DETERMINACION DEL POTENCIAL ANTIOXIDANTE DEL EXTRACTO Y METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS PERTENECIENTES AL LIQUEN

COLOMBIANO RIMELIA CETRATA

JEISSON ANDRES PABON ORTIZ20022150056

NINA MARIA SANCHEZ RAMIREZ20012150070

MARIA DEL PILAR SILVA MARTINEZ 20022150069

Trabajo de grado para optar al titulo de Licenciatura en Química.Línea Evaluación Biológica y Fisicoquímica de Metabolitos Secundarios de

Líquenes Colombianos

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDASFACULTAD DE CIENCIAS DE LA EDUCACION

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIADEPARTAMENTO DE QUIMICA FARMACEUTICA

BOGOTA, D.C. 2007

DETERMINACION DEL POTENCIAL ANTIOXIDANTE DEL EXTRACTO Y METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS PERTENECIENTES AL LIQUEN

COLOMBIANO RIMELIA CETRATA

JEISSON ANDRES PABON ORTIZ20022150056

NINA MARIA SANCHEZ RAMIREZ20012150070

MARIA DEL PILAR SILVA MARTINEZ 20022150069

Trabajo de grado para optar al titulo de Licenciatura en Química.Línea Evaluación Biológica y Fisicoquímica de Metabolitos Secundarios de

Líquenes Colombianos

DIRIGIDO POR:DR. JOSE LEOPOLDO ROJAS ARAQUE

Investigador Principal

DRA. NORMA ANGELICA VALENCIA ISLASCo- Investigadora

LIC. MARISOL RAMOSDocente Titular Universidad Distrital Francisco José de Caldas

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDASFACULTAD DE CIENCIAS DE LA EDUCACION

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIADEPARTAMENTO DE QUIMICA FARMACEUTICA

BOGOTA, D.C. 2007

Nota de Aceptación

________________________

________________________

________________________

__________________________Firma del Presidente del Jurado

__________________________Firma del Jurado

__________________________Firma del Jurado

Dedicatoria

“Si resultara cierto que alimentar a los extraños es inherente a la naturaleza toda, como

Algo que tiene carácter de ley general, muchos enigmas quedarían entonces resueltos”

Goethe 1827, in Kropotkin, El apoyo mutuo: un factor de evolución.

AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan agradecimientos a:

Marisol Ramos, Licenciada en Química, Facultad de Ciencias de la Educación, Universidad Distrital Francisco José de Caldas, Docente Titular, por su constante apoyo y motivación al trabajo.

DRA. Norma Angélica Valencia Islas, Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Co- investigadora del proyecto, por sus valiosos e importantes aportes y orientaciones.

DR. José Leopoldo Rojas Araque, Departamento de Química, facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Investigador Principal del proyecto, por sus valiosas sugerencias.

CONTENIDO

Pág.

1. INDICE DE TABLAS 02. INDICE DE FIGURAS 03. INDICE DE ANEXOS 04. RESUMEN 05. CAPITULO I 0

5.1. JUSTIFICACIÓN 05.2. INTRODUCCION 05.3. ESTUDIOS PREVIOS 0

5.3.1. Del Género 05.3.2. Del Método 0

5.4 PROBLEMA 05.5. HIPOTESIS 05.6. OBJETIVO GENERAL 05.7. OBJETIVOS ESPECIFICOS 0

6. CAPITULO II 06.1. LIQUENES 06.2. CONSTITUYENTES DE LOS LIQUENES 0

6.2.1. Fotobionte o componente algal (ficobionte) 06.2.2. Micobionte u hongo liquenizado 06.2.3. Relaciones entre los simbiontes 06.2.3.1. Relación fisiológica 06.2.4. Morfología y anatomía del talo 0

6.3. ASPECTOS ECOLOGICOS 06.3.1. Sustratos liquénicos 06.3.2. Resistencia a condiciones extremas 06.3.3. Sustancias de los líquenes 06.3.4. Uso de los líquenes 06.3.5. Habitats de los líquenes 0

6.4. QUIMIOTAXONOMIA 06.4.1. Química de los líquenes 06.4.2. Test de coloración 06.4.3. Cristalización 06.4.4. Técnicas cromatográficas 0

6.4.4.1. Cromatografía en capa fina 06.4.4.2. Cromatografía en columna 0

6.4.5. Técnicas espectroscópicas 0

6.4.5.1. Espectroscopía infrarrojo 06.4.5.2. Espectroscopía RMN 06.4.5.3. Espectroscopía ultravioleta 0

6.5. TECNICAS DE COLECCIÓN Y ESTUDIO 06.5.1. Materiales 06.5.2. Datos de campo 06.5.3. Colecta 06.5.4. Estudio del material en el laboratorio 0

7. CAPITULO III 0

7.1. METODOLOGIA 07.1.1. Colecta y Selección del Liquen 07.1.2. Método de Extracción 07.1.3. Elución del extracto primario crudo en 0

cromatografía en columna (CC)7.1.4. Aislamiento de compuestos por polaridad 07.1.5. Test de coloración 07.1.6. Clasificación y separación de compuestos 0

en cromatografía en placa.7.1.7. Purificación de compuestos (CC y CP) 07.1.8. Elucidación estructural de compuestos 0

(RMN, IR, UV, MP, EM).7.1.9. Ensayo de actividad antioxidante (CP) 0

compuestos impuros.7.1.10. Prueba de actividad antioxidante 0

(método DPPHo) de extracto.

8. CAPITULO IV 0

8.1. RESULTADOS 08.2. ANALISIS DE RESULTADOS 08.3. CONCLUSIONES 0

9. CAPITULO V 0

9.1. RECURSOS 09.1.1. HUMANOS 09.1.2. FISICOS 0

9.1.2.1. Materiales 0

9.1.2.2. Equipos 09.1.2.3. Reactivos 0

9.1.3. FINANCIEROS 09.2. CRONOGRAMA 09.3. COMPONENTE PEDAGOGICO 09.4. BIBLIOGRAFIA 0

1. INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Algas participantes en la simbiosis primaria de líquenes.

Tabla 2. Fases de formación de un talo.

Tabla 3. Distribución de líquenes según sustrato.

Tabla 4. Test De Coloración.

Tabla. Materiales

Tabla. Equipos

Tabla. Tiempo De Los Líquenes 1y 2 En El Sistema Soxhlet

Tabla. Masa Inicial Del Liquen Rimelia Cetrata

Tabla. Ubicación De La Especie Parmotrema

Tabla. Tiempo De Los Líquenes En El Método Soxhlet

Tabla. Test De Coloración. Para El LQ Rimelia Cetrata Y LQ 2

Tabla. Test De Coloración. Para Las Fracciones Del El LQ Rimelia

Tabla. Sistemas Para El Barrido De Las Cromatografías

Tabla. Elusión Del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata

Tabla . Clave De La Elusión Del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo De La

Rimelia Cetrata

Tabla . Punto De Fusión De Algunas De Las Claves Que Se Encuentran Puras De La

Rimelia Cetrata

Tabla . Masas Del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata

Tabla . De Las Masas Del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo De La Rimelia

Cetrata

Tabla . Cromatografía En Columna De La Fracción D A Partir Del Extracto Crudo De La

Rimelia Cetrata

Tabla . Clave De La CC De La Fracción D A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia

Cetrata

Tabla . Masas De La Fracción D De La Rimelia Cetrata

Tabla . CC De La Fracción E A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata

Tabla . Clave De La CC De La Fracción E A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia

Cetrata

Tabla . CC De La Fracción CDd A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata

Tabla .Clave De La CC De La Fracción CDd A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia

Cetrata

Tabla . Masas De Las Fracciones A partir De CDd De La Rimelia Cetrata

Tabla . CC De La Fracción Ed A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata

Tabla . Clave De La CC De La Fracción Ed A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia

Cetrata

Tabla . Masas De Las Fracciones Ed De La Rimelia Cetrata

Preparativa De La Fracción 2cdd Y De La 3cdd

Tabla . Preparativa De La Fracción 2cdd Y De La 3cdd

Tabla . Cromatografía Flash De Mediana Presión De La Fracción E A Partir Del

Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata

Tabla .Clave De La cromatografía Flash De Mediana Presión De La Fracción E A Partir

Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata

Tabla . Masas Del Fraccionamiento Primario Del Ed De La Rimelia Cetrata

Tabla . Cromatografía Flash De Mediana Presión De La Fracción E,

Tabla . Clave De La Cromatografía Flash De Mediana Presión De La Fracción E

Tabla . Masas Del Fraccionamiento Primario Del E De La Rimelia Cetrata

Tabla . Valores Espectrofotometricos De [DPPH°] & Absorbancia

Tabla . Valores Espectrofotometricos De [AcAsc] & Absorbancia

2. INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Estructuras de metabolitos secundarios aislados de líquenes.

Figura 2. Cromatografía en columna.

Figura 3. Cromatografía en placa bidimensional.

