FACULTAD DE CIENCIAS EN LA SALUD.LICENCIATURA EN LABORATORIO CLINICO

MANUAL DE DIAGNOSTICO

BACTERIOLOGICO.

INTRODUCCIÓN.

El presente Manual contiene los procedimientos de rutina en el Laboratorio de

Bacteriología, con el fin de conocer las vías bioquímicas y metabólicas que

sirven de base en las identificaciones bacterianas, a la vez se hace mención de

las normas de bioseguridad útiles para mantener la seguridad dentro del

laboratorio y de quienes laboran en el, así como también normas generales en

toma, manejo y envío de muestras para los diferentes análisis bacteriológicos, y

su respectivo control de calidad. Además está elaborado de tal manera que sea

aplicable al funcionamiento actual de los diferentes procedimientos de

laboratorio en Bacteriología.

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CONSIDERACIONES PARA SU PROTECCIÓN PERSONAL

Todas las muestras de especimenes biológicos deben considerarse

potencialmente infecciosas.

Vacunarse contra los principales agentes infecciosos.

Procurar no producir "salpicaduras" con la muestra obtenida. Debe limpiarse y

desinfectarse cualquier superficie contaminada por algún espécimen biológico.

Lavarse las manos correctamente, después de haber tenido contacto con cada

paciente y al concluir cualquier procedimiento.

No deben ingerirse comidas, bebidas, goma de mascar o fumar durante los

diferentes procedimientos en el Laboratorio.

Vigile que los elementos de trabajo estén en perfectas condiciones físicas. Algún

elemento en mal estado, podría causarle una herida.

ESTERILIZACIÓN

Proceso mediante el cual se eliminan todas las formas de vida de los

microorganismos de un objeto o de una sustancia para evitar su reproducción.

ASEPSIA: Libre de microorganismos.

MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN

Comprende todos los procedimientos físicos, mecánicos y preferentemente

químicos, que se emplean para destruir gérmenes patógenos. A través de esta,

los materiales quirúrgicos y la piel del enfermo alcanzan un estado de

desinfección que evita la contaminación operatoria. Hay varias formas de

esterilizar como:

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MÉTODOS QUÍMICOS

Estos métodos provocan la perdida de viabilidad de los microorganismos.

Hipoclorito de Sodio: Es el mas utilizado por su fácil adquisición y por su

efectividad en la desinfección. Vida media 20 minutos.

Oxido de etileno: Destruye todos los microorganismos incluso virus.

Aldehídos: Son agentes alquilantes que actúan sobre las proteínas. Estos

compuestos destruyen las esporas. Glutaraldehído: Este método tiene la ventaja

de ser rápido y ser el único esterilizante efectivo frío. Formaldehído: Las

pastillas de formalina a temperatura ambiente esterilizan en 36 horas. Gas-

plasma de Peróxido de Hidrógeno: Es proceso de esterilización a baja

temperatura la cual consta en la transmisión de peróxido de hidrógeno en fase

plasma.

Alcohol: Esteriliza superficies, pero se evapora fácilmente.

MÉTODOS FÍSICOS

Calor: La utilización de este método y su eficacia depende de dos factores: el

tiempo de exposición y la temperatura. Todos los microorganismos son

susceptibles, en distinto grado, a la acción del calor. El calor provoca

desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de las membranas y/o

procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos.

Calor Húmedo: El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de

proteínas.

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Autoclave

Se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión. El modelo más usado

es el de Chamberland. Esteriliza a 121º C, 15Lb de presión, por 20 minutos.

Calor seco: El calor seco produce desecación de la célula, es esto tóxico por

niveles elevados de electrolitos, fusión de membranas.

Estufas –Hornos

Doble cámara, el aire caliente generado por una resistencia, circula por la

cavidad principal y por el espacio entre ambas cámaras, a temperatura de 170º C

para el instrumental metálico y a 140º C para el contenido de los tambores.

NORMAS DE BIOSEGURIDAD

• Mantenga el lugar de trabajo en óptimas condiciones de higiene y aseo.

• Evite fumar, beber y comer cualquier alimento en el sitio de trabajo.

• NO SE DEBE UTILIZAR ELTELEFONO CELULAR DENTRO DE LAS

PRACTICAS DE LABORATORIO

• No guarde alimentos, en las neveras ni en los equipos de refrigeración de

sustancias contaminantes o químicos.

• Maneje todo paciente como potencialmente infectado. Las normas

universales deben aplicarse con todos los pacientes, independientemente

del diagnóstico, por lo que se hace innecesaria la clasificación específica

de sangre y otros líquidos corporales.

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• Lávese cuidadosamente las manos antes y después de cada

procedimiento e igualmente si se tiene contacto con material patógeno.

• Utilice en forma sistemática guantes plásticos o de látex en

procedimientos que con lleven manipulación de elementos biológicos

y/o cuando maneje instrumental o equipo contaminado en la atención de

pacientes.

• Utilice un par de guantes por paciente.

• Absténgase de tocar con las manos enguatadas alguna parte del cuerpo y

de manipular objetos diferentes a los requeridos durante el

procedimiento.

• Emplee mascarilla y protectores oculares durante procedimientos que

puedan generar salpicaduras góticas -aerosoles- de sangre u otros

líquidos corporales.

• Use batas o cubiertas plásticas en aquellos procedimientos en que se

esperen salpicaduras, aerosoles o derrames importantes de sangre u otros

líquidos orgánicos.

• Evite deambular con los elementos de protección personal por fuera de

su sitio de trabajo.

• Mantenga sus elementos de protección personal en óptimas condiciones

de aseo, en un lugar seguro y de fácil acceso.

• Evite la atención directa de pacientes si usted presenta lesiones

exudativas o dermatitis serosas, hasta tanto éstas hayan desaparecido.

• Las mujeres embarazadas que trabajen en ambientes hospitalarios

expuestas al riesgo biológico VIH/SIDA y/o Hepatitis B, deberán ser

muy estrictas en el cumplimiento de las precauciones universales y

cuando el caso lo amerite, se deben reubicar en áreas de menor riesgo.

• Aplique en todo procedimiento asistencial las normas de asepsia

necesarias.

• Utilice las técnicas correctas en la realización de todo procedimiento.

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• No cambie elementos cortopunzantes de un recipiente a otro.

• Absténgase de doblar o partir manualmente las hojas de bisturí, cuchillas,

agujas o cualquier otro material cortopunzante.

• Evite reutilizar el material contaminado como agujas, jeringas y hojas de

bisturí.

• Realice desinfección y limpieza a las superficies, elementos, equipos de

trabajo al final década procedimiento y al finalizar la jornada.

• En caso de derrame o contaminación accidental de sangre u otros

líquidos corporales sobre superficies de trabajo, cubra con papel u otro

material absorbente; luego vierta hipoclorito de sodio a 5.000 ppm (o

cualquier otro desinfectante indicado) sobre el mismo y sobre la

superficie circundante, dejando actuar durante 30 minutos; después

limpie nuevamente la superficie con desinfectante a la misma

concentración y realice limpieza con agua y jabón. El personal encargado

de realizar dicho procedimiento debe utilizar guantes, mascarilla y bata.

• En caso de ruptura de material de vidrio contaminado con sangre u otro

líquido corporal, los vidrios deben recogerse con escoba y recogedor,

nunca con las manos.

• Los recipientes para transporte de muestras deben ser de material

irrompible y cierre hermético. Deben tener preferiblemente el tapón de

rosca.

• Manipule, transporte y envíe las muestras disponiéndolas en recipientes

seguros, con tapa y debidamente rotuladas, empleando gradillas limpias

para su transporte. Las gradillas a su vez se transportarán en recipientes

herméticos de plásticos o acrílico que retengan fugas o derrames

accidentales. Además deben ser fácilmente lavables.

• En caso de contaminación externa accidental del recipiente, éste debe

lavarse con hipoclorito de sodio al 0.5% (5.000 ppm) y secarse.

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• Restrinja el ingreso a las áreas de alto riesgo biológico al personal no

autorizado, al que no utilice los elementos de protección personal

necesarios y a los niños.

• La ropa contaminada con sangre, líquidos corporales u otro material

orgánico debe ser enviada a la lavandería en bolsa plástica roja.

• Disponga el material patógeno en bolsas resistentes de color rojo que lo

identifique con símbolo de riesgo biológico.

• En caso de accidente de trabajo con material cortopunzante haga el

reporte inmediato de accidente de trabajo.

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GENERALIDADES

A. OBJETIVO GENERAL

Conocer las técnicas, procedimientos y controles que se desarrollan en el

área de bacteriología dentro de un Laboratorio Clínico.

B. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.

Verificar los controles de calidad que se llevan a cabo en el área de

bacteriología.

Conocer las normas de bioseguridad que se realizan en bacteriología.

Conocer el manejo y envío de muestras en el área de bacteriología.

Conocer los diferentes procedimientos que se realizan en la preparación

de medios de cultivo.

Conocer las diferentes técnicas bacteriológicas aplicables para la

identificación de cepas bacterianas.

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I- NORMAS GENERALES DE LA TOMA, MANEJO Y

ENVIÓ DE MUESTRAS PARA ANÁLISIS CLÍNICOS.

1. Los análisis clínicos se practicarán a los pacientes que sean referidos al

laboratorio, por el personal autorizado del Establecimiento.

2. Todo examen deberá ser solicitado en el formulario proporcionado por el

laboratorio, completando los siguientes datos:

Nombre del paciente, número de registro, edad, sexo, servicio que lo refiere,

sello del establecimiento, diagnóstico clínico, firma y nombre de quien lo

refiere y especificar si es de urgencia.

3. Todo paciente con solicitud de exámenes de Laboratorio, deberá

presentarse a éste para que se le de la orientación sobre la colección de la

muestra, la hora y la fecha en que se le recibirá. Estos datos deberán ser

anotados en la hoja de solicitud del examen y en el libro de citas del

laboratorio.

4. Toda solicitud de examen de Laboratorio, deberá revisarse confirmando los

datos requeridos y comparando los datos de identificación con la tarjeta del

expediente del paciente.

5. El Laboratorio Clínico de cada establecimiento para efecto de control de

exámenes llevará un libro de entrada en el que anotará el número

correlativo, fecha, nombre del paciente y análisis a realizarse.

6. Los tubos, láminas, cajas de petri y frascos utilizados para colectar las

muestras, deberán ser identificados inmediatamente después de tomadas o

recibida la muestra con el número correlativo de Laboratorio, nombre o

iniciales del paciente.

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7. Previo al envío de muestras a otro laboratorio debe hacerse contacto con

éste para notificar del envió y saber quien recibirá la muestra.

8. Toda muestra clínica que se envíe a otro laboratorio, debe ser transportada

en envases y condiciones que proporcionen la mayor seguridad para evitar

roturas, derramamientos de la misma o extravío.

9. En el transporte de la muestra se consideran tres aspectos importantes:

a) Protegerlas del calor excesivo.

b) Protegerlas de la luz solar.

c) Acondicionarlas en forma tal que no haya riesgo de derrame.

10. Para el envió de la muestra es conveniente disponer de cajas de madera

con tabiques interiores; si no se dispone de ellas se puede usar una caja

de cartón grueso en la que se anotará la dirección del Laboratorio al cual se

envía y se le marcarán flechas verticales indicado la posición en que debe

mantenerse. Cada envío deberá ir acompañado de la lista con la

identificación de cada muestra contenida en la caja.

RECEPCIÓN DE LA MUESTRA:

Comprobar que las muestras están bien identificadas y que correspondan a la

lista adjunta.

1. Si hay derrame del material, desinfectar el exterior del envase con algodón o

toallas de papel impregnado en fenol al 5 % u otra solución bactericida. Si se

comprueba derrame masivo esterilizar el envase por autoclave o

incineración

2. Notificar al servicio remitente las deficiencias que hubieren en la calidad y

cantidad de las muestras o en la forma en que se hizo el envío.

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ENVIÓ DE MUESTRAS AL LABORATORIO DE REFERENCIA.

ALMACENAMIENTO Y ENVIÓ:

1. Suero: Deben almacenarse entre- 20°C y/o 4°C y transportarse a iguales

temperaturas, evitando así el congelamiento y descongelamiento de las

mismas que dañaría a los microorganismos.

2. Deben hacerse: llegar al laboratorio con la mayor prontitud, y por la vía más

rápida, máximo una semana, además cada envío de muestra debe

acompañarse con la ficha epidemiológica correspondiente.

3. Sangre completa: Debe almacenarse a 4° C (refrigeradora) y enviarlas

rápidamente al laboratorio dentro de las 24 horas siguientes a la obtención

de la sangre. Nunca deben congelarse, pues se hemolizan, además siempre

deben ser acompañadas por su ficha epidemiológica correspondiente.

4. Empaque: Los métodos de empaque y envío deben garantizar protección

tanto a la muestra como al personal que las manipula.

5. Los sueros enviados estarán en tubos o viales perfectamente cerrados, las

tapas o tapones se aseguran bien con cinta adhesiva para que no se aflojen

con la vibración del transporte. Se pueden sujetar con una banda de goma y

colocar cada lote en un recipiente de plástico o en una pequeña bolsa del

mismo material, cada paquete se dispondrá verticalmente en una hielera

que contenga bloques refrigerantes.

6. Al enviar sangre completa debe evitarse el contacto de los bloques

refrigerantes o del hielo de agua con las paredes de los tubos, para que las

muestras no se hemolicen.

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NORMAS DE BACTERIOLOGÍA.

Siempre que sea posible, la muestra para cultivos tiene que ser recolectada

antes de la administración de antibióticos.

ORINA.

La muestra para cultivo de orina puede ser por cateterismo, punción

suprapúbica, muestra limpia o de medio chorro. Esta última exige las siguientes

condiciones:

a) Antes de tomar la muestra practicar un cuidadoso aseo de la zona genital

con agua y jabón.

b) Colectar la primera orina de la mañana o tener como mínimo 2 horas de

retención urinaria.

c) En un frasco estéril de boca ancha, tapón de rosca, transparente, recoger

una cantidad de 15 a 20 ml de orina medio chorro.

d) El tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y su proceso, no debe

exceder de 2 horas; sino se puede procesar al recibirla, se puede refrigerar

hasta por 12 horas.

SECRECIÓN URETRAL.

Toma de muestra: efectuar presión suave sobre la uretra, eliminar la secreción

luego exprimir desde atrás con fuerza y recoger la secreción con dos hisopos

estériles, 1 para el frotis y el otro para el cultivo (Thayer Martín o Agar

chocolate). Si la secreción es escasa introducir en la uretra un hisopo fino y

raspar la pared uretral con delicadeza. Hacer de inmediato el frotis para

coloración de Gram e inocular los medios de cultivo. Si se va a transportar

colocarlo en medio de transporte de Stuart , Amies o Cary Blair. Si no se puede

sembrar de inmediato hacer frotis y mantener el hisopo en un medio de

transporte.

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SECRECIÓN VAGINAL.

