Cultivos Tropicalesversión ISSN 0258-5936

cultrop vol.31 no.3 La Habana jul.-set. 2010

 Efectividad de biofertilizantes micorrízicos en el rendimiento del pimiento (Capsicum annuum L. var. Verano 1) cultivado EN diferentes condiciones de humedad del sustrato 

Effectiveness of mycorrhizal biofertilizer on the yield of pepper (Capsicum annuum L. var. Verano 1) grown under different conditions of substrate moisture

L. Montero I. E-mail: lorenzo@iird.cu, Dra.C. Carmen DuarteII y Ms.C. R. CunIII, Dr.C. J. A. CabreraIV

I Investigador Agregado

II Investigadora Titular

III Investigador Auxiliar del departamento de Investigaciones, Instituto de Investigaciones de Riego y Drenaje (IIRD), Ave. Camilo Cienfuegos, Apdo. 6090, Arroyo Naranjo, Ciudad de La Habana

IV Investigador Titular y Ms.C. P. J. González, Investigador Auxiliar del departamento de Biofertilizantes y Nutrición de las Plantas, Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), gaveta postal 1, San José de las Lajas, La Habana, Cuba, CP 32 700.

RESUMEN

Se evaluó la aplicación de hongos micorrízicos arbusculares como alternativa de biofertilización en organopónicos y su efecto en el rendimiento del pimiento ante diferentes niveles de humedad del sustrato. A partir del inicio de la floración-fructificación, cuando el 20 % de las plantas se encontraban con flores, se establecieron dos variantes de riego, que consistieron en regar cuando la humedad del sustrato descendiera a valores de 65 y 90 % de la capacidad de contenedor (Cc). Las inoculaciones con las cepas Glomus hoi-like y Glomus mosseae incrementaron el rendimiento en la masa de los frutos del pimiento, con respecto al testigo sin inocular, entre 12 y 24 % en el tratamiento de menor contenido de agua (65 % Cc) y entre 10 y 20 % en el de mayor suministro de agua (90 % Cc) del sustrato. Con Glomus mosseae se obtuvo mayor rendimiento ante los diferentes niveles de humedad del sustrato.

Palabras clave: micorrizas, riego, organopónico.

INTRODUCCIÓN

En Cuba, los rendimientos del cultivo del pimiento (Capsicum annuum L.) han decrecido en los últimos años por diversos factores, entre los cuales se encuentran la

baja disponibilidad de fertilizantes minerales y las limitaciones en el suministro del agua, principalmente en el contexto urbano, donde es insuficiente el agua de buena calidad para el riego.

Una de las alternativas para incrementar la producción agrícola es la aplicación de biofertilizantes producidos a partir de hongos micorrízicos arbusculares (HMA), los que al establecer la simbiosis con las raíces de las plantas desempeñan importantes funciones, pues contribuyen de forma más eficiente a la supervivencia y el crecimiento de los cultivos, además de reducir los efectos de estrés asociados con la nutrición y las relaciones con el agua (1, 2). En este sentido, la formación de micorrizas juega un papel importante en el crecimiento de las plantas en condiciones de estrés hídrico (3, 4).

Teniendo en cuenta lo anteriormente planteado, se hace necesario desarrollar estudios para definir estrategias en la fertilización biológica y el manejo de riego del pimiento en condiciones de organopónicos, como alternativas económicamente viables para incrementar las producciones de este cultivo.

La aplicación de los HMA en organopónicos constituye una alternativa agronómica, que beneficia los rendimientos del pimiento, aun cuando existan variaciones en la humedad del sustrato.

Este trabajo se realizó con el objetivo de evaluar el efecto de la aplicación de los HMA en el rendimiento del pimiento en condiciones de organopónico bajo diferentes niveles de humedad del sustrato.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para el estudio se realizó un experimento durante la primavera del 2007, en el organopónico del Instituto de Investigaciones de Riego y Drenaje (IIRD), en Arroyo Naranjo, Ciudad de La Habana.

El organopónico está estructurado por canteros con un área de 6.08 m², separados por pasillos de 0.90 m rellenos con un sustrato, compuesto por la mezcla de suelo Nitisol Ródico Eútrico arcilloso, según la clasificación del World Reference Base (5) y estiércol bovino previamente descompuesto en una relación 1:1 v/v. 

Se utilizaron semillas de la variedad de pimiento Verano 1. El trasplante se realizó en la tercera decena de abril con plántulas logradas mediante la técnica de cepellones (6).

Se efectuó el monitoreo de las esporas sobre 50 g de sustrato, a partir de tres muestras por cantero, tomadas a una profundidad de 0.20 m, antes del trasplante y después de la cosecha de los frutos (96 días después del trasplante). El conteo de esporas se realizó según el método establecido (7) y la inoculación se aplicó en el nido a razón de 1 g de biofertilizante por planta en el momento del trasplante (8).

Se empleó un sistema de riego localizado por micro-aspersión, con un coeficiente de uniformidad de 90.63 % clasificado como bueno (9).En las fases de transplante-inicio de floración y maduración-cosecha (10), la norma neta de riego se calculó para todos los tratamientos a partir de la evapotranspiración del cultivo. Los datos de la evapotranspiración de referencia los suministró la Estación Meteorológica de Casa Blanca y los coeficientes del cultivo se determinaron en estudios anteriores en condiciones de organoponía (11). En la fase fenológica de inicio de la floración-fructificación, cuando el 20 % de las plantas se encontraban con flores,

se aplicaron dos variantes de riego, que consistieron en regar cuando la humedad del sustrato descendiera a 0.27 y 0.37 cm3.cm-3, que representan el 65 (V1) y 90 % (V2) de la capacidad de contenedor (Cc), cuyo valor es de 0.42 cm3.cm-3.

