Guia Practicas Bacteriologia- Una 2009

7/23/2019 Guia Practicas Bacteriologia- Una 2009

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Lab. Microbiología - Guía Práctica deBacteriología Oscar D. Orós B.

INTRODUCCION

El objetivo del Laboratorio de Microbiología es elaislamiento del agente etiológico de la enermedad !uea!ueja a nuestro "aciente. Luego a "artir de #ste se"rocederá a la identi$cación % determinar lasensibilidad del microorganismo aislado.

&on el objeto de lograr esto % "ara dar una orientacióntem"rana al clínico' se "uede "roceder a la tinción %observación directa de la muestra. Luego se sembrará

"ara obtener colonias aisladas del agente ineccioso. Esa "artir de estas colonias !ue se "rocederá a laidenti$cación mediante "ruebas bio!uímicas % a ladeterminación de la sensibilidad a los antibióticos. En elLaboratorio de Microbiología deben tenerse es"eciales"recauciones a $n de evitar la contaminación de lasmuestras clínicas % de los cultivos' así como la ineccióndel o"erador.

Durante el siglo (( la Microbiología )a e*"erimentadoun rá"ido desarrollo en dos direcciones distintas' unabásica % otra a"licada. En su as"ecto a"licado' los"rogresos de +oc) condujeron a un e*tenso desarrollode la microbiología médica % la inmunología en la"rimera "arte del siglo' con el descubrimiento demuc)as nuevas bacterias "atógenas % elestablecimiento de los "rinci"ios "or los !ue estos

"atógenos inectan el cuer"o % se )acen resistentes alas deensas del mismo

,acia los aos setenta nuestros conocimientos sobrelos "rocesos básicos de la $siología' la bio!uímica % lagen#tica bacteriana avanaron de tal modo !ue)icieron "osible mani"ular e*"erimentalmente elmaterial gen#tico de las c#lulas usando bacterias como

instrumentos. Esos conocimientos tambi#n "ermitieronintroducir material gen#tico /D012 de origen e*ógeno

3acultad De Medicina 4eterinaria % 5ootecnia 6 701 6P70O"ag.

1



Lab. Microbiología - Guía Práctica deBacteriología Oscar D. Orós B.en bacterias % controlar su re"licación % características.Esto llevó a la a"arición de la biotecnología.


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CONTENIDO

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Prac. Nro. 3.PL1?7EO < E097B1DO DE MED8O; DE &7L984O

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I


3




RECOMENDACIONES Y BIOSEGURIDAD

La BIOSEGURIDAD, se define como el conjunto de medidas !e"enti"as, destinadas

a mantene! el cont!ol de facto!es de !ies#o la$o!ales !ocedentes de a#entes$iol%#icos, f&sicos o 'u&micos, lo#!ando la !e"enci%n de imactos noci"os(

Se entienden como )!ecauciones Uni"e!sales al conjunto de t*cnicas +

!ocedimientos destinados a !ote#e! al e!sonal 'ue confo!ma el e'uio de salud

de la osi$le infecci%n con cie!tos a#entes, !incialmente i!us

Medidas de Biose#u!idad son un conjunto de medidas de sentido com-n 'ue

e!miten !e"eni! la e.osici%n del e!sonal a !ies#os innecesa!ios(

En el La$o!ato!io de Mic!o$iolo#&a de$en tene!se eseciales !ecauciones a fin de

e"ita! la contaminaci%n de las muest!as cl&nicas + de los culti"os, as& como la

infecci%n del oe!ado!(

Recomendaciones:

Antes de "eni! a clase lea el eje!cicio o !/ctica 'ue se!/ ejecutada ese d&a, de talfo!ma 'ue Ud( )ueda entende! lo 'ue se 0a!/ en clase(

Siem!e lanifi'ue su t!a$ajo a!a e"ita! e!didas de tiemo( 1ome nota de todo lo

'ue se est/ ejecutando du!ante las !/cticas(

Asuma 'ue todos lo mic!oo!#anismos con 'ue Ud( Est/ t!a$ajando son at%#enos

2causantes de enfe!medad3(

Ries#o o! a#entes $iol%#icos

Este se !oduce o! la in0alaci%n, in#esti%n o contacto di!ecto

con la iel, mucosas + conjunti"a de los mic!oo!#anismos(


4



Lab. Microbiología - Guía Práctica deBacteriología Oscar D. Orós B.Ries#o o! a#entes 'u&micos

Este se !oduce o! la in#esti%n, in0alaci%n + contacto di!ecto de

la iel, mucosas + conjunti"a con sustancias t%.icas, co!!osi"as,

inflama$lese i!!itantes(

Ries#o o! a#entes f&sicos

Este se !oduce al esta! en contacto con sustancias

!adioacti"as, !adiaciones, e.osici%n a !uidos, fue#o o

elect!icidad(

Medidas mínimas de bioseguridad que deben ser aplicadas en el Laboratorio

de Microbiología

4( Uso o$li#ato!io de #ua!daol"o o mandil $lanco(

5( Si tiene el elo la!#o, *ste de$e se! !eco#ido(

6( No come!, fuma! ni $e$e! dent!o del La$o!ato!io(

7( 1ene! a$soluto cuidado del mate!ial + e'uio, manteni*ndola limia +

cumliendo con las inst!ucciones del jefe de !/cticas(


5




8( En caso de de!!ame de mate!ial

contaminado, a"isa! inmediatamente al enca!#ado(

9( Nuncausa! la $oca di!ectamente a!a ietea! ni eti'ueta! o !otula! los

en"ases(

:( Cual'uie! accidente 2!otu!a de tu$os,

lacas 'ue conten#an culti"os, as& como 0e!idas de las e!sonas3 de$e

comunica! al t*cnico de la$o!ato!io a!a 'ue tome las medidas necesa!ias(

;( Desec0a! el mate!ial contaminado en los !eciientes adecuados(

<( Uso cuidadoso de los mec0e!os 2#uantes3 a!a e"ita! 'uemadu!as(

4=(No amontona! mate!ial innecesa!io en la mesa de t!a$ajo, sino tene! loindisensa$le(

44( )!e"e! una !o$eta 'ue conten#a soluci%n de fenol al 5 >, lu#ol o amonio

cuate!na!io a!a int!oduci! las ietas usadas(


6




45( De$e deja!se las mesas de t!a$ajo limias + en o!den + no $ota! $asu!a a las

canaletas a!a e"ita! o$st!ucciones(

46(Ce!!a! el #as cada "e? 'ue no sea emleada as& como las lla"es de #!ifos +

l/ma!as(

47(La"a!se las manos con a#ua + ja$%n antes de !eti!a!se del La$o!ato!io(

Control de la contaminación dentro del Laboratorio

Es de la ma+o! imo!tancia el e"ita! la contaminaci%n de las muest!as, a!a as&

o$tene! un $uen dia#n%stico( Es necesa!io o! lo tanto 'ue el oe!ado! t!a$aje

0aciendo uso de una $uena t*cnica as*tica + usando mate!ial est*!il(

Este!ili?aci%n

)!oceso 'ue elimina toda fo!ma de "ida( Elimina $acte!ias + sus fo!mas de

!esistencia, las eso!as, elimina "i!us, + 0on#os(

1*cnica as*tica

1anto los medios de culti"o como las muest!as de$e!/n maniula!se con t*cnica

as*tica, 'ue se!/ !acticada en el la$o!ato!io( Las t*cnicas de siem$!a as*tica +

de siem$!a de aislamiento tam$i*n se!/n lle"adas a la !/ctica(





!R"C#$C" %ro& 1

RECONOCIMIEN1O DE MA1ERIAL Y E@UI)O DE LABORA1ORIO

En el la$o!ato!io de mic!o$iolo#&a se usa una infinidad de mate!iales + e'uios

desde las m/s simles 0asta las m/s sofisticadas, a continuaci%n se most!a!/n +

conoce!/n su uso esecialmente en mic!o$iolo#&a(

1& Re'rigeradoras ( congeladoras&

Las !ef!i#e!ado!as se !e'uie!en a!a

almacena! medios de culti"o, sue!os, discosde sensi$ilidad( El uso de las con#elado!as

son a!a el almacenamiento !olon#ado de

sue!os, en?imas, etc(

De$en locali?a!se lejos de los 0o!nos de ai!e

caliente, de !adiado!es + de tu$e!&as de a#ua

caliente(

2& "utocla)e&

a+ de di"e!sos modelos + ma!cas, estos ueden

funciona! a elect!icidad o a #as !oano, cu+a

teme!atu!a de funcionamiento es de 454C o! 48

Li$!as de !esi%n du!ante 48 a 6= minutos( Se

fundamenta en la e$ullici%n del a#ua a una !esi%n

sue!io! al no!mal, ele"ando la !esi%n atmosf*!ica as&

como la teme!atu!a,en consecuencia el "ao! de

a#ua enet!a o! osmosis a la c*lula coa#ulando su

citolasma, dest!u+*ndose las fo!mas "e#etati"as +

eso!uladas(

3& *quipo para 'iltraciones&

En la actualidad se usan t!es tios de filt!os, a!a la este!ili?aci%n o! filt!aci%n


+



Lab. Microbiología - Guía Práctica deBacteriología Oscar D. Orós B.ilt!o de mem$!ana( Disco de ele"ada o!osidad de este!es de celulosa 2acetato de

celulosa3, con "a!iada #ama de di/met!o de o!os, !etienen en su sue!ficie a'uellas

a!t&culas 'ue so$!easan un tamaFo dado( La !etenci%n de a!t&culas se efectua!/

o! medio de o!os + no o! at!acci%n o adso!ci%n elect!ost/tica(

ilt!o Seit?( Discos fo!mados o! una me?cla de

amianto + celulosa( La !etenci%n de $acte!ias se

0ace o! adso!ci%n + at!acci%n elect!ost/tica(

ilt!os de laca filt!ante de "id!io( Comuesto de

f!a#mentos de "id!io fundido fo!mando un disco, +

'ue suelen utili?a!se a!a "ol-menes!elati"amente $a!atos + !esultan -tiles a!a "ol-menes #!andes(

4& Centri'uga&

Son aa!atos diseFados a!a acele!a! la

sea!aci%n de a!ticula! s%lidas susendidas en

l&'uidos( La "elocidad a la cual sedimenta!/ las

a!t&culas en un l&'uido deende de "a!iosfacto!es como 1amaFo de a!t&cula, "iscosidad

del l&'uido, eso de la a!t&cula + fue!?a

#!a"itacional(

E.isten cent!&fu#as de los m/s di"e!sos tios de acue!do al uso al cual est/n

destinados( Las "elocidades 'ue se o$tienen son tam$i*n "a!ia$les, 0a+ cent!&fu#as

de mano, cent!&fu#as 'ue dan 4,8== !m + ot!as de 6,=== a 8,=== !m + ot!as son

ult!a cent!&fu#as 'ue dan 0asta 4;,=== !m(

)a!a t!a$aja! con las cent!&fu#as, se de$e tene! en cuenta las si#uientes

!ecomendaciones

Ase#u!a!se de conoce! el manejo de una cent!ifu#a dete!minada antes de

utili?a!la, seleccionando los tu$os adecuados a su "elocidad(

Cu$!i! los tu$os a cent!ifu#a! con ta%n de al#od%n 2sujetado de tal fo!ma 'ue


,




no "a+a al fondo3 o con ael de aluminio(

Cont!aesa! los tu$os o! cent!ifu#a! 'ue "an ouesto uno del ot!o(

Su$i! la "elocidad de la cent!ifu#a lentamente, una "e? te!minada la oe!aci%n!educi!la tam$i*n lentamente(

5& Microscopio&

El tio de mic!oscoio m/s utili?ado es el mic!oscoio

%tico, 'ue se si!"e de la lu? "isi$le a!a c!ea! una ima#en

aumentada del o$jeto(Al#unos mic!oscoios %ticos

ueden aumenta! un o$jeto o! encima de las 5(=== "eces(

El mic!oscoio comuesto consiste en dos sistemas de

lentes, el o$jeti"o + el ocula!, montados en e.t!emos

ouestos de un tu$o ce!!ado( El o$jeti"o est/ comuesto

de "a!ias lentes 'ue c!ean una ima#en !eal aumentada del

o$jeto e.aminado( Las lentes de los mic!oscoios est/n

disuestas de fo!ma 'ue el o$jeti"o se encuent!e en el unto focal del ocula!(

Cuando se mi!a a t!a"*s del ocula! se "e una ima#en "i!tual aumentada de la

ima#en !eal( El aumento total del mic!oscoio deende de las distancias focales de

los dos sistemas de lentes(

6& *stereoscopio&

1am$i*n, llamado mic!oscoio este!eosc%ico, utili?ado en

el la$o!ato!io de mic!o$iolo#&a a!a !eali?a! o$se!"aciones

de la mo!folo#&a de las colonias en medios de culti"o en

lacas et!i, etc(

& *stu'a el-ctrica&


1.