Toma de muestra: colocar a la paciente en posición ginecológica, introducir el

especulo, tomar la muestra con dos hisopos del endocervix y vagina; se

recomienda sea tomada por el médico. El hisopo debe estar estéril e

impregnado con solución salina fisiológica al 0.85% estéril. Hacer de inmediato

un frotis para coloración de Gram y hacer un examen directo al fresco,

colocando una gota de solución salina en un porta objetos y suspender en ella

la secreción vaginal; cubrir con el cubre objetos y buscar Trichomonas

vaginalis o levaduras. Si el examen al fresco no se puede hacer de inmediato

colocar el hisopo en 0.5 mL de solución salina, en refrigeración no más de 2

horas. En la coloración de Gram reportar Vaginosis bacteriana si hay

predominio de bacilos gram negativos.

HECES

La muestra debe tomarse en los tres primeros días de la enfermedad y antes de

comenzar el tratamiento antimicrobiano. En los lactantes lo indicado es el

hisopado rectal. Introducir el hisopo, ( previamente humedecido con solución

salina estéril ), dos o tres cms. en el ano imprimiéndole movimientos de

rotación amplia, pero con suavidad arrastrando mucosidad de la pared del

recto. En el adulto la muestra puede obtenerse del recipiente con heces o del

hisopo rectal. Las mejores muestras son aquellas diarreicas, con mucus, o con

sangre, la muestra debe ser de 1 a 2 gramos si es sólida y de 3 a 4 mL. si es

diarreica.

Si el cultivo se hace dentro de las dos horas después de tomada la muestra, no

se requiere medio de transporte. Pasado ese período se recomienda usar el

medio de transporte Cary & Blair, o el caldo de Selenito o Tioglicolato.

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SECRECIÓN FARINGEA.

La muestra debe tomarse de amígdalas y faringe, colocar al enfermo en

posición cómoda y buscando la mejor iluminación, pedir al paciente que

pronuncie la letra A, baje la lengua suavemente con un bajalengua, frote el

hisopo con firmeza pero con suavidad en ambas caras de las amígdalas y

luego en la pared posterior de la faringe de manera que el hisopo quede

impregnado de exudado faríngeo, evite tocar con el hisopo lengua y úvula.

Introducir el hisopo en 1mL. de medio de enriquecimiento, 0.5 mL de caldo de

tripticasa soya, infusión cerebro corazón, o sembrar de inmediato en agar

sangre y Mac Conkey. Si hay pseudomembrana hacer un frotis y colorear por

Gram para investigar difteria.

EXPECTORACIÓN.

Toma de muestra: el paciente debe efectuar repetidos enjuagatorios previos con

solución de bicarbonato de sodio o con solución salina estéril.

Tomar la primera expectoración de la mañana (este esputo debe ser purulento

no saliva). El frasco debe ser de boca ancha, con tapón de rosca y estéril, debe

taparse bien e identificarse correctamente. Enviarlo al Laboratorio

inmediatamente.

SECRECIÓN NASAL.

Introducir el hisopo con solución salina estéril profundamente en dirección

paralela al piso de la fosa nasal. Frotar suave y firmemente (1 minuto en cada

fosa nasal). Colocar el hisopo en 0.5 mL. de caldo de tripticasa soya o inocular

de inmediato en agar sangre y Mac Conkey.

SECRECIÓN OCULAR.

La muestra debe tomarse con cuidado y con la ayuda de otra persona para que

inmovilice la cabeza del paciente. Previa separación del párpado inferior con el

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pulgar de la otra mano, tomar con un hisopo de la secreción conjuntival dirigida

hacia el ángulo interno del ojo, rotar el hisopo suavemente (tomar 2 hisopos uno

para úlcera corneal) sembrar en el medio de agar sangre, Mac Conkey,

tioglicolato y también un tubo de sabouraud. En este caso es recomendable que

el oftalmólogo, con anestesia local tome la muestra con careta. Siempre hacer

examen directo.

SECRECIÓN OTICA.

Con dos hisopos colectar el pus del conducto auditivo externo. Hacer un frotis y

teñirlo con Gram e inocular en agar sangre, agar chocolate y agar Mac Conkey.

PUS DE HERIDAS.

En un absceso cerrado si el contenido es fluido extraer con jeringa, si el

absceso es abierto tomar con un hisopo o bisturí de las paredes internas y no

del centro: hacer frotis de inmediato y colocar los hisopos en medio de

tioglicolato.

LESIONES DE LA PIEL.

Lavar con agua, jabón y desinfectar con alcohol o yodo. Primero remover las

costras y la piel que cubre las pústulas o vesículas, frotar firmemente con

hisopo o bisturí dentro de la lesión. Si la lesión es seca usar hisopo húmedo y

colocarlo en caldo tioglicolato.

SANGRE.

Para la toma de muestra realizar aseo cuidadoso con jabón y agua después

aplicar tintura de yodo al 1% y luego limpiar con alcohol al 70%. Con jeringa

colectar 5 a 10 mL. y colocar en medio de cultivo líquido en volumen 10 veces

mayor.

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LÍQUIDOS CEFALORRAQUÍDEO Y OTROS

LÍQUIDOS DE DERRAME.

Este examen es uno de los de mayor urgencia dentro del Laboratorio

Bacteriológico, por lo cual debe examinarse sin demora ya que la enfermedad

es de evolución rápida y de alta mortalidad o de secuelas importantes. Es

básico la identificación del agente causal y su antibiograma. Se necesitan de 1

a 2 mL. de muestra en tubos de tapón de roscas estériles, enviarlos al

Laboratorio a temperatura ambiente: usualmente se toman 2 tubos uno para

bacteriología y otro para química. Si no es posible, primero procesar

bacteriología y luego remitirlo para química, la muestra debe guardarse en la

estufa a 35°C. hasta completar la rutina. Centrifugar la muestra y con el

sedimento inocular los medios de cultivo y hacer un frotis para Gram y una

preparación con tinta china.

1. PUS.

Si las lesiones son cerradas colectar en jeringa gruesa, previa asepsia con

yodo. Si las lesiones son abiertas, lavar primero con agua y jabón y colectar

con bisturí el pus del borde de las lesiones.

Colocarlo directamente en los medios de cultivo o en porta - objetos. Si el

pus es abundante colocarlo en un tubo estéril con tapón de rosca.

2. SECRECIONES.

Lavado bronquial, líquidos de derrame, LCR, médula ósea y biopsia. Serán

colectadas por el médico con estricta asepsia y colocadas en un tubo estéril

con tapón de rosca u otro recipiente estéril sin preservativo.

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Las muestras deben ser procesadas de inmediato y si no es posible,

guardarlas en refrigeración no más de 24 horas.

EXAMEN DIRECTO.

3. SECRECIONES VAGINALES, URETRALES Y ORALES.

Colocar una gota de secreción en un porta objeto y cubrir con laminilla-

examinar al microscopio. Es recomendable hacer simultáneamente un frotis

de la secreción y colorearla por Gram.

4. PUS Y MEDULA

Hacer un frotis delgado en un portaobjeto y colorearlo por Giemsa.

5. ESPUTO Y LAVADO BRONQUIAL.

Seleccionar las porciones purulentas y hacer frotis y colorear por Giemsa al

mismo tiempo hacer una preparación con KOH al 10 ó 20%.

6. LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO Y LÍQUIDOS DE DERRAME

Centrifugar la muestra a 3000 rpm. Por 15 minutos. Del sedimento tomar 1

gota pequeña y colocarla a la par de una gota de tinta china. Cubrir ambas

gotas con una laminilla para que se forme un gradiente de color negro.

Observar con el objetivo 10 x; si se ven círculos claros, contra fondo negro

observar con el 45x para apreciar la morfología. Además colocar una gota

del sedimento en un porta objeto y dejar secar. Colorear por Giemsa y

observar con objetivo de inmersión, esto para LCR. En caso de líquido

pleural y ascítico se agrega 3 gotas de citrato de sodio al 10% por cada 10

ml. Y se conserva en refrigeración si la muestra no se procesará

inmediatamente.

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7. BIOPSIA

Macerar el tejido con 1 mL. de solución salina en un mortero o con un

homogenizador estéril, preparar un frotis y colorear con Giemsa y hacer

preparación al fresco.

8. SANGRE

Colocar la sangre en un tubo de Wintrobe y centrifugar a 3000 rpm. Por 15

minutos. Con pipeta Pasteur descartar el plasma y tomar 1 gota de la capa

de leucocitos, preparar un frotis en un porta objetos y colorearlos por

Giemsa.

TOMA DE MUESTRA PARA LA IDENTIFICACION DE

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS.

Para que el Laboratorio pueda obtener resultados confiables, no solo es

necesario que ejecute las técnicas en forma correcta, sino que reciba una

buena muestra que provenga del sitio de la lesión a investigar y obtenida en

cantidad suficiente.

La muestra de mayor rendimiento para la baciloscopía es la expectoración,

especialmente de la mañana, proveniente del árbol bronquial, se le pide al

paciente que inspire profundamente, que retenga un instante el aire en sus

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pulmones y que lo expulse violentamente con un esfuerzo de tos hasta

obtener no menos de tres esputos.

Para el diagnóstico se requiere dos muestras: la primera se tomará en el

momento de la consulta, la segunda será recogida al despertar la persona

(matinal) previo aseo de la boca.

Para control de tratamiento: dos baciloscopías al segundo, cuarto y sexto mes

de tratamiento.

Para control post tratamiento: se deben realizar baciloscopías a los 12 y 24

meses de finalizado el tratamiento.

Al recibir la muestra se debe observar la cantidad y la calidad, tapar bien el

recipiente y marcarlos en el cuerpo del recipiente, no en la tapa.

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CONTROL DE CALIDAD.

1. ALMACENAMIENTO DE CULTIVO DESHIDRATADOS:

Los medios de cultivo deshidratados son higroscópicos y absorven agua del

exterior, (así como la formación de agua dentro de una botella) como

consecuencia de las fluctuaciones de temperatura en el ambiente. Además

favorecen el crecimiento bacteriano. Esto puede conducir al consumo de

nutrientes, variaciones de pH y cambios de color en el medio. También la

exposición a la luz puede llevar a cambios importantes o alteraciones en los

constituyentes del medio de cultivo.

Tomando en cuenta los factores antes señalados, los medios de cultivo

deshidratados deben almacenarse siempre en un lugar fresco, protegidos

contra la humedad y la luz. Cuando se requiera abrir un frasco, debe hacerse

en un lugar seco, utilizando condiciones de almacenamiento adecuadas, los

medios elaborados en forma de polvo tienen una vida útil de al menos un año y

los medios en forma granular tienen una duración de al menos tres años. Para

asegurarnos que un medio de cultivo está en buen estado, es conveniente

marcar cada frasco de medio con la fecha en que fue recibido y tomarse las

previsiones necesarias para que la existencia del mismo en bodega cubra las

necesidades del laboratorio por períodos de al menos seis meses. De esta

manera controlaremos su vida útil y evitaremos que se nos deterioren durante el

almacenamiento.

El material que ha sufrido cambios sustanciales, tales como hidratación y

endurecimiento, debe descartarse.

2. RECONSTITUCIÓN O REHIDRATACIÓN.

El grado de disolución del medio deshidratado, así como la eficacia del medio

de cultivo ya preparado dependen en gran medida del procedimiento empleado

en la rehidratación.

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Debe emplearse siempre agua recién destilada o completamente

desmineralizada y erlenmeyers con un volumen, al menos, dos veces mayor a

la cantidad de medio que se va a preparar. Siempre se agrega la cantidad

indicada de medio deshidratado a la mitad del volumen de agua requerido, se

mezcla vigorosamente hasta obtener una suspensión homogénea y luego, se

agrega el resto del agua asegurándose que cualquier partícula de medio

adherida a la pared del erlenmeyers sea lavada en el proceso.

Se ajusta el pH del medio al valor que establece la casa fabricante. Para este

propósito, se utilizan soluciones de NaOH y HCL 0.1 N y un potenciómetro

debidamente calibrado. En el caso que no se disponga de éste y para medios

que no tengan colorantes o indicadores pueden utilizarse las tiras del pH.

Si un medio de cultivo contiene Agar, gelatina o cistina, es indispensable

calentarlo en un baño de agua hirviendo y agitarlo frecuentemente hasta lograr

su disolución completa. Esta se logra cuando no se observen partículas

adheridas a la pared del erlenmeyer y el medio disuelto se observe homogéneo.

Una vez logrado el propósito anterior, debe suspenderse el calentamiento, ya

que un exceso del mismo puede ocasionar deterioro de algunos constituyentes

del medio, tornándolo inadecuado.

Si el medio debe ser distribuido en tubos (TSI, Citrato, etc.) debe agitarse

frecuentemente para asegurar una distribución homogénea del mismo en cada

tubo. Los medios que no contienen agar, gelatina o cistina se solubilizan sin

necesidad de calentarlos.

3. ESTERILIZACIÓN.

El medio de cultivo una vez disuelto (y distribuido en tubos si fuera necesario)

debe someterse al proceso de esterilización, excepto aquellos que no lo

requieran (agar SS, por ejemplo).

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Deben seguirse las instrucciones en cuanto a tiempo y temperatura para

asegurarse la obtención de medios de cultivo útiles. Debe tenerse en mente que

la presión varía de acuerdo con la altura y por tanto no es un factor constante.

De tal manera que son el tiempo y la temperatura los parámetros que deben

tomarse en consideración en el proceso de autoclavado.

4. DISTRIBUCIÓN DEL MEDIO EN PLACAS.

El medio esterilizando debe enfriarse a 45°- 50°C en un baño maría ajustado a

esa temperatura para evitar la formación de agua de condensación. Debe ser

vertido en las placas evitando la formación de burbujas. En caso de que éstas

se presenten, pueden ser eliminadas por calentamiento en la superficie del

medio con ayuda de la llama del mechero. Durante el vaciado los componentes

del medio deben estar distribuidos uniformemente, por lo que es necesario

agitarlo con frecuencia. Si el medio de cultivo se ha enfriado a 45-50°C, el agua

de condensación que pueda formarse en las placas será poca y por tanto,

pueden mantenerse cerradas para evitar contaminación.

Debe guardarse una pequeña cantidad del medio para determinar el pH

después de autoclavado. Si el valor no es el indicado para el medio, descártelo.

5. PRUEBA DE ESTERILIDAD.

Para cada lote que se prepare debe tomarse una muestra de un 10% y

someterla a control de esterilidad a 35°C por 24 horas. Este procedimiento dará

una idea sobre la contaminación obtenida en la preparación del medio.

Esto a su vez permitirá determinar si se deben tomar medidas más rigurosas en

la limpieza y desinfectación del sitio en que se preparan los medios de cultivo y

en el procedimiento de distribución del medio.

6. ALMACENAMIENTO DEL MEDIO PREPARADO.

El medio de cultivo reconstituido tiene una vida útil limitada. Si no se emplea de

inmediato, debe almacenarse bajo condiciones apropiadas para garantizar su

utilidad durante un período de tiempo.

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El almacenamiento a 4°C es el mejor para la mayoría de los medios. Sin

embargo, aquellos que contienen tioglicolato es indispensable mantenerlos a

temperatura ambiente para que mantengan su viabilidad.

Los medios deben mantenerse en sitios oscuros, ya que la luz puede afectar

algunos de sus componentes. Para evitar la desecación los medios pueden

guardarse en bolsas plásticas bien cerradas. Las placas de petri almacenadas

de esta forma deben colocarse con el fondo hacia arriba.