El diseño experimental consistió en los siguientes tratamientos:

V1T1: sin aplicar micorrizas y riego al 65 % CcV2T1: sin aplicar micorrizas y riego al 90 % Cc

V1T2: micorriza con la cepa Glomus hoi-likey riego al 65 % Cc

V2T2: micorriza con la cepa Glomus hoi-like y riego al 90 % Cc

V1T3: micorriza con la cepa Glomus mosseaey riego al 65 % Cc

V2T3: micorriza con la cepa Glomus mosseaey riego al 90 % Cc

Las precipitaciones durante el estudio se registraron con un pluviómetro insertado en el organopónico y la humedad volumétrica del sustrato se determinó diariamente a partir de la fase de inicio de la floración-fructificación, a una profundidad de 0.20 m en tres puntos en cada cantero, con una sonda electromagnética tipo TDR, la cual se calibró para este tipo de sustrato (12).

Se determinó la masa fresca de los frutos (rendimiento agrícola) en balanza técnica al momento de la cosecha.El diseño empleado fue muestral y el análisis estadístico para el procesamiento de los datos fue mediante la prueba de t-student para muestras independientes con un nivel de probabilidad de error de 5 %.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Al evaluar la cantidad de esporas al inicio (antes del trasplante) y después de la cosecha bajo los dos niveles de humedad establecidos (Tabla I), se encontraron diferencias significativas (p<0.05) entre los tratamientos de micorrizas en comparación con el testigo sin inocular.

Tabla I. Conteo de esporas en el sustrato

TratamientosCantidad de esporas.50g-1 de sustrato

Riego 65 % Cc Riego 90 % CcT1 (testigo)

MediaAntes Después Antes Después44.66 45.34 54.00 58.31

t- Student 0.2388 NS 0.1337 NS

T2 (Glomus hoi-like)

Media

 

43.60

 

146.30

 

48.33

 

184.38t- Student 0.0160* 0.0035 **

T3 (Glomus mosseae)

Media

 

45.08

 

180.16

 

50.20

 

194.00t- Student 0.0001 *** 0.0029 **

En el tratamiento de mayor suministro de agua inoculado con micorrizas, el número de esporas en el sustrato alcanzó valores superiores con respecto al testigo sin inocular, en el cual se demuestra que el nivel de humedecimiento en el sustrato del 90 % Cc

(0.37 cm3.cm-3) jugó un papel fundamental en el desarrollo de estos microorganismos en las condiciones estudiadas; es decir, que los niveles altos y estables de humedad en el sustrato estimulan el contenido de HMA. Similares resultados han sido reportados anteriormente (13), los que plantearon que con diferentes cepas de HMA evaluadas en pasto Guinea (Panicum maximum, cv. Likoni), se produjeron porcentajes de colonización y densidad visual superiores al testigo en el período lluvioso. Por otra parte, la cantidad de esporas observadas al final del ciclo vegetativo, donde el suministro de agua fue menor (0.27 cm3.cm-3), mostró ser superior en los tratamientos con HMA, de acuerdo al análisis del sustrato antes del trasplante, con valores de 102 esporas en la cepa Glomus hoi-like y 135 en Glomus mosseae; estos valores también superan el número de esporas obtenidas en el tratamiento testigo sin inocular.

Los resultados del tratamiento de baja aplicación de agua (65 % Cc) son de gran interés para el cultivo del pimiento, en las zonas donde existen grandes limitaciones hídricas, puesto que la formación de micorrizas juega un papel importante en el crecimiento de los cultivos en estado de estrés hídrico. Se ha determinado que las plantas inoculadas con HMA en condiciones de déficit hídrico desarrollan una capacidad de absorción superior a las no inoculadas, lo que favorece no solo la disponibilidad de nutrientes sino también de agua (3).

En la Figura 1A se muestra el comportamiento de la humedad del sustrato a partir de la fase de inicio de floración y fructificación del cultivo. Se observó que la humedad volumétrica se mantuvo como promedio cercana a los límites fijados, con valores de 0.27 cm3.cm-3 en el tratamiento de 65 % Cc y de 0.37 cm3.cm-3  para el de 90% Cc, excepto durante en el período comprendido entre junio y la primera decena de julio. En esta etapa, la humedad volumétrica se incrementó, alcanzando valores promedio de 71 y 96 % Cc para ambos tratamientos respectivamente, debido al comportamiento de las precipitaciones (Figura 1B).

El crecimiento y desarrollo del sistema radical de las plantas evaluadas en los tratamientos con HMA, donde se regó al 65 % Cc, se vieron estimulados por el efecto de los HMA, pues mostraron valores superiores de la masa seca al compararse con las desarrolladas en el tratamiento no inoculado. Este comportamiento pudo deberse a que las raíces de las plantas, al estar expuestas a un bajo nivel de humedad en el

sustrato, recibieron los beneficios de la simbiosis de estos microorganismos, lo que permitió una mayor absorción de agua y nutrientes, y contribuyó más eficientemente al incremento de este órgano de la planta en condiciones de estrés hídrico. Se ha demostrado que las hifas del hongo mejoran indicadores como la conductividad hidráulica de la raíz, lo cual disminuye su resistencia al paso del agua, aspecto que ha sido comprobado en plantas de Ulmus americana(14). Además, la simbiosis hongo-planta es típicamente mutualista, pues el hongo depende de la planta para la obtención de fotoasimilados y la planta recibe a cambio una variedad de beneficios, que le permite incrementar su crecimiento y mejorar sus relaciones hídricas (3). A continuación se puede observar en la Figura 2.

