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ANÁLISIS DE LA LOCALIZACIÓN EN LA SUPERFICIE CELULAR DE LAS PROTEINAS DE CHOQUE TERMICO HSC70 Y HSP70 EN LA LINEA TUMORAL K562 ALFONSO BARRETO PRIETO PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MAESTRIA EN BIOLOGÍA 2001
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ANÁLISIS DE LA LOCALIZACIÓN EN LA SUPERFICIE CELULAR DE LAS PROTEINAS DE CHOQUE TERMICO HSC70 Y HSP70 EN
LA LINEA TUMORAL K562
ALFONSO BARRETO PRIETO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MAESTRIA EN BIOLOGÍA
2001
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ANÁLISIS DE LA LOCALIZACIÓN EN LA SUPERFICIE CELULAR DE LAS PROTEINAS DE CHOQUE TERMICO HSC70 Y HSP70
EN LA LINEA TUMORAL K562
ALFONSO BARRETO PRIETO
TESIS DE GRADO Presentado como requisito parcial para
Optar al título de Magister
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MAESTRIA EN BIOLOGÍA
2001
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ADVERTENCIA
Articulo 23 de la resolución número 13 de julio de 1946: “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus tesis de grado”
4
APROBADO _____________________________ ________________________ SUSANA FIORENTINO , PhD JHON MARIO GONZALES, MD, PhD DIRECTORA CODIRECTOR ____________________________
MANUEL FRANCO MD, PhD
JURADO __________________________ __________________________ JEAN PAUL VERNOT , PhD LEONARDO LAREO, MSc
5
ANÁLISIS DE LA LOCALIZACIÓN EN LA SUPERFICIE CELULAR DE LAS
PROTEINAS DE CHOQUE TERMICO HSC70 Y HSP70
EN LA LINEA TUMORAL K562
____________________________ ___________________________ CARLOS CORREDOR P. , PhD LUIS ALEJANDRO BARRERA, PhD DECANO ACADEMICO DIRECTOR POSGRADO
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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MAESTRIA EN BIOLOGÍA
2001
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Susana Fiorentino y al Dr. Jhon Mario Gonzáles por su permanente asesoría
en el desarrollo de este trabajo.
Al Dr. Carlos Corredor y todos los miembros del grupo de Inmunobiología y Biología
Celular por su discusión y aporte durante los seminarios del grupo.
A las estudiantes de pregrado que participaron en la estandarización de las técnicas
usadas en este trabajo: Diana Montoya, Viviana Angarita y Ruth Avendaño.
A los compañeros del club de revistas de los martes, especialmente los Dres. Manuel
Franco y Juanita de Franco, de quienes aprendí mucho durante estos años.
A la Dra. Gloria Barrera del Unidad de Microscopía Electrónica de Corpoica por su
colaboración en el procesamiento de las muestras.
Y finalmente, a la Pontificia Universidad Javeriana y a la Fundación del Banco de la
Republica quienes financiaron el desarrollo de este trabajo.
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RESUMEN
Las proteínas de choque térmico (HSPs) son moléculas altamente conservadas
a lo largo de la escala filogenética. Estas proteínas fueron descritas inicialmente
porque algunas de ellas son reguladas a través de estímulos como el calor u otros
agentes estresantes. Sin embargo, estas proteínas están asociadas con procesos
celulares que aseguran el plegamiento, ensamblaje y transporte apropiado de las
proteínas. Se ha propuesto que un incremento de estas HSPs podría servir como una
señal de alarma que sirve para alertar al organismo de procesos deletéreos para él.
Dentro de este contexto se ha considerado que las HSPs pueden servir de señales de
peligro que se generan durante un desarrollo tumoral con el fin de favorecer una
respuesta adecuada por parte del sistema inmune.
Las HSPs se han asociado con los mecanismos de inmunidad antitumoral en
diferentes niveles. Por un lado, se ha postulado que proteínas HSPs citosólicas
pueden favorecer el procesamiento y presentación antigénico de las moléculas del
complejo mayor de histocompatibilidad clase I (CMH-I) sobre las células tumorales,
mientras que cuando estas proteínas se expresan sobre la superficie celular tumoral
pueden servir de blanco de reconocimiento de células efectoras del sistema inmune
como las células NK o los LTγδ. Por otro lado, cuando las HSPs son liberadas por
células necróticas parecen llevar a cabos dos actividades funcionales: Una función de
citocina generando la activación de células presentadoras de antígeno (APC) y una
función de “chaperona” transportando péptidos antigénicos para favorecer el
mecanismo de “cross-priming” de LTCD8+ por las células APC. Los mecanismos
que regulan las funciones de las HSPs asociadas con la inducción de la inmunidad
antitumoral son hasta el momento poco conocidos. En este trabajo se quiso
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determinar el efecto de estímulos como el choque térmico o factores
medioambientales como la presencia de mediadores solubles producto de la
interacción célula mononuclear-Cryptococco neoformans, o el estimulo con citocinas
como el IFN-γ y la IL-10 sobre la expresión de la proteína constitutiva HSC70 e
inducible HSP70 en la línea tumoral K562. Se determinó principalmente la expresión
celular total de estas proteínas por la técnica de Western Blot (WB) y la localización
sobre la superficie celular por la técnica de citometría de flujo (FACS).
En los resultados por WB sobre lisados celulares se encontró que la expresión
de la proteína inducible HSP70 se incrementa bajo el estrés con choque térmico o la
presencia del IFN-γ, la IL-10 o el inhibidor del proteasoma MG132, mientras que la
expresión de la proteína constitutiva HSC70 no se ve afectada. Este efecto en la
expresión de la proteína HSP70 parece responder a un incremento en la localización
de la proteína tanto en el núcleo de la célula como en el citoplasma, según lo que se
observó por inmunomicroscopía electrónica en células K562 tratadas con calor o con
IFN-γ. Por otro lado, cuando se evaluó la expresión de estas proteínas sobre la
superficie celular se encontró que el calor y el IFN-γ producen una disminución de la
HSC70 mientras que la HSP70 no se ve afectada. Sin embargo, cuando se combinan
la acción del estrés metabólico producido por el tiempo de cultivo con el choque
térmico, se encontró que la expresión en la superficie celular de la HSC70 se ve
incrementada. Estos cambios en la localización sobre la superficie celular de la
HSC70 pueden ser el reflejo de su liberación al entorno celular, y de este hecho se
podrían derivar sus actividades funcionales relacionadas con la inducción de la
inmunidad antitumoral.
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ABSTRACT
The Heat Shock Proteins (HSPs) are highly conserved proteins throughout
phylogenetic scale. These proteins were initially described because some of them are
regulated by stimuli like heat or another agents that induce cellular stress. These
proteins are associated with cellular processes that ensure an appropriated folding,
assembly and transport of other molecules. It has been proposed that an increasing of
the HSPs could act as danger signals to alert the immune system about deleterious
processes for the body. In this context, HSPs could be danger signals produced by
tumoral cells to favor an adequate immune response.
The HSPs have been associated with antitumoral immunity mechanisms at
different levels. First, citosolic HSPs help MHC-I antigen processing and presentation
on the tumor cells, whereas expressed on the surface could act as target recognized by
immune effector cells (NK or LTγδ). Second,. when HSPs are released by necrotic
cells can act as cytokines generating the APCs activation and as “chaperone”
molecule transporting antigenic peptides to favor the LT CD8 antigen stimulation
throughout this mechanism known as “cross-priming”.
The pathways to regulate this HSPs functions associated with the induction of
the antitumoral immunity are unknown. In this work we wanted to determine the
effect of the thermal shock or the soluble mediators presence in supernatants of
peripheral blood mononuclear cells- Cryptococcus neoformans coculture, or the γ-
IFN and IL-10 cytokines stimuli on the constitutive (HSC70) and inducible (HSP70)
protein expression by the K562 tumoral line. Mainly, the total cellular expression of
these proteins was determined by Westernblot (WB) and cellular surface localization
by flow cytometry (FACS).
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We showed by WB that the expression of the HSP70 was increased by
thermal shock, γ-IFN, IL-10 and the proteasome inhibitor MG132 treatment while
HSC70 expression was not affected. This effect on the HSP70 expression seems to
response such nuclei than the citoplasm protein localization, like we observed by
electronic immunemicroscopy analyses in heat or g-IFN treated K562 cells. By the
other hand, when the cellular surface expression of these proteins was evaluated, we
found that thermal shock and γ-IFN treatment produce a decreased of the HSC70
while HSP70 was not affected. However, when we combine the metabolic stress
action produced by the culture period of time with the thermal shock, we found that
HSC70 cellular surface expression was increased. These changes in the HSC70
cellular surface localization could be a reflect of its cellular environment releasing.
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1. INTRODUCCION
Las proteínas de choque térmico (HSPs) se encuentran altamente conservadas
a lo largo de la escala filogenética desde procariotes hasta mamíferos, y se estima
que representan un buen porcentaje del total de proteínas celulares. Proteínas de
choque térmico como las HSC70 (proteína citosólica constitutiva) y HSP70 (proteína
citosólica inducible) se han asociado con funciones celulares como la estabilización o
generación de precursores de proteínas no plegadas antes del ensamblaje en el
citosol, la translocación en organelos incluyendo el retículo endoplásmico y
mitocondria, la estabilización de polipéptidos recién translocados antes del
plegamiento y ensamblaje, la organización de oligómeros de proteínas, la disolución
de agregados de proteínas y la degradación de proteínas citosólicas de proteínas de
recambio rápido.
Por otro lado, estas proteínas se han asociado con procesos de protección de la
integridad de la célula cuando la viabilidad celular se ve comprometida. De esta
forma, se ha observado que muchas de esta proteínas se incrementan bajo condiciones
de estrés como el calor, la presencia de sales pesadas, oxidantes orgánicos,
infecciones microbianas, entre otras. Se ha propuesto que estas proteínas pueden
constituirse como señales de peligro que alertan a los mecanismos de defensa de la
presencia de alguna situación deletérea para el individuo.
Este sistema de señalización de peligro puede ser usado por el sistema inmune
para el reconocimiento y eliminación de las células tumorales. Se ha demostrado que
las células tumorales presentan un patrón de expresión de proteínas de choque
térmico diferente al de las células normales. De esta forma, se ha observado en ciertas
células tumorales la expresión de HSPs sobre la superficie celular, a diferencia de las
células normales. Se ha propuesto que las HSPs expuestas sobre la membrana celular
tumoral pueden constituirse en blancos de reconocimiento para células como NK o
LTγδ.
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Por otro lado, se ha sugerido que estas HSPs a través de su capacidad para
interactuar con porciones protéicas, pueden constituirse en estructuras que participan
en la selección del repertorio antigénico de las células tumorales. De esta forma las
HSPs participan en el mecanismo de procesamiento y presentación antigénica
acoplada a las moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH).
En los últimos años se ha propuesto que proteínas como las HSC70 y la
HSP70 liberadas de las células tumorales por algún mecanismo aún desconocido,
podrían llevar a cabo dos funciones fundamentales para la inducción de una respuesta
inmune específica a través de su interacción con células presentadoras de antígeno.
Por un lado, se pueden constituir en una señal de activación para las células
dendríticas o macrófagos (función de citocina), y por otro lado, pueden entregar los
péptidos antigénicos que llevan para su presentación por moléculas CMH-I (función
de chaperona).
Los mecanismos que regulan las funciones de las HSPs asociadas con la
inducción de la inmunidad antitumoral, son hasta el momento muy poco conocidos.
En este trabajo se tomo como modelo a las células K562, una línea celular derivada
de una eritroleucemia humana, las cuales expresan las proteínas HSC70 y HSP70
sobre la superficie celular. En estas células se evaluó principalmente la expresión
sobre la superficie celular de estas proteínas cuando las células se exponen a
estímulos como el choque térmico o la presencia de mediadores solubles como las
citocinas IFN-γ e IL-10. Esta expresión sobre la superficie celular podría tomarse
como un marcador de función de la proteína, ya que un incremento en la expresión
en la membrana celular podría ser un indicador de una función como blanco directo
de la respuesta antitumoral, o una disminución podría relacionarse con la liberación
de la proteína y una acción como “chaperocina”.
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2. ANTECEDENTES BIBLIOGRAFICOS
2.1. GENERALIDADES
Las proteínas de choque térmico (HSPs) fueron descubiertas por Ritossa en
1962 (Ritossa, 1962, en: Jolly & Morimoto, 2000), quien observó un patrón de
"puffs" de cromosomas de glándula salivar en moscas del genero Drosophila, como
respuesta a la exposición pasajera a elevadas temperaturas. A partir de este trabajo,
muchos investigadores han demostrado que la respuesta al choque térmico es tanto
ubicua como altamente conservada (desde bacterias a plantas y animales), y que
constituye un mecanismo de defensa esencial para la protección de las células contra
la exposición a un amplio rango de condiciones peligrosas como el calor, alcohol,
inhibidores del metabolismo energético, metales pesados, estrés oxidativo, fiebre o
inflamación. Estos agentes que inducen una respuesta al estrés, frecuentemente
afectan el estado redox y de hidratación de la célula, lo que a su vez, genera un
incremento en los niveles de las proteínas mal-plegadas que pueden ser deletéreas
para la célula debido a la alteración de sus actividades biológicas (Jolly & Morimoto,
2000).
