TIPOS DE PCR

PCR anidada Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificaci n es utilizado como moldeó para realizar una segunda amplificaci n con cebadores que se ubican dentro de la primeraó secuencia amplificada. Este tipo de PCR es muy espec ifica.ñ

PCR in situ La PCR in situ consiste en una reacci n de PCR en secciones histol gicas o células, donde losó ó productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificaci n. Es realizada sobreó preparaciones fijas en un portaobjetos. En la técnica de PCR in situ se realiza una primera amplificaci n de ADN blanco y luego detecci n mediante hibridaci n ó ó ó in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades peque simas de genoma. Estañí tecnolog a es de gran alcance en la capacidad de amplificar espec ficamente una poblaci n deí í ó secuencias de menor representaci n.ó

PCR m ltiplexú

PCR en la cual se amplifica m s de una secuencia en una misma reacci n. Emplea dos o m sá ó á pares de cebadores en nico tubo con el fin de amplificar simult neamente, junto con el resto deú á los reactivos de la reacci n en cantidades suficientes. Sus ventajas: se obtiene la informaci n deó ó varios loci en una sola reacci n, menor cantidad de molde para el an lisis, menor cantidad deó á reactivos, r pida construcci n de base de datos.á ó

PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa inversa (como Tth) para realizar la s ntesis de un ADN complementario al ARNí (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR ser a:í

• 1º paso: retrotranscripci n a partir del ARN.ó

• 2º paso: aplicaci n a partir de la primera hebra de ADNc.ó

• 3º paso: PCR est ndar.á

PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR) Reacci n de PCR cuya principal caracter stica es que permite cuantificar la cantidad de ADN oó í ARN presentes en la muestra original, o para identificar con una muy alta probabilidad, muestras de ADN espec ficas a partir de su temperatura de fusi n (Tm, melting temperature).í ó

Se puede dividir en las técnicas basadas en fluorocromos no espec ficos y en las técnicas basadasí en sondas espec ficas.í

En las técnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve multiplicada su cantidad con cada ciclo, se une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por

el termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite cuantificar s lo una secuencia poró reacci n pero tiene la ventaja de utilizar cebadores normales para su realizaci n. Es mucho m só ó á econ mica que la que usa sondas espec ficas.ó í Las técnicas basadas en sondas espec ficas utilizan una í sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse); cuando la sonda est intacta, presenta una transferencia energética de fluorescencia por resonancia (FRET).á Dicha FRET no se produce cuando la sonda est da ada y los dos fluorocromos est n distantes,á ñ á producto de la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio del patr n de ó fluorescencia y deducir el nivel de amplificaci n del gen.ó La mayor a de estos inconvenientes se han solucionado con la introducci n de la PCR realizadaí ó en tiempo real (Q-PCR), que elimina cualquier proceso post-PCR puesto que monitoriza la progresi n de la amplificaci n en el momento en que ocurre. A diferencia de la PCR convencionaló ó (en punto final), que mide la acumulaci n del ADN al final de un n mero predeterminado deó ú ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el proceso de amplificaci n usando fluorescencia, deó forma que su aumento es proporcional a la cantidad de ADN formada. El proceso se puede automatizar f cilmente usando un sistema que realice la amplificaci n (termociclador) y que a suá ó vez sea capaz de leer fluorescencia. Existe una amplia oferta de aparatos en el mercado. La mayor a pueden trabajar con las diversas opciones de marcado fluorescente y son "abiertos", esí decir, permiten programar las condiciones de amplificaci n y lectura de forma que su uso noó queda limitado a unos reactivos determinados.

VARIACIONES DE LA PCR

• PCR específica de alelo: esta técnica de diagnóstico o clonación es usada para identificar o utilizar los polimorfismos de una sola base (SNPs). • PCR "assembly": consiste en la síntesis artificial de largas secuencias de ADN, realizando para ello la PCR en un fondo de oligonucleótidos largos con secuencias solapantes cortas. • PCR asimétrica: es usada para amplificar preferentemente una cadena del ADN original con respecto a la otra. • PCR de colonia: mediante esta técnica, colonias de bacterias Escherichia coli pueden ser rápidamente examinadas para construcciones viables de vectores de ADN. • Amplificación dependiente de helicasa: esta técnica es muy parecida a la PCR convencional, pero en ella se emplea la enzima helicasa y una temperatura constante en lugar de la polimerasa de ADN y los ciclos repetidos de desnaturalización-extensión. • PCR hot-start: esta técnica reduce la amplificación inespecífica durante las etapas iniciales de la PCR. • PCR específica de intersecuencia (ISSR): se trata de un método de PCR para su uso en huella genética, que amplifica regiones entre repeticiones de secuencia simple para producir una huella genética única de longitudes de fragmento amplificadas. • PCR inversa: es un método usado para poder realizar la PCR cuando sólo es conocida una secuencia interna. Muy útil en la identificación de secuencias que flanquean insertos genómicos. • PCR mediada por ligación: este método usa pequeños linkers de ADN ligados al ADN de interés y múltiples cebadores hibridando estos linkers. • PCR específica de metilación (MSP): se usa para detectar metilaciones en islas CpG de ADN genómico. • Amplificación Múltiple Dependiente de Sonda (Multiplex Ligation-dependent

Probe Amplification o MLPA): permite amplificar varias secuencias objetivo con un único par de cebadores, evitando así las limitaciones de resolución de la PCR multiplex. • PCR cuantitativa: se usa para medir la cantidad de un producto de PCR (preferentemente en tiempo real). • PCR-TAIL: la PCR termal de entrelazado asimétrico es usada para aislar una secuencia desconocida que flanquea una secuencia conocida. • PCR touchdown: se trata de una variante de la PCR que se emplea cuando se desconoce la secuencia exacta de los extremos de la secuencia a amplificar, de modo que se asume que puede existir alguna base desapareada en el alineamiento cebador-secuencia. Su finalidad es reducir el fondo no específico bajando gradualmente la temperatura de hibridación a lo largo del progreso de la PCR. • PAN-AC: este método usa condiciones isotermas para la amplificación, y puede ser usado en células vivas.