Dado que los medios almacenados en refrigeración cuando pasan a

temperatura ambiente tienden a formar agua de condensación en la

superficie, se recomienda poner las placas en el incubador a 35°C por un

período de dos horas, colocándolas con el fondo hacia arriba. De esta manera

se obtendrá una superficie seca.

CONTROL DE CALIDAD EN TINCIONES Y PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN.

Para determinar que los reactivos empleados tanto en tinciones como en

pruebas de identificación bacteriana funcionen adecuadamente, deben

utilizarse bacterias que muestren las diferentes características distintivas para

cada prueba o tinción.

Para ello, deben hacerse controles diarios con las cepas bacterias de referencia

y seguir estrictamente las indicaciones en cuanto al almacenamiento de

reactivos, inoculación de medios, períodos de incubación, metodología para

efectuar las pruebas y tiempo de lectura de las mismas.

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PRACTICA No.1

PREPARACION DE MEDIO DE CULTIVO.

PRACTICA No.1

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO.

Los medios de cultivo usados en Bacteriología contienen los nutrientes y factores

físicos y químicos (pH, concentración de iones), necesarios para la reproducción

bacteriana. Existe una gran variedad de medios de cultivo. Los medios líquidos permiten

la proliferación bacteriana por todo el medio, son de fácil manejo. Los medios sólidos

permiten el crecimiento aislado de grupos de bacterias (colonias) cuyas características

macroscópicas sirven de guía para la identificación de ciertas bacterias.

COMPETENCIA.

Preparar adecuadamente, medios de cultivos líquidos y sólidos, a partir de medios

deshidratados, siguiendo las instrucciones correspondientes.

MATERIAL.

• Caldo tripticasa soya o caldo tioglicolato

• Agar tripticasa soya deshidratado

• Soporte con maya metálica

• Frascos Erlenmeyer o balones volumétricos con apon de algodón o gasa

• Cajas de petri

• Bajalenguas de madera

• Balanza

• Agua destilada

• Probetas tubos de ensayo

25

• Olla de presiona

• Mecheros

PROCEDIMIENTO.

MEDIO DE CULTIVO LIQUIDO

1. se pesa el CTS sobre una balanza granataria (calibrada previamente). Se

observan las especificaciones en el frasco.

2. el CTS debe ser pesado sobre un papel especial para que no haga contacto con la

superficie de la balanza.

3. colocar 50 ml de agua destilada en un erlenmeyer (el volumen se mide en una

probeta)

4. agregar el medio deshidratado. Disolver por agitación y calentamiento hasta que

empiece a hervir. Luego esterilizar en la olla de presión ( 15 lbs de presión por

dos horas).

5. después de esterilizar se procede a colocar el medio de cultivo sobre cada tubo de

ensayo (esterilizados previamente) quedando así listo el medio de cultivo. Los

medios líquidos deben mantenerse debidamente enroscados o sellados para

evitar la contaminación.

MEDIO DE CULTIVO SÓLIDO.

6. se pesa el medio TSA o algún medio sólido, en una balanza granataria

( instrucciones en el frasco)

7. el procedimiento es igual a la de los medios líquidos

26

PRACTICA No. 2

OBTENCION DE BACTERIAS EN CULTIVO PURO

Un paso fundamental para el diagnostico bacteriológico es el aislamiento de

bacterias en cultivo puro. Luego por procedimiento de laboratorio de naturaleza

variada (pruebas bioquímicas, coloraciones, serología, etc.) se procede a su

identificación.

Por lo tanto es de gran importancia poder realizar las técnicas para obtención

de cultivos puros a partir de una flora mixta.

OBJETIVOS

1- Que el alumno obtenga cultivos puros de bacterias Grampositivas y

Gramnegativas, a partir de una muestra con flora mixta.

2- Que utilice medios de cultivos selectivos y diferenciales e interprete los

resultados que obtenga en esos medios.

3- Que constate por observación macroscópica y microscópica si obtuvo cultivo

puro.

PARTE I.

MATERIAL POR LADO DE MESA.

- Una suspensión de heces 1:1000

- Una placa de Agar de tripticasa soya

- Una placa de Agar Mac Conkey

- Una placa de Agar sangre.

PROCEDIMIENTO

Sembrar las placas de agar tripticasa soya, Mac Conkey y agar sangre con la

suspensión de heces utilizando el método de estrías para extenderlo.

27

Incubar todas las placas a 36ºC +/- 1ºC, hasta la siguiente practica de

laboratorio.

PARTE II

MATERIAL:

- Colorante para Gram y dos placas de agar tripticasa soya.

PROCEDIMIENTO

1- Observar el número y tipo de colonias que hayan crecido en las placas de

agar tripticasa soya, Mac Conkey y agar sangre. Notar las diferencias que

hay entre el crecimiento de todas las placas, interpretar los resultados.

2- Hacer frotis de colonias diferentes obtenidas en el medio de Mac Conkey y

agar sangre, colorearlos por el método de Gram. Observarlos en el

microscópio y anotar los resultados.

3- En base a los resultados de los frotis seleccionar una colonia formada por

bacterias Grampositivas y resembrarla en el medio de agar tripticasa soya,

incubarla a 36ºC hasta el próximo laboratorio. Hacer lo mismo con una

colonia Gramnegativa.

28

PARTE III

PROCEDIMIENTO

1- De cada una de las placas sembradas tomar tres colonias aisladas, hacer

frotis y colorearlo por Gram. Observar al microscopio indicar si obtuvo

cultivos puros.

2- Discusión

a) Método de estrías (fundamento y objetivo)

b) Análisis de cada medio de cultivo: nombre, función, clasificación,

composición (sustratos, nutrientes e inhibidores)

c) Descripción de colonias.

d) Análisis de los resultados.

Frotis Bacteriano.

1. Se observa Morfología

2. Se observa tinción ( Gram, Acido resistencia).

29

PRACTICA No. 3

PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS

ANTIMICROBIANOS (ANTIBIOGRAMA)

PROPOSITOS

La prueba de susceptibilidad sirve para determinar IN VITRO a que antibióticos

es susceptible o resistente una determinada cepa bacteriana aislada del

paciente.

Este método permite al médico escoger el antibiótico más adecuado con base

científica proporcionada por el laboratorio y así poder dar un buen tratamiento.

Básicamente hay dos técnicas para verificar estas pruebas: dilución en tubo y

difusión en agar. La técnica del disco sobre agar, se adapta a las necesidades y

fines de la práctica diaria en el laboratorio. Además las pruebas de

susceptibilidad constituyen una ayuda invaluable para la elección de los

agentes antimicrobianos más apropiados para el tratamiento de las

enfermedades infecciosas.

OBJETIVOS

1. Verificar la prueba estandarizada de susceptibilidad bacteriana a los

antimicrobianos por el método de difusión en agar (método de KIRBY

BAUER).

2. Reconocer la importancia de adherirse a las normas estandarizadas

recomendadas para obtener resultados confiables y reproducibles.

3. Analizar las posibles fuentes de error inherentes al método e indicar la forma

de evitarlas.

Suceptible: Cuando los microorganismos responsables de una infección son

inhibidos por concentraciones de antibióticos obtenidos con un régimen usual

de dosificación.

30

Resistente: Si los microorganismos que causan la infección, toleran

concentraciones de antibióticos superiores a las que pueden obtenerse en la

sangre por medio de un régimen usual de dosificación.

Intermedio: Hoy en día se considera como prueba errática, que por lo tanto

debe repetirse, ya que realmente se trata de una población bacteriana

resistente.

PROCEDIMENTO

Por medio de la técnica de Kirby-Baver modificada se obtienen resultados

confiables, reproducibles y de gran utilidad clínica siempre y cuando se sigan al

pie de la letra las instrucciones.

Es una técnica relativamente sencilla. Y siempre debe efectuarse con el Agar de

Mueller-Hinton; el grosor de la caja, concentración del inoculo, humedad,

temperatura y otros factores deben estar perfectamente estandarizados para

que los resultados puedan ser comparables entre los diversos laboratorios. Es

muy importante tomar en cuenta que esta técnica solo sirve para efectuar el

antibiograma a las siguientes bacterias aeróbicas o facultativas de crecimiento

rápido:

1. Staphylococcus aureus

2. Enterobacterias

3. Pseudomonas

El antibiograma para Haemophilus spp y Neisseria sp, debe hacerse en

Mueller-Hinton con 5% de sangre “achocolatado”.

Para prepara el agar de Mueller-Hinton debe seguir las siguientes indicaciones:

1. Las cajas de petri deben tener un tamaño estándar (100 mm de diámetro)

deben llenarse con aproximadamente 25 mL de agar líquido ya

autoclaveado, a manera de obtener un medio de 4mm de grueso.

31

2. Deben guardarse en refrigeración dentro de bolsas plásticas selladas (de 2 a

8°C) por no más de 7 días.

3. El pH del medio debe ser de 7.2 a 7.4.

4. De cada lote de medio, incubar de 2 – 5 cajas por 24 horas a 36°C para

comprobar su esterilidad.

ALMACENAMIENTO DE LOS DISCOS CON ANTIBIÓTICOS:

Almacenar los discos de acuerdo con las siguientes instrucciones para que no

pierdan su potencial:

1. Congelar (idealmente a –20°C) los discos de Penicilina, Ampicilina,

Carbenicilina y Cefalosporinas. Descongelar periódicamente sólo los discos

que serán usados durante la semana. Descongelarlos por lo menos 2 horas

antes de usarlos.

2. Los discos del resto de antibióticos pueden almacenarse refrigerados sin

congelación. De preferencia con un desecante.

PROCEDIMIENTO:

1. Con el asa flameada y fría tomar 4 a 5 colonias bien aisladas y de igual

morfología del cultivo. Debe trasladarse siempre a un cultivo puro.

2. Inocular un tubo con 4 mL de caldo tripticasa soya o caldo infusión de

cerebro - corazón.

3. Incubar el caldo de 2 a 5 horas a 36°C, hasta que aparezca una ligera

turbidez.

32

4. Ajustar la turbidez del caldo, con la turbidez del tubo estándar de Mac

farland 0.5. Si el caldo es más turbio que el estándar, agregar más caldo o

solución salina estéril.

5. Luego inocular la caja presecada de agar Mueller-Hinton así: introducir un

hisopo estéril en el caldo, exprimir bien el hisopo presionándolo ligeramente

contra las paredes del tubo, arriba del nivel del caldo.

6. Con el hisopo exprimido sembrar la caja en 4 direcciones opuestas sobre

toda la superficie, cerca del mechero encendido.

7. Dejar secar la caja de 3 a 5 minutos; pero no más de 15 minutos, con la

tapadera cerrada.

8. Con pinzas estériles, colocar los discos impregnados de antibióticos a

manera que queden lo más separado entre sí. Escoger los antibióticos a

colocar dependiendo de la bacteria aislada.

9. Invertir las cajas o incubarlas por 16 a 18 horas. Nunca usar jarro con

candela (excepto para Hemophiles spp y Neisseria spp)

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS.

1. Después de 16 a 18 horas de incubación, examinar con buena luz las cajas

ya con crecimiento.

2. Medir en milímetros el diámetro de los halos de inhibición completa con una

regla por detrás de la caja petrí.

3. En caso de sulfonamidas, puede ocurrir crecimiento dentro del halo, el cual

no debe tomarse en cuenta.

4. Transformar las medidas de los diámetros de los halos de inhibición en

milímetros, hacer lecturas de acuerdo a tablas actualizadas.

33

INTERPRETACIÓN DE LOS DIÁMETROS DE LAS ZONAS DE

INHIBICIÓN (mm) PARA MIEMBROS DE LA FAMILIA

ENTEROBACTERIACEAE

Agente antimicrobiano

Contenido del disco (meg)

Resistente Intermedio Moderadamente susceptible

Susceptible

Amikacina 30 14 15-16 14-17 17Amoxicilina-ácido clavulánico

20/10 13 14-16 18

Ampicilina 10 13 12-14 17Ampicilina-sulbactan

10/10 11 16-21 15

Aztreonam 30 15 15-17 22Cefamandol 30 14 15-17 18Cefazolina 30 14 13-15 18Cefmetazol 30 12 15-17 16Cefonicida 30 14 16-20 18Cefoperazina 75 15 15-22 21Cefotaxima 30 14 13-15 23Cefotetan 30 12 15-17 16Cefoxitina 30 14 15-17 18Ceftazidima 30 14 15-19 18

Ceftizoxima 30 14 14-20 20Ceftriaxona 30 13 15-22 21Cefuroxima (oral)

30 14 15-17 23

Cefuroxima (parenteral)

30 14 15-17 18

Cefalotina 30 14 15-17 18Cloranfenicol 30 12 13-17 18Ciprofloxacina 5 15 16-20 21Gentamicina 10 12 13-14 15Imipenem 10 13 14-15 16Kanamicina 30 13 14-17 18Mezlocilina 75 17 18-20 21Netilmicina 30 12 13-14 15Piperacilina 100 17 18-20 21Tetraciclina 30 14 15-18 19Ticarcilina 75 14 15-19 20

(Continuación)

Agenteantimicrobiano

Contenido del disco

(mcg)

Resistente Intermedio Moderadamente susceptible

Susceptible

Ticarcilina-ácido clavulánico

75/10 14 15-19 20

Tobramicina 10 12 13-14 15

Trimetoprim-sulfametoxazol

1.25/23.75 10 11-15 16

34

Reportar sólo en Urocultivo Carbenicilina 100 19 20-22 23

Cinoxacina 100 14 15-18 19

Nitrofurantoína 300 14 15-16 17

Norfloxacina 10 12 13-16 17

Ofloxacina 5 12 13-15 16

Sulfisoxazol 250 ó 300 12 13-16 17

Trimetroprim 5 10 11-15 16

INTERPRETACIÓN DE LOS DIÁMETROS DE LAS ZONAS

Agenteantimicrobiano

Contenido deldisco(mcg)

Resistente Intermedio Moderadamente susceptible

Susceptible

Amoxicilina-ácido clavulánico

20/10mcg 19 14-16 20

Ampicilina 10mcg/ml 28 29Ampicilina-sulbactan

10/10mcg. 11 12-14 15

Cefazolina 30mcg. 14 15-17 18Cefotaxima 30mcg 14 15-22 23Ceftriaxona 30mcg 13 14-20 21Cefalotina 30mcg 14 15-17 18Cloranfenicol 30mcg 12 13-17 18Ciprofloxacina 5mcg 15 16-20 21Clindamicina 2mcg 14 15-17 18Eritromicina 15mcg 13 14-22 23Gentamicina 10mcg. 12 13-14 15Imipenem 10mcg. 13 14-15 16

Continuación

Agenteantimicrobiano

Contenido del disco (mcg)

Resistente Intermedio Moderadamente

susceptibleSusceptible

Meticilina 5mcg 9 10-13 14Ofloxacina 5mcg 12 13-15 16Oxacilina 1 mcg 10 11-12 13Penicilina G 10 U 28 29Rifampicina 5mcg 16 17-19 20Tetraciclina 30mcg 14 15-18 19Trimetoprim-sulfametoxazol

1.25/23.75mcg.

10 11-15 16

Vancomicina 30mcg 9 10-11 12Reportar sólo en Urocultivo

35

Nitrofurantoína 300mcg 14 15-16 17

Norfloxacina 10mcg 12 13-16 17

Sulfisoxazol 250 ó 300mcg

12 13-16 17

Trimetroprim 5mcg 10 11-15 16

DISCUSION

1- Características del medio de cultivo.

