupadas por moléculas de agua. Los átomos de oxígeno de los grupos fosforilo α y β, β y γ, o bien α y γ pueden contribuir en la coordinación. Además, se producen diferentes estereoisómeros en función de qué átomo de oxígeno concreto se una al ión metálico.

Figura 5.23. Estructuras de las dos formas isoméricas del complejo ATP-Mg

El ión magnesio también proporciona contactos adicionales de interacción entre el complejo ATP-Mg2+ y la enzima, de modo que se incrementa la energía de unión (fig. 7.24)


Figura 5.24. Complejo ATP-Mg2+ enlazado a la adenilato quinasa.

Al comparar la adenilato quinasa en presencia y en ausencia de un análogo del ATP, se observa que la unión del sustrato induce grandes cambios estructurales en la quinasa (fig.5.25). El bucle P se cierra sobre la cadena del polifosfato, interaccionando más extensamente con el grupo fosforilo β. El movimiento del bucle P permite al dominio de la parte superior de la enzima desplazarse hacia abajo para formar una especie de tapa por encima del nucleótido enlazado; este movimiento se favorece por la interacción entre residuos básicos (conservados entre las NMP quinasas), los grupos –NH del esqueleto peptídico y el nucleótido. Con el nucleótido ATP retenido en esta posición, su grupo fosforilo γ se encuentra próximo al centro de unión para el segundo sustrato, el NMP; en resumen, las interacciones con el sustrato provocan el desplazamiento del bucle P, lo cual permite que se produzcan cambios más profundos como el cierre del dominio principal. La unión del segundo sustrato, NMP, induce a nuevos cambios conformacionales, cambios que junto a los primeros aseguran que se cree una conformación catalíticamente competente solo cuando ambos, el donador y el aceptor, se encuentran unidos, impidiendo así la transferencia del fosforilo al agua.

La enzima mantiene así muy juntos a sus dos sustratos y en una orientación apropiada para estabilizar el estado de transición que conduce a la transferencia de un grupo fosforilo desde el ATP hasta el NMP. Este es un ejemplo de catálisis por aproximación.


Figura 5.25. Cambios conformacionales en la adenilato quinasa.

MECANISMO CATALÍTICO DE LA LISOZIMA

La lisozima, enzima presente en fluidos humanos, fue descubierta en 1922 por Alexander Fleming, por un estornudo casual sobre un medio de cultivo que contenía bacterias. Fleming vio al día siguiente que las bacterias de ese medio de cultivo habían muerto por obra de algún componente de su fluido; muy convencido de haber encontrado el antibiótico universal, dedicó mucho tiempo en averiguar de qué se trataba y descubrió que era una enzima la responsable del hecho a la cual bautizó como lisozima (liso por su capacidad de lisar bacterias).


Poco tiempo después se vio que esta enzima era solo activa para un número reducido de bacterias y no actuaba sobre las bacterias más patógenas. La enzima se encontró también en saliva, lágrimas, posteriormente en clara de huevo y muy pronto fue purificada para estudiar su mecanismo catalítico.

La lisozima rompe las paredes celulares de las bacterias; es decir, su acción específicamente es sobre un polisacárido que tiene alternadamente solo dos monosacáridos: el N-acetilglucosamina (NAG) y el ácido N-acetil murámico (NAM), unidos entre sí a través de enlaces (14). Ver figura 5.26.

Figura 5.26.- Unión del NAG y del NAM en el polisacárido de la pared celular bacteriana.

Ambos compuestos son derivados de la glucosamina en los que el grupo amino está acetilado; el NAM además tiene un ácido láctico unido al carbono 3 por un enlace éter.

La lisozima rompe el enlace glicosídico entre el carbono 1 del NAM y el carbono 4 del NAG; si es el NAG el que aporta el carbono 1 y el NAM el 4, este no puede ser hidrolizado por la enzima.

Otro polisacárido que es sustrato para la enzima es la quitina, homopolímero de NAG presente en el exoesqueleto de todos los artrópodos (crustáceos, arácnidos, insectos, etc) y en algunas estructuras de hongos; en este la unión también es de tipo (14).


Estructura de la lisozimaEs una enzima relativamente pequeña, conformada por 129 aminoácidos, con un PM de 14,6 Kdal. Presenta 4 puentes disulfuro que le dan una elevada estabilidad a esta exoenzima (ver figura 5.27)

Figura 5.27.- Secuencia de aminoácidos de la lisozima de clara de huevo; los aminoácidos que forman parte del centro catalítico se encuentran pintados.

En 1965 David Phillips determinó la estructura tridimensional de la lisozima a través de su mapa de densidad electrónica de alta resolución, el cual mostró una molécula compacta de forma elipsoidal, con dimensiones de 45 x 30 x 30 Angtröms y con un plegamiento complejo; internamente la molécula casi está constituida en su totalidad por aminoácidos hidrofóbicos.

