Fundamentos de PCR

Dr. José A. Cardé-SerranoDr. Jesús Lee-BorgesDra. Liza JiménezDr. José M. PlanasBiol 4207 – Lab de Virologia y BiotecnologiaUniversidad de Puerto Rico - Aguadilla

Objetivos

Estudiar los pasos que componen la reacción de PCR

Discutir factores importantes en la optimización de esta técnica

Conocer Aplicaciones Preparar una reacción de PCR e incubarla

en el termociclador.

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

PCR es básicamente una técnica de amplificación del ADN.

PCR

amplificación

ADN

(molécula sencilla)

Muchasmoléculas

PCRDolan Learning Center

Biology Animation LibraryCSHL

Historia

1985 – se crea la técnica molecular conocida como “PCR”

Kary B. Mullis, Coorporacion CETUS Premio Nobel en

Química 1993

Procedimiento del “PCR”

Desnaturalización Hibridización Extensión

Desnaturalización

Calor del ADN 94°C. Filamentos dobles

se derriten. Hay una separación

física de las dos cadenas.

Hibridización

La temperatura se reduce a 54°C. Movimiento Browniano.

El movimiento que lleva a cabo una partícula muy pequeña que esta inmersa en un fluido

Enlaces de hidrógeno. Filamento de ADN. Bases construidas.

Extensión o Polimerización

Temperatura de polimerasas 72°C. Los “primers” tienen una fuerte

atracción al molde o templado Los “primers” sin exacto pareo se

pierden. No dan extensiones de fragmento. El procedimiento se repite y se forman

copias del ADN.

LINK

Síntesis por DNA polimerasa

-A T G C A T G C A T G C * *

A C G-T

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

Cortos primers de ADN específicos hibridizan con la cadena que tiene que ser copiada

5’ 3’

Síntesis por DNA polimerasa

-A T G C A T G C A T G C * *

A C G T-T

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

5’ 3’

Síntesis por DNA polimerasa

-A T G C A T G C A T G C * *

A C G T-T A5’ 3’

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

Síntesis por DNA polimerasa

-A T G C A T G C A T G C * *

A C G T-T A C

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

5’ 3’

Síntesis por DNA polimerasa

-A T G C A T G C A T G C * *

A C G T-T A C G

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

5’ 3’

Síntesis por DNA polimerasa

-A T G C A T G C A T G C * *

A C G T-T A C G T

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

5’ 3’

Síntesis por DNA polimerasa

-A T G C A T G C A T G C * *

A C G T-T A C G T A

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

5’ 3’

Primero, la fusión separa las dos cadenas de ADN a alta temperatura (~100°C)

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias

Fusión95°C

Hibridización50-60ºC

Extensión deLa cadena

75ºCPrimer Ciclo

2do Ciclo95ºC

50 - 60ºC75ºC

Múltiples ciclos darán un incremento exponencial en el número de copias

PCR LINK

Hay 6 componentes esenciales en el proceso de PCR

ADN polimerasa termoestable Oligonucleotidos iniciadores (“primers”) Desoxiribonucleótidos trifosfatados

(dNTPs) Cationes divalentes Buffer (para mantener el pH) ADN molde (Templado)

ADN polimerasas termoestables

Llevan a cabo la síntesis de ADN dependiente del templado.

Estabilidad – Taq: 9 min at 97°C, Pwo >2 hr a 100°C Fidelidad – Taq: baja, Pfu: alta Algunas presentan actividad transferasa terminal en el

extremo 3´, ej. Taq agrega una A al extremo 3´, especialmente si en el extremo hay una C. Pwo y Tli generan extremos romos

Cantidad usada = 5 x 1012 moléculas (1.5 unidades) La mas comúnmente usada = Taq ADN polimerasa

Taq Thermus aquaticus, Pwo Pyrococcus woesei, Pfu Pyrococcus furiosus, Tli Thermococcus littoralis

Oligonucleótidos iniciadores (primers)

Se conoce su secuencia Es el factor mas importante para la

eficiencia y la especificidad del proceso Deben estar presentes en exceso (1013 = 30

ciclos, 1 kb) Requieren de un cuidadoso diseño Reglas de diseño:

(a) longitud = 18-25 bases (b) Contenido de G+C entre 40-60%(c) Evitar las secuencias repetidas

Evitar las secuencias repetidas

5´5´

3´3´

5´5´3´

3´

Dímero de primer

PCR

3´ repetido

5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’

5’-NNNNNNNNTATA-3’ 3’-ATATNNNNNNNN-5’

Evitar las secuencias repetidas

5´5´

3´3´

no hay extensión

PCR

5´ repetido

5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´

5´-TATANNNNNNNN-3´3´-NNNNNNNNATAT-5´

5´5´

3´3´

Evitar las secuencias repetidas

5´

5´

3´

3´

Productos de PCR no deseados

PCR

Formación de horquillas

5’-NNNNNNNNNNNGCATGC-3’5’-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

5’-NNNNNNNNNNNGCA 3’-CGT

5´3´

ADN molde (templado)

Puede ser ssADN o dsADN (simple o doble cadena)

ADN circular y cerrado es levemente menos efectivo que el ADN lineal

Usualmente se utilizan varios miles de copias, ej: 1 µg de humano, 10 ng de levadura, 1 ng de bacteriano o 1 pg de plasmídico