Lab. Microbiología - Guía Práctica deBacteriología Oscar D. Orós B.E'uio emleado a!a el culti"o de las muest!as cl&nicas, en medios de culti"o( La

teme!atu!a de este e'uio se #!ad-a de acue!do al tio de mic!oo!#anismo 'ue se

'uie!e aisla! 2sic!%filos, mes%filos + te!m%filos3(

+& /orno el-ctrico&

E'uio el*ct!ico cu+o funcionamiento es autom/tico

lle#ando a un m/.imo de 55=C de teme!atu!a o!

un tiemo de 5 0o!as( Se usa a!a este!ili?a! mate!ial

!esistente al calo! seco como ace!o ino.ida$le, i!e.,

etc(

,& Cuenta colonias&

E'uio el*ct!ico, !o"ista de una fuente de lu? +

una lua, con la finalidad de "isuali?a! las colonias

e'ueFas !esentes en la laca et!i, de esta

mane!a efectua! un conteo m/s e.acto del

n-me!o de colonias(

1.&0alana de precisión&

Este e'uio es -til a!a el esado de los medios

de culti"o en su !ea!aci%n, as& como muest!as

cl&nicas, alimento 'ue se!/n sometidas a

an/lisis + cuantificaci%n de #*!menes o! #!amo

de muest!a(

11&arras de anaeobiosis&

Este e'uio si!"e a!a !oo!ciona! un am$iente ca!ente de o.i#eno + muc0as

"eces !oo!ciona!le un dete!minado o!centaje de CO5, en el !oceso de culti"o de

mic!oo!#anismos anae!%$icos o mic!oae!%filos(


11




12&*stuces

para

pipetas (

placas petri&

Necesa!ios a!a somete! a las ietas + lacas

al !oceso de este!ili?aci%n( )oste!io! a esta

mantene!los est*!iles 0asta el momento de su utili?aci%n(

/omogeniador&

E'uio el*ct!ico 'ue a t!a"*s de

"i$!aciones en*!#icas se consi#ue el

0omo#eni?ado del contenido 'ue

#ene!almente es li'uido me?clado con

a!t&culas #!andes(

46(E'uio de siem$!a(

E.iste una "a!iedad de mate!iales + e'uios de siem$!a como t!&ode, malla de

as$esto, mec0e!o $un?en, #uantes de as$esto,asa de Holle, a#uja de Holle, es/tula

de D!i#alH+, teas,lacas et!i, #!adillas, etc( Al#unos de ellos se muest!an en las

si#uientes fotos(


12




!R"C#$C" %ro2

ES1ERILIACIJN Y DESINECCIJN DE MA1ERIAL DE LABORA1ORIO

$ntroducción&Los mic!oo!#anismos como ot!os se!es "i"os, son susceti$les a los cam$ios

de condiciones am$ientales + en la medida en 'ue se 0an odido adata! a estos

cam$ios, se 0an dist!i$uido en una #!an di"e!sidad de 0/$itats inclu+endo los de

condiciones e.t!emas so$!e todo de tio f&sico + 'u&mico(

Se 0an desa!!ollado + alicado di"e!sos !ocesos de desinfecci%n +

este!ili?aci%n a!a limita! su !esencia o elimina!los( La este!ili?aci%n es un m*todo

de eliminaci%n total de todo tio de o!#anismo + 'ue ase#u!a la ausencia a$soluta

de cual'uie! fo!ma "i"iente, mient!as 'ue la desinfecci%n es un !oceso 'ue

solamente elimina fo!mas "e#etati"as de los mic!oo!#anismos(

ES1ERILIACION )OR ME1ODOS ISICOS(

CALOR SECO( Reali?ada en 0o!nos, elimina $acte!ias + eso!as o! dest!ucci%n

o.idati"a de los comonentes celula!es a teme!atu!as de 4;= a 5==KC o! 4

0o!a( CALOR UMEDO(

*bullición& El a#ua 0i!"iendo a 4==KC o! 4= minutos dest!u+e todos losmic!oo!#anismos no eso!ulados(

"utocla)e& El "ao! a 48 L$!s( De !esi%n a una teme!atu!a de 454KC

elimina a las eso!as en 48 minutos( !asteuriación& En la asteu!i?aci%n lenta, la teme!atu!a alcan?a los

96KC + de$e e!manece! du!ante 6= minutos, + en la asteu!i?aci%n

!/ida la 1K de$e alcan?a! :5KC du!ante 48 minutos, so$!e"i"en al#una

$acte!ias en fo!ma "e#etati"a 'ue !esisten al calentamiento(

IL1RACION( iltros& A t!a"*s de filt!os de mem$!ana, estos oseen "a!ios #!ados de

o!osidad, el di/met!o de los o!os oscila ent!e =(55 a =(4= μm( se emlea

a!a la u!ificaci%n de medios a t!a"*s de la !etenci%n de $acte!ias( RADIACION( La lu? sola! di!ecta dest!u+e con $astante !aide? las fo!mas

"e#etati"as de los mic!oo!#anismos 'ue ca!ecen de !otecci%n( La acci%n

$acte!icida de la lu? sola! se de$e a la $anda ult!a"ioleta del esect!o( LU UL1RAIOLE1A( Es utili?ada en flujo lamina!, 'ui!%fanos + ot!as ?onas, con

el fin de disminui! las infecciones t!ansmitidas a t!a"*s del ai!e(ES1ERILIACION )OR ME1ODOS @UIMICOS( )ueden utili?a!se como


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Lab. Microbiología - Guía Práctica deBacteriología Oscar D. Orós B.desinfectante muc0as sustancias 'u&micas, dado 'ue el n-me!o + la "a!iedad de

!oductos es cada "e? ma+o!, de$en ele#i!se cuidadosamente las fo!mulaciones de

acue!do a las necesidades conc!etas(

La acti"idad #e!micida de muc0as sustancias 'u&micas ueden se! modificadas uotimi?adas o! facto!es e.te!nos como La teme!atu!a, , tiemo de la acti"idad,

natu!ale?a del mic!oo!#anismo, !esencia de mate!ial e.t!aFo, etc(

beti)os&

4( Conoce! los !inciios #ene!ales de las t*cnicas de este!ili?aci%n de

mate!iales de "id!io + medios de culti"o de uso com-n en mic!o$iolo#&a(

5( O$se!"a! el efecto de asesia en el cont!ol de la contaminaci%n

mic!o$iana en el la$o!ato!io(

Mate!iales de la$o!ato!io o! e'uio Mate!iales del e'uio9 cajas )et!i con a#a! nut!iti"o 2AN3 Limiado! de isos Ma!cado! indele$le9 cajas de )et!i con a#a! aa de.t!osa

2)DA3

clo!o Ce!illos

isoos est*!iles !anela Colo!es Al#od%n

"cti)idad pr7ctica

)!ue$a de este!ilidad

4( A$!i! una caja de )et!i de cada medio du!ante 4 min( En el la$o!ato!io o ?onas

acceso!ias al mismo + se eti'ueta!/ ai!e

5( La se#unda caja de cada medio de culti"o se a$!i!/ du!ante 6= se#( En el

/!ea as*tica + se eti'ueta!/ /!ea as*tica

6( 1e!ce! caja se conse!"a!/ sin a$!i! + se eti'ueta!/ cont!ol

)!ue$a de desinfecci%n

4( Limia! el /!ea de t!a$ajo con el limiado! de isos si#uiendo las

inst!ucciones del fa$!icante(

5( Con el 0isoo est*!il !eco!!e toda el /!ea 'ue limiaste + oste!io!mente

siem$!a tu caja de )et!i con el mismo 0isoo(

Resultados


14




o ace! la desc!ici%n mo!fol%#ica de las colonias o$tenidas en las cajas con

dife!entes medios de culti"o + con los distintos t!atamientos en !elaci%n a la

caja cont!ol(

o

Reo!ta! el c!ecimiento en fo!ma cualitati"a sin c!ecimiento 23, ococ!ecimiento 23, c!ecimiento !e#ula! 23, c!ecimiento a$undante 23(

o Discuta los !esultados + dete!mine si la este!ili?aci%n en la autocla"e + 0o!no

fue adecuada, as& como el manejo de mate!iales(

Cuestionario

4( Cu/les son los m*todos de este!ili?aci%n m/s utili?ados en mic!o$iolo#&aP

5( en 'ue tio de mate!iales se alica cada unoP

6( E.li'ue cuales son los !ocesos de este!ili?aci%n, desinfecci%n + asesia(


15




!R"C#$C" %ro& 3

)RE)ARACIJN DE MEDIOS DE CUL1IO

IN1RODUCCIJN

Los medios de culti"o son fuentes nut!iti"as, natu!ales o sint*ticas, 'ue semejan el

nic0o ecol%#ico de los mic!oo!#anismos( Esecies $acte!ianas dife!entes,

culti"adas en el mismo tio de medio, ueden aa!ece! dife!entes, de este

modo el conocimiento de la aa!iencia o de las ca!acte!&sticas cultu!ales, de las

esecies $acte!ianas, es -ti l a!a el !econocimiento de cie!to t io de

$acte!ias(

UNDAMEN1O

Cada indi"iduo tiene !oio am$iente + fo!ma de "ida, + a!a culti"a! o

0ace! multilica! a los mic!oo!#anismos, se les somete a un am$iente a!ecido

donde 0a+a alimentos, teme!atu!a, , !esi%n atmosf*!ica, + !esi%n osm%tica

adecuados(

#$!8 9* M*9$8 9* CL#$;

1< !or su origen&

%aturales= medios a $ase de lec0e + aa(

"rti'iciales= siendo t!ansfo!mados o! medios mec/nicos o 'u&micos,

Ejm( A#a! nut!iti"o, A#a! McConHe+(

5 !or su consistencia&

Líquidos= soluciones acuosas Caldo nut!iti"o, caldo BI(

8olidos el comonente !incial es el A#a!a#a! el A#a! nut!iti"o,

A#a! san#!e, A#a! SS etc(

6 !or su obeti)o&


16




a& Medios de transporte= mantiene mic!oo!#anismos "ia$les +

conse!"ados Ca!+ Blai!, Medio Stua!d(b& Medios de enriquecimiento& Multilica $acte!ias antes de su siem$!a

Caldo selenito, Caldo tet!at0ionato(

c& Medios de enriquecimiento meorados& Constituidos o! un medio$ase, se aFade sustancias !icas en !ote&nas como el A#a! san#!e(

d& Medios de aislamiento&• Medios de aislamiento no selecti)os Si!"en a!a aisla! o culti"a!