Figura 4. Esquema de la metodología empleada.

Figura 5. Método soxhlet.

3. INDICE DE ANEXOS

Anexo . Sistema SoxlherAnexo . Preparación De La Sílice Gel Impregnada Con Ácido Oxálico Al 1%.Anexo . Cromatografía En ColumnaAnexo . Cromatografía PreparativaAnexo . RecristalizacionAnexo . Preparación De La Curva De La Curva De Calibración Del Radical [DDPPH]Diagrama . Cinética Del Ácido Ascórbico & Radical Libre (DDPPH)Anexo . Cinética De La Muestra Biológica Del Liquen Rimelia Cetrata Con El Radical Libre (DPPH).Anexo . Balanza AnalíticaAnexo . Balanza de tres brazosAnexo . Cámara de UVAnexo . Campana de ExtracciónAnexo . Columna CromatograficaAnexo . Columna Flash de mediana PresiónAnexo . Espectrofotómetro UVAnexo . Horno de calentamientoAnexo . Horno SecadorAnexo . MicroscopioAnexo . Punto de FusiónAnexo . Rotavapor)Anexo . Soxhletnexo . 1,2 DifenilEndiaminaAnexo . Etilo Acetato Para Cromatografía En Fase LiquidaAnexo . Acido Acético (Glacial) 100% PuroAnexo . Acido L (+) AscórbicoAnexo . Acido FormicoAnexo . Acido Oxálico DihidratadoAnexo . Acido SulfuricoAnexo . Agua DestiladaAnexo . Benceno Para Cromatografía En Fase LiquidaAnexo . Cloruro de Hierro (III)

Anexo . EtanolAnexo . Éter Dietilico PuroAnexo . Hidróxido De PotasioAnexo . Hipoclorito De SodioAnexo . MetanolAnexo . n-Hexano Para Cromatografía En Fase LiquidaAnexo . Silicagel GranuladoAnexo . Sulfato De MagnesioAnexo . Tolueno Para Cromatografía En Fase LiquidaAnexo . Infrarrojo del Compuesto BAnexo . Infrarrojo del Compuesto CAnexo . Resonancia Magnética Nuclear del CompuestoBAnexo . Resonancia Magnética Nuclear del CompuestoCAnexo . Resonancia Magnética Nuclear del CompuestoD

4. RESUMEN

El principal objetivo de esta investigación es realizar un estudio detallado de una especie

de Liquen de Género Rimelia, desde el punto de vista Fitoquímico y así posteriormente

hacer el estudio Cinético a nivel de Extracto con el Radical Libre 2,2- Difenil-1-

picrilhidracilo DPPH°.

Como consecuencia de la gran diversidad biótica que posee nuestro país y la

incalculable fuente de riquezas se puede llegar a tener aplicaciones muy útiles en la

salud, industria, agricultura, biotecnología, entre otras. Uno de estos recursos que no ha

sido muy estudiado desde la parte Química son los Líquenes pero llama bastante la

atención la capacidad que este posee para sobrevivir en condiciones extremas,

habitando en medio ambientales como en el desierto, en los polos, y mas aún en zonas

donde se presenta un clima tropical

Durante el desarrollo de este trabajo nos propusimos cumplir a cabalidad con los

objetivos planteados, relacionado casi en su totalidad con la parte Química del Liquen

perteneciente al Género Rimelia.

Así pues, en el Capitulo I se hace una descripción de los objetivos propuestos, el

problema de investigación y los estudios previos realizados por otros autores.

En el Capitulo II, se tratan todos los aspectos relacionados con la diversidad y riqueza

en las regiones Naturales de Colombia, aspectos ecológicos, y un gran énfasis con

respecto a la Quimiotaxonomia, técnicas de Colección y Estudio. En el Capitulo III se

expone la metodología utilizada durante el proceso de investigación.

En el Capitulo IV, se muestran los resultados obtenidos y se realiza el análisis en

cuanto a estos y se concluye finalmente.

En el Capitulo V se tiene en cuenta el enfoque Pedagógico y Medioambiental como

Futuros Licenciados En Ciencias De La Educación.

Es de gran importancia resaltar que para el estudio Fisicoquímico se hace uso de

Técnicas y Métodos de Separación (cromatografía); en un principio se realizó la

extracción del LQ haciendo uso de la Extracción Continua en Equipos Soxhlet (20°C),

pues es uno de los métodos mas utilizados para obtener constituyentes orgánicos de

tejidos vegetales secos y pulverizados, este procedimiento es ideal para el análisis a

gran escala y como disolvente se utiliza Metanol el cual nos brindará un buen

rendimiento, ya que puede llegar a penetrar rápidamente en los órganos vegetales,

además se tiene en cuenta otras características como la selectividad (poder

disolvente), temperatura de ebullición (estabilidad térmica de los constituyente), poder

de penetración de las paredes celulares, facilidad de recuperar, precio o costo,

seguridad de manipulación, baja reactividad.

Ya con el extracto en bruto se empleo una de las técnicas de separación para los

componentes de una mezcla de solutos, como son las separaciones cromatográficas, la

cual tiene en cuenta las propiedades fisicoquímicas, tales como la polaridad y la carga

iónica de los solutos, el tamaño molecular, el grado de adsorción entre los solutos y las

fases estacionarias, o el reparto entre dos solutos entre las fases líquidas inmiscibles.

En este estudio vamos a utilizar la Cromatografía en columna (CC), la cromatografía en

capa fina (CCF), cromatografía preparativa (CP).

Posteriormente se utilizo Métodos Instrumentales como Infrarrojo (IR), Ultravioleta (UV),

Masas, Resonancia Magnética Nuclear (RMN), espectrofotometría UV, de los

compuestos puros, con el fin de conocer los compuestos hallados. Finalmente se

realizo el Estudio Cinético del Extracto frente al radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidracilo

DPPH°.

5. CAPITULO I

5.1. JUSTIFICACIÓN

En nuestro país existe una amplia biodiversidad de líquenes, los cuales representan un

recurso de gran importancia y atractivo para el mundo. El estudio de estos organismos

ha despertado en la actualidad un gran interés debido a varias propiedades bioactivas

que poseen los metabolitos secundarios que los conforman. Gracias a varios estudios

realizados en Colombia se conoce una amplia gama de las especies que existen de

estos organismos, donde las investigaciones realizadas se han enfocado básicamente

en la clasificación taxonómica contribuyendo en gran medida al conocimiento de la

biodiversidad de líquenes de nuestro país.

Sin embargo en el aspecto químico y biológico los estudios realizados han sido pocos,

ya que aún existe una gran cantidad de especies sin clasificar taxonómicamente dada

la carencia de estudios químicos indispensables para tal fin, la siguiente propuesta

pretende contribuir al conocimiento de la química de los líquenes Colombianos.

Por las razones expuestas y dado el gran potencial que ofrecen los Líquenes como una

fuente de nuevos principios activos y la gran diversidad de Colombia en este recurso

natural, la búsqueda de nuevos y mejores agentes antioxidantes para el tratamiento y

prevención de muchas enfermedades y para el uso en alimentos y cosméticos serán las

problemáticas guías en el proyecto de investigación.

5.2. INTRODUCCIÓN

Los líquenes son organismos simbióticos entre un alga y un hongo, dichos organismos

han sido poco estudiados en nuestro país. Gracias al grupo de investigación en

Estudios Biológicos y Fisicoquímicos de Líquenes Colombianos de la Universidad

Nacional de Colombia dirigido por el Dr. José Leopoldo Rojas Araque, junto con el

apoyo del Instituto de Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia se ha podido

incrementar la investigación en este campo.

El estudio de la actividad antioxidante en extractos liquénicos y compuestos aislados

de los mismos ha sido poco explorado en nuestro país, como se menciono con

anterioridad, los estudios realizados por autores como, (K. DIVAKAR, BLANCO, L.

HAWKSWORTH, CRESPO, 2005) en el género Rimelia cetrata se han encaminado al

estudio taxonómico del mismo, sin embargo no se ha realizado un estudio detallado

acerca de la bioactividad de los metabolitos secundarios que se presentan en dicha

especie.

Para ello es de gran importancia realizar inicialmente un estudio fitoquímico donde se

logre aislar e identificar aquellos metabolitos secundarios de mayor actividad que

presenta la especie y de esta manera realizar un estudio fisicoquímico para lograr

contribuir al desarrollo científico de nuestro país.

5.3. ESTUDIOS PREVIOS

5.3.1. Antecedentes del Género Rimelia

En la base de datos consultada, se encontraron tres artículos relacionados con el

género Rimelia cetrata, estos están basados básicamente en el aislamiento e

identificación de glucanos y galactoglucanos con el fin de presentar información acerca

de la taxonomía de este líquen.

En el articulo titulado “Molecular phylogenetic studies on the Parmotrema reticulatum

(syn. Rimelia reticulata) complex, including the confirmation of P. pseudoreticulatum as

a distinct species” (K. DIVAKAR, BLANCO, L. HAWKSWORTH, CRESPO, 2005).