Determinación del centro activo:Debido a que la lisozima no tiene cofactor, el mapa de densidad electrónica no reveló de inmediato el lugar de unión del sustrato, pero la cristalografía de rayos X si fue una herramienta muy útil, observando la interacción de la enzima con inhibidores. Estos experimentos son


factibles porque los cristales proteicos son bastante porosos permitiendo la fácil difusión de moléculas, inclusive relativamente grandes, a través de ellos; la densidad electrónica correspondiente a la molécula añadida puede calcularse directamente a partir de las intensidades de las reflexiones de los rayos X si la estructura no queda muy alterada. A esta técnica se le conoce como método diferencial de Fourier.

La idea es poder conseguir una imagen en el momento de la unión del sustrato con la enzima, pero como esto es casi imposible debido a que el proceso es muy rápido y la posterior transformación en producto lo es más aún, es que se puede usar técnicas como la crioenzimología, en donde se enfría el proceso (por ejemplo a temperatura de -50ºC) con lo cual se lo hace mas lento. Pero otra forma es empleando análogos del sustrato no reactivos o que reaccionen muy lentamente; en este sentido, para lisozima es útil el trímero de N-acetilglucosamina (tri-NAG), ver figura 5.28. Los oligómeros de N-acetilglucosaminaque constan de menos de 5 residuos, se hidrolizan muy lentamente, sin embargo se unen al centro activo de la enzima; de hecho el tri-NAG es un potente inhibidor.

Figura 5.28.- Tri-N-acetilglucosamina, inhibidor competitivo de la lisozima

Los rayos X mostraron la localización del sitio de unión y las interacciones responsables de la especificidad de esta unión y dio lugar a la propuesta siguiente: el tri-NAG se une a la lisozima en una hendidura presente en la superficie que atraviesa la totalidad de la enzima, el inhibidor solo ocupa la mitad de esta hendidura. El tri-NAG queda unido


a la enzima a través de puentes de hidrógeno e interacciones de Van der Walls; no hay interacciones eléctricas debido a que el tri-NAG carece de grupos ionizables. Los puentes de hidrógeno formados se representan en la figura 5.29 y podemos observar que participan el aspartato 101, el triptofano 63, el triptofano 62, el grupo alfa amino del aminoácido 59 y el grupo alfa carboxilo del residuo 107; asimismo, es el anillo C (tercer anillo del tri-NAG) el que entabla el mayor número de puentes de hidrógeno, 4 en total, en tanto que los otros 2 anillos (A y B) solo un puente de hidrógeno.

Figura 5.29.- Enlaces de hidrógeno entre el tri-NAG y la lisozima

Mecanismo enzimático de la lisozima:El hecho de que el tri-NAG solo llena la mitad de la hendidura de la lisozima hizo pensar que existía espacio suficiente para un oligosacárido de 6 unidades, esto era alentador pues se sabía que el hexa-NAG era rápidamente hidrolizado por la enzima, a la misma velocidad que oligómeros de mayor número de unidades que 6 (ver tabla 5.1)


Tabla 5.1:Efectividad de los oligómeros de la N-acetilglucosamina como sustratos:

SUSTRATO Velocidad de reacción (comparativa)NAG2 0NAG3 1NAG4 8NAG5 4000NAG6 30000NAG8 30000

Mediante la construcción cuidadosa de un modelo molecular, se situaron en la hendidura otros tres residuos de azúcar llamados D, E y F. Los anillos E y F se acoplaron fácilmente, estableciendo un buen número de puentes de hidrógeno; sin embargo el anillo D no se acopla a menos que sea distorsionado es decir de la forma de silla que tiene pase a media silla.

Quedó demostrado asimismo que el enlace que se rompe es el formado entre los anillos D y E por las siguientes razones:

Entre A y B ni entre B y C puede ser porque el tri-NAG no es buen sustrato para la enzima

Entre C y D tampoco porque el NAM por su tamaño nunca podría encajar en el lugar C, por lo tanto allí solo puede haber un NAG, luego en el lugar D habría un NAM (por la alternancia); la enzima solo puede romper el enlace entablado entre el NAM y el NAG (que el NAM aporte el carbono 1 y el NAG el 4).

La incapacidad del NAM de situarse en el anillo C excluye también el enlace entre el anillo D y F pues por alternancia estos estarían ocupados por NAG y NAM respectivamente.

Al determinar que era el enlace que unía los anillos D y E el que se rompía, se pudo establecer loa aminoácidos involucrados en el proceso; pero había que definir exactamente cual era exactamente el lugar de la ruptura, se era entre el oxígeno y el carbono 1 o entre el oxígeno y el carbono 4. Para ello ingeniosamente se utilizó agua marcada con oxígeno 18 de tal manera que al ocurrir la hidrólisis, el carbono que se lleve el oxígeno marcado será el del enlace que se rompe pues el otro carbono mantiene al oxígeno original. De esta forma se estableció que es el enlace entre el carbono 1 y el oxígeno el que se trompe. Ver figura 5.30


Figura 5.30. Hidrólisis con agua marcada con 18O mostrando que la lisozima corta el enlace C1-O y no el O-C4.