$acte!ias, no contienen in0i$ido!es A#a! nut!iti"o A#a! BI, +

mejo!ados como el A#a! san#!e(• Medios de aislamiento selecti)os& )!esentan el medio $ase, adem/s

lle"an un su$st!ato m/s indicado!es + de mane!a esecial

in0i$ido!es sales, colo!antes, como el A#a! EMB, ENDO, Manitolsalado, A#a! "e!de $!illante(

• 9e aislamiento especi'ico& Son altamente en!i'uecidos LoQestein

2M+co$acte!ium3 + el a#a! Sa$ou!aud 20on#os + le"adu!as3(e& Medios di'erenciales o bioquímicos& Son a'uellos 'ue lle"an un

medio co!!iente, caldo o A#a! nut!iti"o al 'ue se le 0a aFadido un

su$st!ato conocido, adem/s lle"a indicado! de , as& tenemos el 1SI,

SIM, LIA etc(

MA1ERIALES

Mat!a? de E!l+nme+e!(

)!o$eta #!aduada(

Balan?a de !ecisi%n(

Medios de culti"o des0id!atado(

Mec0e!o $un?en(

A#ua destilada(

)otenci%met!o(

Autocla"e(


1



Lab. Microbiología - Guía Práctica deBacteriología Oscar D. Orós B. Estufa a 6:KC(

ORMAS DE )RE)ARACIJN E IN1ER)RE1ACIJN DE LOS MEDIOS DE CUL1IO

)OCEDIMIEN1O

4( Al#unos se !ea!an esando in#!ediente o!

in#!ediente, ot!os medios "ienen +a !ea!ados,

a!a un lit!o(

5( No me?cla! los medios con es/tula sucias,lue#o taa! 0e!m*ticamente, a!a e"ita! su

des0id!ataci%n(

6( )esa! en ael mante ca 'ue no e.ceda del tama Fo del latillo, + no

deja! a!t&culas de medio en el ael(

7( Usa! f!ascos $ien la"ados, !efe!i$lemente secos, de tamaFo adecuado a la

cantidad de medio de culti"o(

4( Usa! a#ua destilada o $idestilada + !o$eta limia(

8( Se disuel"en los su$st!atos calentando a teme!atu!a de e$ullici%n, +

cuando est* a 7=KC se le ajusta el de :(5 a :(7 a!a ajusta! el , se usa

soluciones de NaO +o CI(

9( Se taona el f!asco con al#od%n + ael c!aft con el nom$!e del medio,fec0a e iniciales del 'ue lo !ea!%, se ama!!a sujetando el ael al

cuello del f!asco(

5( Lle"a! a autocla"e, la"ado + limio con a#ua destilada(


1+




:( Se este!i li?an los medios de culti"o a 48

li$!as de !esi%n,454KC o! 48 minutos(

4=( Deja! 'ue la !esi%n + la teme!atu!a $ajen

solas cuando estos est*n a 78KC se !ea!ten

en lacas o tu$os(


1,




!R"C#$C" %ro& 4&

)LA@UEO Y EN1UBADO DE MEDIOS DE CUL1IO

E.isten medios de culti"o s%lidos + l&'uidos, deendiendo de esta ca!acte!&st ica se

ueden utili?a! lacas et!i +o tu$os a!a la siem$!a !esecti"a

)LA@UEO

El la'ueo consiste el !ea!to de los medios de culti"o esecialmente de

consistencia s%lida, utili?ando a!a este fin lacas et!i, a!a cumli! los

si#uientes o$jeti"os

OBE1IOS

AislamTiento( )a!a la siem$!a de muest!as, con el o$jeto de conse#ui!

colonias aisladas, la siem$!a es o! est!&as(

Contaje de colonias( )a!a conta! el n-me!o de colonias o! ml(, se

coloca en la laca 4 ml( De la muest!a !o$lema, lue#o 4= ml( Demedio de culti"o 21SA, BI, A#a! Muelle! ilton3( La siem$!a se !eali?a o!

difusi%n(

Bacte!iofa#otiaje o anti$io#!ama( Se !ea!te el medio de culti"o,

lue#o de endu!a!, la siem$!a se 0ace o! diseminaci%n, !es$alando el

culti"o $acte!iano con la a+uda de la es/tula de D!i#alsH+ o un 0isoo(

CONSIDERACIONES )REIAS

Se de$e tene! el am$iente limio + desinfectado, el mate!ial de "id!io

este!ili?ado + f!i%(

MA1ERIALES

)lacas et!i(

1u$os de ensa+o(


2.



Lab. Microbiología - Guía Práctica deBacteriología Oscar D. Orós B. !ascos

Mec0e!os con #as(

Medios de culti"o este!ili?ado, licuados + a una teme!atu!a ent!e 7; + 85KC(

Mat!a? de E!l+nme+e!(

BaFo ma!&a(

L/i? de ce!a(

Estufa(

)ROCEDIMIEN1O

4( Coloca! todo el e'uio necesa!io so$!e la mesa de t!a$ajo(

5( A$!i! las lacas )et!i, del estuc0e o 'uitando el 0ilo + ael(

6( A$!i! el medio a !ea!ti!, + flamea! un, ida + "uelta so$!e la llama(

7( Con la mano i?'uie!da co#e! la laca )et!i, los dedos anula! + meFi'ue "an

o! de$ajo de la laca, ul#a! + medio co#en o! el $o!de, el &ndice toca la

sue!ficie e.te!na de la laca(

8( A$!i! lentamente la laca 0asta el /n#ulo de 78K, manteni*ndola ce!ca de la

llama(

9( Con la mano de!ec0a co#e! el f!asco 'uecontiene el medio de culti"o, a#ita!

sua"emente !otando, flamea! la $oca del

f!asco + "e!te! dent!o de la laca una

cantidad adecuada, m/s o menos 45 ml(

9( Ce!!a! la laca + deja! so$!e la mesa sin 'ue el

medio to'ue la taa(


21




:( )!ose#ui! con el !esto del medio + lacas, flameando con una, ida +

"uelta la $oca del f!asco(

;( Una "e? aca$ado de !ea!ti!, se de$e enjua#a! con a#ua de caFo, los

f!ascos(

4=(Una "e? enf!iado + endu!ado los medios en las lacas, se "oltean +

!otulan con l/i? de ce!a(

44( Se deja en !ef!i#e!ado!a a 7KC(

RE)AR1O DE LOS MEDIOS DE CUL1IO EN 1UBOS(

Medios l&'uidos(

Conocido tam$i*n como Caldo, si el medio es co!!iente uede se!"i! a!a

estudios de desa!!ollo $acte!iano, tu!$ide?, sedimento( Si el medio !esenta un

su$st!ato conocido, se estudia!/ meta$olismo, ejemlo, en caldo etonado

se estudia!/ la !ue$a del Indol(

Medios s%lidos(

Este tio de medio es a'uel 'ue lle"a 4(8 > de a#a!a#a!, + los medios

ueden adota! las si#uientes fo!mas

*n columna( Cuando no se inclina, se siem$!a o! icadu!a o untu!a,

o! lo #ene!al si!"e a!a conse!"a! ceas(

*n plano inclinado( Se !ea!te la 'uinta a!te del tu$o, m/s o menos,5 ml( De medio, lue#o se le inclina en una "a!illa, el medio de$e esta!

o! de$ajo de la taa de al#od%n a 5 cm( En este medio se uede

estudia! desa!!ollo $acte!iano, si el medio lle"a un su$st!ato conocido

m/s indicado!, entonces se estudia!/ la $io'u&mica, ejemlo A#a!

-!ea, se estudia!/ el meta$olismo de la -!ea en el Cit!ato de simons, se

estudia!/ el desdo$lamiento del Cit!ato(

*n plano semi inclinado( El medio se !ea!te en 47 % 46 del "olumen


22




del tu$o, se semiinclina, !ecost/ndolo so$!e una ta$lita 'ue ten#a una

altu!a o anc0o de 6 cm( Este medio se siem$!a en la sue!ficie o! est!&as

+ o! icadu!a en el fondo, #ene!almente son medios de dife!enciaci%n,

si!"e a!a el estudio $io'u&mico, Ejm( 1SI, LIA(

Medios semis%lidos(

Este medio es a'uel 'ue lle"a solo el =(8> de A#a!a#a!, al mismo tiemo

contiene su$st!atos conocidos a!a estudios $io'u&micos, o! ejemlo el

medio fluido de 10io#licolato, si!"e a!a el cont!ol de este!ilidad de

su$stancias, uede usa!se a!a mantene! Ceas el medio SIM si!"e a!a

estudia! las si#uientes !ue$as $io'u&micas 5S, Indol + Motilidad(

)a!a !ea!ti! los medios de culti"o en tu$os, sean l&'uidos o s%lidos, el medio

de$e esta! est*!il, $ien 0omo#eni?ado, licuado + a una teme!atu!a de

78KC, en la 'ue el oe!ado! no suf!a o! el calo!, los tu$os de$en esta!

est*!iles + f!&os, la mesa de t!a$ajo de$e esta! desinfectado, el oe!ado!

de$e sentase c%modamente, colocando los tu$os al lado i?'uie!do + el medio

a !ea!ti! al lado de!ec0o(

)ROCEDIMIEN1O(

4( Se desatan los 0ilos de los a'uetes de tu$os + de la $oca del f!asco(

5( Se a$!e el f!asco tom/ndolo con la mano de!ec0a + con la i?'uie!da se

destaa, + se deja el ta%n de al#od%n dent!o del ael del cauc0%n 'ue la

manten&a en"uelto(

6( Se flamea 5 a 6 ida + "ueltas, la $oca del f!asco + se mantiene en

osici%n semiinclinado este f!asco ce!ca del mec0e!o(

7( Con la mano i?'uie!da se co#e el tu$o de la a!te cent!al, + se lle"a

a!!i$a a la altu!a del t%!a. del oe!ado!, ce!ca del mec0e!o, con el $o!de

del ma!#en infe!io! de la mano de!ec0a + ent!e el dedo meFi'ue, +

anula! se !eti!a el ta%n del tu$o( De$e !ota!se el tu$o + ta%n a!a mantene!

esta$le el ta%n(


23



Lab. Microbiología - Guía Práctica deBacteriología Oscar D. Orós B.8( Se flamea el tu$o + se lle"a ce!ca del ico del f!asco(

9( Se "ie!te una cantidad adecuada de medio de culti"o, en fo!ma lenta(

:( Lue#o se flamea el tu$o, se "uel"e a taona! + se deja en una #!adilla o seinclina so$!e un soo!te en la mesa de t!a$ajo(

;( Se contin-a de id*ntica mane!a(

<( Si so$!a medio de culti"o en el f!asco se flamea la $oca, + se taona, se

coloca e l ael !otulado, se ama!!a e l 0 ilo + se deja en la

!ef!i#e!ado!a(

4=( Si se aca$% el medio de culti"o, se de$e enjua#a! el f!asco antes 'ue se

enf!&e, a!a e"ita! 'ue el medio se enf!i* dent!o del !eciiente(

44( Se !otula los tu$os, se colocan en una misma #!adilla + se dejan en la

!ef!i#e!ado!a(

La siem$!a de$e 0ace!se cuando el medio de culti"o est* $ien du!o, esto en el caso

de medios s%lidos(


24



Lab. Microbiología - Guía Práctica de BacteriologíaOscar D. Orós B.

!R"C#$C" %ro& 4

MV1ODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIEN1ODE MICROORGANISMOS(

8$*M0R"&< Es el !ocedimiento 'ue consiste en acondiciona! el mic!oo!#anismo en un

medio de culti"o f*!til, de acue!do a sus e.i#encias "itales, a!a 'ue en condiciones %timas de

teme!atu!a + tiemo de incu$aci%n ueda desa!!olla! + multilica!se IN I1RO(

1odo aislamiento imlica el a#otamiento de una muest!a so$!e la sue!ficie de un medio s%lido(

502*# $;58

Conoce! los m*todos de siem$!a tiene los si#uientes o$jeti"os

Reali?a! un co!!ecto aislamiento de colonias(

Aace! un t!anslante de mic!oo!#anismos(

Conoce! la t*cnica de siem$!a a!a !ecuento demic!oo!#anismos(

$M!5R#"%C$"

En el aislamiento e!mite la sea!aci%n de losmic!oo!#anismos al estado de u!e?a a

a!ti! de unamuest!a !o$lema, + #ene!a! su !o#enie 2cea3(

Si se a&s lan esecies dist intas, cada colonia tend!/ca!acte!es eseciales

necesa!ios a!a la identificaci%nde un dete!minado mic!oo!#anismo(

Se !eali?a t!aslante con la finalidad de mantene! en lafase e.onencial una cea

dete!minada(

El t!anslante en medios de culti"o eseciales se lo#!aconoce! sus ca!acte!&sticas

$io'u&micas(

Una co!!ecta siem$!a a!a !ecuento e!mite o$tene!!esultados !eales(

3acultad De Medicina 4eterinaria % 5ootecnia 6 701 6 P70O"ag.



Lab. Microbiología - Guía Práctica de BacteriologíaOscar D. Orós B.M"#*R$"L*8

- Estufa de incu$aci%n(

- 1u$o de ensa+o(

- Es/tula de D!i#alsH+(

- Asa de Wolle(

- )ieta #!aduada de 8 4= ml(

- Mo!te!o(

- G!adilla + canastillas(

- Mat!a? de E!l+n Me+e!(

- Mec0e!o $un?en(

- )!o$eta #!aduada de 4== ml(

- )lacas et!i, con medios de culti"o(

- Ceas(

M*#9L>?"