Se concluye que la Parmotrema reticulatum (TAYLOR, M.CHOISY), P. clavuliferum y P.

pseudoreticulatum, son organismos simbióticos de una misma familia que provienen de

un grupo morfológicamente similar, por tal motivo es indiscutible su parecido

químicamente (todos estos géneros contienen atranorina, cloroatranorina, ácido

salazinico y consalazinico). Sin embargo algunos autores (Sano & Fletcher 1990; Sano

& DePriest 1999; Kurokawa 1991, 2003), colocan dichos géneros por separado o a

veces en el género Rimelia, en el cual se encuentra el cetrata.

En los artículos titulados “Chemotypes significance of lichenized fungi by structural

characterization of heteropolysaccharides from the genera Parmotrema and Rimelia” y “

Chemotypes significance of lichenized fungi by structural characterization of

heteropolysaccharides from the genera Parmotrema and Rimelia” (ROSECHRER,

GRASSI MELLINGER A, ELIASARO B, GORIN A, IACOMINI, 2005). Se aislaron

Galactoglucanos y glucanos de los hongos liquenizados del género Parmotrema

(austrosinense de Parmotrema, Parmotrema delicatulum, mantiqueirense de

Parmotrema, schindlerii de Parmotrema, y tinctorum de Parmotrema) y de Rimelia (el

cetrata de Rimelia y reticulata de Rimelia) en dichos estudios se concluyo la similitud

de estos dos géneros. La química y análisis de estos compuestos es posible a varios

métodos espectroscópicos y cromatográficos. Gracias a estos análisis la taxonomia de

este tipo de organismos se estructura aún más.

Los estudios mostrados con anterioridad elucidan la problemática taxonómica de estos

géneros (Parmotrema y Rimelia) en cuanto a sus propiedades químicas, por medio del

aislamiento y la aplicación de métodos espectroscópicos y cromatográficos de dichos

compuestos (glucanos y galactoglucanos) se pudo llegar a la conclusión de que estos

géneros no pueden ser separados. Sin embargo se desaprovecha el potencial del sin

número de compuestos que presentan este tipo de hongos liquenizados, por tal razón

es de suma importancia utilizar dichas propiedades con el fin de un desarrollo a futuro

en el campo de la medicina, industria, alimentos, etc.

5.3.2. Antecedentes del Método

Los estudios y trabajos que se han realizado con líquenes tanto en el aislamiento de

compuestos como en lo relacionado con actividad antioxidante han marcado una pauta

en cuanto a la utilización de estos en distintas áreas tanto en la educación como a nivel

científico, de estos citaremos algunos ya que por su interés y hallazgo son relevantes,

de tal forma también se tuvo en cuenta estos para aplicar la metodología de este

estudio.

En el artículo “Use of Free Radical Method to Evaluate Antioxidant Activity” (WILLIAMS,

E. CUVELIER, C. BERSET, 1995) se utiliza el radical DPPH (2,2-Difenil-1-picrilhidracilo)

como técnica para la evaluación de actividad antioxidante, esta prueba se hace para

compuestos fenólicos, los cuales presentan mayor actividad. Se hace un análisis

detallado de los resultados y se discute de acuerdo a la química de las reacciones

establecidas. Este artículo es la base del estudio cinético para determinar actividad

antioxidante en nuestro estudio, y posee constantes establecidas para posibles

compuestos aislados.

El segundo articulo relevante y de gran ayuda en nuestro estudio se titula “ Improved

Chromatographic Method for the Purification of Phenolic Constituents of the Lichen

Parmotrema Tinctorum (Nyl.) Hale” (G. K. JAYAPRAKASHA, L. JAGANMOHAN, R. P.

SINGH, K. K. SAKARIAH, 1998) en este trabajo se estandariza el método

cromatografico para el aislamiento de los compuestos liquénicos, establece criterios

comprobados en cuanto a cantidad de reactivos y características de estos y menciona

los diversos sistemas de elución para obtener determinado compuesto. Otro articulo

relacionado con estos estudios cromatográficos en líquenes se titula “A Standardized

Method for the Identification of the Lichen Products” (F. CULBERSON, H.

KRISTINSSON, 1970) Se diferencia del anterior por poseer tablas de RF y test de

coloración de compuestos liquénicos. Además muestra otros sistemas de Elución y la

correcta forma de tomar los rf.

En otros estudios relacionados con la actividad antioxidante de importancia han sido:

“Determination of Antioxidative Potencial of Lichen Usnea Ghattensis in Vitro” (B. C.

BEHERA, N. VERMA, A. SONONE, U. MAKHIJA, 2004), “Free Radical Scavenging

Behavior Antioxidant Compounds of Sesame (Sesamum Indicum L.) in DPPHo System”

(K. P. SUJA, A. JAYALEKSHMY, C, ARUMUGHAN, 2004), “Comparison of Antoxidant

Activity and Phenolic Content of Three Lichens Species”(F. ODABASOGLU, A. ASLAN,

A. CAKIR, H. SULEYMAN, Y. KARAGOZ, M. HALICI, Y. BAYIR, 2004 ) “Determination

of Antioxidant Activity of Lichen Cetraria Islandica(L) Ach ” (I. GÜLÇIN, M. OKTAY, Ö.

KÜFREVIOGLU, A. ASLAN, 2001), algunos nombran el método de tiocianato con el fin

de ensayar actividad antioxidante, sin embargo realizan otros estudios, como

determinación de contenido fenólico y poder reductor.

5.4. PROBLEMA

Aislar los Metabolitos Secundarios de mayor Actividad frente al radical 2,2-Difenil-1-

picrilhidracilo DPPH● de un LQ Colombiano del género Rimelia y así poder realizar los

ensayos del poder antioxidante a nivel de Extracto.

5.5. HIPOTESIS

Los metabolitos aislados del líquen de la especie Rimelia presentaran una actividad

antioxidante relevante frente al radical 2,2-Difenil-1-picrilhidracilo DPPH●.

El aislamiento de los metabolitos de la especie Rimelia permitirá la clasificación

taxonómica dentro de la colección de líquenes Colombianos del Instituto de Ciencias

de la Universidad Nacional de Colombia.

5.6. OBJETIVO GENERAL

Contribuir al conocimiento de la química de los líquenes Colombianos del género

Rimelia de una especie no analizada, con la finalidad de identificar y aislar los

metabolitos secundarios presentes en el organismo y de esta manera determinar el

potencial antioxidante a nivel de Extracto mediante el ensayo del poder antioxidante

y del poder reductor.

5.7. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Realizar un estudio Fitoquímico detallado del LQ perteneciente al Género Rimelia.

Identificar y caracterizar los metabolitos secundarios aislados presentes en el liquen

estudiado mediante la determinación de sus constantes físicas a partir de técnicas

espectroscópicas.

Hacer uso del estudio cinético de la reacción del compuesto con el radical libre de

DPPH° a partir de la constante de velocidad y de los Ec50.

6. CAPITULO II

6.1. LÍQUENES.

Los líquenes u hongos liquenizado son organismos complejos formados por un hongo

y un alga. A estas unidades se llega por un equilibrio dinámico entre estos dos tipos de

organismos, en ellos la parte algal actúa como organismo fotoautótrofo que aporta

hidratos de carbono, mientras que la parte fúngica actúa como heterótrofo aportando

sales y agua. Los líquenes se clasifican de acuerdo con el tipo de hongo (llamado

micobionte) que los componen. El micobionte de la mayoría de los líquenes es un

ascomicete, aunque en algunos líquenes tropicales es un basidiomicete (VALENCIA-

AGUIRRE, 2002; DE BARY, 1879; SCHWENDENER, 1868). El alga que compone un

liquen (llamada ficobionte) suele ser unicelular del tipo de las algas verdes, como

Trebouxia o Coccomyxa, o del tipo de las algas verdeazuladas, como Nostoc o

Scytonema.

6.2. CONSTITUYENTES DE LOS LIQUENES.

6.2.1. Fotobionte O Componente Algal (Ficobionte)

Las algas presentes en los talos liquénicos (aproximadamente cuarenta géneros),

clorofíceas y cianobacterias de tipo unicelular, cenóbico o filamentoso reciben

diferentes denominaciones como: algas simbióticas, algas liquenicas, componente

algal, fotobionte o ficobionte. Las algas simbiontes son de vida libre, pueden subsistir

libremente en la naturaleza en donde se reproducen sexual y asexualmente

comportándose como simbiontes facultativos en la asociación liquénica (VALENCIA-

AGUIRRE, 2002).

Los géneros Trebouxia, Trentepholia y Nostoc son los fotobiontes más frecuentes, y de

amplia distribución en las asociaciones liquénicas. Los géneros Trebouxia, Trentepholia

son eucarióticos y pertenecen a algas verdes; Nostoc pertenece al grupo de bacteria

oxígeno –fotosintética (cianobacteria). Cuando un alga se encuentra asociada con un

micobionte no se reproduce sexualmente, lo hace en forma asexual. Las cianobacterias

(algas verde-azules) se multiplican por fisión binaria, heterocistes o akinetos, son de

naturaleza procariota. Las clorofíceas, por su parte se multiplican por división celular

vegetativa o por formación asexual de esporas llamadas aplanoesporas.