Cuando la humedad del sustrato se mantuvo a un nivel cercano al 90 % Cc, no se observaron diferencias significativas en la biomasa entre los tratamientos estudiados. Estos resultados indican que, para altos niveles de humedad en el sustrato, estas cepas no manifestaron influencia que favoreciera el crecimiento radical, lo que se puede atribuir a que las plantas tuvieron agua disponible en el sustrato durante todo el desarrollo de su ciclo biológico para satisfacer sus necesidades hídricas.

Los análisis de estos resultados ofrecen dos aportes de gran interés para el agricultor: en primer lugar, permiten valorar la importancia que tiene el suministro adecuado de agua, para que el pimiento pueda satisfacer su exigencia hídrica durante todas sus fases de desarrollo y, en segundo lugar, la incidencia que tiene la inoculación de HMA en el crecimiento de la biomasa de este cultivo en condiciones de bajo contenido de humedad del sustrato.

En la Figura 3 se presentan los valores medio de la masa fresca total de los frutos (kg.m-2). Como se puede apreciar, entre los tratamientos con micorrizas y el testigo sin inocular, existen diferencias significativas bajo los diferentes límites de humedad productiva (65 y 90 % Cc). El incremento de la masa fresca total de los frutos en los tratamientos inoculados está relacionado con el de la masa seca de las raíces, al explorar un volumen mayor de sustrato y absorber con mayor facilidad los nutrientes y el agua, mejorando de esta manera la nutrición de las plantas. En condiciones de estrés hídrico, la micorrización juega un papel esencial en activar la difusión de los iones y el agua hacia las raíces de las plantas hospederas, lo que le permite soportar las condiciones de sequía (2).

La aplicación de micorrizas como biofertilizante ecológico es un producto natural muy eficaz, para aumentar la producción del pimiento en condiciones de organopónicos, aun cuando existen variaciones de humedad en el sustrato. Esto constituye una alternativa para la producción sostenible de pimiento en aquellas áreas con limitaciones con el agua para el riego.

CONCLUSIONES

La inoculación con las cepas micorrízicas Glomus hoi-like y Glomus mosseae constituye una alternativa agronómica para los ambientes con limitaciones hídricas.La aplicación de biofertilizantes micorrízicos es una vía factible para aumentar los rendimientos agrícolas en condiciones de organopónicos.

Ecología Aplicadaversión impresa ISSN 1726-2216

Ecol. apl. v.5 n.1-2 Lima dic. 2006

 

ARTICULOS ORIGINALES

 

Producción de biofertilizantes utilizandoPseudomonas sp.

Biofertilizers production using Pseudomonas sp. 

Nery Santillana Villanueva1

1 Laboratorio de Rhizobiología, Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga. Portal Independencia N° 57 Ayacucho-Perú.nerysantillana@yahoo.es

 

RESUMEN

Con el objetivo de producir biofertilizantes utilizando 3 cepas de Pseudomonas sp., se realizaron tres experimentos: el primero, para encontrar un medio de cultivo apropiado para la multiplicación de las bacterias; el segundo, para determinar la sobrevivencia de las cepas de Pseudomonas sp en los biofertilizantes y el tercero para determinar la dosis eficiente de aplicación del biofertilizante en frijol, maíz, papa y tomate, en condiciones de invernadero. Al evaluar los resultados, se determinó que el medio de cultivo utilizado para la multiplicación de cepas de Pseudomonas sp., puede ser reemplazado por otros medios de cultivo de menor costo. La viabilidad de las cepas de Pseudomonas sp. en el inoculante fue similar hasta los 3 meses de conservación, garantizándose su uso hasta esa fecha. No se encontró diferencias significativas entre las dosis de biofertilizante aplicados a las plantas de frijol (Phaseolus vulgaris L.), maíz (Zea mays), papa (Solanum tuberosum L.) y tomate (Lycopersicon esculentum Mill.). La materia seca de la parte aérea y de la raíz de plantas de frijol y maíz inoculadas con las cepas de Pseudomonas sp. superaron con diferencias significativas al control sin inocular. En papa y tomate, no se encontraron diferencias significativas con el control.

Palabras claves: Biofertilizantes, Pseudomonas sp., dosis de aplicación.

INTRODUCCIÓN

El efecto de las actividades agrícolas en la degradación de los recursos naturales (erosión del suelo, uso de agroquímicos, etc.) es evidente en varias regiones de nuestro país, y debe ser evitado o por lo menos controlado. El uso de inoculantes biológicos (biofertilizantes), la incorporación de enmiendas orgánicas, las prácticas agrícolas que tienden a la conservación del suelo, la rotación de cultivos y el uso de leguminosas de cobertura, entre otras prácticas, pueden a largo plazo, contribuir a la recuperación de las poblaciones microbianas del suelo y con ello mejorar la calidad de este recurso (Cardoso et al., 1992; Siquiera & Franco, 1998; Lindsey & Jones, 1992). Los resultados de innumerables estudios, junto con la toma de conciencia sobre los efectos adversos de los pesticidas químicos, propiciaron el resurgimiento a escala mundial de la investigación sobre el uso de inoculantes bacterianos para controlar patógenos y mejorar el crecimiento vegetal. De esta manera se utilizan organismos

naturales (rizobacterias) para reducir los efectos de organismos indeseables (patógenos) y así favorecer la producción de cultivos vegetales (Siquiera & Franco, 1988; Pérez et al., 2000). Se conoce un gran número de bacterias de vida libre o asociativas que destacan por su potencial como biofertilizantes (Diaz et al., 2001; Zago et al., 2000), entre las que se encuentran las Pseudomonas. Los efectos positivos que ejercen estas bacterias en las plantas radican en que producen y segregan reguladores del crecimiento de plantas como auxinas, giberelinas y citoquininas, mejorando procesos como germinación de semillas, nutrición mineral, desarrollo de raíces, empleo del agua, entre otros (Pan et al., 1999).