2- Principio del método de difusión.

3- Elaboración del reporte.

4- Antibiótico. Quimioterapéutico.

5- Otros controles: inóculo, discos, siembra e incubación.

PRACTICA No. 4

COPROCULTIVO

La infecciones éntericas pueden ser causadas por varios microorganismos,

siendo de mayor importancia las bacterias del genero Shigella, Salmonella y

desde 1991 el Vibrio cholerae O1

PROPÓSITO:

Demostrar por medio del cultivo, la presencia de bacterias enteropatógenas, es

decir que infectan el intestino penetrando o no su mucosa. Esto causa diarrea,

dolor abdominal, fiebre y a veces la muerte.

OBJETIVOS

1- Observar y describir la morfología de las Enterobacterias aisladas de la

muestra de heces.

36

2- Utilizar un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de bacterias

entéricas y sepa interpretar los resultados obtenidos.

3- Utilizar medios diferenciales para evaluar la actividad bioquímica de las

bacterias que aisle e intérprete los resultados obtenidos.

4- Realizar pruebas serológicas para la identificación de las principales

Enterobacterias patógenas.

5- Elaborar su reporte final en base a los resultados obtenidos utilizando las

tablas de referencia para la identificación de Enterobacteriaceae.

MUESTRA:

Para efectuar un coprocultivo pueden inocularse las siguientes muestras:

Heces frescas (la mejor muestra)

Hisopo rectal (cuando no se obtienen heces)

Material obtenido por proctoscopia.

Biopsia de mucosa intestinal.

Las muestras deben tomarse antes de iniciar tratamiento con antibióticos. Las

heces deberán procesarse lo más pronto posible, de preferencia antes de 2-3

horas de ser emitidas.

El hisopo rectal es una buena toma de muestra (en caso de no ser posible

obtener muestras de heces recientes), porque arranca las bacterias que se

encuentran dentro de la mucosa.

En los adultos, introducir con cuidado en el ano un hisopo estéril 4 centímetros,

dar 3 vueltas a la derecha y 3 vueltas a la izquierda. En niños, introducir el

hisopo 2.5 centímetros y dar la misma cantidad de vueltas.

Cuando las heces, que se encuentran a 37°C dentro del intestino, son

colocadas y permanecen a temperatura ambiente (aproximadamente a 20°C),

el pH baja considerablemente (acidez) y hace que las bacterias, especialmente

37

Shigella sp pierdan su viabilidad (capacidad de reproducirse en cultivo). Por

esta razón si la muestra de heces no se procesa con la velocidad ya indicada,

debe colocarse en un medio de transporte bufferado que evite los cambios

bruscos de pH.

Para éste propósito colocar con hisopo estéril una porción de las heces (con

sangre, moco o pus) bien cargado en tubos con 3 mL del siguiente medio de

transporte:

Glicerol – Salino bufferado, (especialmente para Shigella).

Caldo de Hagna GN (Gramnegativo).

Pero el mejor medio de transporte para Enterobacterias es el Cary - Blair.

Otros caldos de enriquecimiento como Selenito, no deben usarse excepto en

encuestas especiales para buscar Salmonella sp, ya que su uso retrasa 24

horas el resultado del coprocultivo, lo que disminuye considerablemente su

utilidad clínica.

La coloración de Gram en heces nunca debe practicarse por carecer de

significado clínico a menos que el médico lo solicite.

PROCEDIMIENTO:

Debe conocerse la edad del paciente, anotar si es niño menor de 6 meses. Para

efectuar el coprocultivo deben usarse medios que sean selectivos (contienen

inhibidores, por lo que sólo permiten el crecimiento de bacilos gram-negativos) y

diferenciales (contienen lactosa e indicadores de pH que viran cuando se

produce ácido, lo que hace cambiar el color de las colonias y así las diferencia).

Algunos de estos medios contienen sales de hierro que precipitan en forma de

sulfuro ferroso de color negro intenso si las bacterias producen ácido sulfídrico.

El coprocultivo debe efectuarse en dos medios selectivos-diferenciales de

preferencia uno más inhibidor que otro. Se recomienda usar rutinariamente agar

38

Mac Conkey, Agar XLD o Agar SS (Salmonella-Shigella). En caso de heces con

moco y sangre (disentería) debe incluirse adicionalmente el medio de Hektoen.

EFECTUAR EL COPROCULTIVO DE LA SIGUIENTE MANERA:

1. Inocular una porción anormal de heces (con moco, sangre o pus) o de

muestra similar, directamente en una caja de Mac Conkey y una caja de SS.

El inóculo se coloca con asa en anillo (flameada y fría) o con hisopo en las

cajas de ambos medios. Inocular sólo ½ cm en un extremo en el Mac

Conkey y 1 cm en el SS. El Hektoen se inocula igual que el Mac Conkey.

2. Diseminar el inóculo utilizando dos asas en anillo. Flamear una de las asas

mientras la otra se enfría.

3. Ya diseminadas de esta manera las muestras en la superficie de las cajas,

incubar a 36°C por 18 a 24 horas.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

1. Después de incubadas, observar cuidadosamente las placas. Debe contarse

con una luz de lámpara que ilumine las cajas por detrás y observarlas.

Marcar por detrás con un círculo de crayón graso cada tipo diferente de

colonias sospechosas así: primero Mac Conkey escoger colonias lactosa-

negativo (incoloras). Si el paciente es un niño menor de un año, se marcaran

colonia típica de Escherichia colí (roja, brillante y de bordes lisos pero no

mucosa).

Examinar el SS de la misma forma, en este medio el crecimiento será más

escaso ya que es más inhibidor. Marcar por detrás una colonia lactosa-

negativo (incoloras), o incluyendo una colonia con centro negro (ácido

39

sulfhídrico) si las hay. Si inocula Hektoen, marcar una colonia pequeña

verde azulado (lactosa-negativo).

2. Colocar las cajas con las colonias previamente marcadas, usando una asa

en aguja bien recta, flameada y fría, toque la superficie de la colonia

seleccionada, teniendo cuidado de no pincharla o pasar tocando otras

colonias cercanas. Con cuidado de no contaminar la punta del asa que ya

tocó la colonia sospechosa, destape un tubo (13 x 100mm) de TSI flameé la

boca del tubo, luego pínche el medio en el centro y hasta el fondo a manera

de tocar exactamente el centro del fondo del tubo, retire el asa sin salir del

tubo de TSI y estríe rápido y parejo en la superficie inclinada. Flamear y con

la misma asa inocule el medio de Citrato de Simmons, estríe la superficie del

medio, flamear y con la misma asa toque la misma colonia e inocule al

medio de urea, flamee nuevamente y proceda a inocular el medio de

movilidad y los caldos, siempre tocando la misma colonia inocule indol, rojo

metilo y el Voges Proskauer.

3. Incube a 36°C la gradilla que contiene las bioquímicas. Deben permanecer

en incubación de 18-24 horas. Los tapones de rosca deben quedar

ligeramente flojos para permitir la entrada de oxígeno.

4. Examine las reacciones e interprete los resultados de acuerdo a la tabla de

identificación de pruebas bioquímicas.

5. Complete haciendo la respectiva sensibilidad (Antibiograma).

40

COPROCULTIVOS

41

(-)

Heces frescas o Hisopo rectal Inocular Mac Conkey, SS y

SelenitoIncubar 18 – 24 horas a 36ºCCrecimiento colonias lactosa

Lactosa Incubar de 18 a 24 horas a 36ºC

Incubar 8 horas Subcultivar Mac Conkey

(placas standard)

(+) (-) Otras Shigella Enterobacterias Antibiograma Pruebas bioquímicas

Primarias

Tipeo Serológico (Antisueros: B.C.D.A.AD.

PRACTICA No.5

CULTIVO PARA EL AISLAMIENTO DE VIBRIO

CHOLERAE O1

En el caso de cólera el reporte debe ser inmediato, ya que en los casos graves

la vida del paciente puede depender de éste resultado.

MATERIALES:

Hisopos estériles

42

Reportar NBP (adultos)Según crecimientos y numero de Colonias Identificar y hacer antibiogramas en niños.

K/A

Incubar TSI-Movilidad - Urea

Urea

(-)

Urea Urea

UreaUrea

Tubos de vidrio 15 x 100 mm

Tubos de vidrio 16 x 100 mm

Asa redonda

MEDIOS:

Cary Blair 2 hisopos impregnados con heces o vómito.

Agua pectonada alcalina (APA)

Agar T.C.B.S.(Tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa).

MUESTRAS:

Heces líquidas

Hisopo rectal

Vómito

PROCEDIMIENTO:

1. Con uno de los hisopos del tubo con medio de transporte colocar el inoculo

en el medio T.C.B.S regresar el hisopo al tubo de medio.

2. Estriar por agotamiento e incubar a 35°C por 18 a 24 horas.

3. El otro hisopo introducirlo en el agua peptonada alcalina e incubar a 35°C

por 6 a 8 horas máxima a las 8 horas, hacer un subcultivo del agua

peptonada, tomando 2 a 3 asadas de la superficie de dicho caldo o inocular

otra caja de medio de TCBS, estriar por agotamiento o incubar a 35°C por

18 a 24 horas.

LECTURA:

43

Hisopo rectalVómito Heces

Observar ambas cajas de TCBS buscando colonias amarillas cremosas y

chiclosas, de estas inocular un TSI y un TSA (Tripticas soya agar), incubar a

35°C por 18 a 24 horas.

Al observar el TSI A/A sin gas, hacer del TSA la prueba del hilo mucoso: en

una lámina porta objetos suspender el inoculo de un cultivo de 18 a 24

horas en una gota de suspensión acuosa de desoxicolato de sodio al 0.5%)

y la prueba de oxidasa.

Si ambas pruebas son positivas pasar a la serotipificación con: antisuero

polivalente y solución salina para ver si es una cepa autoaglutinable. Con

solución salina no tiene que aglutinar.

Si aglutina con el suero polivalente continuar con el antisuero INABA, si con

éste antisuero también aglutina reportamos: Se aísla Vibrio cholerae O1

INABA, si no aglutina con el INABA, continuar con el antisuero OGAWA. Si

este aglutina, reportamos. Se aísla Vibrio cholerae 01 OGAWA.

Si en los tres antisueros aglutina se reporta: Se aísla Vibrio cholerae O1

HIKOJIMA.

Si la oxidasa nos da positiva y con el antisuero polivalente no aglutina se

reporta: Se aísla Vibrio cholerae Nº O1.

Si no se observan colonias con características antes mencionadas se

reporta: No se aísla Vibrio cholerae.

VIBRIO CHOLERAE

Cary Blair

TCBS

44

Agar Mac Conkey

Colonias lactosa (-) Resiembra en TCBS a las 6-8 horas

Colonias amarilla de ± 3 mm de diámetro(Trabajar con varias colonias sospechosas)

Agua Peptona

Si No crecimiento

No se aísla

Vibrio choleraeTSI TSAA/A ó K/AGas (-)H-S(-) Si

ReporteNo TSA

No se aísla Vibrio cholerae Oxidasa y prueba del collar

NEGATIVO POSITIVO

Reporte Aglutina con Antisuero No se aísla Vibrio cholerae Polivalente anti. V.Cholerae

Serogrupo 01.

POSITIVO NEGATIVO V. cholerae V. cholerae Serogrupo 01 No Serogrupo 01

DISCUSION

1. Definir coprocultivo. Casos especiales (niños menores de 5 años e

inmunodeprimidos)

2. Muestras clínicas: ¿Cómo se toman? ¿Cuándo se indican? Cuidados en el

manejo. Procesamiento.

3. Medios de cultivo: consistencia, composición, aplicación e importancia.

4. Reporte preliminar. Importancia, indicación, como se hace, como se reporta.

5. Análisis del resultado del cultivo.

45

Identificar Salmonellao Shigella

6. Siembra de medios diferenciales. Lectura, incubación e interpretación.

7. Antibiograma. Importancia. Antibióticos recomendados por la Organización

mundial de la salud.

8. Uso de tablas para identificación bacteriana. Reporte.

PRACTICA No. 6

UROCULTIVO

PROPÓSITO:

El cultivo de orina que ha sido colectada adecuadamente o Urocultivo se

efectúa para demostrar la presencia de un número significativo de bacterias.

46

En condiciones normales, la orina dentro del cuerpo es estéril, pero siempre se

contamina con bacterias al obtener la muestra. Por esta razón, el criterio para

interpretar el crecimiento es cuantitativo.

De acuerdo con el llamado “Criterio de Kass” un número de bacterias mayor o

igual a 100,000 UFC/ml (Unidades formadoras de colonias por mililitro de orina)

se considera infección verdadera, es decir es un recuento significativo. A

diferencia de otros cultivos bacteriológicos, las bacterias que causan la

infección urinaria, se limitan a unos pocos microorganismos de crecimiento

rápido. Las principales bacterias que afectan el sistema urinario son las

Enterobacterias (bacilos Gramnegativos).

La Escherichia coli es sin duda la bacteria que con más frecuencia se aísla de

urocultivos positivos, luego tenemos:

Klebsiella spp.

Enterobacter spp.

Proteus spp.

Pseudomona aeruginosa (no es Enterobacteria).

De menor frecuencia tenemos los cocos grampositivos:

Enterococcus spp.

Staphylococcus aureus

Streptococcus pyogenes y Streptococus spp. (raros).

Staphylococcus epidermidis (puede ser por contaminación)

Staphylococcus saprophyticos(puede ser por contaminación).

Las infecciones mixtas causadas por dos o más especies bacterianas son raras,

por lo que el crecimiento con varios tipos de colonias indican contaminación.

La demostración de piuria (presencia de leucocitos poliformonucleares en el

sedimento urinario) y la Bacteriuria (bacterias en orina), son ambas de gran

importancia para establecer el diagnóstico de infección urinaria.

OBJETIVOS

47

1. Aprender a tomar una muestra limpia de orina y a dar indicaciones sobre

dicho procedimiento.

2. Realizar examen directo con coloración de Gram de las muestras de orina

proporcionadas. Observar los resultados, los interprete y hacer el reporte

preliminar.

3. Verificar el recuento de bacterias en las muestras por el método del asa

calibrada, sembrar en placas e interpretar los resultados.

4. Identificar los posibles microorganismos patógenos. Interprete los

resultados.

RECOMENDACIONES GENERALES.

TOMA DE UROCULTIVO EN EL HOMBRE:

a) Desinfectar bien el glande del pene del paciente con una gasa estéril

empapada con jabón antiséptico no irritante. Remover el jabón con otra gasa

estéril, empapada en agua estéril.

b) Pedir al paciente que orine directamente en el inodoro.

c) Después de transcurrido unos 3 a 5 segundos, destapar rápidamente pero

con cuidado un frasco estéril de boca ancha tomar “al vuelo” a medio chorro

una muestra de orina de la parte central de la micción.

Se deja correr la primera porción de orina para que remueva las bacterias de

la parte anterior del meato urinario, que contaminaría el Urocultivo. Tapar

rápidamente el frasco.

d) Si no es posible inocular el Urocultivo antes de una hora de obtenida la

muestra, refrigerarla (no congelar). La muestra conservada en refrigeración

se mantiene en buenas condiciones para ser inoculada, por un máximo de

48 horas.