El fotobionte en asociación liquénica puede cambiar la intensidad del color, la forma

general, el tamaño, las cubiertas de gelatina y tener cambios fisiológicos. Algas como

Trentepholia y Gloeocapsa son más pigmentadas en vida libre que el liquen. En ciertas

especies de Trebouxia y Nostoc una cubierta gelatinosa esta presente en medio de

cultivo, pero no en el talo (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). Aproximadamente el 92% de

las especies poseen ficobiontes verdes, frente a un 8% de cianobacterias.Nostoc,

Scytonema, Stigonema, Gloeocapsa y Calothrix son los cianosimbiontes más comúnes

(BARRENO, 1997).

Los principales grupos de algas participantes en la simbiosis primaria de líquenes son:

CHLOROPHYTA: 90 A 95 % EN REGIONES TROPICALES.Palmellaceae, Coccomyxaceae, Protococcaceae, Trentepohliaceae, Cladophoraceae,

Chlorococcaceae, Oocystaceae, Botryococcaceae.

CYANOPHYTA: 5 A 10 % EN REGIONES TROPICALES.Chroococcaceae, Nostocaceae, Scytonemataceae, Rivulariaceae.

XANTHOPHYCEAE Heterococcus en Verrucaria sp.

PHAEOPHYCEAEPetroderma en Verrucaria sp.

TABLA.1 ALGAS PARTICIPANTES EN LA SIMBIOSIS PRIMARIA DE LIQUENES. (FERRARO, INSTITUTO DE CIENCIAS BOTANICAS, 2000)

6.2.2. Micobionte U Hongo Liquenizado

Los hongos que entran en la constitución de los líquenes son principalmente

Ascomycotina y sólo unos pocos pertenecen a los Basidiomycotina o Deuteromycotina.

Se han observado también algunas formas más o menos inciertas de liquenización

detectadas de otros grupos fungales (VALENCIA-AGUIRRE, 2002).

La clasificación y denominación de los líquenes se refiere siempre al micobionte, según

lo establecido en el Código Internacional de la Nomenclatura Botánica (CINB). El

hongo determina la naturaleza y forma de la mayoría de los líquenes y produce las

estructuras fructificantes, comparables a las formas de vida libre (BARRENO, 1997;

VALENCIA-AGUIRRE, 2002).

Los hongos de los líquenes casi siempre son simbiontes estrictos y no son capaces de

prosperar en la naturaleza sin el ficobionte apropiado (son simbiontes obligados). La

mayoría de ellos forman colonias compactas y elevadas de diversa formas, color y

tamaño; por el contrario los hongos separados del fotobionte forman un micelo carente

de la organización y la diferenciación celular típica del talo del liquen. La pared del

hongo debe ser flexible para facilitar los contactos con el ficobionte; también participan

en la captación de agua, de nutrientes y en su transporte al citoplasma. El agua de las

células algales está controlada por el hongo a través del apoplasto fangal, por lo tanto

no tienen acceso directo a ella (RICHARDSON, 1999; HONNEGGER, 1998).

Otros grupos particulares de hongos como los Myxomycetes al unirse con algas forman

"mixolíquenes"  mientras que la unión de Actinomicetes con algas constituyen

"actinolíquenes", no son muy frecuentes.

6.2.3. RELACIONES ENTRE LOS SIMBIONTES

6.2.3.1. Relación Fisiológica

Es el rol fisiológico que cumple cada uno de los simbiontes en beneficio del consorcio.

El hongo protege al alga contra la desecación y el calor solar produciendo pigmentos en

los tejidos; proporciona al fotobionte gas carbónico de su respiración, retiene agua y

minerales en sus tejidos, los cuales toma a través de sus paredes; extrae minerales del

sustrato, compite por espacio en el mismo; da forma al liquen (en la mayoria de los

casos). Sin embargo, la forma del talo liquénico no es la misma que la del hongo

aislado. Este hecho presupone que el alga también contribuye en alguna porción, al

establecimiento de la forma y estructura del liquen.

El hongo se reproduce sexualmente, aloja al alga de tal forma que tenga el óptimo de

intensidad lumínica y dispone sus hifas para que se pueda alojar adecuadamente. La

mayoría de los líquenes sin fotófilos, pero cuando se presenta iluminación excesiva el

talo se deseca para proteger el aparato fotosintético.

El alga, por su parte, sintetiza un exceso de compuestos orgánicos (especialmente

azúcares simples o monosacáridos), los cuales son utilizados por el micobionte para se

supervivencia, almacenándolos en forma de manitol no disponible para el fotobionte. El

transporte depende de la mediación de algunas sustancias segregadas por el hongo

que facilitan los procesos de difusión, que del contacto entre el micobionte y fotobionte

(VALENCIA-AGUIRRE, 2002).

Cuando el fotobionte es una cianobacteria, suministra sustancias nitrogenadas al

consorcio, ya que tiene la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico; sin embargo, sólo

utiliza una pequeña cantidad del nitrógeno fijado y el resto lo libera en forma de amonio,

para ser utilizado por el hongo para la producción de proteínas y aminoácidos. Cuando

el fotobionte es un alga verde, el suministro del nitrógeno del consorcio es de origen

exógeno y a partir de la urea, nitratos o aminoácidos. Las cianobacterias excretan

glucosa (GALUN, 1988 citado por MOORE LANDECKER, 1996; WERNER, 1992),

mientras que las algas verdes secretan poliol; igualmente proporcionan tiamina y

biotina.

Parece ser que tanto el hongo como el alga pueden obtener, en parte, sustancias

carbonatadas del sustrato, lo cual depende de la relación existente entre éste y el

liquen. Otros aportes del componente fúngico al consorcio son la regulación de las

poblaciones del fotobionte y la longevidad de las células fúngicas liquenizadas,

comparadas con la vida libre (VALENCIA-AGUIRRE, 2002; HONEGGER, 1998).

6.2.4. MORFOLOGIA Y ANATOMIA DEL TALO

Los líquenes exhiben una amplia variedad morfológica que se extiende desde los tipos

rudimentarios hasta los altamente diferenciados. Como respuesta a la unión que se

establece entre los simbiontes y el papel predominante que juega el componente

fúngico dentro de la morfogénesis (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). La unión de los dos

simbiontes se realiza mediante un proceso complejo de liquenización, que presenta

numerosas fases, las cuales se describen a continuación en el siguiente cuadro

(MARCANO ,1994):

FASE DE PRE-CONTACTO: Estimulación por parte del alga y respuesta tigmotrófica del hongo

FASE DE CONTACTO: Reconocimiento y aglutinación.

FASE DE ENVOLTURA DEL ALGA POR EL MICOBIONTE: Desarrollo de haustorios.

FASE DE INCORPORACIÓN DE AMBOS SIMBIONTES PARA LA FORMACIÓN DE UNA MATRIZ COMÚN: Integración. Fase soredial.

FASE DE FORMACIÓN Y DIFERENCIACIÓN DEL TALO.TABLA 3. FASES DE FORMACION DE UN TALO. (FERRARO, INSTITUTO DE CIENCIAS BOTANICAS, 2000)

El talo puede presentar una estratificación con zonas bien delimitadas, con un estrato

algal superior y una médula formada por hifas del hongo, éstos son talos heterómeros.

Este es el tipo de arreglo más común en los líquenes. Si las algas se distribuyen entre

las células del hongo sin ninguna orden el talo es homómero. Los talos pueden ser:

1. CRUSTOSOS: con aspecto de costra, muy adheridos al sustrato, pueden ser

continuos o fragmentados en placas o areólas. El 65% de las 15.000 especies de

líquenes conocidos son crustosos.

2. FOLIOSOS: con aspecto de hojas, muy extendidos, son llamativos y es la forma

más común entre los macrolíquenes.

3. FRUTICULOSOS: son talos ramificados, erguidos o pendientes, como arbolitos

pequeños o barbas enmarañadas, muy largas.

4. GELATINOSOS: talos gruesos, quebradizos cuando se encuentran secos y muy

blandos e hinchados en presencia de agua.

5. TALOS COMBINADOS: crustoso (escamoso o microfilino) y fruticuloso (con

apotecios): podecios (Cladonia sp.) o pseudopodecios (Stereocaulon).

6.3. ASPECTOS ECOLOGICOS

6.3.1. Sustratos Liquénicos

Se definen como el soporte sobre el cual crecen líquenes. Los sustratos influyen sobre

su comportamiento de acuerdo con la textura física y la estabilidad, pH, el contenido

mineral, la composición química y la capacidad de retención de agua que ofrecen para

su establecimiento.

Dada la capacidad de colonizar una amplia variedad de sustratos, han sido ubicados en

una amplia clasificación y de uso común (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). (ver tabla 4).