En tal sentido, se realizó el presente trabajo de investigación con el objetivo general de producir biofertilizantes utilizando cepas de Pseudomonas sp. y con los siguientes objetivos específicos:

- Evaluar la multiplicación de tres cepas de Pseudomonas sp. en diferentes medios de cultivo.

- Evaluar la sobrevivencia de las cepas de Pseudomonas sp. en soporte a base de turba.

- Determinar la dosis apropiada de aplicación del biofertilizante en plantas de maíz, frijol, papa y tomate, en condiciones de invernadero.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

El trabajo de investigación se realizó en el laboratorio e invernadero del Area de Investigación de Rhizobiología, del Programa de Investigación en Pastos y Ganadería de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga – Ayacucho, ubicado a 2 750 msnm. Las cepas de Pseudomonas sp. utilizadas en el experimento, fueron aisladas y caracterizadas en trabajos anteriores realizados en el mismo laboratorio.

El presente trabajo comprendió tres experimentos, los que se indican a continuación:

Experimento 1: Multiplicación de Pseudomonas sp. en diferentes medios de cultivo.

Se consideró cuatro medios de cultivo (Tabla 1) y tres cepas de Pseudomonas sp.: C1, C2 y C3. Cada una de las cepas fueron reactivadas en tubos con agar nutritivo. A partir de los cultivos reactivados, se tomó una asada y se sembró en balones de 1 litro de capacidad con 500 ml de medio de cultivo. Los balones se incubaron a temperatura de ambiente (20°C). A las 24 y 48 horas de incubación se realizó la evaluación del crecimiento bacteriano, utilizando el método de dilución y siembra en placas con medio agar nutritivo. Las placas sembradas se incubaron a temperatura de ambiente y a las 48 horas se realizó el recuento de colonias.

Experimento 2: Sobrevivencia de Pseudomonas sp. en soporte.

Las cepas de Pseudomonas sp fueron multiplicadas en caldo nutritivo e incubadas durante 48 horas. Los biofertilizantes fueron preparados utilizando la técnica descrita por Santillana et al. (1998). Se consideró 2 repeticiones por cepa. La evaluación del número de bacterias por gramo de biofertilizante, se realizó utilizando el método de

dilución y siembra en medio de cultivo. Los resultados fueron evaluados mediante el ANVA en un experimento factorial de 3A x 3B x 2 repeticiones, donde A representa las cepas (C1, C2 y C3) y B los periodos de evaluación (después de la maduración, al mes y a los tres meses de conservación).

Experimento 3: Determinación de la dosis apropiada de biofertilizante para la aplicación a plantas de frijol, maíz, papa y tomate en condiciones de invernadero.

Para cada especie de planta se consideró tres dosis de biofertilizante (0.5; 1.0 y 2.0 gramos de biofertilizante por planta), un control sin inocular y un control con fertilización química. Se utilizó suelo de Pampa del Arco, el que se limpió y abonó con 60 unidades de roca fosfórica. Para el tratamiento con fertilización química se utilizó superfosfato triple y urea (80 – 80 – 0 de NPK). El suelo preparado se colocó en maceteros de 3 kg de capacidad, luego se humedecieron a capacidad de campo. En cada macetero se consideró una planta, la que fue inoculada con las respectivas dosis. El experimento por especie de planta fue conducido en el diseño completamente al azar con tres repeticiones por tratamiento. Los resultados de la materia seca de la parte aérea y de la raíz fueron evaluados mediante el análisis de variancia, la prueba de significación de Duncan (p< 0.05) y la determinación del Índice de Efectividad de la Inoculación (IEI).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Experimento 1: Multiplicación de Pseudomonas sp. en diferentes medios de cultivo.

El Análisis de Variancia del logaritmo del número de bacterias por ml de medio, mostró diferencias altamente significativas entre medios de cultivo, entre horas de evaluación y en la interacción medios por horas (AxC) y diferencias significativas en la interacción

medios por cepas (AxB). Por lo que se procedió al estudio de los efectos simples de las interacciones AxB y AxC. El ANVA para el estudio de los efectos simples de los factores A y C mostró diferencias altamente significativas de los medios de cultivo en las cepas C1 y C3; asimismo, entre horas en los medios M1, M2, M3 y M4.