Las HSPs se han clasificado en seis familias de acuerdo a sus masas
moleculares: HSP100, HSP90, HSP70, HSP60, HSP40, y HSPs pequeñas (Tabla 1).
Dentro de cada familia hay miembros que se expresan de forma constitutiva en la
célula, regulados induciblemente, y/o circunscritos a diferentes compartimentos
celulares (Jolly y Moromoto, 2000). Los miembros de estas proteínas que se expresan
de forma constitutiva y abundante en ausencia de cualquier estrés, son esenciales para
la viabilidad celular en condiciones normales de crecimiento (Tabla 2) (Gething &
Sambrook, 1992).
Una de las funciones más asociadas con las HSPs es la de "chaperona". La
función chaperona de las HSPs citoplasmáticas de 70 kDa (HSC70 y HSP70) se ha
asociado con la estabilización o generación de precursores de proteínas no plegadas
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TABLA 1. CLASIFICACIÓN DE LAS PROTEINAS DE CHOQUE TERMICO
FAMILIA PROTEINAS LOCALIZACION FUNCIONES
Hsp100 Hsp104 Citosol Tolerancia al estrés. Ayuda a la resolubili-zación de las proteínas inactivadas por calor.
Hsp90
Hsp90 gr94
Citosol RE
Papel en transducción de señales (Por ejemplo, interacción con receptores de hormona esteroidea, tirosina cinasas). Replegaje y mantenimiento de proteínas in vitro. Papel en el ciclo celular y proliferación.
Hsp70
Hsc70 Hsp70 Bip
Citosol Citosol RE
Proteína constitutiva que interactúa con el ATP, dependiendo de la forma hidrolizada o no, se une al péptido para promover el correcto ensamblaje o plegamiento del péptido. Potencial molécula presentadora de Ag tumorales. Proteína inducible con funciones generales similares a hsc70, asociada a p53 y algunos antígenos virales, unida a ciertos receptores esteroides. proteína abundante en el RE con capacidad de unirse al péptido, facilita el apropiado ensamblaje de inmunoglobulinas.
Hsp60 hsp60 Mitocondria Importante proteína eucariota en la apropiada translocación y ensamblaje oligomerico de proteínas en la mitocondria.
Pequeñas proteínas de choque térmico
hsp27 αA y αB cristalina
Citosol Pueden estar involucradas en la regulación de mRNA, implicadas en la adquisición y desarrollo de la tolerancia Suprime agregación e inactivación por calor de las proteínas.
FUENTE: Adaptado de KOCHEVAR et al (1991), y Jolly & Morimoto (2000).
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antes del ensamblaje en el citosol, con la translocación entre organelos incluyendo el
retículo endoplásmico y mitocondria, con la estabilización de polipéptidos recién
translocados antes del plegamiento y ensamblaje, con la constitución de oligómeros
de proteínas, con la disolución de agregados de proteínas y con la degradación de
proteínas citosólicas de proteínas de recambio rápido (Gething & Sambrook, 1992).
Tabla 2. INDUCTORES DE EXPRESION DE HSPs
CONDICIONES ESTRES
AMBIENTAL CONDICIONES ESTRES
PATOFISIOLOGICO CONDICIONES NORMALES
- Calor - Metales pesados - Oxidantes orgánicos
- Infecciones microbianas - Trauma de tejido - Lesiones genéticas
- Ciclo celular - Desarrollo embrionario - Diferenciación celular - Estimulación hormonal - Crecimiento microbiano
FUENTE: Gething and Sambrook, 1992. Protein folding in the cell. Nature 355:33-45
El papel que cumplen las HSPs en la protección celular en condiciones de
estrés o injuria celular donde se compromete la configuración y funcionamiento
normal de las proteínas, pudo haber surgido de las funciones relacionadas con la
actividad chaperona de las HSP. Algunas de estas funciones protectoras de las HSPs
se han asociado con eventos como la resistencia a la apoptosis por parte de las
células que se han tratado con choque térmico o que tienen una expresión
incrementada en algunas HSPs (Jacquier-Sarlin et al, 1994), o la protección frente al
daño oxidativo ocasionado por los radicales libres de oxígeno producidos durante la
fagocitosis en una respuesta inflamatoria. En este último ejemplo, el efecto se da
tanto para la célula fagocítica como para el microorganismo, de hecho se ha reportado
un incremento en la inducción de HSPs en microorganismos virulentos respecto de
sus contrapartidas no virulentas (Jacquier-Sarlin et al, 1994).
La asociación entre las alteraciones ocasionadas por el estrés celular y el
incremento en la expresión de algunas proteínas HSPs, pudo haber sido utilizado
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durante la evolución de los mecanismos de defensa del organismo, como una
estrategia para la identificación de procesos deletéreos para el organismo donde se
requiriera el desarrollo de la respuesta adecuada por parte del sistema de defensa. De
esta forma las proteínas HSPs se pudieron constituir en unas excelentes “señales del
peligro” para los sistemas de reconocimiento del sistema inmune.
2.2. INTERACCION HSP-PEPTIDO
Las funciones anteriormente descritas de las proteínas HSPs dependen de su
interacción con porciones polipeptídicas de alguna proteína sustrato. La estructura
básica de la HSP70 consta de tres dominios: un fragmento de 44 kDa amino terminal
que tiene actividad ATPasa y que es seguido por un dominio de 18 kDa que se une al
sustrato, y este a su vez es seguido por un dominio de 10 kDa que puede estar
involucrado en la interacción con moléculas denominadas co-chaperonas de la clase
DnaJ (Morshauser et al, 1999). El dominio ATPasa tiene una alta homología
estructural con los de las proteínas hexocinasa y actina, mientras que el dominio de
unión al péptido es semejante al surco de unión de las moléculas del complejo mayor
de histocompatibilidad clase I (CMH-I) (Feige y Polla, 1994). Dependiendo de su
actividad funcional estas HSPs se pueden unir a proteínas denaturadas o parcialmente
plegadas o a péptidos libres. Greene at al (1995) demostraron por medio de ensayos
de competencia que tanto proteínas como algunos péptidos libres se unen al mismo
sitio sobre las HSP70s.
Experimentos usando péptidos cortos han mostrado que proteínas como las
HSP70s se unen con preferencia a sustratos que contienen un tramo de siete residuos
ricos en residuos hidrofóbicos grandes y aromáticos. Los aminoácidos básicos
usualmente son bien tolerados particularmente para la HSP70 de E. coli (DnaK) y
para la HSP70 citosólica constitutiva, denominada HSC70. En términos generales las
HSP70s presentan una permisividad mayor que resalta la habilidad de estas proteínas
chaperonas para reconocer una variedad más grande de secuencias que las del
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Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) (Fourie et al, 1994; Morshauser et
al, 1999).
Aunque estas HSPs se han conservado enormemente dentro de la evolución,
no son funcionalmente idénticas, y parece que exhiben algún grado de selectividad
sobre las secuencias aminoacídicas a las que se unen. Debido a que el dominio
ATPasa amino terminal de las HSP70 es más altamente conservado que el dominio de
unión a péptido carboxiterminal, la diversidad funcional de las HSP70s puede resultar
de variaciones en su habilidad para unir a diferentes sustratos (Fourie et al, 1994;
Gragerov & Gottesman, 1994).
La estructura del dominio de unión al péptido de la proteína HSC70 ha sido
resuelta recientemente por espectroscopia NMR (Morshauser et al, 1999). El surco de
unión presenta una preponderancia de residuos hidrofóbicos y muestra la presencia
de solamente un bolsillo hidrofóbico profundo específico para residuos de leucina. El
dominio de unión al sustrato esta conformado por una estructura del tipo beta que es
invariante, seguido por un dominio del tipo hélice que puede ocupar diferentes
posiciones con respecto al beta y que por un doblez pueden parecer dos hélices. El
dominio completo de tipo hélice parece funcionar como un picaporte que permite el
acceso al sitio de unión a través de una bisagra en la base de la hélice. Cuando la
proteína se encuentra unida al sustrato, la hélice cubre el surco de unión al péptido
reteniendo al sustrato. Por la llegada de ATP hay un cambio conformacional en el
dominio ATPasa, una interacción con un sector hidrofóbico de la hoja beta desplaza
la base de la helice conduciendo a un desplazamiento total y a la liberación del
sustrato (Morshauser et al, 1999).
La interacción de las HSP con sus proteínas o sus péptidos sustratos es
regulada principalmente por tres factores: la unión del ATP al dominio ATPasa
aminoterminal, la hidrólisis del ATP y el intercambio de nucleótidos ADP por ATP.
Las proteínas HSP70s se consideran que presentan dos conformaciones básicas
dependiendo del tipo de nucleótido unido. En la conformación unida a ATP la HSP70
une y libera rápidamente el péptido, reflejando una afinidad global baja; mientras que
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en la conformación unida a ADP une al péptido lentamente pero de una forma más
estable. La entrada de ATP puede desplazar la molécula de ADP de la conformación
de mayor afinidad, conduciendo a un cambio estructural en el dominio ATPasa que a
su vez produce alteraciones estructurales en el dominio carboxiterminal que
conducen a la liberación del sustrato (Minami et al, 1996). Esta unión y liberación de
los sustratos es fundamental para llevar a cabo tanto las funciones de chaperona como
las funciones asociadas con el transporte de péptidos.
Se ha observado que la unión de los péptidos parece ser mucho más fuerte en
la presencia de ADP que de ATP. Cuando la actividad ATPasa genera ADP a partir
de ATP se disminuye marcadamente la tasa de disociación del sustrato de la HSP70,
ocasionando que el sustrato quede momentáneamente asegurado sobre la HSP. En el
trabajo de Minami et al (1996) se muestra que los diferentes sustratos utilizados se
unen con afinidades ampliamente diferentes. Estas diferencias en la afinidad de unión
a la secuencias peptídicas por parte de las HSPs podría influir sobre la actividad
ATPasa de la proteína. López-Buesa et al (1998) usando como modelo las HSP70s de
Saccharomyces cerevisiae, algunas de las cuales presentan actividades ATPasa
claramente distinguibles, demuestra que diferencias en la afinidad del péptido pueden
influir sobre el dominio ATPasa. Por lo tanto, péptidos que presenten una mayor
afinidad de unión a la HSP70 podrían producir una mayor actividad ATPasa para así
generar la forma estructural de la HSP70 de mayor afinidad de unión.
Debido a que la actividad intrínseca del dominio ATPasa de la proteína
HSP70 es baja, predomina la conformación unida a ATP de baja afinidad por el
sustrato. Como una consecuencia de este hecho, se ha visto por lo menos para la
función chaperona de la HSP70, una dependencia de la regulación por cofactores que
catalizan la interconversión entre las conformaciones de ATP y ADP (Minami et al,
1996). Entre estos cofactores se encuentran las proteína DnaJ y GrpE de E. coli. La
proteína DnaJ acelera la tasa de hidrólisis de ATP de la HSP70 bacteriana
denominada DnaK, mientras que la proteína GrpE promueve el intercambio de
nucleótidos. La estimulación mediada por DnaJ de la hidrolisis de ATP requiere de
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una comunicación entre el dominio ATPasa y el dominio de unión al sustrato de la
DnaK (Laufen et al, 1999). Actuando en conjunto los dos cofactores estimulan la
actividad ATPasa de DnaK en mas de 50 veces (Minami et al, 1996).
En humanos se ha encontrado un homologo de la DnaJ, la HSP40 (Hdj1), la
cual puede estimular la actividad ATPasa de HSC70 incrementando la unión al
sustrato en la presencia de ATP (Minami et al, 1996). Después de esta activación
ATPasa inicial, una proteína denominada Hip se une al dominio ATPasa y reduce la
disociación de la molécula de ADP, estabilizando el complejo HSP70-péptido y
manteniendo la estructura de alta afinidad de unión (Hohfeld, 1998).
La proteína BAG-1 en murinos y su homologo HAP46 en humanos se
consideraban como proteínas intercambiadoras de nucléotidos (Hohfeld, J. 1998), sin
embargo se ha demostrado que actúan como reguladores negativos inhibiendo el
replegaje in vitro dependiente de HSC70 de proteínas denaturadas. BAG-1 estimula
la actividad ATPasa y genera la conformación de un complejo ternario con la HSP70
y el sustrato formando un complejo aún más estable, impidiendo la liberación del
sustrato (Bimston et al, 1998).
Se ha reportado que proteínas individuales de HSP70 se pueden asociar entre
sí para conformar dímeros, trímeros y tetrámeros. Estos oligómeros se da entre
conformaciones unidas a ADP, mientras que las formas unidas a ATP se encuentran
generalmente en estado monomérico (Benaroudj et al, 1996; Gao et al, 1996).