SUSTRATO TIPO

ROCAS O MINERALES SAXÍCOLAS (rupestres o rupículas)

 

 

 

  

* Epilíticos ( encima del sustrato)

*Endolíticos (dentro del sustrato)

*Calcícolas ( en rocas caliza)

*Magnícolas (en serpentina)

*Ferrugíneos ( en magnetita)

*Calcófilos (en calcopirita)

CORTEZA DE ÁRBOLES CORTÍCOLAS Ó CORTICICOLAS

 

 

*Epifleódico (encima de la corteza)

*Endofleódicos (dentro de la corteza)

SUELO TERRÍCOLAS

MADERA LIGNÍCOLAS

BRIOFITAS MUSCÍCOLAS

HOJAS EPIFILOS

  *FolícolasTABLA 4. DISTRIBUCION DE LIQUENES SEGÚN SUSTRATO. (VALENCIA, AGUIRRE, 2002)

La distribución de los líquenes en un área tiene mucho que ver con el grado de

especificidad que muestra por el sustrato. Las especies que colonizan sustratos

indiferenciados tienden a tener una amplia distribución por la mayor oferta de sustratos,

mientras que los que prefieren los específicos poseen un radio de distribución más

limitado. Por esto se observa que la distribución geográfica de un liquen esta en

relación directa con la especificidad que muestra el sustrato (BRODO, 1973).

6.3.2. Resistencia a condiciones extremas

La mayoría de los líquenes son tolerantes a iluminaciones extremas, períodos de frío

intenso o desecación casi completa, condiciones que son frecuentes en su medio

natural. Su capacidad adaptativa es la mayor y la más completa de todos los vegetales

en regiones inhóspitas, donde otro tipo de plantas no se desarrollan. Pueden soportar

durante el día temperaturas de 60°C y en la noche por debajo de 0°C. Estos rasgos de

tolerancia varían de acuerdo con el grado de adaptación a los diferentes hábitats

ecológicos (AHMADJIAN, 1966).

6.3.3. Sustancias de los líquenes

Los líquenes producen, por su actividad metabólica, varios tipos de compuestos

orgánicos, principalmente aromáticos. Entre ellos se incluyen ácidos alifáticos,

depsidonas, depsonas, ésteres bencílicos, dibenzofuranos, ácidos úsnicos, xantonas,

antraquinonas, terpenoides y derivados del ácido pulvínico. Estas sustancias juegan un

papel biológico, comenzando por aceptar que la simbiosis se relaciona con la

producción de todas estas sustancias (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). De entre todas

estas sustancias, son los dépsidos (para y meta), las depsidonas y los ácidos úsnicos

hacia los que los liquenólogos han dirigido principalmente su atención, por tratarse de

compuestos que solo se han encontrado en los líquenes, con la salvedad de algunos

pocos que han sido descritos también en hongos no liquenizados, como el ácido

lecanórico (paradépsido), presente en Pyricularia. No obstante, se ha comprobado que

cuando estas sustancias se presentan en hongos no liquenizados lo hacen siempre en

muy bajas concentraciones. (MANRIQUE REOL, E. 1989.)

Las sustancias químicas presentes en los líquenes se localizan como componentes de

las membranas celulares en el contenido celular o en forma extracelular, como masas

amorfas o cristales, coloras o incoloras. Son insolubles en agua y solubles en solventes

orgánicos, la mayoría de sabor amargo. Las sustancias producidas por los líquenes

tienen un interés desde el punto de vista de su acción antibiótica. Estas sustancias son

activas contra una gran variedad de microorganismos, preferencialmente contra

bacterias gram-positivas y hongos.

6.3.4. Uso de los líquenes

El uso de los líquenes por parte del hombre ha sido muy variado y conocido desde

tiempos muy antiguos, con propósitos alimenticios, curativos y económicos. Las

propiedades potenciales o reales de estos organismos han permitido su utilización en

medicina en forma de extractos o cocimientos desde las antiguas cultura china y

egipcia. Existen numerosos ejemplos. Cetraria islandica, por ejemplo, es utilizada en la

medicina homeopática hoy en día para curar diferentes enfermedades, entre ellas la

tuberculosis; se sabe que su alto contenido de polisacáridos sirve para la fabricación de

harinas de fácil digestibilidad. Usnea longissima ha sido utilizada como expectorante y

para curar las úlceras al aplicarse localmente (FILHO-TOLEDO, 1976). Se sabe de la

existencia de una enorme cantidad de compuestos bioáctivos sin explorar y que pueden

estar en disposición de la industria farmacéutica para utilizar a gran escala médica y

comercial (VALENCIA-AGUIRRE, 2002).

Desde el siglo XVI los líquenes se han utilizado como materia prima en la industria de

cosméticos y perfumes. A varios ácidos liquénicos como el ácido úsnico se le ha

encontrado propiedades antibióticas, por lo que las especies Usnea se han considerado

activas en el tratamiento de enfermedades. Un buen número de líquenes son utilizados

hoy en día como base para la fabricación de cremas, shampoo, desodorantes y

pastillas. Sin embargo en vía opuesta también los productos de los líquenes son

responsables de enfermedades por contacto como dermatitis y eczemas, y otros

problemas de piel caracterizados por hinchazón y enrojecimiento. Especies del género

Cladonia se comercializan en grandes cantidades y además es aprovechada en gran

medida en la industria del perfume.

La amplia gama de actividades biológicas que se les ha atribuido a los líquenes ha

despertado el interés por la investigación de estos organismos, confirmando que

muchos de los metabolitos que producen son “agentes biodinámicas” con propiedades

antibiótica, antiviral, antitumoral, analgésica, antipirética, antiinflamatoria, antioxidante,

antiproliferativa, alelopática e inhibidora de enzimas.

Acorde a las recientes investigaciones de las actividades biológicas de las sustancias

de los líquenes se pueden dividir en:

Actividad Antibiótica: Despidas (INGOLFSDOTTIR, 1985), depsidonas y acido

úsnico son activos contra microorganismos Gram-positivos, drogas

comercializadas en Europa de compuestos como el benzydimetil son distribuidas

como USNO contra ulceras, otitis y mastitis.

Actividad Antitumoral y Antimutagénica: El ácido úsnico, (+)-

protoliquenesterinico presentan una actividad antitumoral y antimutagénica

considerable.

Actividad inhibición enzimatica: Las siguientes sustancias de los líquenes

presentan una actividad de inhibición: ácido lecanorico, ácido úsnico y extractos

de la Vulpicida Juniperinus, Hypogymnia Physodes y Letharia Vulpina.

Actividad contra el Síndrome de Inmunodeficiencia Humana (VIH): Sustancias

químicas derivadas del extracto de la Umbilicaria esculenta inhiben el efecto

citopatológico del VIH in Vitro (Hirabayashi, 1998).

Actividad Antialergica: Numerosas sustancias de los líquenes presentan esta

actividad ellas se encuentran: la atranorina, parietrina, ácido úsnico y ácido

protoliquenesterinico.

6.3.5. Habitats de los líquenes

Los líquenes se encuentran en todos los ecosistemas y regiones de vida colombianas;

son componentes muy conspicuos de la flora. La mayor expresión la exhiben en las

regiones de la vida andina y paramuna, en lo que respecta a líquenes foliosos y

fructicosos.

La mayoría de los líquenes son terrestres, algunos se dan cerca de caídas de agua. Su

tamaño varía mucho, desde pocos milímetros hasta varios centímetros. Existe una clara

zonación florística de estos organismos a lo largo del gradiente altitudinal; los líquenes

comienzan a ser comunes a medida que se incrementa la altitud y el óptimo esta entre

3.000 y 4.000 metros. Entre 1.000 y 2.000 metros el número de especies de

Heterodermia Leptogium y Parmotrema aumentan. Por encima de los 2.000 metros en

la zona de la andina baja, media y alta, es elevada la frecuencia de los líquenes foliosos

Parmeliaceae, Stictaceae, Lobariacae y Collemataceae, siendo por lo general

dominantes (VALENCIA-AGUIRRE, 2002).

6.4. QUIMIOTAXONOMIA

6.4.1. Química de los líquenes

La quimiotaxonomia ha jugado un papel importante en la compresión de grupos que

pertenecen a las categorías taxonómicas superiores, en los líquenes se ha enfocado en

el uso taxonómico de los datos de metabolitos a los niveles de especie y subespecie.

Dentro de los compuestos liquénicos producto del metabolismo del liquen se encuentra

los llamados ácidos liquénicos y otros tipos de sustancias orgánicas. Se conoce la

constitución química de 220 metabolitos secundarios encontrados en los líquenes, los

más comunes y conocidos son la atranorina y la parietrina y los ácidos úsnico,

rizocárpico, norstíctico, thamnólico, barbárico, vulpínico, entre otros. (BARRENO 1997,

VALENCIA AGUIRRE 2002). Varios de los metabolitos anteriormente nombrados

presentan propiedades biológicas importantes con relación ha esto varios de estos

compuestos han sido estudiados para determinar su actividad antioxidante. Algunos de

los compuestos mencionados con anterioridad se muestran en la figura 1.