Al realizar la Prueba de Duncan (p< 0.05) de las diferencias de los medios de cultivo en la Cepa 1 (C1)(Tabla 2) se observó que los medios de cultivo 1 y 2 superaron con diferencias significativas a los medios 3 y 4, indicando que el medio control (M1) puede ser reemplazado por el medio 2 (M2) que tiene 50% de peptona y extracto de carne, abaratando de esta manera los costos de producción. La cepa 3 (C3) puede ser multiplicada de preferencia en el medio 1, aunque no presentó diferencias significativas con los medios 2 y 4, sin embargo, superó significativamente al medio 3. La cepa 2 (C2) puede ser multiplicada en cualquiera de los medios de cultivo, es decir el medio control puede ser reemplazado. Los medio 3 y 4 aún son de menor costo. El medio 3 (M3) presenta sólo 25% de peptona, en lugar de extracto de carne presenta extracto de levadura. El medio 4 (M4) no presenta peptona, ni extracto de carne, sólo extracto de levadura y sacarosa y fosfato de potasio.

En la Tabla 3, se observa, en todos los casos, que el número de bacterias obtenido a las 48 horas superó

significativamente al número de bacterias de las 24 horas. Estos resultados indican que el cultivo de las 48 horas debe ser utilizado para la mezcla con el soporte.

Experimento 2: Sobrevivencia de Pseudomonas sp. en soporte.

Al realizar el Análisis de Variancia de la sobrevivencia de las cepas de Pseudomonas sp. en soporte a base de turba, evaluada después del periodo de maduración, al mes y a los 3 meses de conservación, no se encontró diferencias significativas en ninguna de las fuentes de variación, es decir entre cepas (A1, A2 y A3), entre periodos de evaluación (B1, B2 y B3) y en la interacción cepas por periodos de evaluación (A x B). Los resultados indican que la viabilidad de las tres cepas fue semejante hasta los tres meses de conservación del inoculante (Tabla 4), por lo que se podría recomendar su uso hasta los tres meses sin problemas de pérdida de viabilidad.

Experimento 3: Det erminación de la dosis apropiada de biofertilizant e para la aplicación a plantas de frijol, maíz, papa y tomate, en condiciones de invernadero.

En frijol y maíz la Prueba de Duncan (p< 0.05) de la materia seca de la parte aérea (Tabla 5) mostró que las dosis 2, 1 y 0.5 gramos y la fertilización química (FQ) superaron con diferencias significativas al control sin inocular, observándose incrementos entre 51 y 59% en frijol y entre 77 y 99% en maíz. En papa y tomate, los tratamientos con las diferentes dosis de inoculación fueron similares al control sin inocular.

En todos los cultivos evaluados, no se encontró diferencias significativas entre dosis de inoculación, indicando que puede utilizarse 0.5, 1 ó 2 gramos de inoculante por planta.

Los efectos positivos observados en frijol y maíz sugieren que posiblemente existió un sinergismo entre el hospedante y las bacterias, que junto con las fitohormonas que excretan las raíces provocaron el mayor desarrollo de la parte aérea de las plantas señaladas Así lo reportaron Dashti et al. (1997), Gutierrez-Zamora & Martinez-Romero (2001), Mayak et al. (2004) quienes al inocular rizobacterias promotoras del crecimiento, encontraron mayor desarrollo de la parte aérea de plantas de soya, maíz y tomate, respectivamente. Mientras que el bajo o nulo efecto de Pseudomonas sp. en las plantas de papa y tomate pudo deberse a que las cepas no encontraron el medio adecuado en la rizósfera de éstas plantas (Alexander, 1980).

Al evaluar la materia seca de las raíces, se observó en todos los casos, incrementos con relación al control sin inocular. En maíz y frijol, el desarrollo de las raíces, favorecido por efecto de la inoculación de Pseudomonas sp se manifestó en mayor crecimiento de la parte aérea del cultivo. Estos resultados concuerdan con los reportados por Pereira et al. (1988) y Santillana (2001) quienes observaron incrementos en el desarrollo radicular de diferentes plantas como sorgo, arroz y trébol cuando fueron inoculadas con rizobacterias, lo que repercute directamente en el rendimiento del cultivo.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

- El medio de cultivo utilizado para la multiplicación de las 3 cepas de Pseudomonas sp., puede ser reemplazado por otros medios de cultivo de menor costo.

- La cepa C1 puede ser multiplicada en el medio 2. La cepa C2 puede ser multiplicada en cualquiera de los medios de cultivo evaluados. La cepa C3 de preferencia en el medio 1 (control).

- Se determinó mayor número de bacterias a las 48 horas de incubación, número que superó con diferencias significativas a la viabilidad obtenida a las 24 horas.

- La viabilidad de las cepas de Pseudomonas sp en el inoculante fue similar hasta los 3 meses de conservación, garantizándose su uso hasta esa fecha.

- No se encontró diferencias significativas entre las dosis de biofertilizante aplicados a las plantas de frijol, maíz, papa y tomate.

- La materia seca de la parte aérea y de la raíz de plantas de frijol y maíz inoculadas con las cepas dePseudomonas sp. superaron con diferencias significativas al control sin inocular. En el caso de papa y tomate, no se encontró diferencias significativas con el control.

- En frijol se encontró incrementos de 53 a 59% de la parte aérea y de 10 a 25% de la raíz. En maíz, 77 a 91% de la parte aérea y de 83 a 110% de la raíz. En papa entre 2 a 4 % de la parte aérea y de 13 a 24% de la raíz. En tomate, se observó 40 a 45% de incremento de la raíz, no hubo incremento en la parte aérea.

- Se recomienda, continuar aislando y seleccionando cepas de Pseudomonas sp. eficientes en diferentes plantas de interés agrícola.

- Las cepas seleccionadas deben ser evaluadas a nivel de campos experimentales.