A( SIEMBRAS DIREC1AS

1& 8iembra por estría&

)osee! la muest!a, tomada +a sea con un

0isoo o to!unda,a#uja 0iod*!mica o asa

de Holle(

La muest!a tomada se toca la

sue!ficie del medio deculti"o

deositado en la laca et!i,

coloc/ndola en une.t!emo del medio(




Lab. Microbiología - Guía Práctica de BacteriologíaOscar D. Orós B. Con un asa de siem$!a est*!il, se da inicio a la siem$!a, aa!ti! de donde se deosit% la

muest!a, !oduciendo l&neassi#?a#eantes(

Concluida la siem$!a, ce!!a! la laca + deja!la so$!e la mesacon la $ase 0acia a!!i$a(

Eti'ueta! la laca, + deja!la en la estufa a 6:KC o! 57 a 7;0o!as

Reali?a! este !ocedimiento con asesia ce!ca del mec0e!o$un?en(

B( SIEBRA A )AR1IR DE DILUCIONES SERIADAS( )RE)ARACIJN Y DILUCIJN DE LA MUES1RA(

Las siem$!as a a!ti! de diluciones se!iadas es un m*todo o! a#otamiento + se !eali?a con la finalidad de

cuantifica! el n-me!o de colonias o! una cantidad de muest!a dete!minada Ejm( El N-me!o m/s )!o$a$le

de Colifo!mes, cuantifica! mes%filos "ia$les, etc(

En un mo!te!o est*!il esa! un #!amo de muest!a, adiciona! < ml( De a#ua etonada

a!a o$tene! la diluci%n 4 4= ml(

)ietea! 4 ml( De la diluci%n ante!io! + t!as"asa!lo a ot!o tu$ode ensa+o 'ue conten#a <

ml de a#ua etonada( )!ose#ui! 0asta o$tene! la diluci%n 4 4======(

2& 8iembra por diseminación&

M*todo de siem$!a ma+o!mente usado a!a el

Recuento total de mes%filos "ia$les( El

!esultado de dic0a siem$!a !esenta un

c!ecimiento de las colonias so$!e la sue!ficie de

medio de culti"o en fo!ma diseminada, nosi#uiendo una l&nea de siem$!a como en el

caso de la siem$!a o! est!&as(

O$tene! el inoculo !efe!entemente de

muest!as l&'uidas oa a!ti! de diluciones de muest!as(

AFadi! a cada laca 48 ml( de a#a! a!a !ecuento +enf!ia!los a 78 a9=KC + deja!

solidifica!(

Utili?ando una -nica ieta, toma! O(4ml( de cada una dela diluciones, + deosita!lo





en la sue!ficie del a#a!(Comen?a! o! la diluci%n m/s $aja, llenando + "aciando

laieta 6 "eces antes de t!ansfe!i! =(4 ml(a la laca(

E.tende! las muest!as de =(4 ml( !onto desu*s dedeosita!las so$!e la sue!ficie

del a#a! con la a+uda de laes/tula de D!i#alsH+, deja! seca! la sue!ficie del

a#a!du!ante 48 minutos(

Incu$a! las lacas in"e!tidas o! dos d&as a 6: KC(

Conta! las colonias en las lacas 'ue !esenten ent!e6= + 6== colonias(

3& 8iembra por di'usión&

A dife!encia de la siem$!a o! diseminaci%n, en esta en el 'ue el !ocedimiento es fundi! el

medio de culti"o con el in%culo o la muest!a diluida, el c!ecimiento de las colonias adem/s de

o$se!"a!se en la sue!ficie del medio, 0a+ c!ecimiento en el fondo as& como en el medio del a#a!(

)ietea! en lacas et!i 4 ml( De las diluciones efectuadasen el unto B(

Inmediatamente "e!te! en las lacas inoculadas 4= a 48ml( De a#a! Est/nda! fundido +

temlado a 78KC(

Me?cla! el inoculo de siem$!a con el medio de culti"o

Una "e? solidificado el a#a! in"e!ti! las lacas eincu$a!las a 68 KC du!ante 57 a 7; 0o!as(

Utili?ando el contado! de

colonias, + el disositi"o

de!e#ist!o autom/tico, conta! todas las

colonias en las lacas'ue

!esenten 6=6== colonias





!R@C#$C"%ro5

SENSIBILIDAD BAC1ERIANA

$%#R9CC$%&

El aislamiento de un a#ente infeccioso a a!ti! de un aciente no es con f!ecuencia suficiente a!a

esta$lece! la te!aia adecuada( Muc0as $acte!ias + al#unos 0on#os !esentan !esistencia a los

a#entes antimic!o$ianos + al#unos "i!us 0an desa!!ollado !esistencia a los a#entes anti"i!ales

m/s actuales( Los at!ones de !esistencia cam$ian en fo!ma constante + no imo!ta lo

!/idamente 'ue se int!odu?can los nue"os a#entes te!a*uticos o!'ue los mic!o$ios a!ecen

siem!e disuestos a sue!a!los(

Ya 'ue no se uede !edeci! la susceti$ilidad de las $acte!ias, 0on#os + "i!us a los a#entes

antimic!o$ianos, con f!ecuencia es necesa!io estudia! la sensi$ilidad indi"idual de cada at%#eno

a estas d!o#as, udi*ndose ele#i! entonces el a#ente a!oiado 2el m/s acti"o cont!a el

at%#eno, el menos t%.ico a!a el 0u*sed, con las ca!acte!&sticas fa!macol%#icas a!oiadas + el

m/s econ%mico3, 'ue !oo!ciona ma+o!es osi$ilidades de una e"oluci%n fa"o!a$le(

Un conceto imo!tante so$!e el 'ue es necesa!io insisti! es 'ue no se ueden !eali?a! !ue$asde sensi$ilidad in "it!o con culti"os mi.tos, s%lo los culti"os u!os !oo!ciona!/n !esultados

"/lidos so$!e la eficacia de un anti$i%tico(

OBE1IOS(

Medi! la sensi$ilidad de una cea $acte!iana 'ue se sosec0a es la !esonsa$le de una

infecci%n a uno o "a!ios anti$i%ticos(

Se#ui! la e"oluci%n de las !esistencias $acte!ianas( G!acias a este se#uimientoeidemiol%#ico, a escala de un se!"icio, un cent!o de atenci%n m*dica, una !e#i%n o un

a&s uede adota! medidas de cont!ol(

UNDAMEN1O(

Las !ime!as !ue$as se !eali?a!on inoculando la sue!ficie de una laca de a#a! con el




Lab. Microbiología - Guía Práctica de BacteriologíaOscar D. Orós B.mic!oo!#anismo en estudio, colocando e'ueFas cu$etas 2de metal o "id!io3 so$!e el a#a! +

a#!e#ando las soluciones de los dife!entes antimic!o$ianos dent!o de dic0as cu$etas( Los a#entes

antimic!o$ianos difund&an en el medio en fo!ma !adial al!ededo! de la cu$eta e in0i$&an el

desa!!ollo del mic!oo!#anismo en la ?ona donde suconcent!aci%n e!a suficientemente alta( Las /!eas de

in0i$ici%n #!andes indica$an una acti"idad antimic!o$iana m/s

efecti"a(

MA1ERIALES

- Culti"o de $acte!ias de 57 0o!as de c!ecimiento(

- A#ua destilada est*!il(

- 1u$os de ensa+o(

- Asa de Holle, + es/tula de d!i#alsH+(

- )ietas #!aduadas(

- Mec0e!o $un?en(

- Estufa el*ct!ica a58C(

- )lacas et!i con medio Muelle!inton(

)ROCEDIMIEN1O(

El mic!oo!#anismo a in"esti#a! se inocula ceas !ecientemente incu$adas + !e"iamentediluidas en a#ua destilada(en una o "a!ias lacas de a#a!(

So$!e su sue!ficie se disonen los discos co!!esondientes a "a!ios anti$i%ticos(

Se incu$an las lacas du!ante 4957 0o!as a 68C + al ca$o de este tiemo se estudia el

c!ecimiento en ellas(

Se "alo!a el di/met!o de la ?ona de in0i$ici%n 'ue se fo!ma al!ededo! de cada disco + se

coma!a con las !efe!encias u$licadas o! el NCCLS(





Con esta !efe!encia odemos info!ma! si el mic!oo!#anismo es Sensi$le, Inte!medio o

Resistente 2S, I, R3 a cada uno de los anti$i%ticos ensa+ados en las lacas(

En la ima#en de la i?'uie!da se muest!a una "ista #ene!al de una laca con c!ecimiento

$acte!iano + con seis discos de anti$i%ticos( La ?ona de colo! cla!o 'ue ocua la ma+o! a!te de lalaca es el c!ecimiento $acte!iano en las ?onas no in0i$idas( Los c&!culos ne#!os 'ue !odean a

cinco de los seis discos ma!can las ?onas en 'ue los !esecti"os anti$i%ticos 0an in0i$ido, con

ma+o! o meno! eficacia, el c!ecimiento del mic!oo!#anismo a estudio( El se.to disco 2AM4=3 no

tiene a su al!ededo! 0alo de in0i$ici%n lo 'ue indica la !esistencia del mic!oo!#anismo a ese

anti$i%tico(





!R"C#$C" %ro&6

1INCIJN GRAM

$%#R9CC$A%

La o$se!"aci%n de las $acte!ias fijadas so$!e una l/mina o!tao$jetos de$e 0ace!se

mediante el emleo de tinciones( El tamaFo de la ma+o!&a de las c*lulas $acte!ianas es tal 'ue

!esultan dif&ciles de "e! con el mic!oscoio %tico( La !incial dificultad es la falta de

cont!aste ent!e la c*lula + el medio 'ue la !odea( El modo m/s simle de aumenta! el cont!aste

es la utili?aci%n de colo!antes,uno mu+ usado en mic!o$iolo#&a es la tinción >ram&

Esta tinci%n fue desa!!ollada em&!icamente o! C0!istian G!am en 4;;7( A esa! del tiemo

t!anscu!!ido, la tinci%n aenas se 0a modificado + es uno de los !ime!os asos 'ue se

!eali?a a!a cual'uie! identificaci%n $acte!iana( La t*cnica es caa? de dife!encia! dos #!andes

#!uos de eu$acte!ias G!am ositi"as 2G3 + G!am ne#ati"as 2G3(

Esta tinci%n tiene #!an imo!tancia en ta.onom&a $acte!iana +a 'ue indica dife!encias

fundamentales de la a!ed celula! de las distintas $acte!ias(

Mient!as 'ue las $acte!ias #!amne#ati"as son constantes en su !eacci%n, los mic!oo!#anismos

#!amositi"os ueden !esenta! !esuestas "a!ia$les en cie!tas condiciones 2son #!am

l/$iles3( )o! ejemlo, los culti"os "iejos de al#unas $acte!ias #!amositi"as ie!den la

!oiedad de !etene! el c!istal "ioleta, + en consecuencia, se tiFen o! la saf!anina

aa!eciendo como #!amne#ati"as( An/lo#o efecto se !oduce en ocasiones o! cam$io en el

medio del o!#anismo, o o! li#e!as modificaciones en la ejecuci%n de la t*cnica(

)a!a e.lica! el mecanismo de la tinci%n de G!am se 0an !ouesto "a!ias 0i%tesis

fundadas en la natu!ale?a 'u&mica de las a!edes celula!es de los mic!oo!#anismos(Dife!encias

est!uctu!ales + 'u&micas de los dos tios de a!ed $acte!iana

0*#$;8:

Iniciaci%n en las t*cnicas del estudio de mic!oo!#anismos culti"o,tinci%n + mo!folo#&a(

Ent!enamiento en !ea!aci%n de e.tendidos + !eali?aci%n decolo!aciones(





O$se!"aci%n mic!osc%ica de mo!folo#&a + a#!uamientos$acte!ianos(

M"#*R$"L %*C*8"R$:

Culti"o de $acte!ias(

C!istal "ioleta 24 #( de c!istal "ioleta en 4== ce de a#ua destilada3(

Lu#ol 24 #( de +odo en 5 #( de +odu!o ot/sico en 4== cc de a#ua destilada3(

Saf!anina 24 #( de saf!anina en 4== cc de

a#ua destilada3(

Aceite de inme!si%n(

Mic!oscoio $inocula!(

)o!tao$jetos(

Asas de culti"o(

Mec0e!o(

)lacas de )et!i,

#BC%$C"8 9* R#$8 #$%C$A% >R"M&

)a!a ello se de$e limia! un

o!tao$jeto con alco0ol se e"ao!a este

as/ndolo !/idamente o! el mec0e!o, sedeja enf!ia! + se ma!ca con un l/i? la a!te 'ue "amos a toma!(

PREPARACIÓN DEL FROTIS:

El f!otis tiene como finalidad una del#ada el&cula del !ea!ado a!a una adecuada

tinci%n + o$se!"aci%n mic!osc%ica( La !ea!aci%n de un f!otis se 0ace de la si#uiente mane!a

EXTENSIÓN:

Se coloca una #ota de a#ua destilada en el cent!o del o!ta + ense#uida se este!ili?a un




Lab. Microbiología - Guía Práctica de BacteriologíaOscar D. Orós B.asa de a!#olla coloc/ndola di!ectamente en el mec0e!o + se toma unoco del mate!ial

$iol%#ico a e.amina!( Se emulsiona la e'ueFa cantidad de $acte!ia con la #ota de a#ua

delo!ta, lue#o, se incine!a el asa en el mec0e!o(

SECADO:

)asamos el o!ta o! la a!te mas alta del mec0e!o 2flamea!3 0asta 'ue la #ota con

$acte!ias 'uede seca 2se 0ace sin 'ue el o!ta se 'ueme +a 'ue uede ca!$oni?a! las c*lulas3,

0asta 'ue o$tenemos una ma!ca de una #ota con mate!ial $iol%#ico en el o!ta(

undamento

Se usa !ime!o el c!istal "ioleta 2"ioleta #enciana3 el 'ue enet!a la a!ed celula! tanto de

$acte!ias #!amositi"as como #!amne#ati"as( A continuaci%n se a#!e#a el lu#ol 2+odo

+odu!o3, 'ue act-a como mo!diente fo!mando un comlejo con el c!istal "ioleta( Al decolo!a! con

una me?cla de alco0ol + acetona, la a!ed de los #!amositi"os fo!mada o! una #!uesa caa

de etido#licano imide la salida del comlejo c!istal "ioletalu#ol, manteni*ndose la colo!aci%n

"ioleta( En los #!amne#ati"os o! el cont!a!io el comlejo c!istal "ioletalu#ol sale o! los o!os

'ue 0a #ene!ado el alco0olacetona en la mem$!ana e.te!na de la a!ed celula!( La $acte!ia o!

lo tanto se decolo!a + al a#!e#a! la saf!anina se tiFe de !ojo(

!RC*9$M$*%# 9* L" #$%C$A% >R"M

4( Rotula! con"enientemente cada uno de los o!tao$jetos(

5( )!ea!a! e.tendidos de los mic!oo!#anismos indicados o! el docente(

4( 1oma! mate!ial de la colonia ele#ida, con un asa !e"iamente este!ili?adaa la llama +

susende! este mate!ial en una #ota de a#ua colocada en lamitad del o!tao$jetos(

E.tende! el mate!ial so$!e toda la sue!ficie delo!tao$jeto(

6( Deja! seca! al ai!e junto a la llama del mec0e!o(

5( Se cu$!e comletamente el f!otis con una soluci%n de Dcristal )ioletaD= +se deja actua!

du!ante 9= se#undos(





6( La"a! con a$undante a#ua destilada(

7( A#!e#a! una soluci%n de DlugolD + deja! actua!

du!ante 6= se#undos(


7( Decolo!a! el f!otis o$tenido coloc/ndole

so$!e este alcool acetonadejando actua!

du!ante 4= a 5= se#undos(


8( Cu$!i! el f!otis con #otas de una soluci%n llamada saf!anina, dej/ndolaactua! du!ante

6= se#undos(

:( La"a! con a$undante a#ua destilada nue"amente(

;( O$se!"a! al mic!oscoio con el o$jeti"o de 4==X

Seca! el !ea!ado colocando el o!ta o$jeto en ael a$so!$ente, + si 'ueda muc0a a#ua seuede flamea! sua"emente sin 'ue se 'uemen las

muest!as, + se o$se!"a $ajo inme!si%n(

A la o$se!"aci%n en el mic!oscoio $inocula! de

in"esti#aci%n, esta se !esenta como en la l/mina

a$ajo e.uesta, donde se o$se!"a

mic!oo!#anismos $acilos #!amositi"os teFidos de

a?ul, + los $acilos #!amne#ati"os teFidos de colo!

fucsia(





!R"C#$C" %ro&

1INCIJN DE IELNEELSEN 2acido !esistente3

1iene una eno!me imo!tancia en mic!o$iolo#&a uesto 'ue e!mite one! en e"idencia la

!esencia de $acilos /cidoalco0ol !esistentes 2BAAR3 tales como el Mycobacterium

tuberculosis a#ente causal de la tu$e!culosis( 1am$i*n uede se! usada a!a detecta! la

!esencia de Cry!tos!ori"ium en deosiciones(

undamento

El colo!ante 'ue se usa en esta tinci%n, la fucsina fo!ma un comlejo con los /cidos mic%licosde la a!ed celula! de las M+co$acte!ias( Este comlejo !esiste la decolo!aci%n con alco0ol

/cido clo!0&d!ico e!maneciendo de colo! fucsia, en cam$io las ot!as $acte!ias ie!den la

colo!aci%n( Al usa!se el a?ul de metileno como colo!ante de cont!aste *stas se colo!an de a?ul(

INS1RUCCIONES

4()!ea!a! e.tendidos de los mic!oo!#anismos a estudia!(

5(ija! con calo!(

6(Cu$!i! todo el o!ta con fucsina b7sica 'enolada Ecarbol'ucsinaF

7(Calenta! 0asta emisi%n de "ao!es + se#ui! dic0o calentamiento du!ante 5 minutos

m/s( Si se seca al#una a!te del o!ta

o$jeto, a#!e#a! el colo!ante so$!e el

!ee.istente + no so$!e la a!te seca,0asta cu$!i!lo nue"amente(

8(La"a! con a#ua(

9(Decolo!a! con alcool<7cido 0asta 'ue no se

des!enda m/s colo!ante(

:(La"a! con a#ua(

;(Cu$!i! el e.tendido con aul de metileno& Deja! en contacto du!ante 6= se#undos(





<(La"a! con a#ua( Seca!(

4=(O$se!"a! con o$jeti"o de inme!si%n(

A la o$se!"aci%n en el mic!oscoio seo$se!"a teFido de colo! a?ul todas las

c*lulas 'ue co!!esonden a tejido eitelial, si

la muest!a !ocede de esuto( )e!o el

$acilo acido !esistente se !esenta de un

colo! fucsia, manteniendo el colo!ante

!ima!io, tal como se muest!a en la

si#uiente l/mina(

)RE)ARACION DE COLORAN1ES

8olución de Giel Eucsina 'enicadaF

4( ucsina $/sica =(6 #

Alco0ol et&lico 4= ml(

5( enol 8 #

A#ua destilada <8 ml(

Me?cla! soluciones 4 + 5(

"lcool 7cido

CI 2densidad 4(4<3 6 ml(

Alco0ol et&lico <: ml(

8olución de aul de metileno A?ul de metileno 4(7 #

A#ua destilada 4== ml(





!R"C#$C" %ro& +

COLORACIJN DE ES)ORAS, 1INCIJN NEGA1IA

Coloración de esporas

OBE1IO

Esta t*cnica e!mite distin#ui! las eso!as, del cue!o "e#etati"o delmic!oo!#anismo, como as&

tam$i*n "e! su locali?aci%n + fo!ma(

INS1RUCCIONES

4( )!ea!e un e.tendido del mic!oo!#anismo(

5( ija! o! calo! + cu$!i! todo el o!tao$jeto con una soluci%n de e!de de mala'uita(

6( Calenta! 0asta emisi%n de "ao!es + se#ui! dic0o calentamiento du!ante 6minutos

2no e!miti! 'ue se se'ue el colo!ante( Si esto ocu!!ie!a, a#!e#a!colo!ante, so$!e el

!ee.istente + no so$!e la a!te seca, 0asta cu$!i!lonue"amente(3

7( La"a! con a#ua + cu$!i! con soluci%n de Saf!anina(Deja! actua! 6= se#undos(

8( La"a! con a#ua, seca! + o$se!"a! con

o$jeti"o de inme!si%n(

9( lnfo!ma! mo!folo#&a, colo! + tio de

eso!a(

8olución de ;erde de Malaquita&

e!de de Mala'uita al 8 > en a#ua destilada(

Soluci%n de Saf!anina

Saf!anina =(8 #( en a#ua destilada(




Lab. Microbiología - Guía Práctica de BacteriologíaOscar D. Orós B.#inción negati)a

Es un m*todo de colo!aci%n sencillo, se uede emlea! a!a un f!otis di!ecto de la muest!a cl&nica

en caso de no conta! con la $ate!&a de colo!aci%n G!am esto uede e"idencia! solo si se t!ata de

cocos o $acilos( 1am$i*n se uede emlea! a!a la !ue$a de motilidad en o!ta o$jetos(

INS1RUCCIONES

4( Coloca! una e'ueFa #ota de tinta c0ina en la a!te cent!al del o!tao$jetos(

5( Utili?ando el asa de Holle, coloca! una #ota de la susensi%n de mic!oo!#anismos so$!e la

tinta c0ina(

6( Coloca! so$!e el !ea!ado un cu$!eo$jeto a!a 'ue se fo!me un film 2tintaculti"o3(

7( O$se!"a! con o$jeti"o de inme!si%n(





!R"C#$C" %ro& ,

RECUEN1O 1O1AL DE BAC1ERIAS AEROBIAS MESOILAS(

Recuento *st7ndar en !laca ER*!F: tam$i*n conocido como !ecuento de ae!o$ios

mes%filos, es el an/lisis di!ecto ma+o!mente emleado a!a dete!mina! la calidad

mic!o$iol%#ica de la lec0e + ot!os alimentos(

0*#$;8

El o$jeti"o de !eali?a! este an/lisis es conoce! el n-me!o de mic!oo!#anismos

ae!o$ios mes%filos 'ue contiene un alimento(

Conoce! el #!ado de contaminaci%n $acte!iana, siendo indicado! de la osi$le

!esencias de mic!oo!#anismos at%#enos

Se alica a todos los alimentos con e.ceci%n de los !oductos fe!mentados o

madu!ados tales como 'ueso, cie!tos tios de em$utidos, +o#u!t, etc(

$M!R#"%C$"

Los !esultados de este an/lisis e!miten "e!ifica! la efecti"idad de los !ocedimientos de

limie?a + desinfecci%n(

Dete!mina! si las teme!atu!as alicadas en los !ocesos fue!on las adecuadas(

Dete!mina! el o!i#en de la contaminaci%n du!ante los !ocesos de ela$o!aci%n de

los alimentos( e!ifica! condiciones %timas de almacenamiento + t!anso!te(

O$tene! info!maci%n ace!ca de la "ida -til de los alimentos(

M"#*R$"L*8

- Autocla"e(


- Balan?a de !ecisi%n(





- Mec0e!o Bun?en(

- Asa de Holle(

- Es/tula de D!i#alsH+


- Mo!te!o + istilo(

- G!adilla + canastillas

- Cuenta colonia(


- 1u$os de ensa+o(


- )lacas et!i(

- Medio de culti"o(

M*#9L>?"

A( )RE)ARACIJN Y DILUCIJN DE LA MUES1RA(

En un mo!te!o est*!il esa! un #!amo de muest!a, adiciona! <ml( De a#ua etonada a!a

o$tene! la diluci%n 4 4= ml(

)ietea! 4 ml( De la diluci%n ante!io! + t!as"asa!lo a ot!o tu$ode ensa+o 'ue conten#a < ml( de

a#ua etonada( )!ose#ui! 0asta o$tene! la diluci%n 4 4======

B( SIEMBRA(

4( MV1ODO S1ANDARD DE RECUEN1O EN )LACA )OR SIEMBRA EN )ROUNDIDAD(

)ietea! en lacas et!i 4 ml( De las diluciones efectuadas en el unto A(




Lab. Microbiología - Guía Práctica de BacteriologíaOscar D. Orós B. Inmediatamente "e!te! en las lacas inoculadas 4= a 48 ml( De a#a! Est/nda! fundido + temlado

a 78KC(

Me?cla! el inoculo de siem$!a con el medio de culti"o

Una "e? solidificado el a#a! in"e!ti! las lacas e incu$a!las a 68 KC du!ante 57 a 7; 0o!as(

Utili?ando el contado! de colonias, + el disositi"o de !e#ist!o autom/tico, conta! todas las

colonias en las lacas 'ue !esenten 6=6== colonias(

5( MV1ODO DE RECUEN1O EN )LACA DE SIEMBRA )OR EX1ENSIJN EN

SU)ERICIE(

AFadi! a cada laca 48 ml de a#a! a!a !ecuento + enf!ia!los a 78 a 9=KC + deja!

solidifica!(

Utili?ando una -nica ieta, toma! =(4 ml( de cada una de la diluciones a ensa+a!, +

deosita!lo en la sue!ficie del a#a! 25lacas o! diluci%n3( Comen?a! o! la diluci%n

m/s $aja, llenando + "aciando la ieta 6 "eces antes de t!ansfe!i! =(4 ml a la laca(

E.tende! las al&cuotas de =(4 ml( !onto desu*s de deosita!las so$!e la sue!ficie del

a#a! 2es/tula de D!i#alsH+3, deja! seca! la sue!ficie del a#a! du!ante 48minutos(

Incu$a! las lacas in"e!tidas o! t!es d&as a 68 KC (

Conta! todas las colonias en las lacas 'ue !esenten ent!e 6= + 6== colonias(





- !R"C#$C" %ro1.