Recientemente se ha demostrado que la oligomerización es mediada por el dominio
de unión al sustrato, y que la conformación de monómeros se produce como
consecuencia de la unión de ATP (Fouchaq et al, 1999). Se ha propuesto que la
oligomerización tiene como fin almacenar la HSP70 en una forma inactiva no unida
al sustrato, sin embargo recientemente se ha sugerido que la polimerización se puede
dar como un primer paso en la interacción con el sustrato. Se propone que tanto la
polimerización como la presentación del sustrato a la HSP70 serían mediadas por las
proteínas homologas de DnaJ y que involucrarían el traer el sustrato en proximidad
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con la HSP70 y luego independientemente inducir una hidrólisis rápida de ATP para
causar la formación de un complejo HSP70-sustrato estable (King et al, 1999).
2.3. REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LAS HSPs
Los genes para la HSP70 están ampliamente distribuidos a través del genoma
humano sobre los cromosomas 1, 5, 6 (dentro de los locus génicos del Complejo
Mayor de Histocompatibilidad -CMH-), 11, 14 y 21. Tres genes que codifican
miembros de la familia HSP70 se localizan en la región clase III del CMH y se han
definido como HSPA-1A, HSPA-1B y HSPA-1L. Los genes HSPA-1A y HSPA-1B
codifican una HSP-70 inducible por calor. El gen HSPA-1L es constitutivamente
expresado a bajos niveles, pero no es inducible por choque térmico (Leung et al,
1992; Milner & Campbell, 1992). Por otro lado, otro gen que codifica una HSP70
inducible por calor es el HSPA-6 que se encuentra localizado en el cromosoma 1,
mientras que el gen que codifica para la proteína HSC70 se encuentra localizado en el
cromosoma 11 y se ha denominado HSPA-8 (Tavaria et al, 1995),
Los genes HSPs son regulados a través de elementos reguladores específicos
conocidos como HSE ("Heat shock element"), los cuales comprenden múltiples
arreglos invertidos (5´-nGAAn-3´) del sitio de unión a los factores de transcripción
de choque térmico (HSFs). En organismos como Scaharomyces cerevisiae,
Caenorhabditis elegans, y Drosophila solamente se expresa un HSF, mientras que en
vertebrados y plantas por lo menos se han descrito 4 miembros. En células humanas
se han caracterizado tres miembros HSF1, HSF2 y HSF4: i) HSF1 se encuentra
ubicuamente expresada y participa en la expresión inducida por estrés, ii) HSF2 se
activa durante estados específicos del desarrollo, en la diferenciación celular inducida
por hemina, y durante la inhibición del proteasoma dependiente de ubiquitina, y iii)
HSF4 se expresa en una forma dependiente de tejido y muestra actividad constitutiva
de unión al DNA, y por lo menos una isoforma de HSF4 actúa como un inhibidor de
la expresión génica inducida por estrés (Jolly & Morimoto, 2000).
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En células en condiciones fisiológicas normales, las HSP70s se encuentran
unidas a los HSFs manteniéndolos inactivos. Cuando las células reciben un estimulo
que incrementa el número de blancos de unión de las HSPs (proteínas denaturadas,
degradadas, etc), estas liberan a los HSFs como el HSF1. Una vez los monómeros de
HSF1 se encuentran libres, se favorece su trimerización y su fosforilación, lo que
conduce a la translocación de los HSFs activos al núcleo de las células. Por otro lado,
el factor llamado HSF2 se encuentra como dímero en células a 37°C y a 42°C en
células K562 y cuando estas se exponen a hemina (un compuesto inductor de la
diferenciación) , el HSF2 se trimeriza y migra al núcleo. HSF-1 y HSF2 presentan un
efecto aditivo en la actividad de unión al DNA, pero exhiben ligeras diferencias en la
unión a las secuencias reguladoras. Mientras que HSF2 no se puede unir al primer
sitio de unión en el DNA (pentámero de secuencia 5`nGAAn-3`), HSF1 si se puede
unir a todos los cinco sitios de secuencias pentaméricas que hacen parte de la región
reguladora de las HSP70s (Feige & Polla, 1994). Estas pequeñas diferencias podrían
ser importantes en mediar diferentes respuestas de las HSP70s frente a diferentes
estímulos.
2.4. ASOCIACION HSP E INMUNIDAD ANTITUMORAL
En los últimos años se ha postulado que el sistema inmune parece estar más
relacionado con el reconocimiento del "peligro" y el potencial de destrucción, que
con el discernimiento entre lo propio y lo no propio. Para esto, el sistema inmune
podría reconocer ciertas señales de peligro derivadas de organismos infecciosos
(lipopolisacáridos, mánanos, glicanos) o de células afectadas (HSPs, mitocondrias,
manosa, RNA y DNA) (Matzinger, 1994; Todryk et al, 2000).
En la inmunidad antitumoral las HSPs podrían constituirse en señales de
peligro determinantes que alertan al sistema inmune de la presencia de células
anormales o transformadas. De hecho, en los últimos 15 años se han hecho esfuerzos
encaminados al uso de estas proteínas en los mecanismos de profilaxis o terapia
contra el cáncer. Estos esfuerzos han ido desde la implementación de tratamientos de
22
hipertermia sobre sangre total en leucemias refractarias y linfomas (Mivechi, 1989),
hasta el uso de HSPs purificadas de tumor como vacunas para la generación de una
respuesta inmune específica contra el tumor (Heike et al, 1996; Srivastava & Udono,
1994; Srivastava et al, 1998).
Las células tumorales presentan características que favorecen la expresión de
HSPs como la generación de estrés oxidativo, la sobreexpresión de proteínas
anómalas o la proliferación celular incrementada. Se ha observado que las células
tumorales humanas a diferencia de las células normales i) expresan niveles más altos
de algunas HSPs constitutivas como la HSP90, ii) expresan la proteína inducible
HSP70 en ausencia de algún estimulo estresante y, iii) pueden expresar sobre la
superficie celular proteínas como la HSP90 y la HSP70 (Ferrarini et al, 1992).
La localización inusual de la proteína HSP70 inducible sobre la superficie
celular tumoral se ha demostrado sobre material de biopsias humanas recién aisladas
de carcinomas colorectal, neuronal, pancreático y pulmonar, así como metástasis de
hígado y células blásticas leucémicas de pacientes con leucemia mieloide aguda
(Hantschel et al, 2000; Multhoff et al, 1995b). Esta expresión sobre la membrana
celular tumoral, ha llevado a la realización de trabajos donde se ha querido mostrar
el carácter de blanco de reconocimiento de estas proteínas por células del sistema
inmune como las NK o los linfocitos Tγδ. Multhoff et al (1995a y 1997) demuestran
que la expresión sobre la superficie celular de la HSP70 favorece el reconocimiento
de las células tumorales por parte de las células NK, además de mediar su
citotoxicidad. Por otro lado, se ha demostrado que la expresión de la HSP70 sobre la
membrana de células tumorales puede ser blanco del reconocimiento de células T γδ
(Wei et al, 1996). En otros trabajos se ha postulado que los linfocitos T γδ pueden
reconocer proteínas como la HSC70 cuando ella se encuentra acoplada a péptidos
antigénicos derivados de tumor (Tamura et al, 1993; Takashima et al, 1996). De esta
forma, se ha especulado con el hecho que las proteínas HSP70s podrían actuar como
23
moléculas presentadoras de antígeno de una forma análoga a como lo hacen las
moléculas del CMH; sin embargo esto aún no ha sido demostrado satisfactoriamente.
En cuanto a las proteínas de choque térmico localizadas intracelularmente en
las células tumorales, estas parecen participar asociadas con el procesamiento
antigénico. Proteínas citosólicas como la HSP70 y la HSP90 parecen actuar de
manera secuencial, siendo la HSP90 una proteína que al interactuar con el proteasoma
captura los péptidos recién generados, que después pueden continuar su
procesamiento así como la asociación con las proteínas HSP70s antes de dirigirse al
retículo endoplasmático (Ishii et al, 1999). Lammert et al (1997), usando péptidos
fotoreactivos han demostrado que la proteína HSP del retículo endoplásmico gp96 se
une a péptidos que son transportados por las proteínas transportadoras asociadas con
el procesamiento antigénico (TAPs). Estos péptidos posteriormente son entregados al
CMH clase I que se esta formando para que los presenten sobre la membrana celular.
El papel de las HSPs acá, parece ser básicamente proteger a los péptidos antigénicos
generados para evitar su completo catabolismo.
Por otro lado, se ha postulado que las HSPs derivadas de tumor eventualmente
podrían ser liberadas de las células. Por ejemplo, en algunos pacientes con cáncer de
seno, especialmente aquellos con metástasis, se han encontrado autoanticuerpos
contra la proteína HSP90 (Conroy et al, 1995). Basu et al (2000) muestran en un
estudio que las proteínas de choque térmico HSP70, HSP90 y gp96 de origen tumoral
pueden ser obtenidas a partir de células necróticas pero no de células apoptóticas.
Recientemente se ha postulado, que las HSPs presentes en el microambiente celular
podrían exógenamente llevar a cabo una función dual: por un lado, regulando la
función celular de células como los macrófagos, células dendríticas o inclusive
linfocitos T (función de citocina) y por otro lado, transportando péptidos antigénicos
derivados de las células tumorales hacia estas células presentadoras de antígeno
(función de chaperona). De ahí que se ha empezado acuñar el término “chaperocina”
(Asea et al, 2000; Broeler et al, 1999).
24
Según ha sido demostrado, los complejos de proteínas HSP70-péptido y gp96-
péptido pueden ser tomados por células presentadoras de antígeno como las células
dendríticas y macrófagos, a través de mecanismos de endocitosis mediada por
receptores específicos (Castellino et al, 2000; Singh-Jasuja et al, 2000). Las HSPs
internalizadas a las células translocan los péptidos antigénicos que llevan hacia las
moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad clase I para su presentación en
la membrana celular. Se ha mostrado que este mecanismo puede ser realizado por la
HSP70 a través de dos rutas: una citosólica dependiente de las proteínas TAP
(transportadoras asociadas con el procesamiento) o por una ruta endosomal.
25
3. MATERIALES Y METODOS 3. 1. LINEA CELULAR K562
La línea celular K562 se obtuvo en 1975 a partir del fluido pleural de un
paciente con leucemia mieloide crónica en crisis blástica. Estas células son
precursores eritroides muy tempranos que aún no expresan antígeno Ia y expresan
glicoproteínas de membranas propias de eritrocitos como la glicoforina A (Koeffler
& Golde, 1980).
Las células K562 se cultivaron a 37°C, en una atmósfera de CO2 al 5%, en
medio RPMI 1640 (Sigma) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB)
(ICN), 100 unidades/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina 50 mg/ml de
anfotericina, 5.6 mM de Hepes y 23.8 mM de bicarbonato de sodio. Las células se
mantuvieron a una densidad de 2 x 105 células/ml, y se realizarón subcultivos cada 24
horas. La viabilidad de las células en cultivo se determinó por el método de exclusión
de azul de tripan.
3.2. ANTICUERPOS
- Anticuerpos primarios
Para los procedimientos de western-blot se usaron anticuerpos de cabra
policlonales comerciales específicos contra las proteínas HSP70s. Se trabajo con el
anticuerpo anti-HSC70 SC-1059 (Santa Cruz Biotechnology) que reconoce un
epítope presente en la región carboxiterminal de la proteína humana. Este anticuerpo
es específico contra la HSC70 y no es reactivo con HSP70. De igual forma se uso el
anticuerpo anti-HSP70 SC-1060 (Santa cruz Biotechnology) que reconoce un
epítope presente en la región carboxiterminal de la proteína humana, es específico
contra la HSP70 y no reacciona con la HSC70 (Santa Cruz Biotechnology, 1998).
Por otro lado, para los análisis por citometria de flujo se usaron el anticuerpo
monoclonal hecho en ratón anti-HSC70 SPA-815 (StressGen Biotechnologies Corp.)
el cual detecta de forma específica la proteína HSC70, y el anticuerpo monoclonal
hecho en rata anti-HSP70 SPA-810 (StressGen Biotechnologies Corp) que detecta el
26
epitope correspondiente a la región aminoacidica 436-503 de la HSP70 humana y que
no presenta reactividad contra la proteína HSC70 (StressGen Biotechnologies Corp,
2000).
Para los análisis por inmunomicroscopia electrónica se uso un anticuerpo
policlonal hecho en conejo específico contra la proteína HSP70 regalado por el Dr.
Alexander Asea del Dana-Farber Cancer Institute.
Finalmente, para la detección de las moléculas del CMH-I se uso el anticuerpo
monoclonal hecho en ratón MHBC04 (IgG2a) y conjugado a PE (Phycoeritrin), el
cual reconoce a las moléculas HLA-B, C y ciertas moléculas de HLA-A (algunos A9
y A19 (Caltag Laboratories).
- Anticuerpos Secundarios:
Para realizar la detección de las proteínas por Western-blot se uso el
anticuerpo anti-IgG de cabra conjugada con peroxidasa de Santa Cruz Biotechnology
SC-2020..
En las marcaciones para citometria de flujo se uso el anticuerpo anti-IgG de rata
F(ab´)2 conjugado con FITC (Caltag Laboratories (R40101)) y el anticuerpo anti-IgG
de ratón (molécula completa) conjugado con FITC (ICN (#55494)).