Agricultura técnica en Méxicoversión impresa ISSN 0568-2517

Agric. Téc. Méx vol.32 no.2 México may./ago. 2006

 

Artículos

 

Biofertilización con Azospirillum brasilense en sorgo, en el norte de México*

 

Azospirillum brasilense biofertilization in sorghum at northern Mexico

 

Jesús Gerardo García–Olivares1, , Víctor Ricardo Moreno–Medina1, Isabel Cristina Rodríguez–Luna1, Alberto Mendoza–Herrera1 y Netzahualcóyotl

Mayek–Pérez1

RESUMEN

Durante 2002–2004 se realizó este estudio cuyo objetivo fue evaluar tres cepas de Azospirillum brasilense(CBG–497, CBG–180 y CBG–181), nativas del norte de Tamaulipas, México, para caracterizarlas en laboratorio y determinar su capacidad de producir biomasa y grano de sorgo en condiciones de invernadero y campo. La cepa CBG–497 produjo mayor cantidad de ácido indol–acético in vitro que las cepas CBG–180 y CBG–181. En invernadero, también las plantas inoculadas con CBG–497 incrementaron significativamente la producción de biomasa (50%), en comparación con las del testigo no inoculado, mientras que las CBG–180 y CBG–181 incrementaron la biomasa en 12 y 22%, respectivamente. En campo los tratamientos inoculados tuvieron un rendimiento promedio de grano en sorgo de 13 y 17% mayor que el testigo no inoculado en 2002–2003 y 2003–2004, respectivamente; y las cepas CBG–180 y CBG–181 incrementaron el rendimiento en mayor proporción respecto al testigo (13 a 27%), en comparación con CBG–497 (10% a 12%). Los resultados indican que la aplicación de biofertilizantes con base en cepas nativas de A. brasilense, incrementaron el rendimiento del sorgo.

Palabras clave: Sorghum bicolor (L.) Moench, ácido 3–indol–acético, biofertilizantes, rendimiento de grano.

INTRODUCCIÓN

En el estado de Tamaulipas, México, durante 2004 se sembraron alrededor de 800 000 ha con sorgo [Sorghum bicolor (L.) Moench], cuya producción promedio de grano fue de 3.7 t ha–1 (SIAP, 2005). La mayor parte de dicha superficie se estableció en condiciones de temporal en el norte del estado, región caracterizada por la prevalencia

de altas temperaturas, escasa y errática precipitación pluvial, y altos índices de salinidad del suelo (SEDESOL, 1995). Para obtener rendimientos aceptables, el sorgo requiere cantidades importantes de fertilizantes químicos; sin embargo, su alto costo impacta negativamente en la rentabilidad del mismo; además incrementa el problema de la salinidad, debido a las características químicas de sus suelos. Una alternativa al uso de los fertilizantes químicos son los microorganismos promotores del crecimiento denominados: "bioestimulantes", "biofertilizantes" o "inoculantes".

Los microorganismos más utilizados son las bacterias de los géneros Rhizobium y Azospirillum, así como hongos micorrícicos del género Glomus, que generalmente provenientes de otras regiones, lo que limita a los agricultores locales. Así, los estudios sobre la adaptación y eficiencia biofertilizante de nuevas cepas deberán conducirse en las regiones donde se utilizarán recurrentemente. La inoculación con A. brasilense es altamente benéfica en gramíneas como: maíz, caña de azúcar, pastos y sorgo, pues aporta de 30 a 50% de los requerimientos de nitrógeno de dichos cultivos (Martínez–Morales et al., 2003; Viviene et al., 2004).

A partir del 2000, en el Centro de Biotecnología Genómica (CBG) del Instituto Politécnico Nacional se han aislado y caracterizado cepas de A. brasilense, nativas del norte de Tamaulipas, y se ha determinado su potencial biofertilizante en condiciones controladas de invernadero. Sin embargo, es necesario evaluar su potencial bioestimulante en cultivos de importancia económica bajo condiciones de campo. El objetivo del presente estudio fue evaluar el potencial biofertilizante en sorgo de tres cepas de A. brasilense nativas del norte de Tamaulipas.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Obtención de aislamientos de Azospirillum brasilense

Durante el otoño–invierno de 1999–2000 se realizaron colectas de suelos cultivados con maíz en los municipios de Díaz Ordaz y Río Bravo, Tamaulipas, México (26° 13' LN, 98° 35' LO y 40 msnm), sitios de suelos con textura franco–arcillosa y franco–arenosa, respectivamente, contenido de materia orgánica menor a 1% y pH de 7.8.

A. brasilense se aisló en medio de cultivo PY (peptona 0.5%, extracto de levadura 0.3%, CaCl2 0.007 M), adicionado con 20 µg mL–1 de ácido nalidíxico y 10 µg mL–1 de tetraciclina (Caballero–Mellado et al., 1992). Lugo et al. (2001), identificaron los aislamientos fijadores de N en el medio NFB (5 g de ácido málico y malato de sodio, 5 mL de K2HPO4 10%, 2 mL de MgSO4 7H2O 10%, 1 mL de NaCl 10%, 2 mL de CaCl2 1%, 2 mL de NaMoO4 2H2O 1%, 1 mL de MnSO4 2H2O 1%, 2 mL de azul de bromotimol 5%, 0.4 g de FeSO4 7H2O, 4 g de KOH, 0.8 mL de NH4NO3 10 mM, 1 mL de Biotina y Piridoxal, y 33 g de dextrana), mientras que la capacidad para producir sideróforos se determinó con el método cromoazurol (Schwyn y Neilands, 1987).