Se investigó sobre los posibles grupos catalíticos contiguos al enlace que se rompe, buscando dadores o aceptores de protones y se encontró que los únicos residuos posibles eran el glutamato 35 y el aspartato 52, los dos situados a ambos lados del enlace. Estos dos aminoácidos a pesar de estar muy cerca, tienen entornos marcadamente diferentes, el aspartato está en un medio claramente polar (pH 5 es el óptimo de la lisozima) lo que hace que se encuentre desprotonado, en tanto que el glutamato se encuentra protonado (indicando que el medio circundante próximo a el, está fuertemente influenciado por los aminoácidos cercanos de la enzima que hacen que no se ionice cuando debería estarlo a pH 5). Los oxígenos más próximos de ambos aminoácidos se hallan a una distancia de 3 Angströms del enlace a romperse.

El mecanismo de la catálisis fue propuesto por Phillips y colaboradores: El grupo –COOH del ácido glutámico 35 cede un H+ al enlace entre

el carbono C-1 del anillo D y el átomo de oxígeno glicosídico, rompiéndolo.

Esto crea una carga positiva en el C-1 del anillo D, formándose un ión carbonio (ver figura 5.31)

El dímero del NAG conformado por los anillos E y F difunde fuera de la enzima

El carbanión intermediario reacciona con un ión OH- del agua (ver figura 5.32). El tetra NAG con los residuos A,B,C y D difunde fuera de la enzima.

El ácido glutámico 35 queda protonado y listo para otro ciclo catalítico.


Figura 5.31.- Mecanismo catalítico de la lisozima, primera parte

Figura 5.32.- Mecanismo catalítico de la lisozima, segunda parte

Como puede verse, el proceso se realiza a través de un esquema general ácido pues hay una transferencia de un protón desde el ácido glutámico hacia el oxígeno. La ruptura del enlace es la que promueve la formación de un ión carbonio el cual es estabilizado por el aspartato 52.

El factor geométrico es la distorsión del anillo D, ajustándose perfectamente a la hendidura del centro catalítico (ver figura 5.33), en donde ocurre un cambio de la conformación de silla a la de media silla; esto fuerza al sustrato a adquirir la geometría del estado de transición que es el ión carbonio.


Figura 5.33.- Distorsión del anillo D del sustrato de la lisozima hacia la forma de media silla o bote; luego del arreglo los carbonos 1, 2 y 5 así como el oxígeno quedan en el mismo plano.

Apoyo experimental para el mecanismo de lisozima:

La forma en que se rompe el hexa-NAG es en un di-NAG y un tetra-NAG

La energía libre total de la unión del sustrato hexamérico, determinada mediante medidas de equilibrio de enlace, no es más que la contribución de cada uno de los seis residuos y se muestra en la figura 7.20. El hallazgo sorprendente es que el residuo D realiza una contribución negativa a la afinidad de unión ( + 15 Kj/mol ), esto significa que esto constituye el precio energético que se tiene que pagar para conseguir distorsionar el anillo D.

Utilizando análogos del estado de transición, es decir un hexa-NAG que tiene el anillo D en forma de media silla (ya distorsionado), la afinidad de unión a la enzima de este, es mucho mas fuerte

Dependencia del pH de la velocidad de catálisis: la velocidad de hidrólisis presenta su máxima rapidez a pH 5, la actividad enzimática desciende rápidamente a cualquier lado de este pH óptimo; el descenso en el lado alcalino se debe a la ionización del glutamato 35, mientras que el descenso de la velocidad en el lado ácido se debe a la protonación del aspartato 52.

La lisozima permanece activa cuando se esterifican todos sus grupos carboxilo excepto los del glutamato 35 y el aspartato 52. El ácido glutámico 35 y el ácido aspártico 52 quedan sin modificar si esta reacción se lleva a cabo en presencia de sustrato, lo que indica que la interacción de ellos con el sustrato los protege.


Figura 5.34.- Contribuciones energéticas hechas por cada uno de los seis azúcares del hexa-NAG a la energía libre estándar de unión del sustrato; obsérvese que es el anillo C el que realiza la mayor contribución energética, debido a que es al que se le facilita mas su unión.

EJERCICIOS DEL CAPÍTULO V

1. ¿Qué otras proteasas tienen triada catalítica?

2. ¿Cuál sería el comportamiento del Zinc como cofactor?

3. ¿Qué otros iones metálicos participan como cofactores?

4. ¿En qué casos se emplea la crioenzimología en la determinación del sitio de unión del sustrato?

5. ¿A qué se refiere la forma de silla y de bote de la glucosa?

Capitulo V

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