TOMA DE UROCULTIVO EN LA MUJER:

48

En el caso de la mujer, debe observarse especial cuidado en la toma de la

muestra, ya que sus genitales están expuestos, por lo tanto hay una abundante

colonización de bacterias. Proceder de la siguiente manera:

a) Solicitar a la paciente que se coloque sobre la tasa del inodoro con las

piernas abiertas. Con los dedos índices y medio de la mano derecha

izquierda debe separarse los labios genitales mayores.

b) Con una gasa empapada con jabón antiséptico no irritante, limpiar bien toda

el área y luego remover el jabón con otra gasa empapada con agua estéril.

c) Obtener la muestra de orina a medio chorro, que corra el chorro de orina

unos segundos y luego la tomar de la porción central de la micción. Tapar

rápidamente.

d) Sembrar antes de una hora ó refrigerar la muestra.

TOMA DE UROCULTIVO EN NIÑOS PEQUEÑOS:

a) En niños varones desinfectar bien con jabón antiséptico no irritante, todo el

pene y el área genital.

En las niñas desinfectar bien los labios mayores y el área genital que los rodea.

Quitar bien el jabón con gasa y agua estéril, luego secar finalmente con una

gasa estéril seca.

b) Pegar una bolsita de plástico estéril y descartable, especial para tomar

urocultivos pediatricos. En niños tener la precaución de introducir todo el pene

en el orificio del llenado y en las niñas que el agujero de la bolsa quede pegado

al centro por donde saldrá la orina.

MATERIALES

Placas de agar sangre.

Placas de Mac Conkey

Tubos de orina de pacientes con pielonefritis (la traerá el alumno)

Asa calibrada de 0.001ml

49

PROCEDIMIENTO:

1. Sembrar la orina en dos medios de cultivo según la técnica del Asa calibrada.

Los medios de cultivo a utilizar son:

a. Agar sangre de carnero al 5% crecen la mayoría de microorganismos

b. Agar Mac Conkey: Crecen solo bacilos Gramnegativos aerobios

(Enterobacterias) pues es selectivo y diferencial.

2. Para sembrar usar un asa calibrada de platino (95% platino, 5% radio) que

tome 0.001 mL. agitar el frasco de orina, abrir delante del mechero y flamear

la boca del mismo. Introducir verticalmente el asa flameada y fría en la orina,

justamente por debajo de la superficie.

3. Inocular primero el agar sangre deslizando el asa una sola vez a lo largo de

la caja de petri pasando por el centro. Flamear o inocular en igual forma el

medio de Mac Conkey.

4. Inmediatamente estriar con asa corriente en anillo el inoculo de orina, en

ambas cajas, haciendo estrías tupidas y perpendiculares a la estría dejada

por el asa calibrada.

5. Inmediatamente incubar el agar sangre a 36°C en jarro de boca ancha con

un trozo de papel absorbente húmedo y una candela encendida, cerrar bien.

6. Incubar el Mac Conkey sin jarro en la incubadora a 36°C.

INTERPRETACIÓN:

50

1. Después de incubar ambas cajas durante 18-24 horas interpretar resultados

de ambas cajas simultáneamente y con buena luz.

2. Contar el número de colonias presentes y multiplicar por 1000; si se usó el

asa calibrada de 0.001 mL, multiplicar por 100 si se utilizó un asa calibrada

de 0.01 mL.

3. Recuento mayores de 100,000 UFC/ml de orina, cepa pura: identificarlo con

bioquímica, hacer sensibilidad y reportarlo.

UFC/ML CRITERIO PARA REPORTAR

0 –10,000Negativo a las 24 horas de incubación a 36°C

10,000-50,000

Sugerir repetir cultivo. Revisar condiciones de toma

de muestra y correlación de leucocitos en sedimento

urinario.

50,000-100,000

Se aisló ___, _____, 000 UFC / mL(reportar el

número de UFC contado y especie bacteriana con su

sensibilidad antimicrobiana.

100,000 ó másSe aisló ___, más de 100,000 UFC / mL infección

urinaria verdadera, hacer antibiograma y reportar.

UROCULTIVOS

Crecimiento No Crecimiento

51

Sembrar con Asa calibrada de 0.001 mL

Agar sangre (carnero)Agar Mac Conkey

Incubar 18 a 24 horas

DISCUSION

1- Muestra de orina. Obtención. Cantidad y procesamiento.

2- Detección de bacterias por la coloración de Gram en orina no centrifugada.

Aplicación

3- Utilidad de usar agar sangre y agar Mac Conkey.

4- Cultivo. Inóculo. Uso del asa calibrada. Siembras en los medios de cultivo.

5- Uso del factor y reporte.

52

Recuentos mayores de 50,000 de un solo tipo de bacterias

Recuento de más de un tipo

de bacterias Recuento y

cultivo negativo

Identificar bacteria sensibilidad Identificar bacteria

RecuentoBacteriano

Sensibilidad

Recuento y nombre de

bacteria

Reporte

Reporte

ReporteReporte

Recuentos menores de 50,000 de un solo tipo de bacterias

Crecimientomixto. Pedir

nueva muestra

PRACTICA No. 7

LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO Y OTROS LÍQUIDOS DE

DERRAME.

PROPÓSITO:

Demostrar por medio de la tinción de Gram y el cultivo, la presencia de

bacterias en estas muestras que normalmente deben ser líquidos estériles ya

53

que son tomadas por el médico que las solicita en condiciones quirurgicas

estériles, por eso, todo microorganismo que se aisle es patógeno. Las bacterias

de mayor importancia en el líquido cefalorraquídeo son:

GRAMNEGATIVOS.

Neisseria meningitidis (causa meningitis meningococica severa)

Haemophilus influenzae (Meningitis en niños de 6 meses a 4 años de edad)

Escherichia coli y otras Enterobacterias (en pacientes inmunodeficientes)

Pseudomonas aeruginosa

GRAMPOSITIVOS:

Streptococcus pneumoniae (muy importante)

Staphyloccus aureus

Streptococcus sp

Streptococcus pyogenes.

OTROS MICROORGANISMOS IMPORTANTES:

Mycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum

Cryptococcus neoformans, Candida albicans

OBJETIVOS

1. Realizar el examen directo del Líquido cefalorraquideo, interpretar y hacer

su reporte.

2. Identificar los medios de cultivo de utilidad para muestras de LCR y otros

líquidos de derrarme, inocularlos e incubarlos en condiciones adecuadas.

3. Identificar las bacterias aisladas y reportar sus resultados.

4. Aislar e identificar hongos causantes de meningitis.

5. Procesar otros líquidos de derrame.

MUESTRA:

54

Las muestras incluidas en los fluidos corporales son:

Líquido cefalorraquídeo

Líquido ventricular

Fluido abdominal (líquido peritoneal o ascítico)

Líquido pleural

Líquido pericardico

Líquido sinovial

Médula ósea.

Las muestras deben transportarse rápidamente al laboratorio y ser procesadas

inmediatamente no después de 30 minutos de recolectados. Rotular con el

nombre del paciente, número de registro, fecha y naturaleza de la muestra. Si el

médico sospecha que la muestra puede contener bacilos alcohol ácido

resistentes debe hacerlo saber en su solicitud al laboratorio.

PROCEDIMIENTO:

1. El médico debe obtener la muestra (LCR o cualquier otro fluido corporal del

cual desee examen completo).

2. Uno de los tubos no se centrífuga, enviarlo para que se le haga el

citoquímico (recuento total de células) recuento diferencial (fórmula) y

análisis químico. El otro tubo sirve para análisis microbiológico.

3. Centrifugar la muestra 15 minutos a alta velocidad. (2500-3000 RPM).

Decantar asépticamente, tapar, agitar y procesar sólo el sedimento.

4. Sembrar una asada del sedimento en cada uno de estos medios:

a. Agar sangre de carnero al 5%

b. Agar chocolate

c. Agar Mac Conkey

d. Sabouraud (hongos)

e. Tioglicolato

f. Lowenstein-Jensen (solo si se investiga BAAR)

55

5. Diseminar por estrías en toda la superficie de los medios sólidos. Introducir el

agar sangre de carnero y el agar chocolate en jarro húmedo con candela

encendida. Incubar todos los medios a 36°C, excepto el sabouraud que se

incuba a temperatura ambiente, para el aislamiento de hongos patógenos

especialmente (Cryptococcus neoformans).

6. En porta-objetos nuevos o bien limpios con alcohol, hacer dos frotis

pequeños (de aproximadamente un centímetro de diámetro) en el centro de

la lámina.

7. Colorear un frotis con Gram y otro con Ziehl- Neelsen.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

Observa los frotis de sedimento de LCR con el objetivo de inmersión. En vista

que del resultado de los frotis depende el tratamiento inmediato de pacientes

con infección grave de las meninges, su observación debe hacerse con todo

cuidado. Observar las siguientes morfologías:

1. Diplococos gram-negativos (rojos o rosados), arriñonados, dispuestos en

parejas como granos de café, idénticos a N. gonorrhoeae de pus uretral:

morfología compatible con N. meningitidis. Dar alerta al médico

inmediatamente.

2. Cocobacilos gram-negativos (rojo pálido) pleomorficos, con escasas formas

bacilares: morfología compatible con H. Influenzae agente de meningitis en

niños de 6 meses a 4 años.

3. Cocos gram-positivos (morados), lanceolados, ovalados, dispuestos en

parejas o cadenas cortas, la cápsula se insinúa como halo claro alrededor

de las bacterias: En LCR morfología compatible con Streptococcus

pneumoníae.

56

4. Bacilos gram-negativos (rojos) de coloración sólida, no pleomorficos, bacilos

alargados: morfología compatible con Enterobacterias o Pseudomonas (E.

Coli, Salmonella sp, Pseudomonas aeruginosa).

5. Levaduras redondeadas. Algunas con gemaciones laterales, gram positivo

se insinúa cápsula, hacer “tinta china”, para demostrar la presencia de

levadura capsulada sugestiva de Cryptococcus neoformans.

6. En Zielh-Neelsen: bacilos alcohol-ácido resistente (rojos) cortos, algunos con

coloración dispareja en forma de gránulos: morfología compatible con

Mycobacterium tuberculosis.

INFORME:

El primer informe, entregar el mismo día de la obtención del muestra: Frotis

de Gram: se observan morfología de bacterias, cantidad de leucocitos.

Cultivo pendiente.

El segundo informe; entregar el día que termina la identificación:

Cultivo: se aísla: Nombre de la bacteria, género, especie más

antibiograma.

L.C.R. Y LÍQUIDOS DE DERRAME

57

Agar sangre Agar chocolate Caldo, Tripticasa soya Gram

Incubar 18 a 24 horas

Crecimiento No crecimiento

Reincubar 24 horas

más

Gram

Identificar bacteria

Sensibilidad Crecimiento No crecimiento

Reporte Reporte

Bacteria aislada Gram

Sensibilidad Subcultivo del caldo Cultivo negativo

a las 48 horas

Identificar bacteria Antibiograma

Reporte

DISCUSIÓN

1- Muestra. Cantidad y procesamiento.

2- Frotis coloreado. Cuidados al hacerlo, importancia y significado clínico.

3- Diagnostico preliminar.

4- Medios de cultivo.

5- Aislamiento e identificación bacteriana.

6- Prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos.

7- Reporte definitivo.

58

Se aislo: (Dar nombre de bacteria y sensibilidad

PRACTICA Nº. 8

HEMOCULTIVO

PROPÓSITO:

El hemocultivo o cultivo de sangre, sirve para detectar las bacterias que se

están reproduciendo en la sangre, lo que provoca septicemia. Cuando las

bacterias se multiplican a una velocidad que excede la capacidad del sistema

retículo-endotelial para removerlos de la sangre, ocurre la septicemia. Se

59

diferencia de la bacteremia, que es la presencia transitoria de bacterias en el

torrente circulatorio. Usualmente causa septicemia una sola especie bacteriana.

OBJETIVOS

1. Aprender la toma de sangre venosa en condiciones asépticas e inocularlas

en los medios de cultivo apropiados.

2. Reconocer en forma macroscópica los signos visibles de crecimiento

bacteriano de un hemocultivo positivo.

3. Conocer los medios de cultivo necesarios para la inoculación de muestras

de sangre en el laboratorio, así como también los procedimientos efectuados

para la identificación bacteriana.

4. Elaborar el reporte final en base a los microorganismos encontrados, si los

hay.

MUESTRA:

Los síntomas del paciente que indican la necesidad de obtener un hemocultivo

son: Aumento súbito del pulso y la temperatura, cambios sensoriales,

escalofríos, postración y presión baja. Además la recuperación de las bacterias

de la sangre depende de los siguientes factores.

1. Cantidad de sangre que se cultiva. En niños debe ser al menos 2.5 mL y en

adultos usualmente 5 mL.

2. La relación entre la sangre y caldo de cultivo debe ser siempre 1:10 es decir

sangre al diez por ciento en caldo, con el objeto de evitar coagulación.

3. La presencia de inhibidores bacterianos en el suero tales como anticuerpos,

complemento o antibióticos.

4. La característica de la bacteria de ser “fastidiosa” es decir que requiere de

un medio de cultivo enriquecido y complejo.

5. El hemocultivo debe obtenerse siempre antes de iniciar el tratamiento con

antibióticos.

6. En algunos casos se justifica obtener varias muestras del paciente, en

tiempo y sitios diferentes, es decir “seriado”.

60

INSTRUCCIONES PARA LA TOMA DE UN HEMOCULTIVO:

1. Destapar el frasco con caldo de hemocultivo, para descubrir el tapón de hule

perforable. Dejar la tapadera a un lado y con un algodón empapado en

solución de yodo al 3% y alcohol, limpiar bien el tapón perforable. Dejar

secar mientras se atiende al paciente.

2. Colocar la ligadura en el brazo del paciente, luego palpar la vena y localizar

con precisión el sitio donde se va a puncionar.

3. Lavar con agua y jabón el brazo del paciente, antes de aplicar desinfectante.

Limpiar el sitio correcto con un algodón empapado en tintura de yodo al 3%.

Dejar secar y luego limpiar el sitio de punción con un algodón empapado en

alcohol, con movimientos circulares en forma de espiral que se inicia en el

sitio de punción.

4. Con aguja y jeringa estériles, puncionar la vena y obtener asépticamente

5 mL o más de sangre.

5. Inyectar exactamente 5 mL de sangre en el frasco que contiene 45 mL de

caldo o 10 mL en un frasco con 90 mL de caldo. En los hemocultivos

pediátricos, inyectar 2.5 mL de sangre en 25 mL de caldo.

6. Agitar suavemente las botellas ya inoculadas e incubar a 36°C.

PROCEDIMIENTO:

1. Incubar los hemocultivos por siete días, excepto en casos especiales en los

cuales debe prolongarse la incubación, por ejemplo para el aislamiento de

Brucella spp.

2. Con mucho cuidado para que el caldo no se agite, examinar diariamente los

frascos contra la luz, para buscar algunos de los siguientes signos visibles

que indican crecimiento bacteriano, los cuales orientan hacia el tipo de

bacteria que esta creciendo:

61

Signos Visible Posible Bacteria

Turbidez

Bacilos Gramnegativos aerobios

Staphylococcus spp.