FIGURA1. ESTRUCTURAS DE METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS DE LÍQUENES.

NEELAKANTAN (1965) presentó una importante contribución sobre la clasificación de

las sustancias liquénicas, a nivel de grupos así:

1. Serie alifática

Grupo 1- Ácidos Carboxílicos

Grupo 2-Derivados de carbohidratos

Grupo 3- Compuestos sulfurados

2. Serie carbocíclica

Grupo 1- Isoprenoides alicíclicos

Grupo 2- Dépsidas

Grupo 3- Quinonas

3. Serie heterocíclica oxigenada

Grupo 1- Derivados del ácido tetrónico

Grupo 2- Depsidonas

Grupo 3- Depsonas

Grupo 4- Dibenzofuranos

Grupo 5- Xantonas

Grupo 6- Chromonas

4. Serie heterocíclica nitrogenada

6.4.2. Test de Coloración

El test de coloración es un método rutinario, simple. Se orienta exclusivamente a

detectar microscópicamente la presencia de grupos de compuestos químicos, que se

presentan dentro de un grupo taxonómicamente dado, evidenciado por los cambios de

color (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). El test de coloración indica la presencia o

ausencia de sustancias alifáticas y aromáticas. Rutinariamente se emplean cuatro test

de coloración para sustancias liquenicas, cuya denominación convencional es: test K,

test C, test KC y test P o PD. Los test C, K y KC fueron descubiertos por NYLANDER

(1866, citado por SANTESSON, 1973). Los test de PD o (P) fue introducido por

ASAHINA (1934). Estas pruebas se llevan a cabo aplicando el reactivo apropiado

directamente sobre un fragmento liquénico, por medio de una varilla de vidrio

puntiaguda o haciendo una incisión al talo o la apotecio. Las reacciones color obtenidas

dependen de cierta forma de la concentración y localización de las sustancias

liquenicas en el talo; la corteza o médula deben ser tratadas a parte y para su

observación es mejor hacerlo bajo estereoscopio (VALENCIA-AGUIRRE, 2002).

Los cambios de coloración (amarillo, anaranjado, rojo, violeta) se consideran positivos e

indican la presencia de un grupo de compuestos determinados; se consideran negativo

si no hay cambio de color.

Test C: Se emplea como reactivo una solución acuosa saturada de hipoclorito de

sodio o calcio. Como sustituido puede usarse blanqueador líquido comercial. Las

reacciones de color obtenidas por este test son inestables.

Test K: Se usa como reactivo una solución acuosa de hidróxido de potasio.

Test KC: Es una mezcla de hipoclorito de calcio con hidróxido de potasio.

Primero se aplica K e inmediatamente C.

Test P o PD: Se utiliza como reactivo la fenilenodiamina en una solución

alcohólica fresca al 5%. Actualmente se emplea un reactivo más estable

denominado mezcla de Steiner.

En la siguiente tabla se resume la reacciones de las pruebas de coloración de algunas sustancias

liquénicas; sin embargo sólo indica los grupos de compuestos (SANTESSON, 1973;

VALENCIA-AGUIRRE, 2002).

REACCION COMPUESTOS

Pigmentos

K+Rojo a

violeta

Antraquinonas, Bisantraquininas, terpenilquinonas

naftoquinonas, pyxiferina

K+,KC+ Xantonas,Sordidona

K+,PD+,K+ Ácidos úsnicos

Compuestos Incoloros

PD+,K+

Despidas:ácido alectoriálico,atranorina

ácido baeomicico,ácido barbatólico

cloroatranorina,ácido descarboxithamnólico

ácido emathamnólico, nefroarctina

ácido thamnólico

Depsidonas:ácido constíctico, ácido fumar-

protocetrárico,ácido norstíctico

ácido fisodálico,ácido salazinico

ácido stictico,ácido virénsico

PD+,K-

Pannarina,ácido psorómico,ácido fumar

protocetrarico

ácido protocetrarico, ácido virensico

PD-,K+,C+

Ácido critoclorofaeíco,ácido hiascico

ácido hipomnólico (K+violeta)

ácido meroclorofaeíco,ácido paludósico

ácido ramalinolico,scrobiculina

PD-,K-,C+ Rojo

Ácido anziáico,ácido4-O-dimetilbarbático

eritrina,etilorcelinato,ácido gyrofórico

ácido lecanorico,montagnetol,ácidoolivetorico,

Siphulina.

PD-,K-,C+ VerdosoÁcido didymico,ácido pannarico,ácido

strepsilina

PD-,K-,C+ Azuloso Ácido diploschistesico

PD-,K-,C-,KC

+

Ácido alectóronico,ácido a-collatolico

ácido glomeliférico,ácido lobárico

ácido 4-O-metilfisódico

ácido microphillinico,ácido physidico

norlobaridona,ácido picroliquénico

TABLA 5. TEST DE COLORACION (SANTENSSON, 1973)

6.4.3. Cristalización

La cristalización es el proceso de separación de un soluto a partir de una solución, por

sobresaturación, concentración o enfriamiento de la misma. La cristalización permite

separar soluto a partir de una solución, en forma prácticamente pura.

Existen varias formas de sobresaturar una solución para que esta comience a cristalizar

fracciones de soluto: por saturación de solución en caliente y posterior enfriamiento de

la misma. Por concentración de la solución, mediante la evaporación de una parte del

solvente. Por adición de una substancia de mayor solubilidad en el solvente, que el

compuesto que se desea separar. Cuanto más lento sea el enfriamiento de la solución

saturada, más grandes y puros serán los cristales del sólido que se separa.

6.4.4. Técnicas cromatográficas

Debido a la gran diversidad de técnicas cromatográficas las cuales posibilitan el

aislamiento de estos metabolitos secundarios, la cromatografía se ha convertido en la

técnica microquímica más utilizada en las determinación de muchas sustancias

liquénicas, debido a su sensibilidad, rapidez y relativa simplicidad del equipo utilizado

(VALENCIA, AGUIRRE 2002).

La palabra Cromatografía significa "Escribir en Colores" ya que cuando fue desarrollada

los componentes separados eran colorantes. Los componentes de una mezcla pueden

presentar una diferente tendencia a permanecer en cualquiera de las fases

involucradas. Mientras más veces los componentes viajen de una fase a la otra

(partición) se obtendrá una mejor separación. En todas las técnicas cromatográficas

hay una fase móvil que consiste en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico) que

arrastra a la muestra a través de una fase estacionaria que se trata de un sólido o un

líquido fijado en un sólido.

Los componentes de la mezcla interaccionan con distinta forma con la fase estacionaria

y con la fase móvil. De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a

distintas velocidades y se van separando (S. DOUGLAS ,1995). Después de haber

pasado los componentes por la fase estacionaria y haberse separado pasan por un

detector que genera una señal que puede depender de la concentración y del tipo de

compuesto.

La cromatografía en sus diversas modalidades constituye hoy por hoy, una de las

herramientas analíticas más potentes que se conocen. Las técnicas cromatográficas

pueden clasificarse de diversas formas:

6.4.4.1. Cromatografía en capa fina

Un importante papel es una técnica nueva, la cromatografía en capa fina, con mucha

mayor sensibilidad y capacidad resolutiva, que, aunque conocida con anterioridad, no

fue aplicada al estudio de la química de los líquenes hasta el comienzo de la década de

los setenta (CULBERSON & KRISTINSON, 1970; CULBERSON, 1972; MENLOVE,

1974, CULBERSON & AMMANN, 1979). Esta técnica permitió el descubrimiento y

caracterización de sustancias nuevas que habían pasado inadvertidas, mediante el uso

de la cromatografía en papel, quizá por problemas de solapamiento o por bajas

concentraciones.

6.4.4.2. Cromatografía en columna

La cromatografía es una técnica que se emplea en el fraccionamiento de compuestos

orgánicos. Consiste en la aplicación de una muestra en una columna de cristal en la

que se ha situado una matriz sólida porosa que está inmersa en el solvente (SKOOG,

DOUGLAS 2003). A continuación se bombea una gran cantidad de solvente a través de

la columna Los diferentes compuestos se van retrasando de manera distinta según sus

interacciones con la matriz, por lo que pueden ser recogidas separadas a medida que

son eluídas por el fondo de la columna (ver figura 2.). Según la matriz escogida, los

compuestos se pueden separar de acuerdo a su carga, su hidrofobicidad, su tamaño o

su capacidad de unirse a grupos químicos particulares.

En la cromatografía en columna se utilizan los siguientes términos:

Matriz de la columna: Sustancia que está empapada de solvente y que se empaqueta

en la columna. También se denomina el lecho de la columna.

Longitud de la columna: Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna. Es

importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco

importante en otras como la cromatografía de afinidad.

Volumen de la columna: Volumen total de gel que se empaqueta en una columna

cromatográfica.