3.3. ANALISIS DE LA EXPRESION DE HSP70 EN CELULAS K562 BAJO
CONDICIONES FISIOLOGICAS NORMALES Y DE CHOQUE
TERMICO A 41.8°C
3.3.1. Inducción de la expresión de HSP70 en células K562 por choque térmico
a 41.8°c
Para realizar el choque térmico las células se recuperaron por centrifugación a
560 g por 10 minutos. En seguida, las células se contaron en cámara de Newbauer y
se ajustaron a una población apropiada dependiendo del tipo de ensayo a realizar. Las
células K562 se sometieron a estrés térmico a una temperatura subletal de 41.8°C en
27
un baño serológico durante diferentes tiempos (1h, 3h, 3h20´) y en seguida se
llevaron a 37°C también durante diferentes tiempos (3h y 4h) para permitir un
periodo de recuperación de las células. En todos los ensayos siempre se mantuvo un
control de células a 37°C en un número equivalente al de choque térmico y durante
un periodo de tiempo correspondiente al lapso de choque y recuperación.
3.3.2. Determinación por Western blot de la expresión de las proteínas HSC70 y
HSP70 en las células K562
Para el análisis de la expresión de las proteínas de choque térmico en las
células K562 sometidas a choque térmico, después de cada tratamiento las células se
recuperaron por centrifugación a 560 g por 10 minutos. Cada botón celular formado
se resuspendió en 100 µl de buffer de lisis (NaHCO3 1mM/EDTA 0.2 mM)
suplementado con inhibidores de proteasas (ICN). Luego se incubaron las células
sobre hielo por 30 minutos para permitir que éstas se hincharan (Morré at al, 1995) y
se sometieron a lisis celular en un sonicador Branson 1510 por 15 minutos. En
seguida, el lisado celular se paso varias veces por jeringas de 5 y 1 ml para favorecer
el rompimiento de aquellas células que no se alcanzaron a lisar. La eficacia de la lisis
se monitoreo por observación en el microscopio. Los análisis se llevan a cabo sobre
los lisados celulares totales obtenidos. Las proteínas de los lisados se cuantificaron
según la técnica de Bradford.
La electroforesis se realiza en condiciones denaturantes utilizando el sistema
de Laemmli (Laemmli, 1970) en geles de policarilamida SDS-PAGE al 10% a 120 V
y 60 mA durante un tiempo cercano a 2 horas y 30 minutos, en una cámara de
electroforesis Mini-Protean II X2-2D Cell. Se sembraron 50 µg de cada muestra por
pozo. Luego, se realizó la transferencia a papel de nitrocelulosa GIBCO BRL 0.22
nm previamente activado con Buffer de transferencia, durante 1 hora a 100 V y 350
mA. La transferencia se verificó tiñendo el papel con rojo de Ponceau S. En seguida,
el papel se bloqueó con una solución de TBS-Tween-5% de leche descremada
durante 30 minutos en agitación a temperatura ambiente. Se eliminó el exceso de
28
solución bloqueadora y se incubó 1 hora en agitación con el anticuerpo primario
específico (IgG de cabra anti-HSP70 y anti-HSC70, sc-1060 y sc-1059, Santacruz ,
respectivamente) en una dilución 1/100 en la solución bloqueadora. En seguida, las
membranas se lavan con solución de lavado (TBS- Tween 20 al 0.2%) por 5 minutos
cada uno. Se incubó durante 50 minutos en agitación y protegido de la luz con el
conjugado anti-IgG de cabra-HRP (SC-2020, Santacruz) en una dilución 1/500 en
solución bloqueadora. Se realizaron 5 lavados en las condiciones anteriores. Luego
las membranas se trataron con una solución de visualización por quimioluminecencia
para peroxidasa (Luminol, SC2048, Santacruz) durante 1 minuto. Se descartó el
exceso de Luminol y la membrana se uso para impresionar películas fotográficas para
quimioluminiscencia HIPERFILM ECL de Amersham, durante aproximadamente 1
minuto 30 segundos. Finalmente las películas se revelaron por las técnicas
convencionales de fotografía. Las bandas obtenidas por ECL se analizaron en un
video-densitometro ZEINEH 92631 de Biomed Instruments empleando un Software
de la American Applied Biology.
3.3.3. Análisis por citometria de flujo de la expresión de HSP70 en células K562
estresadas por calor
Para el análisis de la expresión de las proteína HSC70 y HSP70 se tomaron
poblaciones de 1 x 106 células que se distribuyeron según los tratamientos realizados.
Una de ellas se mantuvo a 37°C mientras que las otras se sometieron a estrés a
41.8°C durante 3 horas y 20' . Después del choque térmico las células se dejaron
recuperar a 37°C por un periodo de 3 horas. Después de los tratamientos cada una de
las subpoblaciones se dividió en 5 poblaciones de 2x105 células para realizar el
marcaje: se realizaba un control sin marcar, uno con anti-rata conjugado a FITC, uno
con anti-ratón conjugado a FITC, uno con el primario anti-HSC70 (y el conjugado
correspondiente) y otro con el primario anti-HSP70 (y el conjugado correspondiente).
Como primer paso las células se lavaron dos veces en PBS 0.01% NaN3, 10% de
SFB para bloquear inespecificidades. En seguida las células se incubaron con el
29
anticuerpo primario durante 20 minutos a 4°C (0.5 µg/10µl). Después de la
incubación las células se lavaron 1X con PBS 0.01% NaN3 2% SFB, y se incubaron
durante 20 minutos con el anticuerpo secundario (0.6 µg/10 µl de anti-rat-FITC y
1/250 del anti-mouse-FITC). En seguida las células se adquirieron en el citómetro de
flujo FACScalibur (Becton Dickenson). Los análisis se realizaron por medio del
programa CELL QUEST. Se determinó principalmente la intensidad de fluorescencia
de cada una de las poblaciones. La cantidad de proteína expresada sobre las
superficie de las células se determinó mediante la elaboración de histogramas donde
se tomo como control de “Background” la intensidad de fluorescencia determinada
para la población incubada con el anticuerpo secundario, y sobre esta se superpuso la
fluorescencia de la población de células incubadas tanto con el anticuerpo primario
como con el secundario.
3.4 . INDUCCIÓN DE LA EXPRESIÓN DE PROTEINAS DE CHOQUE
TERMICO CON MEDIADORES SOLUBLES
3.4.1. Preparación de los sobrenadantes provenientes de células mononucleares
de sangre periférica depletadas en monocitos y células B
Para obtener células mononucleares de sangre periférica (PBMC) depletadas
de monocitos se tomaron inicialmente unos 10 ml de sangre periférica en tubo
heparinizado. Esos 10 ml se diluyeron 1:2 en RPMI1640 y se sembraron sobre un
colchón de Ficoll-Hypaque (Sigma) quedando en una relación de 3 de sangre diluida
por 1 ml del gradiente. El gradiente con la sangre se centrifugó a 560 g durante 30
minutos a temperatura ambiente. En seguida se removió cuidadosamente la fracción
nubosa que se forma entre el plasma y el Ficoll, que es donde se encuentran las
PBMC. En seguida se dejan adherir los monocitos durante 30 minutos sobre cajas de
petri plásticas a 37°C. Luego, se recuperaron las células no adherentes, se lavaron y
se contaron en cámara de Newbauer. La población de células no adherentes se paso a
través de una columna de Nylon previamente activada para eliminar los linfocitos B.
30
Las células que no son atrapadas se recuperaron y una fracción se congeló para su
posterior fenotipificación.
La producción de sobrenadantes de estas células mononucleares obtenidas
estimuladas con Cryptococcos neoformans se realizó inicialmente sembrando una
cantidad de 2 x 105 células en 200 µl de RPMI1640 sin anfotericina por pozo en una
placa de 96 pozos. Estas células se enfrentaron a una cantidad de 1000 C. neoformans
y los sobrenadantes se recogieron a las 24 horas o las 48 horas. Por otro lado, la
misma cantidad de PBMC (que son las células mononucleares que fueron tratadas
para la depleción de monocitos y células B) se enfrento con 20 µl del polisacárido
GXM purificado de la cápsula de C. neoformans y los sobrenadantes se recogieron a
las 24 ó 48 horas. Como un control se colectaron sobrenadantes provenientes de la
incubación de células PBMC por 24 o 48 horas en ausencia de la levadura o el
polisacárido.
3.4.2. Estimulación de las células K562 con los sobrenadantes de células PBMC
activadas
Para este ensayo las células K562 se separaron en poblaciones iguales de
1x106 células en placas de 24 pozos. Unas células se tomaron como control de
expresión normal de HSP70s y se mantuvieron a 37°C durante todo el procedimiento
y otras células se usaron como control de expresión de HSP70s bajo estrés y por lo
tanto se les realizó un choque térmico durante 3 horas y 20 minutos y luego se
dejaron en recuperación por un tiempo de 3 horas. Una de las poblaciones de células
K562 se enfrentaron con 200 µl de sobrenadantes provenientes de las PBMC
activadas con C. neoformans por 24 horas y se mantuvieron en un volumen total de 2
ml de medio RPMI1640 en frascos de cultivo T25 durante 24 horas a 37°C en
presencia de 5% de CO2. Otras poblaciones se mantuvieron bajo las mismas
condiciones con los sobrenadantes de las células estimuladas con C. neoformans por
48 horas, o con las células con el GXM por 24 o por 48 horas. De igual forma otras
K562 se enfrentaron bajo las mismas condiciones con los sobrenadantes controles. A
31
las 24 horas de tratamiento, todas las células se recuperaron por centrifugación a 1800
rpm por 5 minutos y se lavaron con medio RPMI1640 a 1800 rpm por 5 minutos. Las
células se lisaron como se describió arriba y la expresión de las proteínas se
determinó por WB.
3.4.3. Inducción de HSP70s con las citocinas recombinantes IFN-γ e IL-10
Para el tratamiento con las citocinas, se tomaron poblaciones de 1x106 células
que se incubaron por 18 horas con 375 ó 750 U/ml del IFN-γ recombinante humano
(R&D Systems) o con 15 ng/ml de la IL-10 recombinante humana (R&D Systems).
Para algunos experimentos, las células se trataron por 18 horas con 0.5 ó 1 µM del
inhibidor del proteasoma MG132. Las células estimuladas se procesaron para
Western-blot o citometría de flujo como se describió arriba.
3.5. ANÁLISIS POR INMUNOMICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA HSP70 SOBRE LA LÍNEA CELULAR K562
La localización de la proteína HSP70 a nivel del citoplasma o del núcleo en
células tratadas con calor o con IFN-γ se analizó por medio de la técnica de
inmunomicroscopia electrónica. Las células se estimularon con calor e IFN-γ tal
como se describió arriba. Para realizar los análisis por inmunomicroscopía electrónica
(IME), las células se sometieron dos veces a un lavado suave con PBS a 560 g por 3
minutos. El “pellet” celular se resuspendió en 1 ml de una solución de
paraformaldehído al 1% y glutaraldehído al 0.5% y se incubó a 4°C durante 20
minutos. Las células posteriormente se lavaron dos veces con PBS a 560 g por 3
minutos.
Las células se deshidrataron con alcoholes y por lo tanto, inicialmente se
resuspendieron en una solución de alcohol al 50% y se incubaron a temperatura
ambiente por 5 minutos. Luego, se centrifugaron a 560 g por 3 minutos y el pellet se
resuspendió en una solución de alcohol al 70%. Se incubó por 10 minutos y luego se
32
centrifugó de nuevo para repetir el último paso por la solución de alcohol al 70%.
Para iniciar el proceso de inclusión en la resina, las células se centrifugaron y
resuspendieron en 200 µl de la solución de resina LR WHITE (disuelta en una
proporción 1:1 en alcohol al 70%), y se llevaron a incubar durante 20 minutos a 4°C.
Luego, se centrifugó y descartó el sobrenadante para resuspender el “pellet” en 200 µl
de resina pura. De nuevo se incubó a 4° durante 20 minutos y se repitió una vez el
paso de la resina pura. Finalmente, después de la ultima incubación de 20 minutos a
4°C las células se centrifugaron y se resuspendieron en una solución resina pura LR
WHITE que contenía el agente polimerizante. La resina con las células se llevaron a
4°C toda la noche.
Los cortes para ME realizaron en un Ultramicrotomo ULTROTOME III LKB.
Los cortes obtenidos se colocaron sobre unas rejillas de cobre y se bloquearon con
una solución de TBS glicina 0.2M durante 10 minutos. Luego se bloqueo con TBS
BSA al 1% durante 20 minutos y se incubó con el anticuerpo anti-HSP70 (No. 47,
donado por el Doctor Alexander Asea del Danna Farber Cancer Institute - Boston) en
una dilución de 1/500 durante toda la noche a 4°C. Las rejillas se lavaron 4 veces en
agitación con una solución Tris - Tween 20 al 0.01% y se incubaron con la proteína
A conjugada con oro coloidal de 20 nm (dilución 1/200) durante 30 minutos. Se
lavaron las rejillas 4 veces con Tris-Tween 20 al 0.01% y luego se lavaron
intensamente con agua de grifo.
