AUTOMATIZACION EN EL AREA DE BACTERIOLOGIA

En la medicina actual y con el desarrollo importante de resistencia en cocáceas Gram positivas (Staphylococcus, Streptococcus y Enterococcus) y bacilos Gram negativos(enterobacterias y no fermentadores) resulta difícil para el clínico predecir los patrones de resistencia en las infecciones que afectan a los pacientes críticos. La terapia empírica se inicia generalmente con antimicrobianos de amplio espectro, de alto costo y numerosos efectos adversos. Si el laboratorio de microbiología no entrega resultados oportunos, esta terapia inicial puede prolongarse por más tiempo del necesario.

Es así importante abreviar los tiempos de respuesta por parte del laboratorio, lo que no es posible con los métodos convencionales deestudio de susceptibilidad antimicrobiana. Los sistemas automatizados acortan estos tiempos porque mejoran la sensibilidad analítica de los métodos, es decir, son capaces de detectar el desarrollo bacteriano en una suspensión, con y sin antimicrobianos, antes que el laboratorista pueda detectar turbidez.

Este es el fundamento de los sistemas automatizados de estudio de susceptibilidad, por diferentes métodos (colorimetría, turbidimetría, fluorometría, etc) detectan el desarrollo bacteriano en micropaneles que contienen diluciones seriadas del antimicrobiano, estableciendo la mínima concentración del antimicrobiano que es capaz de inhibir el desarrollo bacteriano

VENTAJAS DE LOS SISTEMAS AUTOMATIZADOS DE ESTUDIOS DE SUCEPTIBILIDAD BACTERIANA

DESVENTAJAS DE LOS SISTEMAS AUTOMATIZADOS DE ESTUDIO DE SUSCEPTIBILIDAD BACTERIANA

SISTEMAS AUTOMATIZADOS PARA IDENTIFICACION Y ESTUDIO DE SUSCEPTIBILIDAD BACTERIANA

Sistema Semiautomatizados y Automatizados en el Perú

• MicroScan Walkaway (Dade)

• Sistema Vitek (BioMerieux)

• Sistema Phoenix (Becton Dickinson)

MicroScan

Equipos

Los sistemas para microbiología MicroScan proveen una nueva generación de pruebas automatizadas para la identificación bacteriana y las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos junto con la introducción de su nuevo sistema de manejo de datos LabPro y el nuevo sistema Alertex, la automatización es más inteligente para el manejo de la administración de la base de datos de sus clientes, control de infecciones y datos epidemiológicos.

LabPro software proporciona un manejo gerencial de la información, exclusivo para los sistemas MICROSCAN proporcionando soluciones simples para aerodinamizar el flujo de trabajo; es la parte medular de nuestros sistemas WalkAway 96SI, WalkAway 40SI, AutoScan-4 y Manual LabPro, puede completar sobre el 90% de su flujo de trabajo diario con sólo 5 clicks del mouse.

El windows NT del sistema operativo es fácil de usar y fácil de aprender con un mínimo de entrenamiento.

Los sistemas WalkAway con su avanzada tecnología nos ofrecen un principio de seguridad en las pruebas de MIC al obtener verdaderos resultados de concentración mínima inhibitoria, automatiza más del 90% de su rutina y tiene la capacidad para procesar páneles rápidos y convencionales al mismo tiempo. Disponible en 2 modelos WalkAway 40 y WalkAway 96.

El Nuevo sistema WalkAway 96 Plus con la misma fortaleza que sus antecesores, ahora con un sistema de detección de nivel de reactivos, conexión opcional de agua, mayor capacidad de reactivos, conectividad remota para diagnóstico del instrumento.

AutoScan-4 sistema de lectura automatizada de páneles convencionales en sólo 5 segundos simplificando las pruebas de identificación y susceptibilidad a los antimicrobianos y la estandarización de resultados.

PÁNELES MICROSCAN

La versatilidad de páneles que MicroScan ofrece se adapta a sus necesidades; se tiene páneles convencionales para gramnegativos y grampositivos con lectura a partir de las 16 horas de incubación y páneles rápidos para gramnegativos y grampositivos con lectura de ID a 2 horas y susceptibilidad a partir de las 3.5 horas con diferentes configuraciones de antimicrobianos en diferentes formatos:

- Panel ID.

- Panel MIC o panel BP.

- Panel combo ID+AST-MIC.

- Panel combo ID+AST-BP.