Volumen muerto de la columna: Cantidad de solvente que tiene que atravesar la

columna para asegurar que se ha reemplazado completamente. Coincide con el

volumen de solvente que sale de la columna desde que se aplica la muestra hasta que

empieza a salir la primera proteína. En general, y dependiendo del tipo de

cromatografía puede ser de 1 a varias veces el volumen de la columna (SKOOG,

DOUGLAS 2003).

FIGURA 2. CROMATOGRAFIA EN COLUMNA. (SKOOG, DOUGLAS 2003).

De las muchas variantes que se conocen en la actualidad, son de particular importancia

en este trabajo la cromatografía en placa preparativa, cromatografía bidimensional (ver

figura 3) y cromatografía flash de mediana presión. Todas estas técnicas conservan el

mismo principio de elución, pero su utilización depende tanto de la naturaleza de la

muestra como de las posibles variantes que se presenten a lo largo del proceso.

FIGURA 3. CROMATOGRAFIA EN PLACA BIDIMENSIONAL. (SKOOG, DOUGLAS 2003).

6.4.5. Técnicas espectroscópicas

La caracterización y la elucidación estructural de los metabolitos secundarios aislados

de la especie de liquen seleccionada se realiza mediante la determinación de sus

propiedades físicas color, apariencia, puntos de fusión, datos espectroscópicos (RMN 1H, RMN 13C).

6.4.5.1. Espectroscopía infrarroja (Espectroscopía IR)

Es la rama de la espectroscopía que trata con la parte infrarroja del espectro

electromagnético. Esta cubre un conjunto de técnicas, siendo la más común una forma

de espectroscopía de absorción. Así como otras técnicas espectroscópicas, puede

usarse para identificar un compuesto e investigar la composición de una muestra.

Para medir una muestra, un rayo de luz infrarroja atraviesa la muestra, y se registra la

cantidad de energía absorbida en cada longitud de onda. Esto puede lograrse

escaneando el espectro con un rayo monocromático, el cual cambia de longitud de

onda a través del tiempo, o usando una transformada de Fourier para medir todas las

longitudes de onda a la vez. A partir de esto, se puede trazar un espectro de

transmitancia o absorbancia, el cual muestra a cuales longitudes de onda la muestra

absorbe el IR, y permite una interpretación de cuales enlaces están presentes. (GROS,

POMILIO, SELDES, BURTON 1985).

Esta técnica funciona exclusivamente con enlaces covalentes, y como tal es de gran

utilidad en química orgánica. Espectros nítidos se obtienen de muestras con pocos

enlaces activos al IR y altos niveles de pureza. Estructuras moleculares más complejas

llevan a más bandas de absorción y a un espectro más complejo. Sin embargo esta

técnica no se ha podido utilizar para la caracterización de mezclas muy complejas.

6.4.5.2. Espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN)

Es una técnica empleada principalmente en la elucidación de estructuras moleculares,

aunque también se puede emplear con fines cuantitativos.

Algunos núcleos atómicos sometidos a un campo magnético externo absorben

radiación electromagnética en la región de las frecuencias de radio o radiofrecuencias.

Como la frecuencia exacta de esta absorción depende del entorno de estos núcleos, se

puede emplear para determinar la estructura de la molécula en donde se encuentran

éstos.

Para que se pueda emplear la técnica los núcleos deben tener un momento magnético

distinto de cero. Esta condición no la cumplen los núcleos con número másico y número

atómico par. Los núcleos más importantes en química orgánica son: ¹H, 13C, 31P, 19F y 15N. Otros núcleos importantes: 29Si, 77Se, 117Sn, 195Pt, 199Hg, 203Tl, 205Tl, 207Pb.

6.4.5.3. Espectroscopia Ultravioleta

El espectro Ultravioleta y Visible de las moléculas está asociado a transiciones

electrónicas entre los diferentes niveles energéticos en ciertos grupos o átomos de la

molécula y no caracterizan a la molécula como entidad.

En contraste la absorción de energía en la región Infrarroja estimulan la molécula

completa y causa cambios vibracionales y rotacionales en esta lo cual caracteriza la

entidad estructural de dicha molécula.

Los grupos de átomos que dan origen a la absorción en el UV cercano o UV de cuarzo,

se conocen como grupos cromóforos. La mayoría de los grupos insaturados y

heteroatómicos que tienen pares de electrones no compartidos, son cromóforos

potenciales y estos grupos son la base de la elucidación de grupos estructurales en las

moléculas activas en el UV cercano.

El espectro Ultravioleta de una molécula se obtiene generalmente en forma adicional al

espectro infrarrojo de la misma especie. Este espectro IR frecuentemente sirve como

dato confirmativo de la ausencia o presencia de ciertos grupos funcionales.

En algunos casos la espectroscopia UV puede ser fundamental para el estudio de

ciertos problemas específicos. Por ejemplo en la industria de los cosméticos, tintes,

colorantes y pinturas. El estudio de los grupos auxocromos y de su influencia en el

desplazamiento de ciertos compuestos químicos hacia la región visible hacen de esta

técnica una de las de mayor interés en ésta área. (SKOOG, D. A.; LEARY J.J. HOLLER

F. JAMES)

6.5. TECNICAS DE COLECCIÓN Y ESTUDIOPara coleccionar líquenes se deben tener en cuenta las siguientes recomendaciones.

6.5.1. MaterialesBolsas de papel, bolsas plásticas, navaja o cuchillo, martillo geológico, cincel, marcador

a prueba de agua, lupa de campo, libreta de notas, lápiz, reactivos.

6.5.2. Datos de campo Localidad: país, departamento, estado, provincia, vereda, finca, kilometraje a la

localidad mas cercana, coordenadas geográficas.

Hábitat: descripción breve del tipo de bosque (primario, secundario), talud del

camino; potrero; condiciones ambientales circundantes, iluminación, humedad.

Sustrato: suelo (tipo si es posible), roca, corteza, hojas (en lo posible el nombre

científico y/o vulgar del árbol), parte del árbol.

Altitud: sobre el nivel del mar o en forma aproximada cuando no se conoce.

Fecha: durante la cual se realizó la colección; especificar día, mes y año.

Colector y número de colección: Nombre y apellido del colector o colectores, y el

número de colección.

Los datos anteriores se deben consignar en una libreta de notas para cada espécimen

coleccionado.

6.5.3. ColectaPara colectar un ejemplar liquénico se deben tener en cuenta ciertas condiciones

inherentes a cada tipo de liquen: los crustáceos por su unión tan íntima con el sustrato

deben retirarse con un fragmento de éste y usar para ello una navaja o cuchillo; cuando

se trata de líquenes epilíticos o endolíticos se recomienda utilizar un martillo geológico.

Los líquenes se buscan sobre las rocas, en el suelo, en el talud de los caminos, sobre

troncos caídos, en las cercas. En el interior de los bosques se recomienda recorrer

cuidadosamente todas las partes del árbol (las cortezas, las ramas, el dosel). Para

buscar y colectar líquenes gelatinosos es mejor hacerlo después de la lluvia, por cuanto

en estado seco son inconspicuos y pueden pasar desapercibidos.

Se debe tener precaución con los líquenes foliosos muy secos, puesto que se puede

fracturar fácilmente; en estos casos, es mejor humedecerlos un poco o hacer la colecta

cuando el ambiente esté más húmedo.

Los ejemplares se toman en bolsas plásticas y se marcan con el número de colección

correspondiente. La muestra debe ser suficiente y en buen estado; se debe tomar una

buena cantidad que llene una bolsa, excepto cuando la población es pequeña; en lo

posible debe ser material fértil; no obstante, el material estéril no se debe desechar.

Posteriormente las muestras se pasan a bolsas de papel y en ellas se secan a baja

temperatura en la estufa o en el aire. No necesitan prensarse. Cuando las condiciones

ambientales son favorables, se puede coleccionar directamente en bolsas de papel.

Una vez el material esté seco, se puede guardar indefinidamente como material de

estudio docente o seguir el proceso habitual para su inclusión en el herbario. Cuando se

necesita hacer un estudio microscópico en el laboratorio, se coloca fragmentos de la

muestra (cuadrados de 0.5 – 1 cm de lado), apotecios enteros o seccionados (si son

grandes) en frascos con FFA (formol, ácido acético, alcohol) o con FPA (formol, ácido

propiónico, alcohol).

6.5.4. Estudio del material en el laboratorio

Los ejemplares deshidratados y debidamente preservados se pueden utilizar en el

laboratorio y seguir las técnicas pertinentes para las cuales se efectúo la colección. En

términos generales se puede humedecer parcial o totalmente la muestra; en este caso,

se debe ser muy cuidadoso con el material de donde se tomo la porción, para evitar que

otros organismos la contaminen y no pueda volverse a utilizar.

Los especimenes requeridos en estudios taxonómicos se tratan de manera muy

especial, no así aquellos utilizados en la docencia, que pueden ser fragmentados o

reutilizados para este propósito. Si se necesita hacer observaciones anatómicas del

talo, se realizan cortes transversales a mano alzada, usando pauche como soporte. Los

cortes más delgados se escogen para observaciones en el montaje húmedo.