Caracterización in vitro de cepas de A. brasilense

Las cepas aisladas se desarrollaron en medio líquido Luria–Bertani (LB) adicionado con triptófano (0.1 g L–1) y se incubaron a 29 °C y 200 rpm de agitación constante. Se tomaron muestras del cultivo a las 24, 48 y 72 h en incubación y se centrifugaron a 1942 g por 30 min, en cada una se determinó la concentración de ácido 3–indol–acético (AIA) y triptófano por cromatografía de líquidos (HPLC, High Pressure Liquid Chromatograph, Hewlett Packard modelo 1100). Para la separación se utilizó una

columna RP–18 (Beckman Ultrasphere) de 150 mm de largo y 4.6 mm de diámetro interno, con tamaño de partícula de 5 mm. La fase móvil consistió en acetonitrilo–fosfatos 30/70 y detector de muestras de 20 mL de volumen de inyección, ajustado a 220 nm de longitud de onda. El equipo se calibró con la mezcla de estándares triptófano, AIA y ácido–indol–butírico (IBA) (Sigma–Aldrich Co., San Luis, Missouri, EUA), cuyos tiempos de retención fueron de 2.6, 6.4, y 15 min, respectivamente. El análisis se realizó por triplicado y se determinó la media y el error estándar de cada tratamiento (cepa), en cada tiempo de muestreo.

Efecto de A. brasilense en sorgo

Experimento en invernadero. El experimento se llevó a cabo en un invernadero del Centro de Biotecnología Genómica (CBG) del Instituto Politécnico Nacional (IPN) en Reynosa, Tamaulipas, durante el ciclo otoño–invierno de 2004, en charolas de plástico de 38 orificios en sustrato de turba (Redi Earh ScottR) con pH 6.8. Se inoculó con la aplicación de 1 mL de cultivo bacteriano, cultivado en medio líquido PY (Döbereiner et al., 1976) y suplementado con CaCl2 0.04%, durante 48 h a 32 °C y 200 rpm de agitación constante. Al momento de aplicarse, cada muestra tenía 1x108 unidades formadoras de colonia (ufc) mL–1. Al testigo se le aplicó agua destilada estéril. Se utilizó el híbrido comercial de sorgo DK–54 (DekalbR). Se empleó un diseño experimental completamente al azar, con 16 repeticiones y la unidad experimental fue de dos plantas. A los 7, 12, 15 y 23 días después de la siembra se cortó la parte aérea de las plantas de cuatro repeticiones, mismas que se secaron en estufa a 60 °C por 48 h. Se calcularon las medias y el error estándar para cada uno de los tratamientos en cada fecha de corte.

Experimento en campo. El estudio se realizó en condiciones de temporal durante los ciclos otoño–invierno de 2002–2003 y 2003–2004 en la localidad de Villa Cárdenas, Matamoros, Tamaulipas (97° 49' LN; 25° 55' LO y 11 msnm), donde el suelo tiene textura franco–limosa, pH de 8.1, conductividad eléctrica de 0.5 mmhos cm–1 a 25 °C, contenido de materia orgánica de 1.4% y altos contenidos de N inorgánico (NO3) (11.5 ppm), P (P2O5) (11.5 ppm) y K (550 ppm). Durante el desarrollo de los experimentos, se registraron temperaturas medias de 22.3 °C (2002–2003) y 21.8 °C (2003–2004), con una precipitación pluvial total de 164 mm (2002–2003) y de 429 mm (2003–2004).

Las cepas se cultivaron en 250 mL de medio líquido PY, suplementado con CaCl2 0.04% a 32 °C por 48 h y 200 rpm de agitación. Posteriormente, los cultivos se mezclaron con 500 g de turba estéril (Redi Earh ScottR) con pH 6.8. Las mezclas se incubaron por siete días a 32 °C en bolsas de polietileno, bajo condiciones asépticas. Antes de sembrarse, la semilla se mezcló con el inóculo (1 kg de inóculo por 14 kg de semilla, 6x107 ufc por semilla) y se agregó solución acuosa de goma arábiga 20% (40 mL kg–

1 de semilla) como adherente. La semilla inoculada y sin inocular se sembró inmediatamente después de la inoculación.

Los tratamientos (cepas de A. brasilense) se establecieron en parcelas de 24 surcos de 20 m de largo, y separados entre sí a 0.86 m, con una densidad de siembra de 220 000 plantas/ha. Al testigo no se le aplicó bacteria ni fertilización química, ya que en el norte de Tamaulipas es común no fertilizar el sorgo en condiciones de temporal. En cada parcela se tomaron cinco muestras de plantas a la cosecha, a partir de cinco surcos de 8 m de largo (34.4 m2) y se determinó el rendimiento de grano al 14% de humedad, expresado en toneladas por hectárea. Se calcularon las medias y el error estándar para cada tratamiento y experimento.

 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Caracterización in vitro de cepas de A. brasilense

Las cepas CBG–180 y CBG–181 presentaron menor producción de triptófano, precursor del AIA en A. brasilense(Van de Broek et al., 1999), que CBG–497 a las 24, 48 y 72 h en incubación; mientras esta última presentó la mayor producción de AIA (Figura 1). La relación directa entre la asimilación de triptófano y la producción de AIA en A. brasilense fue observada por Khawas y Adachi (1999) y Martínez–Morales et al. (2003). Lo mismo ocurre en otras especies de Azospirillum (Han y New, 1998; Holguin et al., 1999) y en otras bacterias tales como Rhizobium meliloti, Enterobacter cloacae, Pseudomonas syringae pv. fluorescens y Agrobacterium tumefaciens(Caballero–Mellado, 1999; Zakharova et al., 1999; Vázquez et al., 2000). La producción de altas cantidades de AIA in vitro es un parámetro apropiado en la selección de mejores cepas nativas de A. brasilense, para producir biofertilizantes de plantas cultivadas (Van de Broek et al., 1999).