- Páneles Convencionales con prueba de Confirmación de ESBL incluida.

PÁNELES CROMOGÉNICOS rápidos para identificación de levaduras, anaerobios y microorganismos difíciles (Neisseria, Haemophilus, Gardnerella, Moraxella) en sólo 4 horas.

VENTAJAS DE LA LÍNEA MICROSCAN:

– Dentro de las fortalezas de los páneles MICROSCAN está la versatilidad de lectura visual, evitando la repetición innecesaria de las pruebas.

– Vienen en empaques individuales.

– Los páneles convencionales se mantienen a temperatura ambiente.

– Los páneles rápidos y páneles cromogénicos se mantienen en refrigeración.

– Estandarización en la prueba al utilizar un panel tipo combo

– Mismo programa para la validación de la prueba si se trabaja de forma manual, con lectura automatizada o totalmente automatizado.

– Diferentes métodos de preparación del inóculo dependiendo del tipo de microorganismo.

– Programa de control de calidad en línea.

– Control de calidad integrado por panel.

– Reglas de la CLSI integradas al programa.

– MIC real.

– Diferentes formatos de panel.

– Calibración automática de los sistemas MICROSCAN.

– Mínimo mantenimiento diario.

– Actualizaciones del nuevo software LabPro sin costo.

– Personalización de reglas, análisis y reporte de acuerdo a las necesidades de cada laboratorio.

– Con capacidad de exportar datos a excel para obtener gráficos de los reportes epidemiológicos.

Microscan AutoScan – 4 Semiautomatizado

•Sistema de Lectura automatizada de paneles convencionales en solo 5 segundos simplificando las prueba ID/AST y la estandarización de resultados

c

MicroScan WalkAway 96 plus Completamente automatizado

MANUAL DE PROCEDIMIENTO

DISEÑO DE USO

Para utilizar con paneles CIM/Combo de MicroScan para gram negativos deshidratados y paneles combo de punto de corte para gram negativos deshidratados.

Los paneles MicroScan están diseñados para determinar la sensibilidad a agentes microbianos y/o a nivel de especie de bacilos gram negativos aerobios y anaerobios facultativos

RESUMEN Y BASES DE PROCEDIMIENTOS

Después de la inoculación e rehidratación con suspensión estandarizada del microorganismo e incubación a 35°C por un mínimo de 16 horas, la concentración inhibitoria mínima para el microorganismo de pruebas se determina observando la concentración más baja de antimicrobiano que muestra la inhibición de crecimiento.

Para la identificación de bacilos gram negativos fermentadores y no fermentadores se utiliza las pruebas convencionales y cromogenicas modificadas.

La identificación se basa en la detección de cambios de PH, utilización de sustratos y crecimiento en la presencia de agentes antimicrobianos al cabo de 16 a 42 horas de incubación a 35°C.

PRECAUCIONES

1- Exclusivamente para uso diagnóstico de in vitro2- En todos los procedimientos, debe utilizarse técnicas de asepsiay las

precauciones establecidas para evitar riesgos microbiológicos teniendo especial cuidado en el caso de los paneles inoculados que tienen microorganismos especialmente patógenos

3- Este material contiene agentes infecciosos y deben desecharse conforme a las normas para la eliminación de residuos en peligro biológico

4- Los resultados de esta prueba deberán interpretarse siempre de acuerdo a la historia clínica del paciente, la sintomatología clínica y otras observaciones.

CONSERVACIÓN

Los paneles gram negativo deshidratados deben almacenarse de 2 a 25°C

RECOGIDA Y PREPARACION DE MUESTRAS

Las muestras apropiadas deben recogerse, trasportarse y colocarse en medio de aislamientos primarios, siguiendo los procedimientos recomendados en el manual de microbiología bacteriana

PROCEDIMIENTOS

Materiales proporcionados

Consulte la etiqueta del producto para ver el contenido específico.

DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO

a) PREPARACIÓN DEL PANEL

1. Extraigo los paneles que se van a utilizar del lugar en el que se conservan en refrigeración. No los utilices si el envase está dañado

2. Abra la bolsa y extraiga el panel. Si se almacena en el frigorífico, extraiga el panel inmediatamente de la bolsa del papel aluminio.