Bacteroides spp.

Hemólisis

Estreptococcus spp.

Staphylococcus spp

Listeria spp

Clostridium spp.

Bacillus spp.

Formación De Gas Bacilos Gramnegativos aerobios

Anaerobios

Colonias Visibles Como “Motas

de Algodón”

Staphylococcus spp.

Streptococcus

Formación De Película

Pseudomonas spp.

Bacillus spp.

Levaduras

Coloración Verdosa (Raro) Pseudomonas aeruginosa

1. En caso de observar cualquiera de estas características, agitar suavemente,

limpiar el tapón perforable con algodón y alcohol, puncionar con jeringa y

aguja estéril, y aspirar una pequeña cantidad de caldo. Inocular una gota y

luego estriar con asa sobre una caja de agar sangre y una caja de agar

chocolate; incubar ambas en jarro con candela. Simultáneamente dejar secar

dos gotas del caldo sobre un porta objetos, colorear con Gram.

2. Observar cuidadosamente el frotis coloreado por Gram con objetivo de

inmersión, pues la observación de las bacterias es la base de su

caracterización. Además, algunas bacterias como Haemophilus influenzae,

62

no producen signos visibles en el caldo si se observan bacilos o cocobacilos

gram-negativos, inocular adicionalmente una caja de Agar Mac Conkey;

incubar aeróbicamente. Esto es especialmente importante para el

aislamiento o identificación de Salmonella typhi.

3. Si se observan cocos gram-positivos esféricos y con tendencia a agruparse

en racimos, inocular una caja de agar manitol-sal, para facilitar el aislamiento

e identificación de Staphylococcus aureus. Si se observan diplococos o

cadenas cortas de cocos gram-positivo ovalados, aplicar los discos de

optoquina y bacitracina sobre la segunda estría del agar sangre, para aclarar

la identificación presuntiva de Streptococcus pneumoniae y Streptococcus

pyogenes.

4. Rutinariamente revisar los hemocultivos aparentemente negativos.

Procederá así: hacer asépticamente un frotis de Gram del caldo a las 48

horas y también al séptimo día de incubación. La incubación prolongada

puede producir una leve turbidez de fibrina.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

1. Con siete días de incubación a 36°C se recupera el 95% de las bacterias

clínicamente significativas. Si se observa en Mac Conkey el crecimiento de

colonias lactosa-negativo sospechosas de Salmonella typhi, aglutinar

inmediatamente el crecimiento en agar sangre con antisuero polivalente anti-

salmonella, anti-salmonella del grupo D y anti-antígeno Vi. Si hay

aglutinación franca, reportar inmediatamente la presencia de salmonella

typhi.

63

2. Algunas bacterias importantes en hemocultivos positivos, son las siguientes:

Salmonella typhi

Escherichia coli

Streptococcus pneumoniae

Staphylococcus aureus

Streptococcus pyogenes

Pseudomonas aeruginosa

Haemophilus influenzae

3. Algunas bacterias que frecuentemente crecen en hemocultivos como

contaminantes provenientes de la microbiota de la piel son:

Bacillus sp

Corynebacterium sp.

INFORME:

1. Los hemocultivos deben reportarse como negativos si no se observan

bacterias en el Segundo control por coloración de Gram, a los siete días de

incubación, NUNCA ANTES. Reportar así: NEGATIVO A LOS SIETE DÍAS

DE INCUBACIÓN A 36°C.

2. Si el hemocultivo presenta crecimiento a cualquier tiempo de incubación

reporta cuanto antes la bacteria aislada, identificada si es posible, hasta

64

5 mL de sangre45 mL de medio

especie, aunque la identificación sea presuntiva. Reportar así: SE AISLÓ

____________________SUSCEPTIBILIDAD PENDIENTE.

3. En el caso del aislamiento e identificación de Streptococcus pneumoniae ó

Streptococcus pyogenes de hemocultivo, reportar así: SE AISLO

Streptococcus________________, se recomienda tratamiento con

penicilina. Sí se trata de S. pneumoniae, hacer la prueba de sensibilidad a la

penicilina.

4. Después de interpretar los resultados de la prueba de susceptibilidad

antimicrobiana, enviar otro reporte, así:

Se aisló:__________________________________

Susceptible a:______________________________

Intermedio a:_______________________________

Resistente a: _______________________________

HEMOCULTIVOS

Muestra N° 1

Muestra N° 2

Incubar 24 horas

65

Sub-cultivo en agar chocolate y hacer

coloración de Gram

DISCUSION

1- Obtención de la muestra

2- Medios de cultivo utilizados e incubación

3- Elaboración del reporte preliminar

4- Resultado Final

5- Resultado del antibiograma

66

Subcultivo yGram positivo

Subcultivo yGram negativo

Identificar bacteriaSensibilidad

Observar diariamente

Bacteria Sensibilidad

7° día hacer Subcultivo en agar chocolate y

Gram

Cultivo negativo al 6° día de incubación

Incubar

Reporte

PRACTICA N0.9

IDENTIFICACION DE MICOBACTERIAS

Este grupo de bacterias en forma de bacilos, se tiñen con dificultad por el alto

contenido de grasa en su pared celular. Para lograr teñirlas deben usarse

coloraciones con fenol y calor. Una vez teñidas con fucsina carbólica, no se

decoloran con alcohol acidificado. Por esta característica muy particular se les

llama “BACILOS ALCOHOL-ÁCIDO RESISTENTES”.

Las mycobacterias son aerobios estrictos, no móviles, no poseen cápsula no

producen esporas. Su crecimiento es sumamente lento, la mayoría de especies

patógenas crecen después de 2 a 6 semanas de incubación a 36°C en el medio

de Lowenstein-Jensen. Aproximadamente 12 especies de Mycobacterium se

67

asocian con enfermedad , en nuestro medio, sin lugar a duda, M. tuberculosis

es la especie más importante

PROPOSITO.

Demostrar por medio de coloración y cultivos especiales la presencia de

bacterias pertenecientes al género Mycobacterium, especialmente

Mycobacterium tuberculosis.

OBJETIVOS

1-Conocer las técnicas de laboratorio útiles para la identificación de M.

tuberculosis.

2-Conocer las tinciones utilizadas para la identificación presuntiva de M.

tuberculosis.

MUESTRAS.

1. Esputo: Es la muestra que con mayor frecuencia se remite al laboratorio para

la investigación de tuberculosis.

El esputo debe colectarse temprano en la mañana, inmediatamente al

despertar. De preferencia tres a cuatro muestras (seriadas) en días

alternos.

El primer esputo de la mañana es la más adecuada para el análisis, pues

es más concentrada y menos contaminada.

Colectar la muestra antes de iniciar tratamiento.

Indicar al paciente que al despertar se enjuague la boca dos veces con

agua corriente, no debe de usar pasta dental o cualquier otro antiséptico.

El paciente debe depositar la muestra en un recipiente estéril de boca

ancha.

El paciente que tiene dificultad para producir esputo puede usar estos

métodos:

68

b) Nebulización de solución salina hipertónica (cloruro de sodio al 10%,

sin propilenglicol), es excelente para inducir la producción de esputo,

generalmente diluido.

c) Los hisopos faríngeos pueden ser usados en estos pacientes para

extraer el esputo. Especialmente este procedimiento es aconsejable

para niños pequeños a los cuales no se les pude pedir una muestra

adecuada.

d) Broncoscopía: Puede ser usada para obtener las muestras

directamente del sitio infectado.

2. Lavado gástrico: Frecuentemente se solicita lavado gástrico para análisis de

micobacterias. No se usa para detectar tuberculosis del estómago, sirve para

demostrar micobacterias del esputo que el paciente involuntariamente se ha

tragado.

3. Orina: Se debe examinar un mínimo de tres muestras de la PRIMERA

ORINA DE LA MAÑANA colectar a “medio chorro” en un recipiente estéril de

boca ancha.

4. Otro tipo de Muestra:

Lavado bronquial

Fragmentos de pulmón

Hisopado faríngeo

Líquido cefalorraquídeo

Líquido pleural

Líquido articular

Pus

Raspado endometrial (sangre menstrual)

Médula ósea

69

Líquido pericardico

Trozos de tejido de biopsias.

PROCEDIMIENTO:

El diagnóstico de Micobacterias se basa en la observación de los bacilos

alcohol-ácido resistentes en la muestra y su cultivo IN VITRO. Los bacilos

alcohol-ácido resistentes deben teñirse con las coloraciones de Zielh-Neelsen o

Kinyoun. Ambas técnicas dan buen resultado.

COLORACIÓN DE KINYOUN:

Tiene la ventaja de que no necesita calentamiento. Proceder así:

1. Preparar el frotis de igual forma que para Zielh-Neelsen y fijarlo con calor.

2. Colocar la lámina en la gradilla de coloración y dejar que enfríe. Cubrir el

frotis con Fucsina de Kinyoun y dejar que se coloree por 4 minutos. No es

necesario calentar.

3. Lavar con agua corriente

4. Decolorar el frotis con alcohol-ácido hasta que ya no salga más colorante

rojo.

5. Lavar con agua corriente.

6. Cubrir el frotis con azul de metileno por 1 ó 2 minutos.

7. Lavar con agua corriente.

8. Dejar secar y examinar con lente de inmersión.

COLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN:

1-Cubrir el frotis previamente fijado con fucsina fenicada por 5 minutos y

calentar hasta la emisión de vapores. (No hervir).

2- Lavar con agua de chorro.

70

3- Decolorar con alcohol-ácido por 2 minutos.

4- Lavar con agua de chorro.

5- Cubrir el frotis con azúl de metileno por 1 minuto.

6- Lavar con agua de chorro y dejar secar.

INTERPRETACIÓN DE LA BACILOSCOPÍA:

Número de Bacilos

Alcohol-Ácido Resistente

Reporte

0 No se observan bacilos Alcohol-Ácido Resistente1 a 2 en todo el frotis Informar el número de BAAR encontrados y

pedir nueva muestra 3 a 9 en todo el frotis + ó escasos 10 ó más en todo el frotis ++ ó regular cantidad1 ó más por campo +++ abundantes

CULTIVO DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS.

Antes de inocular los medios de cultivo para la identificación final de M.

tuberculosis deben realizarse una serie de procedimientos para tener éxito en

los aislamientos. Dentro de los procedimientos a realizar tenemos:

A) Descontaminación

B) Neutralización

C) Centrifugación

Luego de realizar estos procedimientos se procede a inocular los medios de

cultivo apropiados.

DISCUSION

1- Medios de cultivo utilizados en la identificación de Mycobacterias.

2- Tinciones utilizadas. Uso de cada colorante.

71

3- Reporte preliminar.

4- Baciloscopia. Ventajas, desventajas y utilidad clínica.

PRACTICA No. 10

CULTIVO DE GARGANTA.

Debido a la gran ocurrencia de procesos infecciosos en el área faríngea, el

estudio bacteriológico del exudado faríngeo es uno de los procedimientos que

con mayor frecuencia se realizan en el laboratorio clínico. La flora aislada

incluye cocos y bacilos, tanto Grampositivos como Gramnegativos además de

encontrarse cierto número de levaduras.

Para un estudio satisfactorio del exudado faríngeo es necesario tomar una

adecuada muestra de la región de amígdalas y faringe. El cultivo se efectúa

para demostrar la presencia de Sreptococcus pyogenes, Steptococcus

agalactiae y otras especies del género Streptococcus.

Otras bacterias que frecuentemente se pueden aislar en un cultivo de garganta

son las siguientes:

72

Streptococcus pneumoniae

Haemophilus influenzae

Staphylococcus aureus

Klebsiella pneumoniae

Pseudomonas aeruginosa

Estos microorganismos solo se deben reportar si predominan sobre la

microbiota normal.

OBJETIVOS

1- Colectar muestras de exudado faríngeo en forma adecuada y cuando sea

conveniente la estudie por la técnica del examen directo con la coloración de

Gram y Azul de metileno.

2- Observar los microorganismos presentes en las preparaciones anteriores y

determinar cuales pudieran ser patógenos de la faringe. Escribir el reporte

correspondiente.

3- Inocular los medios de cultivo apropiados con las muestras colectadas de sus

compañeros.

4- identificar los posibles microorganismos patógenos aislados en los medios de

cultivo y realizar pruebas especiales para su identificación.

MUESTRA:

La muestra debe tomarse siempre antes de iniciar algún tratamiento con

antibióticos. Además si el paciente ya comió se recomienda dejar pasar unas

dos horas para que se vuelva a formar la secreción deglutida.

73

Localizar el fondo de la garganta y en las amígdalas (que se encuentran a los

lados), observar las siguientes lesiones:

Inflamación (Enrojecimiento)

Pus (secreción blanquecina o amarillenta)

Úlceras blanquecinas.

Con un hisopo estéril frotar firmemente las lesiones con sumo cuidado de no

tocar la lengua, la campanilla, la pared interna de los carrillos, labios y dientes al

retirar el hisopo.

PROCEDIMIENTO:

1. Inocular inmediatamente una caja (placa) de agar sangre al 5%, hacer dos

cortadas en el agar durante la siembra. Las cortadas deben ser

aproximadamente de 1 cm de largo y el asa debe llegar al fondo de la caja.

El propósito de las cortadas es introducir las bacterias dentro del agar para

alejarlos del oxígeno atmosférico y así incrementar la hemólisis tipo beta.

2. Con el objeto de obtener cultivos evidentes de Streptococcus pyogenes, sin

necesidad de hacer sub-cultivos proceder así: Con pinza flameada y fría,

colocar en la zona de más fuerte inoculación en el agar sangre de carnero

(primera estría), un disco de 30 mcg de neomicina. A unos 8 –10 mm de

distancia, colocar un disco de 0.04 unidades de bacitracina. Streptococcus

pyogenes y Streptococcus pneumoniae son resistentes al antibiótico

neomicina, por lo que crecen en cultivos casi puro alrededor de éste disco.

3. Introducir la caja en un frasco de vidrio de boca ancha, poner en el fondo

una toalla de papel húmeda, colocar la caja con el medio y luego introducir

una candela corta y encendida, cerrar el frasco. La candela se apagará sola.

4. Incubar por 18 a 24 horas a 36°C

74

INTERPRETACIÓN.

Para interpretar correctamente los crecimientos de los cultivos de exudados

faríngeos, tomar en cuenta lo siguiente:

Tipo de Hemólisis Apariencia del Halo ALFA

BETA

Verde (Incompleta)

Claro, del color del medio (Completa )

REPORTEInhibición por Bacitracina Reportar

+ (Si produce halo)

- (No inhibición)

Se aisló Streptococcus pyogenes beta

hemolítico del grupo “A” de

Lancefield

Streptococcus sp. beta hemolítico no

del grupo “A” de LancefieldDISCUSION

1- Reporte preliminar

2- Toma de muestra.

3- Cultivo. Medios utilizados. Inoculación. Lectura e interpretación.

4- Subcultivo. Identificación. Antibiograma.

5- Reporte final.

75

PRACTICA No.11

SECRECIONES GENITALES

PROPÓSITO:

Demostrar la presencia de microorganismos de varios tipos bacterianos que

infectan los órganos genitales femeninos y masculinos, tales como:

Neisseria gonorrhoeae: Bacteria, causante de la gonorrea.