Las rejillas con el inmunomarcaje se fijaron con glutaraldehído al 2% en PBS
durante 5 minutos. En seguida se lavaron con agua de grifo y se colorearon con
acetato de uranilo durante 5 minutos. Finalmente las células se lavaron con agua
copiosamente y se dejaron secar sobre papel filtro. Las rejillas se montaron en el
Microscopio Electrónico de Transmisión y se visualizaron para localizar (dentro del
núcleo o fuera del núcleo) los puntos de la reacción. Se tomaron fotos de
acercamientos de las células para contar en cada uno de los diferentes tratamientos los
puntos de reacción y así poder determinar si hubo una mayor o menor expresión de la
HSP70 inducible respecto a las células control de 37°C.
33
3.6. ANÁLISIS ESTADISTICO Las muestras sobre las cuales se hizo un análisis estadístico presentaban una
distribución normal y tenían varianzas similares. A estos experimentos se les aplico
una prueba T pareada con una o dos colas según el caso. Se considero para todas las
comparaciones un nivel de significación del 5%.
34
4. RESULTADOS 4.1. ANALISIS DE LA EXPRESION DE LAS PROTEINAS HSC70 Y HSP70
EN CELULAS K562 BAJO CONDICIONES DE CHOQUE TERMICO
Se decidió escoger como modelo de estudio a las células K562 básicamente
por dos razones: Primero, porque se ha reportado que estas células expresan de forma
constitutiva la proteína HSP70 sobre la superficie celular. Y segundo, por que existen
trabajos preliminares con esta línea celular donde se reporta un incremento en la
citotoxicidad celular dependiente de células NKs cuando las células K562 son
tratadas con choque térmico. Este efecto sobre la citotoxicidad se ha atribuido a un
incremento en la expresión de la proteína HSP70 (Multhoff y col., 1995).
En la primera parte de este trabajo se caracterizo la expresión de la proteína
HSC70 y HSP70 bajo condiciones de choque térmico. Se determinó tanto la
expresión total de las proteínas por la célula (Westernblot) como la expresión sobre la
superficie celular (Citometría de flujo)
4.1.1. Análisis por Western-blot de la expresión de HSP70s en lisados celulares
de K562
Las condiciones del choque térmico se determinaron según el trabajo del
grupo de Multhoff y col (1995) donde se reporta una inducción de la expresión de la
HSP70 sobre células de sarcoma humano que favorece una citotoxicidad celular
mediada por NKs, cuando las células son expuestas por 3 horas y 20 minutos a
41.8°C con tiempos de recuperación a 37°C de 3, 4 o más horas.
Según lo anterior, se analizó la expresión de las proteínas HSC70 y HSP70 en
lisados celulares de K562 estresadas a 41.8°C durante 3 horas y 20 minutos y con
tiempos de recuperación de 3 horas o 4 horas a 37°C. La expresión de las proteínas
HSC70 y HSP70 de las células expuestas a choque térmico se comparó con la de las
células control mantenidas a 37°C por el mismo periodo de tiempo y bajo las mismas
condiciones de densidad celular. La expresión de las proteínas se determinó por WB
35
y las bandas de reacción obtenidas por quimioluminiscencia se analizaron por
densitometría para comparar de forma cuantitativa la expresión de las proteínas por
los diferentes tratamientos.
En la figura 4.1 se observa que el tratamiento de choque térmico con tiempo
de recuperación de 4 horas genera un ligero incremento en la expresión de la proteína
HSP70 acompañado de una ligera disminución en la expresión de la proteína HSC70,
mientras que con el tiempo de recuperación de 3 horas se produjo un incremento
notable en la expresión de la proteína HSP70 pero no de la HSC70. Con estos
resultados a partir de este único experimento preliminar, se decidió tomar como
condiciones de choque térmico para los demás experimentos un tiempo de
recuperación de 3 horas a 37°C poschoque térmico, ya que permitió observar un
efecto más claro del choque térmico sobre las células según se ha descrito:
incremento de la proteína inducible HSP70, sin una aparente alteración de la proteína
constitutiva HSC70 (Beckmann et al, 1992; Kim et al, 1995; Welch & Feramisco,
1984; Welch & Suhan, 1986)
En 12 experimentos independientes realizados, se analizo por WB el efecto
del choque térmico sobre la expresión de las proteínas HSC70 y HSP70. De acuerdo a
una prueba T apareada usando las densidades ópticas obtenidas para cada banda de
reacción, se determino que no hay diferencias significativas en la expresión de la
proteína HSC70 (p=0.171) entre los tratamientos a 37°C y 41.8°C. Por otro lado, si se
encontraron diferencias significativas en la expresión de la proteína HSP70
(p=0.0009), donde se observo un incremento en su expresión en las células tratadas
con choque térmico de 351.67+/-72.37 a 800.92+/-162.37 (media +/- SEM) (Tabla 3,
Figura 4.2). Por lo tanto, el choque térmico bajo las condiciones descritas genera un
incremento en el nivel de expresión de la proteína inducible HSP70, mientras que el
de la proteína constitutiva no se ve afectado.
36
FIG. 4.1. ANALISIS DENSITOMETRICO DE LA EXPRESION DE HSC70 Y HSP70 EN CELULAS K562 MANTENIDAS A 37°C O ESTRESADAS A 41.8°C
HSC70 HSP70
37° 41.8° 37°
1 2 3 4
3 H
HSC70 HSP70
37° 41.8° 37° 41.8°
1 2 3 4
4 H
Las células K562 se estresaron a 41.8°C por 3 horas y 20 minutos y luego se mantuvieron por periodos de 3 horas (ARRIBA) y 4 horas (ABAJO) en recuperación a 37°C. Se observa el análisis densitometrico de los resultados obtenidos por WB de la expresión de HSC70 y HSP70 de las células control a 37°C o estresadas por calor.
TABLA 3. ANALISIS DENSITOMETRICO DE LA EXPRESION DE HSC70 Y HSP70 EN CELULAS K562 MANTENIDAS A 37°C O ESTRESADAS A 41.8°C
37
92.8 52.1 126.3 99.7 211.5 42.3 358.7 41.4 42.9 155.2 609.0 44.35
634 171 384 295 330 99 373 104 171 433 1145 1252
1317 499 688 591 486 333 477 355 570 712 1333 2250
683 328 304 296 156 234 104 251 399 279 188 998
% INCREMENTO 41.8°C *p=0.0009
D.0 41.8-37°C D.O 41.8°C HSP70
D.O. 37°C HSP70
1.7 1.5
-12.6 -19.6 9.6 -4.7 -8.9 25.8 26.8 3.4 17.1
162.42
22 16
-134 -451 119 -22 -69 215 293 17 161 1030
1336 1050 928 1846 1365 443 709 1048 1387 513 1101 2680
1314 1034 1062 2297 1246 465 778 833 1094 496 940 1650
*p=0.171 HSC70 HSC70 % INCREMENTO 41.8°C D.0 41.8-37°C D.O 41.8°C D.O. 37°C A
B
La expresión de las proteínas determinadas por WB, se cuantificó por densitometria óptica. En las tablas aparecen las densidades ópticas obtenidas en las células a 37°C y 41.8°C, así como las diferencias entre los tratamientos, con el fin de determinar si el choque térmico genera un incremento en la expresión de la HSC70 (arriba) o la HSP70 (abajo).
OBTENIDA EN LOS TRATAMIENTOS A 37°C Y 41.8°C EN EXPERIMENTOS FIG. 4.5. COMPARACION DE LA EXPRESION DE HSC70
38DE 6H20´ Y 18 H
Se comparan las intensidades medias de fluorescencia (IMF) +/- SEM de la expresión en la superficie celular de la proteína HSC70 en las células estresadas por calor respecto a las células control a 37°C en experimentos de 6H20´ y 18 horas.
EEXXPPEERRIIMMEENNTTOOSS 1188HH
02468
1012141618202224
37°C 41.8°C 37°C 41.8°C
6 H 20´ p=0,008 18 H
p=0.016
INTEN
SIDA
D M
EDIA
DE
FLUO
RESC
ENC
IA
n=6 n=5
39
4.1.2. Análisis por citometría de flujo de la expresión de las proteínas HSC70 y
HSP70 sobre la superficie de las células K562
Para determinar si el choque térmico producía algún efecto sobre la
localización de las proteínas HSC70 y HSP70 en la membrana celular de las K562,
las células se estimularon y analizaron por citometría de flujo. Para no tener un
efecto por estrés metabólico producto del sobrecultivo, en los días previos a cada
experimento, las células se mantuvieron en frascos T25 a una densidad de 2x105
células/ml, realizándose pases con recambio de medio cada 24 horas. Inicialmente,
se determinó el efecto del tiempo de duración del choque térmico sobre la expresión
de las proteínas HSC70 y HSP70. Se tomaron células K562 y se sometieron durante
30´, 1 h, 2 h o 3h20´ a un choque térmico a 41.8°C y con un periodo de recuperación
de 3 horas a 37°C. Como se observa en la figura 4.3, únicamente el choque térmico
de 3h20´ es el que produce alguna modificación en la expresión de alguna de las
proteínas de choque térmico estudiadas. Bajo estas condiciones de estrés térmico las
células presentan una disminución en la expresión de la HSC70, mientras que las
HSP70 no se ve afectada.
En análisis posteriores se encontró que la respuesta al choque térmico depende
de las condiciones de cultivo de las células. Esto se determino básicamente con el
desarrollo de dos tipos de experimentos ambos llevados bajo las mismas condiciones
de choque térmico: 3h 20` de exposición a 41.8C con 3h de recuperación a 37C. En
un tipo de experimento, las células se podían llevar a una densidad de 5x105
células/ml y directamente ser expuestas a choque térmico por un periodo de 3h20` y
con un periodo de recuperación de 3h a 37°C (Experimentos de 6h20´); o las células
antes del choque térmico podían colocarse en cultivo toda la noche a una densidad de
5x105 células/ml y luego ser expuestas a choque térmico por 3h20´ con 3h de
recuperación (Experimentos 18h). Luego, las células se marcaron y adquirieron en el
citómetro de flujo FACSCalibur y se analizaron a través del software CellQuest.
En seis experimentos independientes de los de 6h20´ se encontró en todos los
histogramas que con el choque térmico las células K562 no presentan modificación
FIG. 4.3. EFECTO DEL TIEMPO DE CHOQUE TERMICO SOBRE LA EXPRESION
EN LA SUPERFICIE CELULAR DE K562 DE LAS PROTEINAS HSC70 Y HSP70 40
HSC7 HSP70
1 H
2 H
3 H 20´
Poblaciones de 1x106 células en 2 ml de RPMI1640 se sometieron a choque térmico por periodos de 30´ (datos no mostrados), 1, 2 horas y 3H20´ y con periodos de recuperación de 3H a 37C. La expresión de lss proteínas HSC70 y HSP70 en las células estresadas (fucsia) se comparó con la de las células a 37C (verde).
37°C 41.8°C
37°C 41.8°C
37°C 41.8°C
37°C 41.8°C
37°C 41.8°C
37°C 41.8°C
41
en cuanto a la expresión de la proteína HSP70, pero si se observó una disminución en
la intensidad de la media de fluorescencia en la expresión de la proteína HSC70
(p=0.008). Esta disminución también se observo en el número de células positivas
que paso de 83.02+/-1.74 (media+/-SEM) en las células a 37°C a 75.18+/-2.37 en las
células a 41.8°C (p=0.0025) (Figura 4.4, panel A; Figura 4.5; Tabla 4, panel A).
Por otro lado, se encontró que el estrés metabólico producto del sobrecultivo
modifica la respuesta al choque térmico por parte de las células K562. En 5
experimentos independientes donde la noche previa al choque térmico se colocaron
1x106 células en 2 ml de medio de cultivo y en placas de cultivo de 24 pozos, se
observó que las células estresadas por calor en la mañana siguiente, presentaban un
incremento en la expresión de HSC70 (p=0.016), respecto a las células control
mantenidas las 18 horas a 37°C (Figura 4.4, panel B; Figura 4.5; Tabla 4, panel B).
Al igual que en los experimentos de 6H20´ la expresión de la proteína HSP70 no fue
modificada con el choque térmico (Figura 4.4, panel B), y el efecto también se
observo en el % de células positivas que paso de 80.94+/-1.74 en el tratamiento a
37°C a 71.56+/-2.48 en las células tratadas con choque térmico (p=0.0057).