3. Los paneles no deben utilizarse si se da una de las siguientes circunstancias:a) El secante no está presente o está dañadob) Los pocillos del panel están descoloridos

4. Deje que los paneles se equilibren a temperatura ambiente antes de hidratarlos. Los paneles se pueden apilar, colocando una tapa limpia en la parte superior. Una vez abiertos, los paneles deben utilizarse en le mismo día o desecharse

b) PREPARACIÓN DEL INOCULO

El usuario debe prestar especial atención a la preparación del inoculó, especialmente con los métodos manuales que son técnico-dependiente como el sistema Prompt o inóculos preparados sin la ayuda de algún instrumento fotométrico.

Nota no se admite las técnicas de fase logarítmica y estacionaria con los productos MicroScan.

1. Técnicas del estándar de turbidez: método de inoculación primariaLa técnica del estándar de turbidez se recomienda para la inoculación para la inoculación directa de todos los bacilos gram negativos aerobiosa) Con un aplicador,asa o bastoncilloestéril,tocar la superficie de 4-5

colonias grandes o 5-10 colonias pequeñas bien aisladas o morfológicamente similares, de un cultivo de 18-24 horas en placa de agar no inhibitorio

b) Emulsione en 3 ml de agua para el inoculo (agua desionizadaesterilizada en autoclave). La turbidez final debería ser equivalente a la del estándar de la turbidez de 0.5 de McFarland.

Puede conseguir una turbidez equivalente utilizando un Turbidimetro MicroScan con un intervalo de 0.08+- 0.02. tape bien

c) Agite la suspensión en el Vortex de 2 a 3 segundosd) Pipetee 0.1 ml (100ul) de la suspensión estandarizada en 25 ml de

agua con PLURONIC. Tape bien. Invierta de seis a ocho veces para mesclar

REHIDRATACIÓN E INOCULACIÓN DEL PANEL

La rehidratación e inoculación se utiliza usando el sistema RENOK con inoculadores –D. si se utiliza un sistema alternativo rehidrate con 115ul +-10 ul de agua de inoculo (PLURONIC).

Debe lograrse una concentración final en pocillo de 3-7x 105 CFU/ml

Para asegurar la viabilidad y pureza del microorganismo analizado debe de prepararse una placa de pureza extendiendo el inoculo en una placa de agar apropiada e incubando en las condiciones adecuadas.

Si la placa de pureza presenta 2 o más tipos de colonias vuelva a aislar las colonias y repita la prueba.

c) CUBIERTAS BIOQUÍMICAS PARA POCILLOS

1. usando un cuenta gotas, recubra los pocillosGLU,URE,H2S, LYS,ARG,ORN,DCB con 3 gotas de aceite mineral

2. el medio de los pocillos debe cubrirse completamente con aceite mineral pero el aceite no debe rebasar los pocillos en sí.

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d) INCUBACIÓN

1. para asegurar una distribución homogénea durante la incubación, apile los paneles en grupos de 3 a 5

2. coloque una tapa limpia en la parte superior de cada grupo de paneles para evitar la evaporación. Las tapas pueden volverse a utilizar. No descontamine las tapas con alcohol, lo pude hacer con agua y jabón. Aclare bien y déjelas secar al aire.

3. incube los paneles durante 16 horas a 35°C en un incubador sin CO2

e) LECTURA DE LOS PANELES

Pueden leerse manualmente utilizando el visualizador de microdilucion de MicroScan y los resultados se registran en la hoja del panel manual o en la instrumentación MicroScan.

1. Al cabo de 16 horas de incubación, extraiga los paneles del incubador.2. Limpie la parte inferior del panel con un paño sin pelusas para eliminar la

condensación o los desechos que pueda haber.3. Lea los paneles solo si el pocillo de crecimiento esta turbio o si no hay

crecimiento en el pocillo de crecimiento. El crecimiento en los pocillos antimicrobianos aparece en forma de turbidez a modo de neblina blanca en todo el pocillo, un botón blanco en el centro del mismo o un crecimiento granular fino en todo el pocillo.el crecimiento inapropiado se caracteriza por una ligera neblina en el pocillo o transparencia del caldo

4. Si los resultados se leen manualmente, regístrelos en la hoja apropiada.5. Lectura de las sensibilidades antimicrobianas

a. Lea todos los antimicrobianos el pocillo CET frente a un fondo negro(iluminado directamente)

b. Registre los resultados de sensibilidad/punto de corte de la siguiente forma: 1. Resultados de la CIM

a. Tras 16 a 20 horas de incubación , registre la CIM como la concentración antimicrobiana más baja que muestra inhibición de crecimiento

b. Cuando hay crecimiento en todas las concentraciones hay un antimicrobiano, la VIM se registra como superior a (>) la concentración máxima

c. Cuando no hay concentración en ninguna de las concentraciones de antimicrobianos, la CIM se registra como inferior o igual a la concentración más baja.

d. Un pocillo transparente en una serie de pocilloscon crecimiento(ej. Crecimiento de 1,2 y 8 ug/ml, pero no a 4 ug/ml) se denomina pocillo salteadoy no se debe de tener en cuenta.