Se puede amplificar a partir de una sola molécula de ADN molde, pero las condiciones deben estar muy optimizadas

El ciclo de PCR

Desnaturalización - 94-95°C por 45 segundos si G+C < 55%

Temperatura de hibridización (Annealing) – debe ser calculada o determinada empíricamente para cada par de primers demasiado alta = poco o nada de producto demasiado baja = annealing no específico =

productos incorrectos Extensión - a la temperatura óptima de la

ADN polimerasa utilizadaej.: 72°C para Taq

Variantes de la PCR

Touchdown PCR Colony PCR Multiplex PCR Hot start PCR Nested PCR Inverse PCR Long PCR Quantitative “real time” PCR

Multiplex PCR Describe una PCR en la cual hay presentes

múltiples pares de primers (hasta 8) lo que da una serie de productos. Los mismos pueden verse como múltiples bandas en un gel de agarosa

Multiplex PCR es frecuentemente usada en diagnóstico médico

Ahorra templado, tiempo y gastos Requiere una cuidadosa optimización

Nested PCR

A veces 1 ronda de PCR no da un producto único a partir de un templado complejo, apareciendo un “esparcido”

Se puede resolver utilizando un segundo par de primers que hibriden un poco mas internamente que los primeros

Realizar una segunda ronda de PCR usando el producto de la primera (esparcido)

Rinde un producto único porque solo el fragmento correcto de ADN posee los sitios correctos de hibridización para el segundo par de primers

Nested PCR

2da PCR

Esparcido de ADN

1era PCR

ADN específico

Clonado con PCR: clonado T-A 3’-A

A-3’

AA

Ligamiento con extremo adhesivo de 1 base = 50 veces mejor que ligamiento con extremos romos

ligamiento

Producto de PCR a partir de Taq

Vector con cola-T

Mutagénesis por PCR

Introduce cambios de secuencia dentro de fragmentos (clonados) de ADN

El método de extensión solapada requiere 2 primers mutagénicos y otros 2

Amplifica un fragmento 5´ y un fragmento 3´ que se solapan. Ambos portan la mutación

Usa los productos en otra reacción para producir el ADN mutado de longitud completa

Dos 1ras PCRs

separadas

Primer SP6 Primer mutagénico directo (forward)

primer mutagénico inverso (reverse) Primer T7

X

x

x

x

remover primers, desnaturalizar y re-hibridizar

2da PCR

Mutagenesis con PCR- extension solapada

Para amplificar copias de cADN de ANR Es especialmente útil cuando solo se dispone de pequeñas

cantidades de ANR Frecuentemente usada para amplificar genes específicos

(como cANDs) si algo de su secuencia es conocida Requiere primer “antisense” y un AND polimerasa

dependendinte de ANR Puede ser usada para construir bibliotecas de cAND Primero se hace un cAND a partir del templado de ARN Luego se usa un segundo primer (“sense”) para hacer el

duplex de cAND por PCR

RT-PCR = PCR con transcriptasa reversa

RT-PCR LINK

AAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTT-5’

Transcripción reversa

PCR usando GSP+GSP1

AAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTT-5’

mANR(sense)

Primer Antisense:oligo(dT)o

1ra cadena cDNA

GSP1 (sense)

GSP (antisense)

GSP1

GSP

Requiere el conocimiento de la secuencia para diseñar GSP and GSP1

Real Time - PCR

-Alta especificidad

-Usa primers marcados con moleculas fluorescentes

- Resultados son no solo cualitativos sino cuantitativos

-Sensitividad mucho mayor

-LINK

Parte Práctica

Amplificación de DNA de Fago λ

Lambda ADN

Bacteriófago Lambda (λ) Aislado de E. coli W3110 (c/857 sam7

strain) Usado como sustrato para enzimas de

restricción Peso molecular 31.5×106 daltons y

genoma de 48502 pares de bases

Secuencia de Lambda DNA

Sanger et al. 1982 J. Mol. Biol. 162: 729-773

Protocolo Seguir el protocolo delineado en el “PCR AMplificatiom Kit” Cat. #R011

React Vol (ul) [ ] Fin [ ] Ini

PCR Buff 5 1x

dNTP Mix 4 200uM

Primer 1 0.5 0.2uM

Primer 2/3 0.5 0.2uM

Taq Pol 0.25 1.25U/50ul -

DNA Temp 0.5 0.5ng/50ul -

dH20 50 (39.25) - -

Total 50 - -

Sondas control

Sonda control 1 5’-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACT-3’

Sonda control 2 5’-CCACATCCATACCGGGTTTCAC-3’

Sonda control 3 5’-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-3’

¿Preguntas?

Preguntas

Muy poco magnesio no produce suficiente producto de PCR y mucho produce bases pareadas erróneas, ¿por qué?

Al escoger los “primers” es importante evitar secuencias que sean complementarias entre estos, ¿por qué?

¿Como cambiaria el producto del PCR si en vez de amplificar ADN viral se amplificara ADN bacteriano (este ADN es metilado)?

Asignación

Hacer un reporte con la secuencia de λ y donde en ella se pegan los primers usados.

Demostrar la complementaridad y la secuencia comprendida en la amplificación.