Para determinar si solamente el tiempo de cultivo era capaz de generar
modificaciones en la expresión basal de la proteína HSC70, se colocaron poblaciones
de 0.5x106 células en los 2 ml de medio de cultivo y se cultivaron por 48 horas. La
expresión de la proteína HSC70 se determinó a las 0, 12, 24 y 48 horas de cultivo. En
los resultados de este único experimento, se observó que las células después de 12
horas de cultivo parecen presentar un ligero incremento de la expresión de la HSC70
respecto al control de 0 horas, mientras que a las 48 horas de cultivo se presenta una
disminución destacable en la expresión de la HSC70 (Figura 4.6). La reducción
observada en la expresión de la HSC70 podría ser explicada por el incremento en el
número de células así como por la reducción en la viabilidad celular causados por el
tiempo de cultivo (Tabla 5). Por lo tanto, a pesar que el choque térmico no genera una
alteración importante en la expresión de la HSC70, sí lo hace sobre la localización en
la superficie celular. Además, esta localización de la HSC70 sobre la membrana
FIG. 4.4. EFECTO DEL CHOQUE TERMICO SOBRE LA EXPRESION EN LA
SUPERFICIE CELULAR DE K562 DE LAS PROTEINAS HSC70 Y HSP70 42
HSC7 HSP70
6H20´
18 H
Los ensayos de choque térmico se realizaron sobre experimentos de 6H20´ (panel A) ó 18 H (panel B). En ambos tipos de experimentos se partio de poblaciones celulares de 1x106 células en un volumen final de 2 ml de RPMI 1640. En los experimentos cortos una población de células se estresó por periodos de 3H20´a 41.8C con un tiempo de recuperación de 3H a 37°C, mientras que la población control se mantuvo las 6H20´a 37°C. En los experimentos largos las poblaciones celulares de 1x106 células se mantuvieron toda la noche a 37°C, y en la mañana siguiente el manejo se realizó como en los experimentos cortos. La expresión en la superficie celular de HSC70 y HSP70 se determinó por FACS en las células estresadas (fucsia) y se comparo con la de las células control a 37°C (verde).
A
B
37 41.8°C
37 41.8°C
37 41.8°C
37 41.8°C
43
44
45
FIG. 4.6. EFECTO DE LA DENSIDAD CELULAR Y EL TIEMPO DE CULTIVO SOBRE LA EXPRESION DE HSC70
R
12 H
24 H
Las células K562 se colocaron a cultivar en una densidad celular de 0.5x106 células en 2 ml de RPMI1640. La expresión de la proteína HSC70 se determinó a las 0 (línea verde) , 12 (línea fucsia), 24 (línea roja) y 48 horas (línea azul) de cultivo.
48 H
0 H 12 H
0 H 24 H
0 H 48 H
46
celular parece ser sensible a alteraciones en el microambiente celular productos de la
proliferación y el metabolismo celular.
Tabla 5. Número de células y porcentaje de viabilidad celular en 48 horas de
cultivo
T. CULTIVO (H) NUMERO CELULAS VIABILIDAD CELULAR
0 500.000 99%
12 654.000 98%
24 1´233.000 90.3%
48 1´830.000 87.4%
Es posible que la respuesta al choque térmico en cuanto a la expresión de la
HSC70 sobre la superficie celular, la cual no ha sido reportado en trabajos previos, se
deba a condiciones específicos del tipo celular y no sea exclusiva de la naturaleza de
esta proteína. Este punto se esta evaluando actualmente y en análisis preliminares se
tomaron células Jurkat, las cuales son células transformadas de un linaje linfoide T y
se expusieron a 41.8°C bajo las mismas condiciones que las K562. Sobre estas
células se evaluó tanto la expresión de las proteínas HSC70 y HSP70 como las de las
moléculas CMH-I. Se encontró que las células tanto a 37°C como estresadas a
41.8°C no expresan ninguna de las proteínas de choque térmico, mientras que se
observo que las células estresadas por calor presentan una disminución en la
expresión de las moléculas CMH-I (Figura 4.7).
47
R
37 °C 41.8°C
37°C 41.8°C
37°C 41.8°
FIG. 4.7. EFECTO DEL CHOQUE TERMICO SOBRE LA EXPRESION DE LAS PROTEINAS HSC70, HSP70, Y CMH-I EN LA LINEA CELULAR JURKAT
Poblaciones de 1x106 células en 2 ml de RPMI1640 de células JURKAT se sometieron a choque térmico por 3H20´ y con un periodo de recuperación de 3 h a 37C. La expresión de las proteínas HSC70, HSP70 y CMH-I en las células estresadas se comparó con la de las células a 37°C.
HSC7 HSP70
CMH-I
48
4.2. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE LAS PROTEINAS HSP70s EN
CELULAS K562 ESTIMULADAS CON MEDIADORES SOLUBLES DE
CELULAS MONONUCLEARES
4.2.1. Análisis por Western-blot de la expresión de HSP70s en células K562
tratadas con sobrenadantes de PBMC estimuladas con C. neoformans
Con el objetivo de determinar si la presencia de factores solubles producidos
durante una respuesta a un agente infeccioso pueden regular la expresión de las
proteínas de choque térmico se obtuvieron sobrenadantes de células mononucleares
de sangre periférica que se habían enfrentado a la levadura o al polisacárido capsular
GXM derivado de C. neoformans.
El Criptococco neoformans, se utilizó como modelo porque su estudio se ha
venido desarrollando de forma paralela en otra línea de investigación del grupo. Por
lo tanto, se contaba con el polisacárido capsular de la levadura GXM purificado. Los
sobrenadantes de 24 y 48 horas obtenidos a partir del cocultivo entre células
mononucleares y la levadura completa o el GXM, se usaron para estimular
poblaciones de K562 durante toda la noche (entre 18 a 24 horas).
Para los análisis se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica
(PBMC) de 3 donantes sanos. En este trabajo se ha puesto un particular interés en la
acción de citocinas como el IFN-γ y la IL-10 sobre la expresión de las HSPs
estudiadas. Teniendo en cuenta que los linfocitos son la principal fuente de
producción de IFN-γ, las PBMC obtenidas se sometieron a procesos de purificación
que involucraron adherencia de monocitos y columnas de Nylon para remoción de
linfocitos B. En la inmunofenotipicación realizada sobre las células usadas (ver Tabla
6) se observa que el enriquecimiento no fue exitoso, por lo tanto las poblaciones
usadas en este estudio se denominaron como PBMCs. Los sobrenadantes producidos
por estas células mononucleares enfrentadas tanto al GXM como a la levadura, se
usaron para estimular las células K562. Se encontró que la expresión de la HSP70 se
49
incremento en todas las poblaciones celulares que se enfrentaron a los sobrenadantes
productos de la inducción con la levadura completa o con el polisacárido GXM de C.
neoformans. Este efecto no se observó en las células expuestas a los sobrenadantes
control, que se habían colectado de las células mononucleares sin exposición al
polisacárido o la levadura. Por otro lado, la expresión de la proteína constitutiva
HSC70 no fue modificada por ningún tratamiento (Figuras 4.8 , 4.9 y 4.10).
Tabla 6. Inmunofenotipificación donantes Células Mononucleares
CD3+CD56- CD3+CD56+ CD3-CD56+ CD14 CD19
D1 72.07 2.40 6.85 1.66 15.99
D2 43.88 8.15 6.20 1.93 38.23
D3 70.23 5.86 1.98 2.71 21.97
4.2..2. Análisis por Western-blot de la expresión de HSP70s en células K562
tratadas con las citocinas recombinantes IFN-γ e IL-10
Los mecanismos de inducción o evasión de la respuesta inmune específica
frente a las células tumorales se han asociado entre otros mecanismos con la
realización o no de un apropiado procesamiento y presentación de los antígenos
tumorales. Estos procesos están regulados por las citocinas antagónicas IFN-γ e IL-
10, donde la primera regula positivamente el procesamiento antigénico (Gaczynska et
al, 1993), y la segunda se ha asociado con mecanismos de evasión de la inmunidad
antitumoral por disminución de la expresión de las moléculas del CMH-I (Yue et al,
1997). Por lo tanto, en este trabajo se quiso determinar si las proteínas de choque
térmico podían ser reguladas de alguna forma cuando las células se exponen a alguna
de estas citocinas.
De esta forma, se tomaron células K562 y se incubaron con las citocinas
recombinantes IFN-γ e IL-10 durante un periodo de 18 horas. De igual forma, las
células también se incubaron con el péptido inhibidor del proteasoma MG132 (0.5µM
o 1µM).
50
FIG.4.8. EXPRESION DE LAS PROTEINAS HSP70 Y HSC70 BAJO INDUCCION CON SOBRENADANTES DE PBMC ESTIMULADOS CON LA LEVADURA O EL GXM DE
C. neoformans
37° 41.8 24H 24H 48H
PBMC 1 PBMC 2
37° 41.8 24H 24H 48H PBMC1 PBMC 2
37° 41.8 24H 48H 24H 48H PBMC 1 PBMC 2
HSC70 HSP70
LE
VA
DU
RA
37° 41.8 24H 48H 24H 48H PBMC 1 PBMC 2
GXM
Las células K562 se trataron con sobrenadantes de células mononucleares de 3 donantes diferentes (PBMC 1, PBMC 2 y PBMC 3) que se enfrentaron por 24 o 48 horas a la levadura completa (arriba) o al polisacarido GXM (abajo) del C. neoformans. Las K562 se estimularon durante 24 horas y en seguida se lisaron y analizaron por WB para evaluar la expresión de las proteínas HSC70 (izquierda) y HSP70 (derecha)
70 KDa
70 KDa
51
FIG. 4.9. ANALISIS DENSITOMETRICO DE LA EXPRESION DE HSP70s CON SOBRENADANTES DE PBMCs ESTIMULADAS CON LA LEVADURA O
GXM DE C. neoformans
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
37°C 41.8°C Cn24H Cn48H0
500
1000
1500
2000
2500
3000
37°C 41.8°C Cn24H Cn48H
0
5001000
1500
2000
25003000
3500
GXM24H
GXM48H 0
500
1000
1500
2000
2500
37°C 41.8°C GXM24H GXM48H
HSC70 HSP70
Levadura
GXM
Los histogramas muestran la expresión de las proteínas HSC70 y HSP70 según las densidades ópticas determinadas en las células K562 expuestas a los sobrenadantes de las PBMC estimuladas con la levadura o el GXM de C. neoformans. Las barras muestrasn las medias de densidad òptica +/- SD.
DENSIDADES OPTICAS
DENSIDADES OPTICAS
FIG.4.10 . EXPRESION DE LA HSP70 EN LAS CELULAS K562
EXPUESTAS A SOBRENADANTE DE 24 Y 48 HORAS DE LINFOCITOS T 52SIN ESTIMULAR
37°C CONTROLES PBMC+Cn 24H 48H 24H 48H 24H 24H 24H 48H
70 KDa
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
LT24
HLT
48H
LT+C
n24H
LT+Cn4
8H
DENSIDADES OPTICAS
Expresión de HSP70 en células K562 tratadas con sobrenadantes de cèlulas mononucleares de 24 y 48 horas sin activar (controles) o activados con C. neoformans (PBMC). Arriba aparece la imagen obtenida por ECL de un ùnico experimento y abajo el análisis según las densidades ópticas obtenidas por densitometria
53
Los análisis por Western-blot de los lisados celulares de tres experimentos
independientes, presentan una expresión constante de la proteína HSC70 bajo los
diferentes tratamientos, mientras que la proteína HSP70 se ve incrementada por cada
uno de ellos frente a la expresión de las células control a 37°C. Este incremento es
mayor para las células tratadas con calor o el inhibidor MG132, y menor aunque
destacable para los tratamientos con IFN-γ o IL-10 (Figura 4.11).
4.2.3. Análisis de la expresión de la proteínas HSC70 y HSP70 sobre la superficie
de células K562 tratadas con IFN-γ y con IL-10
Con el objetivo de evaluar el efecto del IFN-γ y la IL-10 sobre la localización
en la superficie celular de las proteínas HSC70 y HSP70, las K562 estimuladas con
estas citocinas se analizaron por FACS. En trabajos anteriores se han reportado
tratamientos con 200 U/ml o 1000 U/ml por 48 horas o 96 horas para lograr una
expresión significativa de moléculas del CMH-I en células K562. Por lo tanto, las
células K562 se trataron con concentraciones intermedias como son 375 U/ml ó 750
U/ml de IFN- γ. Inicialmente, las células se analizaron luego de 1, 2, 3, 6, 10 y 18
horas de tratamiento con la citocina. Solamente se observo una disminución en la
expresión de la HSC70 sobre la superficie celular a las 18 horas de exposición,
mientras que la HSP70 no se modifico en ninguno de los tiempos (Figura 4.12). En
cinco experimentos independientes se encontró que esta disminución en la expresión
en la superficie celular de la HSC70 es significativa (p= 0.010) (Tabla 7; Figura
4.13). En cuanto al porcentaje de células positivas también se observó en todos los
tratamientos una disminución que paso de 85.08+/-1.91 en las células a 37°C a
74.74+/-5.16 en las células tratadas con IFN-γ, aunque esta diferencia no fue
significativa por la prueba T apareada (p=0.089).
Teniendo en cuenta, que se ha descrito que el IFN-γ favorece la generación de
péptidos antigénicos compatibles con la asociación a las moléculas CMH-I, es posible
que haya una relación entre la movilización de las HSPs hacia la membrana celular y
54
FIG.4.11. EXPRESION DE LAS PROTEINAS HSP70 Y HSC70 BAJO INDUCCION CON IFN-γ, IL-10 Y MG132 EN LA LINEA CELULAR K562
37°C 41.8°C IFN-γ 1L-10 MG132 37°C 41.8°C IFN-γ 1L-10
0
300
600
900
1200
1500
37°C 41.8°C IFN-g IL-10 MG-132
1500
1550
1600
1650
1700
1750
1800
1850
1900
37°C 41.8°C IFN-g IL-10 MG-132
HSP70 HSC70
Expresión de HSC70 y HSP70 en células K562 tratadas con IFN-γ, IL-10 y MG132. Arriba aparece la imagen obtenida por ECL y abajo el análisis según las densidades ópticas obtenidas por densitometria de uno de tres experimentos independientes realizados.