- R*C*%# 9* CL$RM*8: 9*#*RM$%"C$A% 9*L %M*R M"8 !R0"0L* E%M!F&

- El emleo de colifo!mes como indicado!es de o!#anismos at%#enos en el a#ua es una

!/ctica "i#ente en la actualidad( Las $acte!ias Colifo!mes, com!enden la E. Coli + Enterobacter

aerogenes. Am$os o!#anismos son $acilos co!tos, #!amne#ati"os 'ue fe!mentan la lactosa con

!oducci%n #as( E. Coli tiene su locali?aci%n !ima!ia en el t!acto intestinal del 0om$!e + de los

animales, + de all& su nom$!e Coli, 'ue de!i"a del colon( E. Coli se encuent!a no!malmente en

el t!acto #ast!ointestinal de los animales, donde no suele causa! enfe!medad(

- Los o!#anismos colifo!mes son $uenos indicado!es de la calidad 0i#i*nica de los

alimentos, se $asa en la e.e!iencia ositi"a ad'ui!ida en el a#ua( El 0alla?#o de #!an n-me!o

de o!#anismos en los alimentos + en el a#ua indica la oluci%n o contaminaci%n fecal( Ya 'ue

las enfe!medades t!ansmitidas o! el a#ua #ene!almente son de ca!/cte! intestinal, la !esencia

de oluci%n indica la osi$i lidad de 'ue e.istan a#entes etiol%#icos !oducto!es de

enfe!medades #ast!ointestinales(

-

0*#$;8

Estima! el n-me!o de mic!oo!#anismos 2colifo!mes3 !esentes en muest!as de alimentos

l&'uidos o el a#ua(

Conoce! la metodolo#&a del NM) colifo!mes como, indicado! de contaminaci%n de los

dife!entes alimentos(

Dete!mina! la !esencia de colifo!mes, !ocesando t!es diluciones !oo!cionales se!iadas,sem$!adas en < tu$os con el medio adecuado a!a coma!a! con la ta$la est/nda!(

- $M!R#"%C$"

- Los !esultados de este an/lisis e!miten

Re"ela! el &ndice de contaminaci%n fecal, !o"eniente de 0eces del 0om$!e + animales

de san#!e caliente(

Conoce! 'ue la !esencia de colifo!mes es indicado! de 'ue ueda e.isti! la !esencia de





at%#enos como salmonelas + E.coli ente!oti.i#*nica(

Dete!mina! el o!i#en de la contaminaci%n du!ante los !ocesos de ela$o!aci%n de los alimentos(

- M"#*R$"L*8

- Autocla"e(


- Balan?a anal&tica(

-

Mec0e!o Bun?en(

- Asa de colle(





- Camanas Du!0am(

- 1u$os de ensa+o(


- )lacas et!i(

- Medios de culti"o(

- M*#9L>?"

4( )!ea!a! las muest!as de alimento 0asta la o$tenci%n de las diluciones(

5( )ietea! 4 ml( De cada uno de las diluciones del 0omo#eni?ado del alimento en tu$oscon medio de culti"o 2t!es tu$os o! diluci%n3(




Lab. Microbiología - Guía Práctica de BacteriologíaOscar D. Orós B.6( Incu$a! los tu$os a 68KC du!ante 57 a 7; 0o!as(

7( )asadas las 57 0o!as, anota! los tu$os 'ue muest!en !oducci%n de #as( ol"e! a la

estufa los tu$os #as ne#ati"os a!a su incu$aci%ndu!ante 57 0o!as m/s(

8(

)asadas las 7; 0o!as, anota! los

tu$os 'ue muest!en !oducci%n de

#as(

9( Ele#i! la diluci%n m/s alta 2ositi"os a #as3, los t!es tu$os + las dos diluciones sue!io!es

m/s !%.imas( Si no fuese facti$le selecciona!las t!es -ltimas diluciones + anota! el

n-me!o de tu$os ositi"os encada una(

:( Confi!ma! 'ue los tu$os inoculados + seleccionados, sean ositi"os a colifo!mes,

t!ansfi!iendo un asa de cada tu$o a alacas de a#a! eosina a?ul de metileno 2EMB3,

ENDO o McConHe+, o$se!"a! colonias t&icas de colifo!mes desu*s de 57 a 7; 0o!as

de incu$aci%n a 6:KC(

-

-

-

-

-




Lab. Microbiología - Guía Práctica de BacteriologíaOscar D. Orós B.-

-

-

-

-

-

-

-

-

;( )a!a o$tene! e l NM), "e! en cada una de las t!es di luc ionesseleccionadas el

n-me!o de tu$os en los 'ue se confi!mo la !esencia de colifo!mes( Busca! en la ta$la del

NM)(

-

)a!a

o$tene! el N-me!o M/s )!o$a$le 2NM)3 e! en cada una

de las 6 diluciones seleccionadas, el n-me!o de tu$os en los 'ue se dete!min% la !esencia de conifo!mes !e"ia

confi!maci%n( Busca! en la ta$la del NM) + anota! el NM) 'ue co!!esonda al n-me!o de tu$os ositi"os de cada

diluci%n( As& si como ejemlo tenemos una lectu!a 6, 4, =, la ta$la indica 'ue este !esultado si#nifica un NM) de 764==

ml(

-

- )a!a o$tene! el NM) de conifo!mes o! #!amo de alimento se utili?a la si#uiente fo!mula





- NM) de la ta$la X El facto! de diluci%n inte!medio NM) #(

- 4==

-

Si el facto! de diluci%n inte!medio emleado a!a la !ue$a es 4 4==, 4 4===, + 4 4====

- Entonces se !eemla?a la fo!mula de la si#uiente mane!a

- 76 X 4,=== 76= colifo!mes o! #!amo

- 4==

- #"0L" %M!- I ndi ce de l NMP y l ím it es de conf ianza 95% para va ri as comb i nac iones de resu l tados

posi t ivos y negat ivos cuando se ut i l izan t res al ícuotas de 1 ml ! " t res de 1 ml ! " y ot ras t res de "1ml!-

- N#mero de tubos posi t ivos del total de$ - Indice de lNMP por 1 ml!

- imites de conf ianza 95%

- > tubosJ= ml.

- > tubosJ ml.

- > tubosJ=. ml.

- - Infer ior - &uperior

- -

-1

- 1- 1- 1- 1- '- '- '- '- '

-'

- (- (- (- (- (- (- (- (- (- (

-(

- (

- - 1

-

- - 1- 1- '- - - 1- 1- '

-'

- - - - 1- 1- 1- '- '- '- (

-(

- (

- 1-

-

- 1- - 1- - - 1- - 1-

-1

- - 1- '- - 1- '- - 1- '-

-1

- '

- (- (

-)

- *- *- 11- 11- 9

- 1)- 15- '- '1

-'+

- '(- (9- ,)- )(- *5

- 1'- 9(

- 15- '1- ')

-),

- 11

- !5- !5

-!5

- 1- 1- (- (- 1- (- (- *- )

-1

- )- *

- 15- *

- 1)- (- 15- (- (5- (,

-*1

- 15

- 9- 1(

-'

- '1- '(- (,- (,- (,- (*- ))- +9- )*

-15

- 1'- 1(- (+- '1- '(- (+- (+- ))- )*

- 1(

-')

- )+




Lab. Microbiología - Guía Práctica de BacteriologíaOscar D. Orós B.- Fuente: F.S. Thatcher y D.S. Clark 1972





- !R"C#$C" %ro 11

- IDEN1IICACIJN DE COCOS GRAM )OSI1IOS(

- No!malmente se encuent!an Sta0+lococcus at%#enos en !ocesos +o#enos, en

todas las esecies animales + en /ja!os( Ellos son f!ecuentemente aislados de

seticemias en animales, as& como de los casos de a!t!itis + mastitis( No!malmente se

encuent!an at%#enos en las sue!ficies de la iel + en la na!i? de e!sonas sanas + al#unas

esecies animales(

- Culti)o

- Los estafilococos at%#enas c!ecen efica?mente $ajo condiciones ae!%$icas en la ma+o!&a

de los medios $acte!iol%#icos usuales de e.t!acto de ca!ne + etona, e!o lo 0acen de mane!a

mas !ofusa en a#a! san#!e 'ue se usa o! lo com-n a!a aisla! fo!mas( Estos c!ecen

!/idamente a 6:KC e!o tienden a fo!ma! i#mentos mejo! a teme!atu!a am$iente 25=KC3(

Las colonias en medio s%lido son !edondeadas, unifo!mes, so$!esalientes + !eslandecientes(

)ueden fo!ma! "a!ios tios de i#mentos Sta!#ylococcusaureus!esenta un colo! ama!illo o!o

intenso S e!i"ermis es de colo! $lanco o!celana tam$i*n ueden o$se!"a!se colo!aciones

inte!medias( Muc0as colonias desa!!ollan i#mentos solo desu*s de una !olon#ada

incu$aci%n a 5=KC(

- En #ene!al las ceas !eci*n aisladas de S( aeureusson las mase.i#entes en sus

necesidades alimenticias los "iejos culti"os de la$o!ato!io + S( e!i"ermis lo son menos(

- EL AISLAMIEN1O E IDEN1IICACIJN DE ES1RE)1OCOCOS Los est!etococos son

uno de los #!uos m/s imo!tantes de o!#anismos 'ue son at%#enos a!a los animales +

0om$!e( Las esecies dom*sticas adecen de est!etococosis 'ue "a!ia desde lesiones

suu!ati"as locali?adas, mastitis, menin#itis, a!t!itis + seticemias( Ellos tam$i*n ueden aisla!se

de la na!i?, #a!#anta, iel + ca"idad $ucal de animales sanos(

- EL AISLAMIEN1O

- El culti"o de muest!as !o"enientes de lesiones suu!ati"as locales, o del 0&#ado, $a?o,

#l/ndula linf/tica, !iF%n, fluido ce!e$!oesinal + san#!e as&como en condiciones delseticemia, en a#a! san#!e + a#a! MacConHe+( 1am$i*n es aconseja$le inocula! en caldo de




Lab. Microbiología - Guía Práctica de BacteriologíaOscar D. Orós B.sue!o o caldo de 1oddeQittal mismo tiemo( Se incu$a a 6:KC( La incu$aci%n anae!o$io

mejo!a acti"idad 0emol&tica(

- IDEN1IICACIJN

- Las ca!acte!&sticas cultu!ales En a#a! san#!e de o"eja fo!man las colonias e'ueFas,

ele"adas, semit!ansl-cidas desu*s de 57 0o!as( Ellos ueden se! alfa 0emol&ticas o $eta,

culti"os !ecientes uede se! los mucoides si los cocos !esentan una c/sula(

- Ca!acte!&sticas $io'u&micas 'ue Ellos son los llamados catalasane#ati"os +

o.idasane#ati"o( Ellos fe!mentan los a?-ca!es e!o no !oducen #as(

- 0*#$;8

Desc!i$i! las ca!acte!&sticas mic!osc%icas cultu!ales + $io'u&micas'ue e!miten ejecuta! el

aislamiento + la dife!enciaci%n ent!eSta0+lococcusau!eus + los estafilococos coa#ulasa

ne#ati"a(

Selecciona! los medios de culti"o emleados a!a lle"a! a ca$o ladetecci%n de los

estafilococos(

Ele#i!, lee! e inte!!eta! las !ue$as 'ue e!miten identifica! a losestafilococos(

Desc!i$i! los fundamentos, t*cnicas + limitaciones de lasmetodolo#&as asociadas a la

detecci%n de los estafilococos en lasmuest!as cl&nicas(

- $M!R#"%C$"