Garnerella vaginalis: Bacilo gramnegativo causante de la vaginosis.

Treponema pallidum: Bacteria causante de la sífilis.

Candida albicans: Hongo levaduriforme, causante de la vulvovaginitis.

Trichomonas vaginalis: Protozoo, causante de tricomoniasis vaginal.

OBJETIVOS

76

1. Realizar el examen directo de la secreción uretral utilizando la coloración de

Gram.

2. Elaborar el reporte preliminar.

3. Cultivar la muestra en los medios de cultivo adecuados y seguir la marcha

bacteriológica correspondiente para la identificación del microorganismo

causante de la infección.

4. Realizar la prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos.

5. Elaborar el reporte final.

LA TOMA DE LA MUESTRA

HOMBRES:

1. Tener listo: hisopos estériles, porta-objetos limpios, agar sangre y agar

Thayer –Martin.

2. Con el hisopo estéril tomar una gota de la secreción.

3. Preparar cuidadosamente un frotis delgado sobre el porta objetos, haciendo

rodar el palillo sobre la lámina, no frotar

4. Simultáneamente inocular los medios sólidos (agares)

MUJERES:

1. En las mujeres la muestra la debe obtener el ginecólogo. Tener listo el

mismo material que en el caso de los hombres.

2. Hacer el mismo procedimiento.

PROCEDIMIENTO:

1. Colorear los frotis con coloración para Gram.

2. Con asas flameadas y frías, diseminar por estrías el inoculo sobre la

superficie de las placas.

3. Incubar el agar sangre y el de Thayer –Martín durante 24 a 48 horas a 36°C

en jarro húmedo con candela encendida.

77

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

GRAM: Buscar diplococos adosados en forma de granos de café y

Gramnegativos (rojos). Anotar si se encuentran intracelularmente, dentro de

los leucocitos polimorfonucleares o fuera de ellos (extracelular.)

CULTIVO: Después de 24 a 48 horas de incubación a 36°C en jarro con

candela, examinar el Thayer –Martín, ya que este contiene sustancias

enriquecidas que favorecen el crecimiento de Neisseria gonorreae. Efectuar la

prueba de oxidasa para verificar género.

La prueba de oxidasa puede efectuarse aplicando directamente el reactivo

líquido al cultivo o sobre discos de papel filtro ya impregnado con el reactivo.

Luego identificar la especie Neisseria gonorreae por medio de la prueba de

oxidación de tres azúcares (CTA): maltosa, glucosa y sacarosa (sucrosa).

DISCUSION

1- Toma de muestra.

2- Diagnostico preliminar.

3- Medio de cultivo. Composición. Incubación.

4- Interpretación del cultivo

5- Pruebas bioquímicas utilizadas.

6- Prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos.

7- Reporte final.

78

SECRECIONES

Incubar de 18 a 24 horas

79

Agar Sangre Agar Chocolate Agar Mac Conkey Tioglicolato Gram

Crecimiento No crecimiento

Reincubar 24 horas más

GramIdentificar bacteria

Sensibilidad

Crecimiento en placas ó en subcultivos de

caldo

No crecimiento

Reporte

BIBLIOGRAFÍA

Gustavo A. Gini Q.B. “Manual de Procedimientos para la Identificación de

las bacterias con importancia clínica”, Segunda Edición, Guatemala 1995.

Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social. Unidad de Laboratorio

“Manual Normativo, toma, manejo y envió de muestras para análisis de

laboratorio”. Páginas 1-11, San Salvador. El Salvador 1995.

Miguel Francisco Torres. “Manual Práctico de Bacteriología Médica”.

Segunda Edición. Páginas 41-189, Guatemala 1999.

Giuseppe Nicoletti, Vito Nicolosi “Diccionario de Bacteriología Humana”

Centro Documentación Científica Menarini Barcelona 1990.

80

Bacteria aislada Sensibilidad

Cultivo negativo a las 48 horas de

incubación

ReporteGram

Identificar bacteriaSensibilidad

Reporte nombre de bacteria y sensibilidad

Hospital Nacional de Niños Benjamín Bloom. “Manual de Técnicas de

Microbiología” Pág. 1-44. San Salvador, El Salvador 1996.

Koneman/ Allen/ Dowell/ Janda y otros. Texto y Atlas, Diagnostico

Microbiológico. 4ta Edición. Editorial Médica Panamericana.

Anexos

81

Anexo 1Coloraciones

COLORACIÓN DE GRAM.

1. Hacer un frotis.

2. Fijar el frotis con calor y dejar enfriar.

3. Cubrir el frotis con cristal violeta por 1 minuto.

4. Lavar con agua de chorro, eliminar el exceso de agua

5. Cubrir el frotis con lugol para Gram por 1 minuto.

6. Lavar con agua de chorro.

7. Decolorar con alcohol acetona por 20-30 segundos.

8. Lavar con agua de chorro.

9. Cubrir con safranina el frotis por 30 segundos.

10. Lavar con agua de chorro. Dejar secar al aire y observar al microscopio con

objetivo 100x.

INTERPRETACION

Bacterias Gramnegativas: Color rojo o rosado.

Bacterias Grampositivas: Color violeta oscuro.

82

TINCION DE ALCOHOL ÁCIDO RESISTENTE.

(Ziehl- Neelsen).

Esta es una tinción diferencial que permite distinguir entre algunas bacterias

que por su alto contenido de sustancias lipídicas o céreas se tiñen con dificultad

por los procedimientos usuales; sin embargo, una vez teñidas resisten el

colorante aún cuando se les lave con una mezcla de alcohol- ácido clorhídrico.

Esta tinción es importante para distinguir, entre otras las bacterias ácido

resistentes causantes de la tuberculosis y la lepra. (Mycobacterium sp). Existen

varias técnicas para este tipo de tinción, sin embargo nos referimos a la de

Ziehl- Neelsen.

REACTIVOS:

1. CARBOLFUCSINA:

Fucsina básica...................................... 0.3 g

Etanol 95°C........................................... 10.0mL

Cristales de fenol fundidos por calor...... 5. 0mL

Agua destilada....................................... 95.0mL

Disuelva la fucsina básica en el alcohol y el fenol en el agua. Mezcle las dos

soluciones y deje en reposo por una semana antes de usar. Almacene en

frascos ámbar a temperatura ambiente.

2. ALCOHOL- ÁCIDO:

Etanol 95°C.............................................97.0mL

Ácido clorhídrico concentrado................ 3.0mL

Agregue el HCL al alcohol, homogenice y almacene en frascos a temperatura

ambiente.

3. AZUL DE METILENO:

83

Azul de metileno.................................... 0.3 g

Agua destilada....................................... 100.0mL

Disuelva el azul de metileno en el agua mediante agitación. Almacene en

frascos ámbar a temperatura ambiente.

FILTRE LOS COLORANTES AL MENOS UNA VEZ AL MES.

PROCEDIMIENTO:

1. Prepare un frotis adecuado de la muestra a estudiar.

2. Cubra la lámina con CARBOLFUCSINA y caliente suavemente hasta que

haya emisión de vapor. NO DEJE QUE EL COLORANTE HIERVA NI SE

SEQUE. Agregue más carbolfucsina si es necesario. Mantenga la emisión

de vapor durante 3-5 minutos.

3. Lave la preparación con agua del grifo.

4. Decolore con alcohol- ácido durante 2 minutos o hasta que queden sólo

trazas de color rosado.

5. Lave con agua del grifo

6. Aplique el colorante de contraste AZUL DE METILENO por un minuto.

7. Lave con agua del grifo.

8. Deje secar y observe con objetivo de inmersión.

RESULTADO:

Bacterias alcohol- ácido resistentes: rojas.

Bacterias alcohol- ácido sensibles: azules.

84

CONTROL DE CALIDAD:

Utilice una mezcla de bacterias que contengan bacilos alcohol ácido resistentes

(Mycobacterium sp.) y cocos alcohol- ácido sensibles (Staphylococcus sp.)

COLORACIÓN DE AZUL DE METILENO PARA

MUESTRAS DE HECES.

Es una coloración directa simple usada para diferenciar las características

morfológicas de microorganismos y glóbulos blancos en materia fecal. Utilizado

para diferenciación de glóbulos blancos en muestras de heces el procedimiento

puede desarrollarse: Con un montaje húmedo (directo al fresco) o con frotis de

heces que contengan leucocitos (el cual ha sido previamente fijado).

PROCEDIMIENTOS PARA FROTIS FIJADOS.

1. Hacer un frotis a partir de una muestra de heces dejar sacar al aire.

2. Fijar con metanol al 95% por 1-2 minutos dejar secar.

3. Cubrir la preparación con azul de metileno por 30-60 segundos.

4. Lavar con agua. Dejar secar. Observar microscopio con objetivo 100x.

INTERPRETACIÓN.

85

En este caso se usa para diferenciar leucocitos fecales en enfermedades

invasivas.

Predominio de Neutrófilos: se asume que existe un proceso infeccioso de

origen bacteriano.

Predominio de Linfocitos: se asume que el proceso infeccioso es de origen

viral.

Elevado número de Eosinófilos: Se sospecha la presencia de parásitos o una

enfermedad crónica.

REPORTE.

Contar 100 células y reportar: porcentaje de linfocitos y porcentaje de

PMN.

Si están escasas las células reportar: solo el número de células

encontradas sin reportar porcentaje. Ejemplo: 25 PMN, 2 Linfocitos.

Si no se observan células, reportar: 0% de linfocitos, 0% de PMN.

86

Anexo 2.

Otras pruebas bacteriologicas

PRUEBA DEL CORDÓN.

En una lámina colocar unas gotas de desoxicolato de sodio al 0.5% y

suspender las colonias bacterianas sospechosas. La mezcla se vuelve

sumamente viscosa si es una bacteria del género Vibrio. Esta viscosidad se

puede visualizar mejor si se sumerge dentro de la mezcla un asa. Al retirar el

asa de la preparación se forma un cordón o hilo de mucosidad entre el asa y la

mezcla.

PRUEBA DE LA COAGULASA.

La coagulasa es una enzima que tiene la capacidad de convertir el fibrinógeno

que está presente en el plasma humano o animal, en fibrina, lo cual se

evidencia en el laboratorio por la formación de un coágulo visible.

Esta prueba se usa para diferenciar Staphylococcus aureus que siempre

produce esta enzima, de otras especies de Staphylococcus que no la producen.

87

La coagulasa está presente en las bacterias en dos formas: a) libre y b) unida a

la pared de la bacteria. La coagulasa unidad a la pared se evidencia haciendo

la prueba en lámina, y la coagulasa libre se determina haciendo la prueba en

tubo. La prueba en lámina es presuntiva y a todos los cultivos que den la

prueba débil o negativa se les debe hacer la prueba en tubo, porque algunas

cepas de S. aureus sólo producen la coagulasa libre.

MEDIOS Y REACTIVOS.

1. Plasma de conejo o plasma humano obtenido de sangre fresca estéril, no

nitratada.

2. Cloruro de calcio al 5%: Pese 5.0 gramos de Cloruro de calcio, deposite

en un balón aforado de 100 mL y lleve con agua destilada hasta la marca

de aforo.

3. Medio de cultivo: Cualquier medio sólido, libre de sal (NaCl) debe usarse

para que crezca el microorganismo a probar.

PRUEBA EN LAMINA.

1. Ponga una gota de solución salina estéril en un portaobjeto limpio.

2. Tome una asada del cultivo a probar. Debe tener 18 horas y haber crecido

en un medio libre de sal. Haga con el asa una emulsión homogénea en la

gota de solución salina.

3. Agregue una gota de plasma a la suspensión de bacterias y mezcle.

4. Observe si hay formación inmediata o no de un precipitado granular de

coágulos blancos.

PRUEBA EN TUBO.

1. Agregue asépticamente 0.5 mL de plasma a un tubo estéril 12 x 75 mm.

88

2. Añada 0.5 mL de cultivo crecido en caldo infusión de cerebro y corazón o

una asada de un cultivo crecido en un medio sólido.

3. Incube el tubo en un baño María a 35°C.

LECTURA E INTERPRETACIÓN

1. PRUEBA EN LAMINA:

PRUEBA POSITIVA: Formación de un precipitado granular dentro de un

período de tiempo de 5 segundos a 1 minuto. Después de 1 minuto si aparece

precipitado, monte la prueba en tubo.

PRUEBA NEGATIVA: Suspensión homogénea.

Confirme el resultado con la prueba en tubo.

2. PRUEBA EN TUBO:

Observe cada 30 minutos y si a las 4 horas está

negativa, deje 24 horas en el baño María.

PRUEBA POSITIVA: Cualquier indicio de

coágulo.

PRUEBA NEGATIVA: Suspensión permanece homogénea.

CONTROL DE CALIDAD:

a. Control de esterilidad del plasma: 24 horas a 35°C.

b. Control de coagulación: Agregue una gota de solución de Cloruro de calcio

al 5% a 0.5 mL de plasma. El plasma debe coagular en un periodo de 1

minuto.

89

c. Control positivo: S. aureus.

d. Control negativo: S. epidermidis.

PRECAUCIONES Y RECOMENDACIONES:

1. Si se usa plasma citrato, agregue 5 unidades de heparina/ mL para eliminar

falsos positivos en la prueba de la coagulasa, ya que microorganismos que

utilizan citrato causan coagulación del plasma al consumirlo.

2. Si el cultivo a probar tiene más de 24 horas o es escaso se puede obtener

una prueba de coagulasa débil.

3. Si una colonia no se suspende en la solución salina en la prueba en lámina,

el resultado es imposible de interpretar.

4. No se deben emplear inóculos provenientes de medios con alta

concentración de sal, ya que el cultivo autoaglutina en solución salina.

5. Cuando realice la prueba en tubo no agite el tubo para observar la

formación de coágulo. Un falso negativo puede ocurrir debido a un

rompimiento del coágulo inicial que no se formará de nuevo.

6. Es muy importante observar el tubo cada 30 minutos, ya que existen cepas

de S. aureus que producen grandes cantidades de fibrinolisina, por lo que

el coágulo se puede lisar antes de 4 horas e interpretar erróneamente el

resultado como negativo.

90

7. Algunas cepas producen poca coagulasa, por lo que la formación del

coágulo se evidencia hasta las 24 horas de incubación.

PRUEBA DE LA CATALASA.

La catalasa, es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias y

anaerobias facultativas.

El peróxido de hidrógeno es uno de los productos finales del metabolismo

oxidativo de los carbohidratos y si se acumula es letal para el microorganismo.

La catalasa convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno de acuerdo a

la siguiente reacción:

CATALASA

H202 2H2O+O

Esta prueba es de vital importancia en la diferenciación de Streptococcus

(catalasa negativa) y de los Staphylococcus (catalasa positiva).

91

REACTIVO

Peróxido de hidrógeno al 3%: Se prepara con peróxido de hidrógeno y agua

destilada. Este es un reactivo muy inestable que cuando se expone a la luz se

descompone fácilmente. Debe almacenarse en refrigeración y en botella color

ámbar. Además justo cuando se va a usar debe revisarse que dé bien con los

controles de calidad.

1. PRUEBA EN LAMINA.

a) Con una aguja bacteriológica o un aplicador estéril, pique el centro de una

colonia bien aislada y transfiera el inóculo a un portaobjeto limpio.

b) Añada 1 o 2 gotas de peróxido al 3%.

c) Observe si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade

el reactivo.

d) Descarte la lámina en un recipiente con desinfectante.