DENSIDADES OPTICAS
70 KDa
55
IFN 10H
IFN 3H
IFN 1H
HSC7 HSP70
FIG. 4.12. EFECTO DEL TIEMPO DE EXPOSICION A IFN-γ SOBRE LA EXPRESION EN LA SUPERFICIE CELULAR DE LAS PROTEÍNAS HSC70 Y
HSP70
Las células K562 se colocaron en presencia de 750 U/ml de IFN-γ durante tiempos de exposición de18, 10, 6, 3, 2, y 1 hora. En seguida se determino la expresión de las proteínas HSC70 y HSP70. En los histogramas se compara la expresión de las proteínas en los tratamientos con IFN-γ (Rojo) con la expresión en células sin tratamiento (verde).
37 IFN-γ
37 IFN-γ
37 IFN-γ
37 IFN-γ
37 IFN-γ
37 IFN-γ
37 IFN-γ
IFN 18H
37 IFN-γ
56TABLA 7. EXPRESION SOBRE LA SUPERFICIE CELULAR DE LA HSC70
K562 + IFN-γ
MED
IA (X
)
% C
ELU
LAS
+
MED
IA (X
)
% C
ELU
LAS
+
13,4 84,67 8,46 56,45 -5 36,96 28,214,5 82,51 9,91 73,08 -4,6 31,61 9,4313,3 92,21 11,89 87,86 -1,4 10,80 4,3511,8 81,13 10,1 78,78 -1,7 14,19 2,3516,6 84,86 12,67 77,39 -4 23,86 7,47
%R
EDU
C. X
IFN
- γ
% C
EL 3
7C -
CEL
IF37°C IFN-γ
X 3
7°C
- X
IFN
- γ
EN CELULAS A 37°C O TRATADAS CON IFN-g (750 U/ml)
Se compara la respuesta al IFN-γ en la expresión de la proteína HSC70 en células K562 en 5 experimentos independientes. Se determinó por FACS tanto la media de intensidad de fluorescencia como el porcentaje de células positivas.
FIG. 4.13. COMPARACION DE LA EXPRESION DE HSC70 EN CELULAS TRATADAS CON IFN-γ vs CÉLULAS A 37°C
0
5
1
1
2
37° IFN-
INTEN
SIDA
D M
EDIA
DE
FLUO
RESC
ENC
IA
37°C
IFN-γ p=0,010
HHSSCC7700
nn==55
Se comparan las intensidades medias de fluorescencia (IMF) +/- SEM de la expresión en la superficie celular de la proteína HSC70 en las células expuestas a IFN-γ respecto a las células control a 37°C.
57
la expresión de las moléculas CMH en células expuestas a la acción del IFN-γ. Para
tratar de evaluar esta posible relación, en estos momentos se están realizando
experimentos encaminados hacia este objetivo. Por lo tanto, en experimentos
preliminares, se quiso determinar el efecto del IFN-γ sobre la expresión de tanto de
las proteínas HSC70 y HSP70, como de las moléculas del CMH-I. Con este propósito
las células se trataron por periodos de 18 ó 60 horas en presencia de 750 U/ml de
IFN-γ. Se encontró que las células K562 tratadas por 18 horas presentan un
incremento en la expresión de las moléculas CMH-I, que es más ostensible a las 60
horas de tratamiento. En cuantos a las HSPs, se observo que a diferencia del
tratamiento por 18 horas, las células a las 60 horas presentan un incremento en la
expresión de la HSP70, mientras que la HSC70 permanece igual respecto al control a
37°C (Figura 4.14). Este posible, que la disminución en la expresión de la HSC70 a
las 18 horas y el incremento en la expresión de la HSP70 a las 60 horas, se pueda
asociar en un futuro con la actividad del IFN-γ sobre el proteasoma y la expresión de
las moléculas CMH-I.
Finalmente, se evaluó el efecto de la IL-10 sobre la expresión de las
HSPs en la superficie celular. Las células se trataron con 15 ng/ml de la citocina
recombinante durante 18 horas, y la expresión de las proteínas se determino por
citometría de flujo. En estos análisis no se observo ningún efecto sobre la expresión
en la superficie celular de la HSC70 o la HSP70 (Figura 4.15).
4.2.3. Análisis de la expresión de la proteína HSP70 en citoplasma y núcleo de
células tratadas con calor e IFN-γ
Según los resultados anteriores se tiene que la expresión celular de la proteína
HSP70 es incrementada bajo los diferentes tratamientos usados. Y a diferencia de la
expresión de la proteína HSC70, el tratamiento con calor o con IFN-γ durante 18
horas no modifica la expresión en la superficie celular de la proteína inducible. Con el
fin de determinar si el incremento en la expresión de la HSP70 era ocasionada por
58FIG. 4.14. EFECTO DEL IFN-γ SOBRE LA EXPRESION EN LA SUPERFICIE
CELULAR DE LAS PROTEÍNAS CMH-I, HSC70 Y HSP70
CLASE HSP70
37 IFN-γ
37 IFN-γ
37 IFN-γ 18H
CLASE
37 IFN-γ
HSP70
37 IFN-γ
37C VERDE IFN
37 IFN-γ
60 H
Las células K562 se trataron por 18 horas o por 60 horas con IFN-γ y en seguida se marcaron simultaneamente con un anti-HLA conjugado a PE y con los anticuerpos anti-HSC70 y anti-HSP70 acoplados al sistema de FITC. Se determimino la expresiòn de las proteìnas segùn la intensidad media de fluorescencia presentada por cada poblaciòn.
59FIG. 4.15. EFECTO DE LA IL-10 SOBRE LA EXPRESION EN LA SUPERFICIE
CELULAR DE LAS PROTEINAS HSC70 Y HSP70
R
HSP70
37 IL-10 37
IL-10
Las células K562 se expuisieron a 15 ng/ml de IL-10 durante 18 horas y se marcaron para determinar la expresión en la superficie celular de las proteínas HSC70 y HSP70. En la figura aparece el resultado de uno de dos experimentos independientes realizados bajo las mismas conciciones.
60
una movilización de la proteínas hacia un componente intracelular en particular de la
célula, se realizó una aproximación inicial por análisis de inmunomicroscopía
electrónica (IME). Por lo tanto, se determinó sí la proteína HSP70 se localizaba con
preferencia a nivel del citoplasma o del núcleo.
Las células K562 se trataron con calor durante 3h20´ y con 3h de recuperación
a 37°C (Experimentos de 18 h) o con IFN-γ durante 18h. Se encontró un incremento
en la expresión de la proteína HSP70 cuando las células se trataban con calor (172+/-
12), o con IFN-γ (195+/−17), respecto al control a 37°C (97+/-5), y en concordancia
con lo que se había mostrado en los WB de los lisados celulares totales. En cuanto a
la localización dentro de la célula, se encontró que no hay diferencias en los
tratamientos respecto a si la proteína se localiza al interior o fuera del núcleo (Figura
4.16 y Tabla 8).
Tabla 8. Cuantificación de perlas de oro coloidal en células K562 tratadas con calor o
IFN-γ
LOCALIZACION CELULAR 37°C 41.8° IFN-γ Número Eventos Totales (n=3) 97+/-5 172+/-12 195+/-17 % Fuera del núcleo 33,7 34,8 33,5 % Dentro del núcleo 66,3 65,1 66,5
61
FIG.4.16. ANALISIS POR INMUNOMICROSCOPIA ELECTRONICA DE LA EXPRESION DE HSP70 EN CELULAS K562
A. 37°C
B. 41.8°C
62
C. IFN-γ
Las células K562 tratadas con calor o IFN-g se procesaron para inmunomicroscopia electrónica y se marcaron con un anticuerpo policlonal anti-HSP70 y en seguida se incubaron con una proteína A conjugada con perlas de oro coloidal de 20 nm. Aparecen imágenes de células a 37°C (A), 41.8°C (B) e IFN-γ (C).
63
5. DISCUSION
5.1. REGULACION DE LA EXPRESIÓN DE HSC70 Y HP70 POR CALOR
Las HSPs clásicamente han sido descritas como proteínas que responden a
estímulos térmicos (Schlesinger et al, 1990). Por lo tanto, en primer lugar se evaluó
el efecto del choque térmico sobre la expresión tanto de la proteína HSC70 como de
la proteína HSP70 en las células K562. Analizando por WB los lisados celulares de
12 experimentos diferentes se encontró que las K562 expresan la proteína HSP70 aún
en ausencia de estimulo térmico y que el choque térmico favorece un incremento
significativo en la expresión de la proteína HSP70 (p=0.0009), pero no de la HSC70
(p=0.171). Esto es concordante con trabajos anteriores donde se reporta que las K562
presentan una mayor resistencia al choque térmico (termotolerancia) que otras líneas
celulares derivadas de leucemia, debido a que estas células presentan un incremento
en la síntesis de HSP70 por un periodo de tiempo más prolongado bajo la inducción
con choque térmico, además que estas células presentan una notable síntesis basal de
estas proteínas en ausencia del estimulo térmico (Mivechi, 1989). Además en el
presente trabajo se hace una extensión de estos resultados evaluando la expresión de
la proteína HSC70 en las células expuestas a choque térmico.
Por otro lado, se evaluó por citometría de flujo como era la expresión de estas
proteínas sobre la membrana celular. Las proteínas HSC70 y HSP70 son de
localización principal a nivel del citoplasma, y su ubicación al nivel de la membrana
celular se ha descrito para algunos tipos de células tumorales. El efecto del choque
térmico sobre la expresión en la membrana celular de las HSPs fue variable
dependiendo de las condiciones de cultivo. En los experimentos cortos (Experimentos
de 6H20) se encontró una disminución en la expresión en la membrana celular de la
HSC70, mientras que en los experimentos de 18 horas se incremento la expresión de
la proteína. Luego, esto parece ser un indicativo del efecto de la actividad metabólica
de la célula sobre la localización de la HSC70 en la membrana celular. Estos
resultados sobre movilización de la proteína HSC70 en la membrana celular bajo el
64
estimulo térmico no han sido descritos en trabajos previos, y por el momento no hay
una explicación biológica clara del porque de estos resultados. Es posible, que las
modificaciones en la expresión en la superficie celular sea un indicativo de la
movilidad de la proteína entre el interior y el exterior de la célula; y sencillamente
para estas células transformadas podrían existir umbrales de localización en la
membrana celular alto y bajo y por lo tanto la respuesta al choque térmico dependerá
de que tanta proteína esta expresando sobre la superficie celular. Esto podría ser un
indicativo del nivel de estrés de la célula y/o de eventos de liberación de la proteína.
En algunos trabajos donde se ha evaluado el efecto del choque térmico sobre
la expresión de la HSP70 en la membrana celular se han reportado resultados
diferentes a los hallados en este trabajo. Se ha mostrado que líneas celulares de origen
neoplásico (células de sarcoma de Ewing y células de osteosarcoma HOS58 y MG63)
o células tumorales recién aisladas (adenocarcinoma ovárico) incrementan la
expresión de la proteína inducible HSP70 cuando son expuestas a choque térmico
durante 3h 20´ con tiempos de recuperación desde 1 a 96 horas o durante 30 a 60
minutos con 2 horas de recuperación, respectivamente. Mientras que la línea celular
de carcinoma mamario (MG63) y la línea celular de carcinoma de colon (CX2) no
sufren ninguna modificación en la expresión en la superficie celular (3 horas 20
minutos a 41.8°C y 12 horas a 37°C o 30-60 minutos a 41.8°C y 2 horas a 37°C,
respectivamente) (Multhoff et al, 1995; Multhoff et al, 1997; Wei et al, 1996). Estas
diferencias en los diferentes trabajos se pueden deber a aspectos relacionados con el
tratamiento de choque térmico, el origen celular o inclusive a diferencias en las
condiciones de cultivo (por ejemplo, las presentadas durante los experimentos de
6h20´ y 18h). Cuando se sometieron las células K562 a choque térmico por periodos
de 1h, 2h y 3h con 20 minutos y se dejaron recuperar por 3 horas a 37°C, únicamente
las células del tratamiento durante 3h y 20´ presentaron una disminución en la
expresión en membrana de la HSC70. Por otro lado, cuando se tomaron células Jurkat
y se expusieron al choque térmico bajo las mismas condiciones que las K562, se
encontró que las células no expresaron sobre la membrana celular ninguna de las
65
HSPs ni a 37°C ni a 41.8°C. Y finalmente, cuando las células se colocaban en cultivo
por un periodo de 48 horas y en ausencia total de choque térmico, presentaban una
disminución en la expresión en la superficie celular de la proteína HSC70 respecto a
las células de la hora 0; hecho acompañado con una disminución en la viabilidad
celular. Esta disminución observada en la expresión de la proteína HSC70 puede estar
reflejando su liberación al entorno celular.