Efecto de A.

brasilense en sorgo en invernadero y en campo

La inoculación con A. brasilense incrementó la producción de biomasa en sorgo a los 23 días después de la siembra, en comparación al testigo, y CBG–497 promovió la mayor producción de biomasa (Figura 2). En campo, las tres cepas incrementaron el rendimiento de grano en 500 kg ha–1 en 2002–2003 y en más de 700 kg ha–1 en 2003–2004 (Figura 3). Varios autores han reportado incrementos en el rendimiento en cultivos como maíz (Zea mays L.) (O'Hara et al., 1981; Okon y Labandera–González, 1994; Bashan et al., 1996; Fallik y Okon, 1997; Döbbelaere et al., 2002; Holguin et al., 2003; Irízar et al., 2003; Aguirre–Medina, 2004), frijol (Phaseolus vulgaris L.) (Burdman et al., 1996), trigo (Triticum aestivum L.) (Döbbelaere et al., 2002), garbanzo (Cicer arietinum L.), haba (Vicia faba L.) (Hamaoui et al., 2001) pastos (Setaria italica) (Fallik y Okon, 1997) y sorgo [Sorghum bicolor (L.) Moench] (Martínez–Medina et al., 2004).

Contrario a lo observado en invernadero, en el campo las cepas CBG–180 y CBG–181 incrementaron el rendimiento de grano respecto al testigo en 21.5% y 13.4%, respectivamente (Figura 3). La cepa CBG–497 ocasionó los mayores incrementos en la acumulación de biomasa en sorgo, cultivado en invernadero, lo que probablemente se asocia con la mayor producción de AIA; resultados similares han sido reportados por Sumner (1990); Okon y Labandera–González (1994); Bashan y Holguin (1997) y Döbbelaere et al. (2002).

En general, la producción de grano fue mayor en 2003–2004 debido a que la precipitación pluvial fue mayor al ciclo anterior en 162%. Los resultados de este trabajo concuerdan con los de Okon et al. (1976), Levanony y Bashan (1991), Kanungo et al. (1997), Bashan (1998), Díaz–Franco et al. (2004) y Pecina–Quintero et al. (2005), quienes reportaron la interacción positiva entre el desarrollo y colonización de A. brasilense y el contenido de humedad en el suelo. Las cepas CBG–180 y CBG–181 alcanzaron los mayores incrementos en la producción de grano, en comparación con el testigo. Las diferencias entre cepas, respecto a la producción de la biomasa o grano, se deben principalmente al efecto de las condiciones ambientales variables en la colonización de cada cepa de forma específica (Pecina–Quintero et al., 2004; 2005).

Las cepas CBG–180 y CBG–181 se aislaron de suelos franco–arenosos de Río Bravo, mientras que la cepa CBG–497 se aisló en Díaz Ordaz de suelos franco–arcillosos. Las condiciones del suelo del sitio de prueba [características físico–químicas del suelo, poblaciones nativas de A. brasilense y clima (Pecina–Quintero et al., 2005)], probablemente favorecieron el efecto promotor del crecimiento vegetal en CBG–180 y CBG–181.

Los efectos positivos de A. brasilense en diversos cultivos se atribuyen principalmente al mejoramiento en el desarrollo de la raíz y al incremento subsecuente en el hospedante de la tasa de asimilación de agua y la utilización de minerales del suelo (Fallik y Okon, 1996; Burdman et al., 1997; Hamaoui et al., 2001; Döbbelaereet al., 2002). La inoculación con A. brasilense ha incrementado los rendimientos de grano de cereales en condiciones de campo (mayores al 30%), así como el crecimiento y la acumulación de biomasa en invernadero para diversas especies de plantas (Sumner, 1990; Okon y Labandera–González, 1994).

A pesar de los resultados positivos, la inoculación con A. brasilense se asocia aún con la inconsistencia (Ramírez y Luna, 1995; Pecina–Quintero et al., 2005), lo que restringe su desarrollo como inóculo comercial en gran escala (Bashan y Holguin, 1997). Los factores responsables de tales irregularidades son difíciles de identificar, pero generalmente se atribuyen a lo variable de las condiciones ecológicas y ambientales, tales como físico y químicas del suelo, presencia de microorganismos en la rizósfera, genotipo del hospedante o la capacidad de la bacteria para establecerse y competir con la microflora nativa (Okon y Labandera–González, 1994; Ramírez y Luna, 1995; Döbbelaere et al., 2002; Pecina–Quintero et al., 2005). Las características básicas de la interacción A. brasilense–raíces y los diferentes parámetros críticos para obtener la inoculación exitosa, pueden mejorar la eficacia de los inóculos basados en A. brasilense bajo condiciones ambientales y del suelo variables, y de esta forma, estimular su utilización comercial en la producción agrícola en campo (Bashan y Holguin, 1997).

 CONCLUSIONES

La cepa CBG–497 de A. brasilense logró los mayores incrementos en la producción de biomasa de sorgo en invernadero debido a su mayor producción de AIA.

Las cepas de A. brasilense nativas del norte de Tamaulipas incrementaron la producción de biomasa y el rendimiento de grano en sorgo.