2. MÉTODO EN PLATO O TUBO CON AGAR.

a) Añada unas gotas del peróxido de hidrogeno al 15% directamente sobre la

superficie donde hay crecimiento.

b) Observe si se forman o no burbujas de inmediato.

CONTROL DE CALIDAD.

a) Control positivo: Staphylococcus sp.

b) Control negativo: Streptococcus sp.

PRECAUCIONES.

1. El orden de la prueba en lámina no debe invertirse cuando se use asa de

platino ya que puede dar un resultado falso positivo. El alambre de

nihcrome no interfiere.

92

2. La prueba debe realizarse a cultivos de 18- 24 horas; cultivos más viejos

pueden perder su actividad de catalasa dando una reacción falsa negativa.

3. El peróxido de hidrógeno es extremadamente cáustico por lo que se debe

evitar que toque la piel ya que puede causar quemaduras dolorosas. En

caso que ocurran, inunde de inmediato el área afectada con alcohol al 70%

para neutralizar la acción. NO DEBE USAR AGUA.

PRUEBA DE OXIDASA.

La enzima Oxidasa, conocida también como CITOCROMO O OXIDASA O

INDOFENOL OXIDASA. Se encuentra presente en una gran variedad de seres

vivientes entre los que incluyen bacterias hasta animales superiores. Su función

es la de promover la oxidación del citocromo “c” a expensas del oxígeno

molecular.

En bacteriología se puede determinar su presencia al hacer reaccionar una

población bacteriana con su sustrato oxidable como el dimetil o tetrametil- p-

fenilendiamina y el resultado observado es la aparición de color que va del

rosado al púrpura.

Las siguientes reacciones ilustran lo anteriormente expuesto:

2 citocromos “c” reducidos + 2H* + ½ O2 CITOCROMO.c2 citocromo “c” oxidativos + H2O

OXIDASA.

2 citocromos “c” reducidos + REACTIVO COMPUESTO COLOREADO

OXIDACIÓN

93

Esta prueba es sumamente importante en la identificación de bacterias Gram

negativas y en la diferenciación de cocos Gram positivos de importancia clínica:

Micrococcus (prueba positiva) y Staphylococcus (prueba negativa excepto S.

Sciuri).

REACTIVOS.

I. PARA GRAM NEGATIVOS.

1. REACTIVO DE KOVAC

Tetrametil P- fenilendiamina dihidrocloruro....................... 0.1 g

Agua destilada................................................................... 10 mL.

Agregue agua al tetrametil – p- fenilendiamina y disuélvalo. Si es necesario

caliente lentamente para lograr la disolución completa.

Este reactivo debe ser incoloro o mostrar un tono rosado sumamente leve. Si

presenta otro aspecto, descártelo; es poco estable y se oxida rápidamente, de

tal forma que debe prepararse justo antes de usarlo.

De los reactivos empleados para detectar OXIDASA, este es el MÁS

SENSIBLE.

2. REACTIVO DE GORDON Y McLEOD:

Dimetil – p- fenilendiamina monohidrocloruro...................0.1 g

Agua destilada...................................................................10 mL

Agregue el agua al dimetil –p- fenilendiamina y disuélvalo. Si es necesario,

caliente lentamente para lograr la disolución completa.

Este reactivo debe presentar un tono lila muy tenue. Si presenta otro

aspecto, descártelo. Es más estable que el reactivo de Kovac pero MENOS

SENSIBLE. Debe prepararse justo antes de usarlo.

II. PARA COCOS GRAM POSITIVOS.

94

1. REACTIVO DE FALLER Y SCHLEIFER:

Tetrametil – p- fenilendiamina dihidrocloruro...................0.6g

Dimetilsulfóxido.................................................................10 mL.

Agregue el dimetilsulfóxido al tetramil- p- fenilendiamina y disuélvalo. Este

reactivo presenta un tono lila suave, es muy sensible.

Almacénelo en botellas color ámbar. Si el reactivo presenta otro color,

DESCARTELO.

PROCEDIMIENTO

I. PARA GRAM NEGATIVOS

A. TIRAS DE PAPEL

A partir de un cultivo de 18-24 horas, tome un inóculo denso con asa de platino

o palillo de madera estériles y deposítelo sobre una tirilla de papel filtro

impregnada con el reactivo para oxidasa

B. PRUEBA DIRECTA EN PLACA.

Inunde las colonias en estudio en la placa con el reactivo para oxidasa.

II. PARA COCOS GRAM POSITIVOS.

A partir de un agar incubado a 36°C por 18-24 horas en atmósfera aerobia tome

una asada del cultivo y espárzala en una tira de papel filtro. Agregue 1 gota del

reactivo de Faller y Schleifer.

LECTURA E INTERPRETACIÓN:

a) REACTIVO DE KOVAC: Se debe hacer la lectura en un período de hasta 10

segundos.

95

b) REACTIVO DE GORDON Y McLEOD: Se debe de leer en un período de

hasta 30 minutos.

c) REACTIVO DE FALLER Y SCHLEIFER: Se debe leer en un período de

hasta 2 minutos.

PRUEBA POSITIVA: Aparición de color púrpura en el tiempo estipulado

PRUEBA NEGATIVA: No aparición de color púrpura en el período señalado.

CONTROL DE CALIDAD:

a) Control positivo para:

Gram negativos: Aeromonas hydrophila.

Pseudomonas aeruginosa.

Gram positivos: Micrococcus sp.

b) Control negativo para: Gram negativos: Escherichia coli

Gram positivos: Staphylococcus aureus .

PRECAUCIONES Y RECOMENDACIONES:

96

1. La cristalería empleada para preparar y almacenar los reactivos para

oxidasa debe ser lavada escrupulosamente para eliminar restos de materia

orgánica, ya que ésta contribuye a oxidar el reactivo.

2. No realice la prueba de oxidasa a colonias bacterianas crecidas en medios

que contengan glucosa, ya que su fermentación inhibe la actividad de la

enzima y ocasiona falsos negativos.

3. La prueba debe realizarse únicamente a colonias provenientes de medios

no selectivos y no diferenciales.

4. Para la prueba no debe utilizarse el asa corriente (NIHCROME) dado que

ésta, por las trazas de hierro que deja, puede inducir la oxidación del

reactivo y dar falsos positivos.

5. La reacción debe observarse ÚNICAMENTE en la colonia y no alrededor

de ésta.

6. El dimetil- p- fenilendiamina es menos sensible y las colonias viscosas

(mucosas) pueden aparecer como oxidasa negativas por la poca

penetración del reactivo.

97

Anexo 3.

PROCEDIMIENTOS BACTERIOLÓGICOS

PARA LA INOCULACIÓN O INTERPRETACIÓN DE LAS

PRUEBAS BIOQUÍMICAS.

1. AGAR HIERRO TRES AZUCARES (TSI).

A partir de una colonia pura y bien aislada, tomar una asada, utilizando el

asa en punta. Picar el medio hasta el fondo solamente una vez y luego

estriar el “Bisel”. Incubar a 36°C. Por 18 a 24 horas.

Interpretación de las reacciones en TSI:

A- Utilización de los carbohidratos.

1. Fermentación sólo de la glucosa:

Bisel: alcalino (rojo), Fondo: ácido (amarillo).

2. Fermentación de la glucosa y otro azúcar:

Bisel: ácido (amarillo), Fondo: ácido (amarillo).

3. Ninguno de los carbohidratos es fermentado:

Bisel: alcalino (rojo), Fondo: alcalino (rojo).

98

B- Producción de gas.

Positivo:

Burbujas dentro del medio

Rompimiento del medio

Desplazamiento del medio hacia arriba.

Negativo:

No se produce lo anteriormente descrito en el medio.

C- Producción de H2S

Positivo:

Todo el fondo del tubo se observa negro, ó se produce un precipitado

escaso, (se observa un color negro, entre el fondo y el bisel).

Negativo:

No se observa ningún precipitado negro.

2. LA UTILIZACIÓN DEL CITRATO.

99

Se inocula el medio sólido de Simmons a partir de un cultivo puro o colonia

aislada, se estría únicamente el bisel.

Incubar por 24-48 horas a 35- 36°C, en algunos casos puede requerirse una

incubación de 4 días.

INTERPRETACIÓN.

Positivo: Crecimiento con viraje azul del indicador (Control: Citrobacter

freundii).

Negativo: No hay crecimiento ni cambio de color (Control: Escherichia colí

ATCC 25922).

3. PRUEBA DE LA UREASA:

Inocular el medio de urea (caldo o sólido) a partir de una colonia pura, el

más utilizado es el Medio de Christensen, el cual se estría únicamente en el

bisel.

Incubar a 35°C, leer de 6 - 24 horas y dejar hasta 6 días si es necesario.

INTERPRETACIÓN.

Positivo: Color rosado intenso en el bisel (Control: Proteus mirabilis).

Negativo: No hay cambio de color (amarillo) (Control: E. Colí ATCC 25922).

4. PRUEBA DE LA MOVILIDAD.

Deben de inocularse dos tubos de agar movilidad a partir de un cultivo de

18-24 horas, utilizando para ello la aguja bacteriológica e introduciéndola en

el centro hasta una profundidad de 1.5 cm. un tubo se incuba a 35°C por 24-

48 horas y el otro se mantiene durante el mismo período de tiempo a

temperatura ambiente, por cuanto existen bacterias que presentan movilidad

únicamente a temperatura ambiente.

INTERPRETACIÓN

100

Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se observan los tubos inoculados

comparándolos con un tubo sin inocular para determinar si la bacteria es móvil.

Prueba positiva: Se observará migración de la bacteria a partir de la línea de

inóculo que se manifiesta por la aparición de turbidez en el tubo. En bacterias

no fermentadoras puede observarse esta misma migración pero a nivel de la

superficie del medio.

Prueba negativa: La bacteria crecerá solamente a lo largo de la línea de

inoculación y el resto del tubo permanece sin turbidez.

CONTROL DE CALIDAD:

a) Control de esterilidad: 24 horas a 35°C.

b) Control positivo: Escherichia colí y Pseudomonas sp.

c) Control negativo: Klebsiella sp.

5. PRUEBA DE INDOL.

Inocular el microorganismo en un caldo o medio semisólido que contenga

triptófano.

Incubar a 36°C por 24 horas.

Agregar al medio cultivo 5 gotas del reactivo de Kovac y agitar suavemente.

INTERPRETACIÓN

Positivo: Color rojo en el anillo de interfase del reactivo con el medio.

Negativo: No hay cambio de color y el reactivo queda amarillo

Control positivo: E. Colí ATCC 225922.

Control negativo: Enterobacter cloacae.

ROJO DE METILO Y VOGES – PROSKAUER

101

Inocular un tubo de caldo RM-VP con un cultivo puro o con una colonia bien

aislada. Incubar por 18 a 24 horas a 36°C.

INTERPRETACION

ROJO DE METILO (RM).

A partir del tubo incubado con el microorganismo pasar 2. 5 mL a otro tubo

limpio.

Agregar a éste 5 gotas del indicador rojo de metilo.

Positivo:

El indicador permanece rojo.

Negativo:

El indicador cambia a un color amarillo.

VOGES-PROSKAUER (VP):

A los otros 2.5 mL del medio que quedaron del paso anterior, agregarles 6

gotas del reactivo de alfa- naftol ( α - naftol) y luego 2 gotas de KOH al

40%. Agitar fuertemente y luego dejar en reposo por 15 minutos. Se

sugiere agitar de vez en cuando.

INTERPRETACION

Positivo: Color rojo o rosado en el medio.

Negativo: El medio no tiene color o es amarillo.

Control positivo: Klebsiella pneumoniae.

Control negativo: Escherichia Colí ATCC 25922.

102

TABLA PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS.

BACTERIA BISEL FONDO GAS H2S CITRATO UREA INDOL MOVILIDAD

ROJO

DE

METILO

VOGES- PROSKAUER

Proteus

vulgaris

A ó K A + 2-4+ + ó - + + + + -

Proteus mirabilis

K A + 4+ + ó (+) + - + + -/+

Morganella morganii

K A + - - - ó + 1/2

+ + + -

Proteus retgeri

K A -ó +w

- + + + + + -

Providencia stuartii

K A + - + - + + + -

Providencia alkalifaciens

K A - - + - + + + -

Edwarciella torda

K A - + - - + + + -

Yersinia pseudote-berculosis

A A - - - + - -A + -

Yersinia enterocolitica

A A - - - + + ó - -A + -

Pseudomonas aeroginosa

K K - - + - - + - -

Pseudomona flurorecens

K K - - + - - + - -

Pseudomonas multophilia

K K - - - - - + - -

Pseudomonas cepacias

K K - - + ó - - - + - -

Pseudomonas pseudomollei

K K - - + - - + - -

103

Pseudomonas mallei

K K - - + - - - - -

Pseudomonas stutzeri

K K - - - - - - - -

Pseudomonas putrefaciens

K K - + - - - + - -

Alcaligenes fecales

K K - - + ó - - - + ó - - -

Alcaligenes odorans

K K - - + - - + ó - - -

Alcaligenes Denitrificans

K K - - + - - + - -

TABLA PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS.

BACTERIA BISEL FONDO GAS H2S CITRATO UREA INDOL MOVILIDAD

ROJO

DE

METILO

VOGES-PROSKAUER

Escherichia colí A ó K A + ó - - - - + - ó + + -Escherichia colí – Alcalescens dispar

K A - - - - + - + -

Shigella dysenteriae

K A - - - - d - + -

Shigella flexneri

K A - -** - - d - + -

Shigella boydii K A - -*** - - d - + -Shigella sennei K A - - - - - - + -Salmonella sp. K A d D - - - + + -Salmonella Typha

K A - +w - - - + + -

Salmonella paratyphi A

K A + - + + - + + -

Salmonella arizonae

d A + + - - - + - -

Arizona sp. K ó A A + 2-4+ + - - + + -Citrobacter intermedius

A A + - + d + + + -

Citrobacter freundii

K ó A A + 2-4+ + (+) - + + -

Klebsiella pneumoniae

A A + - + + - - - +

Klebsiella ozonae

K A + - D d - - + -

Klebsiella rhinoschleronalis

K A - - - - - - + -

Enterobacter cloacae

A A + - + + - + - +

Enterobacter aerogenes

A A + - + - - + - +

Enterobacter hafnae

K A + - + ó - - - + - -

Enterobacter agglomerans

A ó K A - ó + - + ó - - ó +s - ó + + -/+ +/-

104

NOMENCLATURA.

D = Diferentes tipos de bioquímicas.**= Algunas S. Flexneri serotipo 6 producen.

***= Serotipos 13 y 14 son gas+ -W = reacción débil.

(+) = positivo lento ó tardío.S = débil

A – ácido - negativo.

Pseudomonas aeruginosa. Oxidasa positivaPseudomonas fluorecens Oxidasa positivaPseudomonas multophilia. Oxidasa positivaPseudomonas cepacia. Oxidasa positivaPseudomonas pseudomallei Oxidasa positivaPseudomonas mallei Oxidasa positivaPseudomonas stutzeri Oxidasa positivaPseudomonas putrefaciens. Oxidasa positiva

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