- Los !esultados de este an/lisis e!miten identifica! al a#ente causal de la enfe!medad mate!ia de

an/lisis de la$o!ato!io(

- M"#*R$"L*8

- Autocla"e(






Lab. Microbiología - Guía Práctica de BacteriologíaOscar D. Orós B.- Mec0e!o Bun?en(

- Asa de colle(


- )ieta #!aduada de 8 4= mi


- Mat!a? de E!l+nMe+e!(

- Camanas Du!0am(

- )!o$eta #!aduada de 4== mi(

- )lacas et!i(


- Muest!as cl&nicas(

- Bate!&a de colo!aci%n G!am

- ME1ODOLOGZA

4( )on#a a alcance los mate!iales + muest!as junto al mec0e!o(

5( )!ea!e la muest!a a sem$!a! con est!icta asesia(

6( 1ome un 0isoo o asa de Holle

7( Reti!e todo tio de !otecci%n de las muest!as o$tenidas(

8( Con el mec0e!o de Bunsen encendido + !esetando el ma!#en deeste!ilidad inocule con el

0isoo o asa el mate!ial, en una laca con a#a!san#!e + a#a! S44=, emleando la t*cnica de

est!iaci%n(

9( @ueme su 0isoo a!a 'ue no sea nue"amente utili?ado





:( Incu$e a 6:KCdu!ante 57 0o!as(

;( 1!anscu!!ido las 57 0o!as, sa'ue las cajas de la incu$ado!a + encienda elmec0e!o, a!a

!eali?a! el !ei'ue co!!esondiente en a#a! san#!e(

<( a#a un f!otis de las colonias 'ue c!ecie!on en

el a#a! san#!e

4=(1ina con la t*cnica de G!am

44( O$se!"e con aceite de inme!si%n el f!otis

45(De acue!do a lo o$se!"ado en cada uno delos f!otis !ealice las

!ue$asco!!esondientes(

- !R*0"8 0$H?M$C"8 8"9"8 *% L" $9*%#$$C"C$A% 9*CC@C*"8

- Catalasa

-

Este test $usca la !esencia de la en?ima catalasa'ue desdo$la el a#uao.i#enada en a#ua o.&#eno(Esta

en?ima la oseen los Sta!#ylococcus Micrococcus+

Listeria$ Nooseen catalasa los Stre!tococcus$Se coloca

una #ota de e!%.ido de 0id!%#eno so$!e un o!tao$jetos + lue#ose a#!e#a la colonia en estudio,

la aa!ici%n !/ida + mantenida de $u!$ujasindica 'ue el test es 23(

- Coagulasa

- Este test $usca la !esencia de la en?ima coa#ulasa!oducida o!

elSta!#ylococcusaureus$Esta en?ima es un acti"ado! del fi$!in%#eno, t!ansfo!m/ndolo en

fi$!ina( Laa!ed del Sta!#ylococcusaureusadem/s osee un !eceto! del fi$!in%#enolo 'ue

e!mite la fo!maci%n de uniones ent!e $acte!ia + $acte!ia, fo!m/ndoseun co/#ulo( )e!mite

dife!encia! los estafilococos coa#ulasa 23 de losestafilococos coa#ulasa23(Se !eali?a

usando de !efe!encia el lasma de conejo(

-





-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-





- !R"C#$C" %ro& 12

- IDEN1IICACION DE BACILOS GRAM )OSI1IOS

- IN1RODUCCION(

- El #!uo de $acilos anae!%$icos eso!ulados inclu+e di"e!sas fo!mas, al#unas de *stas son

at%#enas a!a el 0om$!e + animales( La ato#enicidad de estos $acilos se at!i$u+e m/s $ien a

la caacidad de fo!ma! otentes e.oto.inas( )o! tanto las infecciones o! anae!o$ios eso!ulados

no es com-n en ci!cunstancias o!dina!ias, +a 'ue en la ma+o! a!te de los casos 0a+ una lesi%n

t!aum/tica antes de la infecci%n(

- Dent!o de este #!an #!uo de mic!oo!#anismos se uede dife!encia! $acilos #!am ositi"os

anae!%$icos 'ue #ene!almente son miem$!os del #ene!o Clost!idium, + los del #!uo de ae!o$ios

son muc0os, dent!o de los cuales est/n el Gene!o Liste!ia, Lacto$acilos + Bacilus(

- 1odos los $acilos #!amositi"os anae!%$icos eso!ulados son o! definici%n miem$!os del

#*ne!o Clost!idium( Adem/s indica 'ue la !ue$a de la catalasa es -til a!a dife!encia! las

esecies de Clost!idium de las de Bacillus si las !ue$as de ae!otole!ancia !esultan dudosas(

- Los $acilos del #*ne!o Clost!idium, se encuent!an como comensales no!males de los

t!actos #ast!ointestinal, !esi!ato!io + u!o#enital del 0om$!e + los animales( Los Clost!idiums

tam$i*n se 0allan en m-ltiles su$st!atos como suelo, a#ua, a#uas !esiduales, lantas,

alimentos, etc(, como consecuencia de la contaminaci%n fecal(

- MUES1RAS(

- Las muest!as a!a esta !/ctica se ueden o$tene! de us, + l&'uidos de lesi%n local,

san#!e, esuto, incluso del suelo(

- CARAC1ERIS1ICAS CUL1URALES

- Dent!o del G*ne!o Clost!idium e.iste una "a!iedad de esecies dent!o de las cuales est/n

el Cl. perfringens, Cl. botulinum, Cl, sépticum, Cl. novy, Cl, tetani , etc( Estas difie!en

eno!memente en cuanto a sus ca!acte!&sticas cultu!ales( El asecto de las colonias de Cl.

perfringens en a#a! +ema de 0ue"o son e'ueFas, #lo$osas, t!asl-cidas, mucosas + 'ue!oducen oalescencia( En a#a!san#!e las colonias 'ue fo!man una fina el&cula !i?oide + con




Lab. Microbiología - Guía Práctica de BacteriologíaOscar D. Orós B.tendencia a !olife!a! en el medio son conside!adas como Clostridiumsépticum y

Clostridiumtétani + 'ue adem/s !oducen una disc!eta 0em%lisis en el medio(

- Las ca!acte!&sticas mo!fol%#icas a la colo!aci%n de G!am son el Clostridiumperfringens

en el f!otis demuest!an se! $acilos #!amositi"os #!uesos de $o!des !edondeados + de lon#itud

oco "a!ia$le( El Clostridiumtétani son $acilos #!amositi"os del#ados con una lon#itud "a!ia$le

en cu+os e.t!emos se encuent!a la eso!a

te!minal( El Clostridiumsépticum demuest!an se!

$acilos mu+ "a!ia$les en cuanto a sus

dimensiones + se colo!ean i!!e#ula!mente(

- OBE1IOS(

La !esente !/ctica tiene o! finalidad

0ace! 'ue los alumnos se familia!icen con la identificaci%n de los $acilos #!amositi"os(

Aisla! e identifica! miem$!os del G*ne!o Clost!idium + Bacillus a a!ti! de muest!as cl&nicas

+ su$st!atos(

Selecciona! los medios de culti"o emleados a!a lle"a! a ca$o la detecci%n de los Bacilos#!am ositi"os(

Ele#i!, lee! e inte!!eta! las !ue$as 'ue e!miten identifica! a los Clost!idios(

- MA1ERIALES(



- Mec0e!o Bun?en(

- Asa de Holle(



- Mat!a? de E!l+nMe+e!(




Lab. Microbiología - Guía Práctica de BacteriologíaOscar D. Orós B.- 1u$os de ensa+o(


- )lacas et!i(



- Bate!&a de colo!aci%n G!am

- ME1ODOLOGZA





8( Con el mec0e!o de Bun?en encendido + !esetando el ma!#en de este!ilidad inocule con el

0isoo o asa el mate!ial, en una laca con a#a! san#!e emleando la t*cnica de

a#otamiento o!est!&a(

9( @ueme su 0isoo a!a 'ue no sea

nue"amente utili?ado

:( Incu$e en ja!!as de anae!o$iosis a6:KCdu!ante 7; 0o!as(

;( 1!anscu!!ido las 7; 0o!as, sa'ue las lacas

et!i de la ja!!a de anae!o$iosis+ encienda el

mec0e!o, a!a !eali?a! el !ei'ue co!!esondiente nue"amente en a#a! san#!e(

<( a#a un f!otis de las colonias 'ue c!ecie!on en el a#a! san#!e







45(De acue!do a lo o$se!"ado en cada uno de los f!otis !ealice las !ue$as co!!esondientes(

)a!a la identificaci%n definiti"a

- 8e eecutaron las siguientes pruebas:

- IDROLISIS DE LA ESCULINA(

- )a!a esta !ue$a se uede utili?a! el medio $ase L !ecomendado a!a anae!o$ios o! el

C&!culo de Estudios e In"esti#aci%n Galeno 24<;;3, con la

adici%n de =(8> de esculina( La siem$!a se !eali?a

utili?ando el asa de Wolle, e incu$/ndolas a 6:oC du!ante 7;

0o!as en anae!o$iosis( Lue#o se !ocede a adiciona! 5 a 6

#otas de soluci%n de cit!ato f*!!ico amoniacal al 4>( La

!esencia de una colo!aci%n o$scu!a indica una !eacci%n

ositi"a(

- )RODUCCION DE INDOL(

- Dado 'ue el medio $ase L a!a anae!o$ios

contiene t!itona, se utili?a el !e/cti"o de Wo"ac 2ti!as de

ael3, el cual se int!oduce en los tu$os inoculados e

incu$ados( El "i!aje del !eacti"o a un colo! !osado, indicauna !eacci%n ositi"a(

- REDUCCION DE NI1RA1OS(

- )a!a la ejecuci%n de esta !ue$a se utili?% el caldo nit!ato 2CN3, la !ea!aci%n +

dist!i$uci%n de este medio fue si#uiendo la t*cnica dada o! el C&!culo de Estudios e

In"esti#aci%n Galeno 24<;;3( Lue#o de la inoculaci%n de las c*as en los tu$os se incu$a a 6: oC

du!ante 7; 0o!as, oste!io!mente se a#!e#a 5 #otas del !eacti"o A 2[3 + dos #otas del !eacti"o B

2[[3( La aa!ici%n de un colo! !ojo indica la !esencia de nit!itos, si no aa!ece el colo! !ojo "inosose a#!e#a mallas de ?inc, si 0u$ie!a nit!atos NO 6 en el medio este se!/ !educido a nit!itos +

aa!ece!/ el colo! !ojo "inoso, o! tanto la $acte!ia no 0a de#!adado el nit!ato( )o! el cont!a!io si

no aa!ece el colo! !ojo "inoso se de$e a la ausencia de nit!atos, es deci! 'ue la $acte!ia 0a

!educido 0asta N6 + N5(

-




Lab. Microbiología - Guía Práctica de BacteriologíaOscar D. Orós B.- [ Reacti"o A Acidosulfan&lico =(; #

- Acido ac*tico 28N3 4==(== ml(

- [[ Reacti"o B Alfa naftilamina =(9 #(

-

Acido ac*tico 28N3 4==(== ml(





- !R"C#$C" %ro& 13

- $9*%#$$C"C$% 9* CC8 >R"M %*>"#$;8

- La #ono!!ea es una enfe!medad de t!ansmisi%n se.ual 2E1S3, !o"ocada o! laNeisseriagonorrhoeae una $acte!ia 'ue uede c!ece! + multilica!se f/cilmente en /!eas

0-medas + ti$ias del t!acto !e!oducti"o, incluidos el cuello ute!ino 2la a$e!tu!a de la mat!i?3, el

-te!o + las t!omas de aloio 2tam$i*n llamadas o"iductos3 en la muje!, + en la u!et!a

2conducto u!ina!io3 en la muje! + en el 0om$!e( Esta $acte!ia tam$i*n uede c!ece! en la $oca, la

#a!#anta, los ojos + el ano(

- MOROLOGZA E IDEN1IICACIJN

- Los mic!oo!#anismos del #!uo Neisse!iason dilococos #!amne#ati"os, no m%tiles con

un di/met!o a!o.imado de =(; mic!%met!os, de mane!a indi"idual estos cocos tienen la

fo!ma de un !iF%n(

- CUL1IO

- A las 7; o!as de culti"o en medios en!i'uecidos 2Muelle!inton, medioS*lle!