2. Resultado de punto de cortea. Al cabo de 16 a 20 horas de incubación,si no hay crecimiento

en el antimicrobiano, se registra como “S” (sensible)b. Si hay crecimiento en la menor concentración de

antimicrobiano y no hay crecimiento en la mayor concentración, se registra como “I” (intermedio)

c. Si hay crecimiento en ambas concentraciones del antimicrobiano o en un solopocillo con dilución antimicrobiana, se registra como “R” (resistente)

d. Si hay crecimiento en la mayor concentración de un antimicrobiano, pero no hay crecimiento en la menor concentración, el pocillopodría estar contaminado y debe repetirse la prueba.

3. El crecimiento punteado en pocillos aislados indican contaminación y debe repetirse la prueba.

4. El “trailing effect” o crecimiento residual( arrastre) puede observarse en algunas combinaciones del fármaco/microorganismo como Proteus con cefuroxima (Crm) e imipenem (Imp), Kserratia con antibióticos beta-lactamicos y b.cepacia y b. pseudomallei con ceftazidima (Caz) y piperacilina (Pi)

6. Lectura de sustratos de identificación

a) Lea todos los sustratos de identificación usando un fondo blanco, excepto la CET y los antimicrobianos usados para la identificación ( Cl4, Cl8, P4, k2, Fd64, To4), los cuales deben leerse usando un fondo negro(( luz indirecta)

b) Fermentadores de glucosa: si alas 16 a 24 horas de incubación, se desarrolla un color amarillo muy fuerte en la GLU, el microorganismo es un fermentador de glucosa y deben leerse las 24 pruebas de fermentadores de glucosa.si el color de la reacción es de color naranja o rojo, el microorganismo es un no fermentador de la glucosa. En algunas especies no fermentadoras podrían producir un color dorado, que debe considerarse negativo. Algunas especies de pasteurella no crecen si el pocillo de glucosas está recubierto con aceite mineral, pero fermentaran la sacarosa y/o sorbitol. Siel pocillo de la GLU no muestra crecimiento y SUC o SOR son positivos, deben considerarse un fermentador de glucosa.

c) No fermentadores de glucosa: los no fermentadores de glucosa se pueden leer al cabo de 16 a 24 horas de incubación, si cualquiera de las siguientes combinaciones de prueba son positivas: (1) ARG y OF/G o ARG y CET. (2) LYS u (3) ORN. Si todas estas reacciones son negativas y hay crecimiento en el pocillo de crecimiento, registre las CIM, CET y los antimicrobianos usados para la identificación, y vuelva a incubar durante 24 horas adicionales antes de hacer la lectura e identificación final.

d) Si después de la reincubacion el microorganismo continua mostrándose no-reactivo, asegúrese de que el microorganismo ha crecido en carbohidratos rojo fenol (particularmente si hay poco o ningún crecimiento en el control de crecimientoMuler-Hinton). Si no hay crecimiento en el caldo de carbohidratos rojo fenol debería sospecharse

la presencia de un microorganismo exigente como especie de vidrio halofitico y de yersenia que crecen mejor a 25°C

CONCLUSIONES

Los estudios de susceptibilidad constituyen una herramienta de gran utilidad en la terapia exitosa de un paciente infectado. Los sistemas automatizados de identificación y estudio de susceptibilidad ofrece como principal ventaja la disminución del tiempo requerido en la obtención de los resultados; sin embargo, son de mayor costo que los sistemas manuales convencionales. Los sistemas automatizados presentan además otras ventajas que facilitan y mejoran la calidad técnica de los estudios de susceptibilidad; no obstante, se han descrito restricciones técnicas a su uso para determinados microorganismos antimicrobianos. Es necesario conocer las ventajas y problemas de estos sistemas y considerarlos al momento de decidir la adquisición de alguno de estos sistemas y que podrían justificar el alto costo de equipamiento y en los insumos, aunque también es recomendable una evaluación local del real impacto clínico que estos sistemas pueden presentar