5.2. REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE HSC70 Y HSP70 POR
CITOCINAS
Se ha postulado que el desarrollo de algunos procesos infecciosos puede
favorecer mecanismos de regresión tumoral (Brouckaert et al, 1992; Rook, 1992;
Starnes, 1992), a través de mecanismos relacionados con la producción de factores
solubles como las citocinas factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) e interferon
gamma (IFN-γ) (Havas et al, 1990; Havas et al, 1993). Es posible que a través de
estos mediadores solubles producidos durante un proceso infeccioso se pueda inducir
la regulación de la generación de HSPs como señales de peligro por las células
tumorales, y en consecuencia el desarrollo de mecanismos inmunes antitumorales.
Para tratar de dilucidar la existencia de una relación entre la producción de factores
solubles y la regulación de las HSPs, se tomo como modelo el efecto de
sobrenadantes producidos durante la interacción entre células mononucleares y el
hongo levaduriforme C. neoformans sobre la expresión de las proteínas HSC70 y
HSP70.
Las células K562 se expusieron durante 24 horas a los sobrenadantes de
diferentes poblaciones de células mononucleares enfrentadas por 24 o 48 horas a la
levadura o al polisacárido capsular GXM de C. neoformans. Los análisis de los
lisados celulares muestran una inducción en la expresión de la HSP70, pero no de la
HSC70 en las K562 expuestas a los sobrenadantes. Se propone que esta regulación de
la expresión de la HSP70 es el efecto de ciertos factores que se produjeron por la
interacción entre la célula mononuclear y levadura completa o el polisacárido
66
purificado. El hecho que la exposición de las células K562 a sobrenadantes derivadas
de cultivo de 24 o 48 horas de células mononucleares solas no produzca el mismo
efecto, descarta la posibilidad de la acción de factores celulares producto del
metabolismo normal de las células mononucleares.
En diversos trabajos se ha descrito la producción de varias citocinas como IL-
1β, TNF-α, IL-12, INF-γ e IL-10 producto de la interacción con la levadura C.
neoformans o con el polisacárido capsular GXM (Levitz, 1996; Murphy, 1998;
Pietrella et al, 2001; Pitzurra et al, 1999; Retini et al, 1999; Shoham et al, 2001). En
este trabajo, se quiso evaluar el efecto directo de las citocinas recombinantes IFN-γ e
IL-10 sobre la expresión y localización de la HSC70 y la HSP70. Se seleccionaron
estas citocinas, básicamente por su papel en el procesamiento y presentación
antigénica. Se ha observado que el IFN-γ favorece la expresión de las moléculas
CMH-I sobre la superficie celular producto de su efecto sobre la actividad del
proteasoma y la generación de péptidos compatibles con la asociación a las moléculas
CMH-I (Gaczynska et al, 1993), mientras que la IL-10 regula negativamente la
expresión de estas moléculas (Yue et al, 1997). Y dado, que se presume que proteínas
como la HSP70 pueden interactuar con los péptidos derivados de la actividad del
proteasoma (Ishii et al, 1999), es posible que algunas de estas citocinas pueda
modular su actividad.
Analizando los resultados por WB sobre los lisados celulares se observo un
incremento en la expresión de la HSP70 pero no de la HSC70 cuando las células se
trataron con IFN-γ, IL-10 y el inhibidor del proteasoma MG132. La inducción en la
expresión de HSP70 por la acción del IFN-γ ya había sido descrita por Stephanou et
al (1999), quienes demostraron que al tratar linfocitos humanos con IFN-γ se
producía un incremento en la producción de la proteína HSP70 a través de una
señalización intracelular mediada por STAT-1. En cuanto al MG132, es un péptido
aldehído que se une reversiblemente a los sitios activos del proteasoma e inhibe el
clivaje de sustratos hidrofóbicos o ácidos. Se ha descrito que el tratamiento con 1 µM
67
del inhibidor reduce la degradación de proteínas de corta vida en un 60-70% (Bush et
al, 1997) y es capaz de inducir la expresión de la HSP70 producto de la acumulación
de proteínas que deberían ser degradadas (Bush et al, 1997; Lee & Goldberg, 1998;
Meriin et al, 1998). El efecto ocasionado por el inhibidor MG132 podría ser bien
similar al observado durante el choque térmico, teniendo en cuenta que el estrés por
calor genera una inactivación latente del proteasoma, daña la posterior activación de
proteasoma 26S por ATP, disminuye los niveles de RNAm del proteasoma e inhibe
el ensamblaje del complejo proteico (Kuckelkorn et al, 2000). Esto ayudaría a
explicar la disminución observada de las moléculas del CMH-I cuando las células
Jurkat fueron estresadas por calor. Este mismo efecto del calor sobre la expresión de
las moléculas CMH-I fue descrito por Multhoff et al (1995) para las líneas celulares
ES, HOS58, MG63 y MX-1.
Por otro lado, se quiso determinar cual era el efecto de las citocinas sobre la
localización de las proteínas en la superficie de las K562. Para ello inicialmente se
hizo una cinética de acción de la citocina en el tiempo durante periodos de exposición
de 1, 2, 3, 10 y 18 horas de exposición. Únicamente se observo algún efecto sobre la
expresión de las proteínas cuando las células fueron expuestas durante 18 horas a la
citocina, y en 5 experimentos independientes se encontró una disminución
significativa (p=0.0125) en la expresión de la HSC70 pero no hubo ninguna
modificación en la expresión sobre la superficie celular de la HSP70. No hay
antecedentes previos donde se muestre que el IFN-γ ejerce algún tipo de regulación
de la localización sobre la superficie celular de alguna de estas proteínas. Pero, en
trabajos previos con células K562 se ha reportado que el uso de 200 U/ml ó 1000
U/ml durante un tiempo de exposición de 48 ó 96 horas induce la expresión de
moléculas CMH-I (Maziarz et al, 1990; Nishimura et al, 1994). Por lo tanto, se
evaluó la expresión concomitante de las proteínas HSPs y de las moléculas CMH-I
sobre células K562 tratadas con IFN-γ por 18 horas y 60 horas. Se observo que
cuando las células se trataron durante 60 horas en comparación con las de 18 horas,
68
se genero un incremento más notable en la expresión de moléculas CMH-I, la
expresión de la HSC70 no se vio afectada, mientras que la expresión de la HSP70 se
incremento. Es posible que los péptidos generados por la actividad del proteasoma
regulada por el IFN-γ, así como favorecen la expresión en la membrana celular de las
moléculas del CMH-I (Gaczynska et al, 1993), estén asociados a los movimientos
observados sobre la membrana celular de las proteínas HSC70 y HSP70. Aunque, se
ha reportado que al sobreexpresar la proteína HSP70 en una línea celular derivada de
melanoma humano no se produce un incremento en la expresión de moléculas CMH-I
(Dressel et al, 1999).
Por otro lado, en los análisis por IME se quiso determinar la localización
intracelular de la proteína HSP70 y se observo un incremento en la expresión de la
HSP70 de una forma homogénea tanto en el citoplasma como en el núcleo. Este
incremento tanto a nivel del núcleo como de citoplasma parece responder tanto al
choque térmico como al periodo de recuperación. Welch & Feramisco (1984)
haciendo un seguimiento de 30 minutos a 2 horas de exposición a 41.8°C y sin
tiempo de recuperación a 37°C encontraron que hay un incremento en la síntesis de la
HSP70 y que aproximadamente un 30% de la proteína recién sintetizada migra al
núcleo, mientras que Welch & Suhan (1986) muestran que células estresadas a
42.5°C durantes 3H presentan una acumulación de la proteína dentro del citoplasma
con una buena porción de la proteínas presentando una colocalización con los
ribosomas citoplasmáticos durante un periodo de recuperación de 4H a 37°C .
Tomando juntos todos estos resultados en este trabajo se encontró que la
regulación de la expresión y localización de las proteínas HSP70 y HSC70 parece
darse por mecanismos diferentes. Por un lado, la expresión de la proteína HSP70 es
incrementada por estímulos como el calor, la presencia de citocinas como el IFN-γ y
la IL-10 y el inhibidor del proteasoma MG132. Mientras que en la exposición al calor
y al MG132, la inducción de la síntesis de la HSP70 se puede dar por acumulación de
proteínas anómalas no degradadas; la regulación positiva por el IFN-γ puede ser el
69
producto de la acumulación de péptidos procesados por el proteasoma. Este último
hecho podría relacionarse con el incremento en la expresión de CMH-I observada a
las 18 horas de estimulación, y que a las 60 horas es más evidente y es acompañado
por un incremento de la localización de la HSP70 sobre la membrana celular.
El efecto en la localización de la HSC70 sobre la superficie celular podría
responder a interacciones directas con péptidos. Se ha reportado que la HSC70
expresada sobre la superficie celular se puede encontrar asociada con péptidos
antigénicos tumorales (Takashima et al, 1996; Tamura et al, 1993), por lo tanto la
generación de péptidos derivados por el proteasoma por acción del IFN-γ estaría
favoreciendo la expresión de péptidos antigénicos compatibles con la expresión en
superficie de las moléculas del CMH-I pero no de las proteínas HSC70. Las proteínas
HSC70 se han reportado que se unen con preferencia a péptidos que contienen un
tramo de siete residuos ricos en residuos hidrofóbicos grandes y aromáticos. Los
aminoácidos básicos usualmente son bien tolerados particularmente para proteínas
como la HSC70 (Fourie et al, 1994). De esta forma la acción del IFN-γ sobre las
K562 se vería reflejada como un incremento en la expresión de CMH-I y una
disminución en la expresión de HSC70 sobre la superficie celular.
Por otro lado, la disminución de la HSC70 sobre la superficie celular podría
deberse a una internalización hacia el citoplasma o a una liberación al medio
extracelular. Se ha reportado que el IFN-γ sobre las células K562 genera
modificaciones en la fluidez de la membrana celular, que pueden asociarse con
mecanismos de recirculación de los receptores de transferrina entre el citoplasma y la
membrana celular y viceversa, o liberación de estas moléculas en exosomas al
entorno celular (Iwagaki et al, 1994; Iwagaki et al, 1996). Se ha descrito que las
proteínas HSC70 participan en estos procesos asociados con lo receptores de
transferrina así como con la liberación de exosomas en otros sistemas como las
células dendriticas (Géminard et al, 2001; Thatte et al, 1996) o la liberación de
neurotransmisores (Zinsmaier & Bronk, 2001). Por lo tanto, un mecanismo pudo
70
haber coevolucionado entre la liberación de componentes celulares a través de
exosomas y la generación de señales de peligro por células anómalas como las
tumorales con la posterior entrega de péptidos antigénicos de origen tumoral (función
chaperona) y la señalización de procesos de maduración hacia las células
presentadoras de antígeno (función citocina).
A pesar de todo, la relevancia biológica de la regulación de la expresión y
localización celular las proteínas HSC70 y HSP70 en cuanto a los mecanismos
asociados con la inducción de la inmunidad antitumoral, aún quedan por establecerse;
sin embargo, el modelo desarrollado en este trabajo genera una buena cantidad de
perspectivas.
71
6. CONCLUSIONES
- Las células K562 expuestas a estímulos como el calor, la presencia de
sobrenadantes de células mononucleares, citocinas como IFN-γ, y la IL-10,
así como factores que interfieren con la degradación normal de la proteínas
(MG132) producen un incremento en la expresión de la proteína inducible
HSP70, pero no afectan la de la proteína constitutiva HSC70.
- La expresión sobre la superficie celular de la proteína HSC70 disminuye por
la exposición de las células al calor, al IFN-γ, o como producto del
metabolismo normal de la célula. Pero, la expresión en la superficie celular
de la HSP70 no se ve afectada, a menos que las células se expongan por un
buen periodo de tiempo al IFN-γ. Lo que ocasiona un incremento en la
expresión de la HSP70 acompañado por el incremento en la expresión de las
moléculas CMH-I.
- Según los análisis por IME, se puede sugerir que el incremento en la
expresión celular de la HSP70 observado por WB, se puede explicar como
una localización de la proteína tanto a nivel del núcleo como del citoplasma.
72
7. PERSPECTIVAS
- Teniendo en cuenta los diferentes comportamientos que tuvieron tanto la
HSC70 como la HSP70 en cuanto a la expresión y localización en la
membrana celular bajo diferentes estímulos, es importante determinar las
diferentes vías que están regulando cada una de estas proteínas en el modelo
estudiado en este trabajo.
- Es importante estudiar si el incremento en la expresión de la HSP70
observado en el tratamiento con IFN-γ, esta directamente asociado con la
inducción de la expresión de las moléculas del CMH-I.
- Es fundamental hacia el futuro determinar si el estrés térmico o la regulación
por citocinas como el IFN-γ, favorecen una liberación de la proteína HSC70,
y el mecanismo por el cual son liberadas (por ejemplo, liberación por
exosomas). De esta forma , se podría determinar cual es el efecto de estás
proteínas liberadas por células tumorales en la regulación de la respuesta
inmune antitumoral específica.
- Finalmente, queda por evaluar si las proteínas HSPs localizadas sobre la
superficie celular se encuentran acopladas a péptidos, y de ser así, determinar
el origen y potencial antigénico de estos péptidos .
73
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