Ma!tin + ot!os3 los #onococos + menin#ococos fo!man coloniasmucoides con"e.as,

!eslandecientes + ele"adas, con un di/met!o de 4 a8mm( La colo!aci%n deende de la esecie

"a!iando desde no i#mentadas,oacas 0asta ama!illas(Son ae!o$ios est!ictos e!o tam$i*n

!e'uie!en a!a su c!ecimiento un 8> deCO5 o mic!oae!ofilia(

- IDEN1IICACIJN

- La ma+o! a!te fe!mentan los ca!$o0id!atos + !oducen /cido, e!o no #as, tiene

!eacci%n o.idasa ositi"as(

- 0*#$;8

Desc!i$i! las ca!acte!&sticas mic!osc%icas cultu!ales + $io'u&micas'ue e!miten ejecuta!

el aislamiento + la dife!enciaci%n cocos #!amne#ati"os(

Selecciona! los medios de culti"o emleados a!a lle"a! a ca$o ladetecci%n de Neisse!ia(

Ele#i!, lee! e inte!!eta! las !ue$as 'ue e!miten identifica! a lasNeise!ias(




Lab. Microbiología - Guía Práctica de BacteriologíaOscar D. Orós B.- $M!R#"%C$"&

- Los !esultados de este an/lisis e!miten

Dete!mina! la !esencia de cocos #!am ne#ati"os eninfecciones #*nito u!ina!ias(

amilia!i?a!se con la identificaci%n de cocos #!am ne#ati"os(

- M"#*R$"L*8

- Autocla"e(


- Mec0e!o Bun?en(

- Asa de colle(

- )ieta #!aduada de 8 4= mi


- 1u$os de ensa+o(


- )lacas et!i(



- Bate!&a de colo!aci%n G!am(

- M*#9L>?"









8( Con el mec0e!o de Bunsen encendido + !esetando el ma!#en deeste!ilidad inocule con el0isoo o asa el mate!ial, en una laca con a#a! BI, Muelle!intons, a#a! san#!e,

emleando la t*cnica de est!iaci%n(

9( @ueme su 0isoo a!a 'ue no sea nue"amente utili?ado

:( Incu$e a 6:KC du!ante 7; 0o!as(

;( 1!anscu!!ido las 7; 0o!as, sa'ue lascajas de la incu$ado!a + encienda

elmec0e!o, a!a !eali?a! el !ei'ue

co!!esondiente en a#a! san#!e(

<( a#a un f!otis de las colonias 'ue

c!ecie!on en el a#a! san#!e(

4=( 1iFa con la t*cnica de G!am(


45(De acue!do a lo o$se!"ado en cada uno de los f!otis !ealice las !ue$asco!!esondientes(

- )RUEBAS COM)LEMEN1ARIAS(

)!ue$a de la o.idasa(

- Se !e'uie!e de discos im!e#nados con o.idasa, se 0umedecen estos con a#ua destilada

este!il, lue#o se colo#a so$!e una colonia sosec0osa, incu$a! a 68C o! 58 minutos, o$se!$a!

los cam$ios de colo! 'ue se !esenten(

- Las colonias o.idasa ositi"as toman un colo! !osado, desu*s ma!!on + finalmente

ne#!o(

- Las colonias o.idasa ne#ati"as no !oduce cam$io de colo! en las colonias o solo

ad'uie!e un li#e!o colo! !osado de$ido al !eacti"o(





e!mentaci%n de ca!$o0id!atos Lactosa, maltosa + suc!osa

- )a!a la !eali?aci%n de esta !ue$a se utili?a un medio $ase al cual se le adiciona el

ca!$o0id!ato a testa! 2Glucosa, saca!osa, etc(3( Una "e? inoculado la cea a testa! se lle$a a

incu$aci%n a 6:C o! 57 0o!as( La fe!mentaci%n del ca!$o0id!ato se e"idencia o! el #!ado de

tu!$ide? en el medio de culti"o ocasionado o! el c!ecimiento del #e!men(





- !R"C#$C" %ro& 14

- IDEN1IICACIJN DE BACILOS GRAMNEGA1IOS

- La familia de las ente!o$acte!iaceaeinclu+en muc0os #*ne!os como Esc0e!ic0ia,

S0i#ella, Salmonella, Ente!o$acte!, Wle$siella, Se!!atia + )!oteus( Al#unos mic!oo!#anismos

intestinales o! Ejemlo Esc0e!ic0iacoli son a!te de la mic!o$iota no!mal + !oducen de

mane!a accidental enfe!medad, en tanto 'ue ot!os como Salmonelas + S0i#elas son at%#enos

de mane!a !e#ula! a!a el 0om$!e + los animales(

- Escherichiacoli ( es causante de muc0as infecciones intestinales esecialmente

en neonatos de muc0os animales + es la causa de mo!talidad, as& como ente!oto.emias e

infecciones o! Escherichiacoli en ce!dos destetados ( En la alaca 0an sido o$se!"ados

cuad!os dia!!eicos en c!&as dent!o de sus dos !ime!os meses de "ida, de al#unos de estos

casos se aisla!on Escherichiacoli de 0eces dia!!eicas(

- MOROLOGZA E IDEN1IICACIJN

- Son #!amne#ati"os "a!iando desde fo!mas cocoides, $iola!es 0asta la!#os filamentosos,

f!ecuentemente se !esenta aislados e!o no son !a!as las cadenas co!tas, no !esentan

eso!as( Los $acilos son co!tos de =(8 um( de anc0o o! 4 6 um( de la!#o entendi*ndose

'ue se t!ata de $acilos del#ados( )e!o ot!os auto!es seFalan 'ue se t!ata de $acilos #!uesos +

'ue mide 4(8 . 7 um(

- CUL1IO

- Culti"os fecales en a#a! McConHe+ muest!an colonias ci!cula!es, con"e.as + lisas

con $o!des definidos de un colo! !osado( En a#a! eosina a?ul de metileno las colonias

!esentan cent!os enne#!ecidos con un $!illo met/lico ca!acte!&stico( Aa!te de las

ca!acte!&sticas mencionadas e.iste "a!iaciones de colonias lisas + !u#osas, + las ceas !eci*n

aisladas son #ene!almente lisas( El desa!!ollo en la ma+o!&a de los medios a!tificiales de culti"o

es !/ido + ueden aa!ece! so$!e ellos como colonias lisas, !u#osas % mucoides,

#ene!almente las colonias !u#osas no son at%#enas, a dife!encia de las colonias mucoides las

cuales est/n asociadas a !ocesos ente!oato#*nicos o setis*micos(





- En

medios

selecti"os como a#a! Salmonella S0i#uella 2SS3 el desa!!ollo de las colonias de Salmonella

son incolo!as con cent!o ne#!o de$ido a la !oducci%n de #as, 5S( Las esecies de S0i#uella

muest!an in0i$iciones "a!ia$les + sus colonias incolo!as no !esentan enne#!ecimiento( En

a#a! Xilosa Lisina Deso.icolato 2XLD3 la ma+o! a!te de las esecies de Salmonella+ A!i?ona

fo!man colonias !ojas, la ma+o!&a con cent!o ne#!o o! el #as, 5S( Los #*ne!os )!o"idencia +

S0i#uella + muc0as esecies de )!oteus no utili?an nin#-n 0id!ato de ca!$ono + fo!man colonias

t!asl-cidas(

- IDEN1IICACIJN Y DIERENCIACIJN

-

Se emlean $/sicamente los at!ones de !eacci%n $io'u&mica, los at!ones defe!mentaci%n de los ca!$o0id!atos + la acti"idad de las desca!$o.ilasas de los amino/cidos +

ot!as en?imas(

- 0*#$;8

46(Desc!i$i! las ca!acte!&sticas mic!osc%icas cultu!ales + $io'u&micas'ue e!miten ejecuta!

el aislamiento + la dife!enciaci%n $acilos #!amne#ati"os(

47(Selecciona! los medios de culti"o emleados a!a lle"a! a ca$o ladetecci%n de las

ente!o$acte!ias(

48(Ele#i!, lee! e inte!!eta! las !ue$as 'ue e!miten identifica! a lasente!o$acte!ias(

- IM)OR1ANCIA

K Los !esultados de este an/lisis e!miten

K Dete!mina! la !esencia de $acilos ne#ati"os en infecciones#ast!ointestinales(





K amilia!i?a!se con la identificaci%n de $acilos #!am ne#ati"os(

K Inte!!eta! las !ue$as $io'u&micas a!a la dife!enciaci%n delas ente!o$acte!ias + ot!os

$acilos #!am ne#ati"os(

- MA1ERIALES

- Autocla"e(

- Mic!oscoio(

- Este!eoscoio


- Mec0e!o Bun?en(

- Asa de Holle(

- )ieta #!aduada de 8 4= ml


- 1u$os de ensa+o(

- )lacas et!i(



- Bate!&a de colo!aci%n G!am(

- Laminas o!ta o$jetos(

- M*#9L>?"







6( 1ome un 0isoo o asa de colle


8( Con el mec0e!o Bun?en encendido + !esetando el ma!#en deeste!ilidad inocule con el0isoo o asa, el mate!ial, en una laca con a#a!McConHe+, EMB, SS a#a!, emleando la

t*cnica de a#otamiento enest!&as(

9( @ueme su 0isoo a!a 'ue no sea nue"amente

utili?ado

:( Incu$e a 6:KC du!ante 57 0o!as(

;( 1!anscu!!ido las 57 0o!as, sa'ue las lacas de la

incu$ado!a + enciendael mec0e!o, a!a !eali?a! el

!ei'ue co!!esondiente en a#a! McConHe+(

<( a#a un f!otis de las colonias 'ue c!ecie!on en el a#a! McConHe+(



45(De acue!do a lo o$se!"ado en cada uno de los f!otis

!ealice las !ue$asco!!esondientes(

- !R*0"8 CM!L*M*%#"R$"8&

- SIEMBRA EN AGAR 1RI)LE A\CAR IERRO 21SI3(

- Emleando el asade Holle se sem$!% en el fondo o!

icadu!a + en la sue!ficie en est!&a(La fe!mentaci%n de los ca!$o0id!atos se demuest!a o! el

"i!aje del colo!del medio de !oji?o a ama!illo la #lucosa en el fondo del tu$o, saca!osa enla a!te

inte!media + la lactosa en la sue!ficie(





-

- SIEMBRA EN AGAR CI1RA1O DE SIMMONS( Solo c!ecen en

este mediolos #*!menes 'ue utili?an el cit!ato como fuente de

ca!$ono( Seconside!an cit!ato 23 si no muest!an c!ecimiento

t!as 7 d&as de incu$aci%n(

-

-

- SIEMBRA EN CALDO O AGARUREA( Los mic!oo!#anismos

'ue tienen la en?imau!easa, desdo$lan la u!ea en amoniaco + en

an0&d!ido ca!$%nico, loscuales 0acen "i!a! el indicado! !ojo de

fenol al colo! !ojo ce!e?a(

-

- SIEMBRA EN LISINA DESCARBOXILASA AGAR( Las desca!$o.ilasas23 , 0acen "i!a! el

colo! al "ioleta(1am$i*n se lee la !educci%n

detiosulfato a sulfu!o de 0id!%#eno, !oduce

enne#!ecimientoo! la sal de e(

- )RODUCCION DE INDOL(

- )a!a esta !ue$a se utili?an medios de culti"o 'ue

conten#ant!itona o etona, lue#o de la incu$aci%n o! 57

0o!as, se emlea el !eacti"o de Wo"ac 2ti!as de ael3, el

cual se int!oduce en los tu$os inoculados El "i!aje del

!eacti"oa un colo! !osado, indica una !eacci%n ositi"a(

-





-

- BIBLIOGRAIA

4( AGUR1O SAEN 1( 4<<<( Manual de 1*cnicas en Mic!o$iolo#&a( Ausiciado o! el

consejo Nacional de Ciencia + 1ecnolo#&a(

5( CIRCULO DE ES1UDIOS E INES1IGACION GALENO( Medios de Culti"o en

Mic!o$iolo#&a( Manual de La$o!ato!io I + II a!te( U(N(M(S(M(, Lima 4<;;(

6( D(I((C(O( Manual de Bacte!iolo#&a( Edito!ial Mi!asa, Mad!id(4<:;(

7( !a?ie!, Q( 4<;8( Mic!o$iolo#&a de los Alimentos 6!a( Edici%n Edit( Ac!i$ia( a!a#o?a

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Latinoame!icana S(A( CU( M*.ico D((

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Guia Practicas Bacteriologia- Una 2009

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