Para detectar mejor sus constituyentes, el corte delgado de la muestra se coloca en una

solución acuosa de hipoclorito al 0.2-0.5 %; esta sustancia actúa como aclarante y

permite visualizar la coloración de las algas y la orientación de las hifas.

Para realizar los tests de coloración tenga en cuenta las precauciones de preparación y

el manejo de reactivos. (VALENCIA, AGUIRRE 2002).

7. CAPITULO III

7.1. METODOLOGIA

La metodología utilizada se muestra en la figura 4. Se explicara a continuación cada

uno de los pasos empleados.Colecta y selección de la muestra

Extracción (método Soxhlet)

Elución del extracto primario crudo en cromatografía en

columna (CC)

Aislamiento de compuestos por

polaridad

Clasificación y separación de compuestos en cromatografía

en placa (CP)

Purificación de compuestos

(CC y CP)Elucidación estructural

de compuestos (RMN, IR, UV, MP, EM)

Prueba de actividad antioxidante

(método DPPHo) de extracto.

Ensayo de actividad antioxidante (CP)

compuestos impuros.

Test de coloración.

FIGURA 4. ESQUEMA DE LA METODOLOGIA EMPLEADA.

7.1.1. Colecta y Selección del Liquen

Se seleccionó una especie de Liquen perteneciente a la familia Parmotrema a la que

no se le ha designado la especie. Con la colaboración de la Dra. Norma Valencia Islas

perteneciente al Departamento de Farmacia. Facultad de Ciencias. Universidad

Nacional de Colombia. Así mismo, en el Instituto de Ciencias Naturales de la

Universidad Nacional de Colombia se depositará un vaucher de referencia de la especie

analizada.

La cantidad recolectada de la especie fue de 300.7 g. El material liquénico

completamente seco y limpio se trituró en un molino de cuchillas, obteniendo como

peso neto 228.3 g; para que posteriormente se obtengan extractos orgánicos mediante

un proceso de extracción continua vía Soxhlet en metanol.

7.1.2. Método de extracción

Este tipo de extracción se realiza habitualmente en un aparato denominado Soxhlet.

FIGURA 5. METODO SOXHLET. (SKOOG, DOUGLAS, 2003)

La muestra (LQ) sólida se introdujo en un cartucho poroso (hecho con papel de filtro,

que permite al solvente entrar y salir reteniendo al sólido) el cual se colocó dentro del

recipiente B (ver figura 5). Se une un balón C a dicho recipiente donde se adicionó el

volumen de solvente (250 ml de metanol). Por el extremo superior del recipiente B, se

coloca un condensador D.

El solvente se calienta; los vapores ascienden por el tubo E, condensan en el

refrigerante D y caen dentro del recipiente B impregnando el líquen que se encuentra

en el cartucho A. El recipiente B se va llenando lentamente de líquido hasta que llega al

tope del tubo F y se descarga dentro del balón C por efecto de sifón, llevando consigo a

la sustancia extraída. El proceso se repitió hasta que la extracción se completa. El

solvente de extracción se evapora, recuperando así el extracto.

Se hicieron 3 (tres) montajes con el fin de acelerar el proceso, con lo cual cada montaje

tuvo un tiempo en el soxhlet, hasta el momento en el que se vio claro el solvente

mezclado con el liquen.

7.1.3. Elución del extracto primario crudo en cromatografía en columna (CC)

8. CAPITULO IV8.1. RESULTADOS

El Estudio Fitoquímico y Fisicoquímico de Actividad Antioxidante frente al Radical Libre

2,2-difenil-1-picrilhidracilo a nivel de Extracto, se realizo durante un periodo de seis

meses, los resultados obtenidos por los integrantes se reportan a continuación:

8.1.1. Estudio Taxonómico

Gracias a la colaboración del Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional

de Colombia, se determino que el liquen estudiado presenta la siguiente clasificación

taxonómica, según la tabla…. :

REINO FILO CLASE ORDEN FAMILIA

GÉNERO

ESPECIE

FUNGIAscomycot

aLecanoromycete

sLecanorale

sParmeliacea

e Rimelia CetrataTabla . Clasificación Taxonómica del LQ Rimelia Cetrata

Debido a esto, el género y la especie del líquen estudiado es:

RIMELIA CETRATA (syn PARMOTREMA CETRATUM)

Figura. LQ Rimelia Cetrata Figura. LQ Rimelia Cetrata parte posterior

8.1.2. Colecta y Selección del Líquen

Se colectaron dos clases de material vegetal, la especie analizada (Rimelia Cetrata) y un líquen de género desconocido al que llamaremos Líquen 2 (LQ 2). La cantidad recolectada del líquen Rimelia Cetrata fue de 300.7 g y del líquen 2 fue de 61.2 g peso en bruto, después de la respectiva limpieza y molienda se obtuvo 228.3 g del líquen Rimelia Cetrata y 36.6 g de líquen 2. Los datos anteriormente descritos se observan en la tabla….; a continuación:

Tabla . Peso en Gramos de Material Vegetal obtenido

8.1.3. Extracción

El método de extracción utilizado fue Soxhlet en metanol, en la tabla…. se observa el número de extracciones, el tiempo transcurrido, junto con los respectivos intervalos de cada material vegetal, hasta la extracción completa.

LIQUENNo DE

EXTRACCIONES DISOLVENTE TIEMPO(H)INTERVALOS DE

TIEMPO 

Rimelia Cetrata

  

1 Metanol 10 22 Metanol 12 13 Metanol 11 1

4 Metanol 8 1

LIQUEN (LQ)MASA DEL LQ FRESCO (g) MASA DEL LQ SECO

Y LIMPIO (g)

Rimelia Cetrata 300.7 228.32 61.2 36.6

2 1 Metanol 8 2Tabla . Tiempo de Líquenes Rimelia Cetrata y LQ 2 en el Sistema Soxlher

LIQUEN No DE MONTAJES

TIEMPO(HORAS)

Rimelia Cetrata

1 8

2 4 42

Tabla. Tiempo de Líquenes en el Método Soxlher

Al finalizar la extracción de cada uno de los líquenes se obtuvo los siguientes resultados, en la tabla….. , se observa la cantidad en gramos colectada de cada líquen, posteriormente la cantidad de material vegetal seco, limpio y molido; y por último de la cantidad obtenida de extracto en bruto; se separo 2.5 g con sequedad total de extracto del líquen Rimelia Cetrata para actividad biológica, por diferencia se obtuvo 45 g de extracto en bruto del líquen Rimelia Cetrata.

Tabla. Cantidades Obtenidas del LQ Rimelia Cetrata y LQ 2.

8.1.4. Aislamiento de Metabolitos Secundarios del LQ Rimelia Cetrata

8.1.4.1 Elución del Fraccionamiento Primario del Extracto en Crudo del Líquen Rimelia Cetrata

SISTEMA PROPORCION%

FRACCIONES

Hexano 100 1-9

Hexano- 50-50 10-16

LIQUEN

CANTIDAD DEL LQ FRESCO

(g)

CANTIDADDEL LQ SECO Y

LIMPIO (g)

CANTIDADDEL

EXTRACTO EN

BRUTO (g)

CANTIDAD DEL

EXTRACTO EN BRUTA PARA CC

(g)

CANTIDAD DEL

EXTRACTO EN BRUTO

PARA ACTIVIDAD BIOLOGICA

(g)Rimelia Cetrata

300.7 228.3 48.583 45 2.5

2 61.2 36.6 6.656 0.216

ToluenoTolueno 100 17-21

Tolueno-Acetato de

Etilo

50-50 22-39

Acetato de Etilo

100 40-49

Acetato de Etilo-Metanol

50-50 50-54

Metanol 100 55-66

Tabla . Elución Del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo del LQ Rimelia Cetrata

Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata

Sistema Hexano

Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata

Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata

Sistema Metanol

Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata

FRACCIONESCOBINADAS

CLAVE

1-10 A11-15 B16-18 C19-22 D23-37 E38-46 F47-54 G55-60 H61-66 I

Tabla. Clave De Elución Del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo del LQ Rimelia Cetrata

FRACCION FRACCION COMBINADA

PESO DEL VIAL

VACIO(g)

PESO DEL VIAL CON MUESTRA

(g)

PESO DE LA FRACCION(mg)

ORDEN DE LAS

FRACCIONES DE INTERES

A 1-10 5.954 6.030 76 |B 11-15 5.640 5.942 302

C 16-18 5.677 6.307 63D 19-22 49.175 51.976 2801E 23-37 51.915 54.279 2364F 38-46 5.623 7.561 1938

G(ℓ) 47-54 5.392 6.467 1075G(s) 47-54 28.180 28.652 472H 55-60 86.49 88.611 2121I(ℓ) 61-66 137.08 143.353 6271I(s) 61-66 41.588 45.601 4013

Tabla. Masas del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata