INFORME FINAL DEL PROYECTO SIP (2008)

“Aislamiento y efecto benéfico potencial de bacilos en el crecimiento y supervivencia de juveniles de camarón blanco Litopenaeus vannamei,

cultivados en el laboratorio” Responsable: Dr. Antonio Luna González Institución: Centro Interdisciplinario de Investigación

para el Desarrollo Integral Regional-IPN (Unidad Sinaloa)

Dirección: Bulevard Juan de Dios Bátiz Paredes #

250. Colonia San Joachin. C.P. 81100. Guasave, Sinaloa.

Correo electrónico: aluna@ipn.mx, tonol69@yahoo.com Teléfono: 687 87 2 96 26 extensión 87621 Fecha de inicio: Enero de 2008 Periodo que se reporta: Enero-diciembre.

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Resumen

Se aislaron cepas de bacilos del intestino de camarón blanco Litopenaeus vannamei. La

supervivencia fue alta en todos los tratamientos. La supervivencia en el control fue del 97 % y

del 100% en los tratamientos con bacterias. No se encontró una ganancia significativa en peso

en los organismos tratados con bacterias en el alimento. Debido a lo anterior, no se realizó la

identificación molecular de las bacterias, pues está sólo se recomienda cuando los organismos

tienen un efecto benéfico demostrado. A pesar de lo anterior, los bacilos probados en el

experimento no se desecharán y se utilizarán en experimentos futuros para degradar materia

orgánica en los estanques de cultivo de camarón (bioremediación). En este proyecto está

trababajó una alumna de maestría (tesis en proceso) y tres alumnos PIFI.

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INTRODUCCIÓN

La salud de las especies acuáticas está influenciada por interacciones entre el medio

ambiente, los patógenos y el huésped. El cultivo de camarón puede degradar el medio

ambiente causando un significativo estrés en el camarón (Capy et al., 2000). Esto puede

hacerlos más susceptibles a las enfermedades (Lee & Wickins, 1992).

En los sistemas de producción de camarón, muchos patógenos potenciales, tales como

las bacterias, hongos y virus (Martínez-Córdova, 1992), co-existen con el camarón sin causar

un impacto negativo en la producción (Flegel y Pasharawipas, 1998; Spann et al., 2000; Vidal

et al., 2001). Sin embargo, algunas infecciones inactivas pueden desarrollarse en

enfermedades agudas si el camarón está estresado, lo cual provoca pérdidas significativas en

esta industria (Cowley et al., 2000; Vidal et al., 2001).

En los laboratorios de producción larvaria y de engorda de camarón, el único método

practicado para el manejo de las poblaciones bacterianas indeseables ha sido el uso de

quimioterapéuticos, sin embargo, éstos afectan tanto a las bacterias indeseables como a las

benéficas (Balcázar, 2002) y además, puede resultar en la selección de cepas resistentes de

bacterias (Weston, 1996). Tal resistencia puede ser rápidamente transferida a otras cepas, ya

sea por alteraciones en el genoma existente o por transferencia de material genético entre

células a través de plásmidos o bacteriófagos (Tower, 1995). La aparición de cepas bacterianas

resistentes a los antibióticos eleva los costos y reduce la efectividad de los tratamientos y

además posee un riesgo para el medioambiente natural (Son et al., 1997).

Una alternativa para el control de enfermedades es la prevención. Bajo este principio

ha surgido el empleo de microorganismos benéficos llamados probióticos como control

biológico en la prevención de ataques bacterianos (Balcázar, 2002).

En acuicultura, el término probiótico se define como un suplemento microbiano

formado por un cultivo simple o mixto de microorganismos seleccionados que son

adicionados con el propósito de manipular las poblaciones bacterianas presentes en los

sistemas de producción (Balcázar, 2002). Los mecanismos de acción de los probióticos son los

siguientes (Balcázar, 2002):

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· Competencia por sitios de fijación con bacterias patógenas

· Mejoramiento de la nutrición por el suministro de nutrientes esenciales

· Incremento de la digestión por el suministro de enzimas esenciales

· Eliminación directa de materia orgánica disuelta mediada por la bacteria

· Producción de sustancias que inhiben el crecimiento de patógenos oportunistas

· Producción de sustancias inmunoestimulantes

En los camarones peneidos se han realizado importantes estudios sobre el uso de

probióticos en los cultivos larvarios, de juveniles y adultos. Rengpipat et al. (1998, 2000)

encontraron que la cepa Bacillus S11 mejora el crecimiento, la supervivencia y la capacidad

inmune de Penaeus monodon. Gullian et al. (2004) mencionan que en camarones peneidos, la

cepa Vibrio P62 tiene importante efecto benéfico, mientras que Bacillus P64 tiene un

importante efecto inmunoestimulante. Jiqiu et al. (2006) demostraron que la cepa bacteriana

Arthrobacter XE-7 mejora la supervivencia de poslarvas de 10 días de edad de Penaeus

chinensis retadas con vibrios patógenos. En Fenneropenaeus indicus, las cepas de Bacillus

spp. mejoran significativamente la tasa de conversión alimenticia y el crecimiento (Ziaei-

Nejad et al., 2006). También los probióticos han sido empleados para mejorar el crecimiento

larvario en Litopenaeus vannamei obteniendo resultados satisfactorios (Garriques & Arévalo,

1995; Intriago et al., 1998).

La modificación de la flora bacteriana del agua de cultivo mediante el uso de probióticos

ha sido demostrada en el mejoramiento del cultivo de larvas de crustáceos (Nogami & Maeda,

1992; Garriques & Arévalo, 1995). Así mismo, se ha sido sugerido que el mantenimiento de una

comunidad bacteriana natural y equilibrada puede beneficiar los cultivos de camarones peneidos

(Alabi et al., 1997).

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OBJETIVO GENERAL

Evaluar el efecto de bacilos con potencial probiótico en el crecimiento y la

supervivencia de camarón blanco Litopenaeus vannamei, cultivado en el laboratorio.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Objetivos Específicos 1.- Aislar cepas de bacilos y vibrios del tracto digestivo de juveniles y adultos de camarón

blanco.

2.- Caracterizar parcialmente las cepas de bacilos aisladas, determinando su actividad

hemolítica, antagonismo contra vibrios, forma y arreglo celular.

3.- Evaluar el efecto de las bacterias en el crecimiento y la supervivencia de los camarones.

4.- Identificar las cepas de bacilos al nivel de especie por medio de PCR.

METODOLOGÍA

Aislamiento de cepas presuntivas de vibrio

La extracción de intestinos se realizó en juveniles y adultos de L. vannamei. Cada

muestra individual de intestino se maceró en un mortero con 2 mL de agua destilada. Se

realizó una siembra (50 µL) por estría cruzada en cajas de Petri con medio TCBS,

incubándose a 37 °C, por 24 h. Las colonias aisladas fueron resembradas en cultivo masivo en

cajas de Petri con medio TCBS e incubadas a 37 ºC, por 48 h. Las cepas se cosecharon y se

almacenaron a –85 °C en medio Tripticasa de Soya caldo (TSC) y 15 % (v/v) de glicerol. Se

realizó un cultivo de 24 h en TSC para contar las UFC. Las bacterias se centrifugaron a 8000 x

g y se resuspendieron en 1 mL de solución salina (NaCl 3 %) estéril. La solución bacteriana se

ajustó a una densidad óptica de uno en un espectrofotómetro Therrmo Spectronic Genesys 2

(Thermo Scientific) con una longitud de onda de 580 nm. Se determinaron las UFC/mL para

cada cepa, utilizando el método de diluciones seriadas decimales.

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Aislamiento de cepas presuntivas de bacilos

Un volumen de 1.5 mL del macerado utilizado para aislar vibrios se colocó en tubos

de ensayo y se incubó a 80 °C por 10 min con la finalidad de eliminar las células vegetativas

bacterianas y dejar sólo aquellas que forman esporas (como Bacillus sp.). Posteriormente se

sembraron por estría cruzada las muestras (50 µL) en medio Tripticasa de Soya agar (TSA)

con 3 % NaCl, incubándose a 37 °C, por 24 h. Las colonias aisladas fueron resembradas en

cajas con TSA-NaCl 3 % e incubadas a 37 ºC, por 48 h. Las colonias aisladas y sembradas en

cultivo masivo se cosecharon y almacenarán a –85 °C en medio TSC-NaCl 3% y 15% (v/v)

de glicerol. Se realizó un cultivo de 24 h en TSC-NaCl 3 % para contar las unidades

formadoras de colonias (UFC). Se inocularon 50 µL de la cepa stock en 50 mL del medio.

Las cepas fueron contadas utilizando el método de diluciones decimales seriadas,

directamente del cultivo sin centrifugar y agitando antes de tomar la muestra.

Actividad hemolítica de cepas presuntivas de bacilos

La actividad hemolítica de las cepas aisladas fue determinada de acuerdo a Cowan y

Steel’s (1993).

Para la realización del ensayo se prepararon placas de Petri con base de agar con 5 %

de sangre humana. Se hicieron perforaciones de 6 mm de diámetro en la placa con una pipeta

Pasteur de vidrio estéril. Las cepas se cultivaron en TSC-NaCl 3 % a 37 ºC por 24 h y se

centrifugaron a 3000 x g, por 5 min. El sobrenadante (50 µL) se inoculará en los pozos y las

placas se incubarán a 37 ºC, por 24 h. Se midió y analizó el halo de lisis para determinar el

tipo de hemólisis (alfa, beta o gama).

Actividad inhibidora de cepas presuntivas de bacilos contra vibrio

Se determinó el efecto antagónico de cada cepa de bacilos en contra de cepas de vibrio

(aisladas previamente). El método consistió en sembrar por esparcimiento aproximadamente

50,000 UFC de vibrio en cajas de Petri con medio TSA con NaCl 3 %. Por cada placa se

realizaron 5 orificios de aproximadamente 6 mm de diámetro, distribuidos homogéneamente.

En cada pozo se inocularon 40 µL del sobrenadante de un cultivo de bacilos de 24 h (medio

TSC-NaCl 3 %). Las placas se incubaron por 48 h a 37 ºC, realizó la lectura (medición del

halo de inhibición) a las 24 y 48 h.

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Determinación de la tinción Gram, forma celular y arreglo celular

Se realizó la tinción de Gram en las cepas que no tengan actividad hemolítica. Para

este análisis se usó un kit comercial. Lo anterior sirvió no solo para determinar si las cepas

son Gram (+) o Gram (-), sino que también se determinó la forma y el arreglo celular de cada

una de ellas.

Obtención de juveniles y análisis de mancha blanca

Los camarones para los bioensayos (1-2 g) se obtuvieron de la empresa Aracelita

Acuacultores S.P.R. de R.I. de Guasave, Sinaloa. La extracción del ADN se hizo con 100 mg

de tejido de pleopodos con el reactivo DNAzol (Invitrogen). El ADN obtenido fue

cuantificado espectrofotométricamente a 260 nm. Los oligos que se utilizaron en la primera

ronda de la PCR sencillo serán WSSV1 out (sentido) 5’-ATC ATG GCT GCTTCA CAG AC

3’ y WSSV2 out (contrasentido) 5’-GGC TGG AGA GGA CAA GAC AT 3’. Para la segunda

ronda de amplificación (PCR anidada) serán WSSV1 in (sentido) 5’-TCT TCA TCA GAT

GCT ACT GC 3’ y WSSV2 in (contrasentido) 5’-TAA CGC TAT CCA GTA TCA CG 3’. El

tamaño esperado del fragmento de la primera PCR es de 982 pb y de 570 pb para la PCR

anidada. La mezcla de reacción para la PCR sencilla y la anidada se realizó en tubos

Eppendorf de 0.2 mL e incluirá 0.4 mM de dNTP, 4 mM de MgCl2, 0.5 µM de primers

(WSSV), 1.25 U de Taq ADN polimerasa (Promega) y 1x de búfer Taq. El volumen de la

reacción fue de 25 µL. En las reacciones de la PCR sencilla se utilizaron de 2 a 3 ng de ADN.

Para la PCR anidada se utilizará 1 µL de ADN de una dilución 1:100 de la reacción de PCR

sencilla. La amplificación se realizó en un termociclador iCycler (Biorad) usando el siguiente

programa: desnaturalización inicial a 95 °C por 4 min, 40 ciclos a 95 °C por 1 min, 55 °C por

30 s, 72 °C por 1 min y una extensión final a 72 °C por 5 min. Los fragmentos amplificados se

visualizaron (incluido un marcador de peso molecular de 1 kb) en un gel de agarosa al 1 %,

teñido con bromuro de etidio. La visualización del gel se hizo con luz UV.

Incorporación de la mezcla de cepas presuntivas de bacilos al alimento

balanceado

La incorporación de la mezcla de bacilos en el alimento balanceado (Camaronina®) se

hizo por medio del atractante y ligante (Dry Oil®, Innovaciones Acuícolas S.A. de C.V.),

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siguiendo las instrucciones del fabricante. También se impregnó de Dry Oil el alimento para el

control sin bacterias. Las cepas presuntivas de bacilos fueron cultivadas, cosechadas y

contadas por el método de diluciones seriadas decimales. Se agregaron al alimento por medio

de aspersión.

El alimento con bacterias se secó a temperatura ambiente durante 5 h, revolviendo

manualmente cada hora. Se hizo un conteo de UFC/g de alimento cada 15 días durante tres

meses para determinar la viabilidad de las bacterias en el alimento.

Los organismos se alimentaron con una ración equivalente al 6.5 % del peso corporal,

2 veces al día (08:00 y 18:00 h). Se hizo un recambio del 50 % de agua cada 5 días. La

limpieza diaria se hizo por sifoneo y el agua desechada se repondrá inmediatamente.

Evaluación del efecto del alimento con bacilos en camarón

El primer bioensayo duró 55 días y se utilizaron tinas de plástico con capacidad de 120

L con 80 L de agua de mar. En cada tina se colocaron 10 organismos. Los tratamientos se

hicieron por triplicado: 1) control alimentado con camaronina más Dry Oil; 2) camaronina +

mezcla de bacilos (1 x 104 UFC/g); 3) camaronina + mezcla de bacilos (5 x 104 UFC/g); 4)

camaronina + mezcla de bacilos (1 x 105 UFC/g). Los organismos fueron alimentados al inicio

a razón de 6.5 % del peso corporal, 2 veces al día (08:00 y 18:00 h), siguiendo la tabla de

alimentación de Purina. Se hizo un recambio del 50 % de agua cada 5 días. La limpieza diaria

se hizo por sifoneo. Las condiciones del cultivo fueron: temperatura = 26±1.0 °C, pH= 7.0-

8.5, salinidad = 36±2‰, Oxígeno disuelto ≈ 5 mg/L y fotoperíodo natural. Se midió

diariamente la temperatura, el ph, el oxígeno disuelto y la salinidad. Se registró diariamente la

supervivencia y el peso cada 15 días. La toma de los nutrientes (amonio, nitritos y nitratos) se

realizó cada 15 días por métodos químicos ya estandarizados internacionalmente. Al final del

experimento se determinó el factor de conversión alimenticia.

Tasa de crecimiento específico

La tasa de crecimiento específico (TCE) se calculó de la siguiente manera:

TCE = 100 (LN W2 – LN W1)/ T

Donde: W2 es el peso final, W1 el peso inicial y T es el número de días de cultivo.

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Análisis estadístico

Para comparar la supervivencia y el peso de los organismos, se hizo un análisis de

varianza de una vía (ANOVA) usando la prueba F para analizar las diferencias entre

tratamientos con microorganismos y el control sin microorganismos. Los valores de F<0.05

serán considerados significativamente diferentes. Cuando existan diferencias significativas

(Daniels, 1979), se utilizó un análisis a posteriori, usando la prueba de Tukey (HSD) para

identificar la naturaleza de estas diferencias (p<0.05).

RESULTADOS

Aislamiento de cepas presuntivas de vibrio

Se aislaron dos cepas presuntivas de vibrio (CIV1 y CIV2) del tracto digestivo de

camarón, las cuales fueron utilizadas para realizar la prueba de antagonismo.

Aislamiento, pruebas de hemólisis y antagonismo de cepas presuntivas de bacilos

Se aislaron 45 cepas presuntivas de bacilos de L. vannamei, 26 del intestino y 19 del

hepatopáncreas. Veintinueve cepas presentaron hemólisis β (total), 11 hemólisis α (parcial) y

cinco hemólisis γ (sin halo de lisis). De las 5 cepas que presentaron hemólisis γ, solamente una

presentó inhibición (halo de 9 mm) contra las cepas de vibrio (Tabla 1). A las cepas con

hemólisis β ó α no se les realizó la prueba de actividad inhibidora contra vibrio.

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Tabla 1. Cepas presuntivas de bacilos aislados del intestino y hepatopáncreas de camarón Litopenaeus vannamei. Prueba de hemólisis y antagonismo contra vibrio. HICV= Halo de inhibición contra vibrio (mm). HSH= Hemólisis en sangre de humano. HHC= Hemólisis en hemolinfa de camarón. ND= no determinado.

Cepa HSH HHC HICV (mm) Cepa HSH HHC HICV

(mm) HB1 β ND BC1 11 β ND

CHB2 β ND BC1 12 β ND CHB3 β ND BC2 13 β ND CHB4 β ND BC2 14 β ND CHB5 β ND BC2 15 β ND CHB6 β ND BC1 16 γ 0 CHB7 β 0 BC1 17 β ND CHB8 γ ND BC1 18 β ND CHB9 β ND BC1 19 β ND

CHB10 γ 0 BC1 20 β ND CHB11 β ND BC1 21 β ND CHB12 β ND BC2 22 β ND CHB13 β ND CIB1 γ 9 BC2 1 β ND CIB2 α ND BC2 2 β ND CIB3 γ 0 BC2 3 β ND CIB4 α ND BC2 4 β ND CBH1 α ND BC2 5 α ND CBH2 α ND BC2 6 α ND CBH3 α ND BC2 7 β ND CBH4 α ND BC2 8 β ND CBH5 α ND BC2 9 α ND CBH6 α ND BC2 10 β ND

Actividad enzimática de las cepas presuntivas de bacilos seleccionadas

Todas las cepas (BC116, CIB1, CIB3, CHB8 y CHB10) con hemólisis γ presentaron

actividad moderada de la enzima naftol-AS-BI-fosfohidrolasa. Las cepas BC116, CIB1 y

CHB8 presentaron actividad de la fosfatasa alcalina. Las cepas BC116 y CHB8 presentaron

actividad de la enzima fosfatasa ácida. Las cepas CIB1, CIB3 y CHB10 presentaron las enzimas

esterasa (C4) y esterasa Lipasa (C8). Las cepas CIB1, y CIB3 presentaron actividad de la

enzima α-glucosidasa (Tabla 2).

11

Tabla 2. Actividad enzimática de las cepas presuntivas de bacilos. Los números indican la cantidad de sustrato hidrolizado en nM.

Cinética de crecimiento de cepas con potencial probiótico

En la figura 1 se observan los resultados de la absorbancia contra el tiempo en horas de

cinco cepas seleccionadas con potencial probiótico. Las cepas BC116, CIB3, CHB8 y CHB10

tienen una fase exponencial de aproximadamente 20 h, mientras que la cepa CIB1 presenta

una fase exponencial de aproximadamente 46 h.

Enzima BC116 CIB1 CIB3 CHB8 CHB10

Control 0 0 0 0 0

Fosfatasa Alcalina 2.5 2.5 0 10 0

Esterasa(C4) 0 10 10 0 2.5

Esterasa Lipasa (C8) 0 5 10 0 2.5

Lipasa (C14) 0 0 0 0 0

Leucina Arilamidasa 0 0 0 0 0

Valina Arilamidasa 0 0 0 0 0

Cistina arilamidasa 0 0 0 0 0

Tripsina 0 0 0 0 0

α-Quimotripsina 20 0 0 0 0

Fosfatasa Acida 0 0 0 20 0 Naftol-AS-BI-Fosfohidrolasa 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5

α-Galactosidasa 0 0 0 0 0

β-Galactosidasa 0 0 0 0 0

β-Glucoronidasa 0 0 0 0 0

α-Glucosidasa 0 10 10 0 0

β-Glucosidasa 0 0 0 0 0 N-acetil-Beta-glucosaminidasa 0 0 0 0 0

α-Mannosidasa 0 0 0 0 0

α-Fucosidasa 0 0 0 0 0

12

Cinetica de crecimiento

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78

Tiempo (horas)

Abs

orba

ncia

(580

nM

)

Cepa 1Cepa 2Cepa 3Cepa 4Cepa 5

Figura 1. Crecimiento de cepas presuntivas de lactococos cultivadas en TS

caldo 37 ºC. Monitoreo de la viabilidad bacteriana en el alimento

Se preparó alimento con tres bacterias (seleccionadas con base en las pruebas

anteriores) y se guardó a temperatura ambiente para ver su viabilidad. El conteo bacteriano

(Fig. 2), después de añadirlas al alimento dio como resultado 6 x 104 UFC/g. En el día 11, el

conteo se fue de aproximadamente 3 x 104 UFC/g. En el último muestreo del día 21, el

número de UFC por gramo fue de aproximadamente 2 x 104.

13

010,00020,00030,00040,00050,00060,00070,000

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21

Tiempo en días

UFC

/g

Figura 2. Viabilidad de la mezcla de cepas presuntivas de bacilos en el alimento durante 21 d. El alimento se almacenó a temperatura ambiente. Determinación de WSSV

Al inicio del experimento sobre el efecto de los bacilos en el crecimiento y

supervivencia, se analizaron los camarones para ver si traían el WSSV de la granja. El

resultado fue negativo, sin embargo, si eran portadores del virus de la necrosis infecciosa

hipodermal y hematopoyética (IHHNV, por sus siglas en inglés).

Efecto de bacilos en el crecimiento en peso y supervivencia de Litopenaeus vannamei

La supervivencia final en el control fue de 97 % y en los tratamientos con bacterias fue

del 100 % (Fig. 3). Respecto al crecimiento, la TCE en el control fue de 2.6 ± 0.4 (%/d), en el

tratamiento con camaronina + mezcla de bacilos (1 x 104 UFC/g), 2.43 ± 0.05 (%/d), en el

tratamiento con camaronina + mezcla de bacilos (5 x 104 UFC/g), 2.56 ± 0.03 (%/d) y en la

camaronina + mezcla de bacilos (1 x 106 UFC/g) 2.47 ± 0.11 (%/d) (Fig. 4). No hubo

diferencias significativas entre tratamientos (p>0.05).

14

0102030405060708090

100

Control 1x10-5 5x10-5 1x10-6

Tratamientos

Sup

ervi

venc

ia (%

)

Figura 3. Supervivencia final de Litopenaeus vannamei.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Control 1x10-5 UFC/g 5x10-5 UFC/g 1x10-6 UFC/g

Tratamientos

TCE

(%/d

)

Figura 4. Tasa de crecimiento específico (TCE) de Litopenaeus vannamei. Barras de error = promedio ± EE. No hubo diferencias significativas entre tratamientos (p>0.05).

Análisis de los resultados

La supervivencia fue alta en todos los tratamientos. La supervivencia en el control fue

del 97 % y del 100% en los tratamientos con bacterias. No se encontró una ganancia

significativa en peso en los organismos tratados con bacterias en el alimento. Debido a lo

anterior, no se realizó la identificación molecular de las bacterias, pues está sólo se

15

recomienda cuando los organismos tienen un efecto benéfico demostrado. A pesar de lo

anterior, los bacilos probados en el experimento no se desecharán y se utilizarán en

experimentos futuros para degradar materia orgánica en los estanques de cultivo de camarón

(bioremediación).

Debido a que no se obtuvieron incrementos significativos del peso en los tratamientos

con bacilos, se decidió aislar bacterias ácido lácticas de camarones silvestres.

Aislamiento de bacterias ácido lácticas (BAL)

Las bacterias fueron aisladas tanto de camarón café silvestre (Penaeus californiensis).

Para lo cual, se extrajo el intestino completo de los organismos, y se colocó en tubos

Eppendorf (1.5 mL) con 200 µL de solución salina estéril, y se homogenizó la muestra. Se

sembraró por esparcimiento, 100 µL del homogenizado en medio Rogosa (BD Difco) con 2%

de NaCl, y se incubaron a 30 °C por 120 h, observando el crecimiento cada 24 h. Las colonias

aisladas se resembraron por método de estría cruzada. Posteriormente, cada colonia aislada fue

resembrada de forma masiva en medio MRS (BD Difco) con 2% de NaCl, y se incubó a 30 °C

por 24 h. Finalmente, se cosechó la bacteria y se colocó en tubos Eppendorf con caldo MRS

con 15% de glicerol y 3% de NaCl, se homogenizó la muestra y se guardó a -80 °C (stock),

para su posterior caracterización.

Caracterización de las cepas bacterianas

Prueba de hemólisis con sangre humana

De las cepas cosechadas, se tomaron 10 µL, y se sembraron en tubos Falcon con 5 mL

de caldo MRS con 2% de NaCl, y se incubaron a 30 °C por 24 h. Posteriormente, se tomó 1

mL de los cultivos previamente homogenizados, y se colocó en tubos Eppendorf para

centrifugar a 10,000 x g por 10 min. El pH del sobrenadante se ajustó a valores de 6 o 7 con

NaOH 1 M, para evitar crear falsos halos de lisis ocasionados por la acidez del medio

(Balcazar et al., 2008). Finalmente, se sembraron 50 µL del sobrenadante en pequeños pozos

dentro de placas Petri con agar sangre y placas con agarosa (20 mL de medio base agar o

agarosa + 1 mL de sangre por placa; BD Bioxon). Se incubaron a 37 °C por 48 h, haciendo

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lecturas cada 24 h. Las cepas inoculadas en el medio, se compararon con un control negativo,

el cual consiste en caldo MRS con 2% de NaCl. Se tomaron solo aquellas cepas bacterianas

que presenten hemólisis gamma (γ) en ambos medios, y se realizó una segunda prueba para

corroborar resultados.

Cinética de crecimiento bacteriano de las cepas de BAL

Con el fin de conocer la curva de crecimiento de las cepas a utilizar, se realizó una

cinética de crecimiento, cultivando 20 µL del stock de cada cepa, en 50 mL de medio MRS

con 2% de NaCl, y se incubaron a 31 °C. Se determinó la absorbancia de los cultivos con

respecto de un control (medio MRS), a 580 nm en un espectrofotómetro Thermo Spectronic

Genesys 2, iniciando a las 6 h después de la inoculación, y posteriormente a las 12, 24, 48, 72

y 96 h.

Conteo de BAL

Para el conteo de UFC/mL, se utilizó el método de diluciones seriadas. Primeramente

se sembraron cada una de las cepas en tubos Falcon con 10 mL de MRS al 2% de NaCl, y se

incubaron a 31 °C durante 24 h. De cada cultivo se tomará 1 mL, se colocó en un tubo

Eppendorf, y se centrifugó a 10,000 x g durante 10 min. La pastilla obtenida se resuspendió en

1 mL de solución salina estéril al 2% de NaCl, y se deteminó la absorbancia en el

espectrofotómetro a una longitud de onda de 580 nm. La absorbancia se ajustó a 1, ya sea

adicionando una mayor cantidad de células, o diluyendo en solución salina estéril. Una vez

obtenida la absorbancia deseada, se tomó 1 mL de la muestra y se inoculó en un tubo Falcon

con 9 mL de solución salina estéril al 2% de NaCl, que representa la dilución 10-1. El

procedimiento se repitió hasta obtener la dilución 10-7. De la dilución 10-5 a la 10-7, se tomaron

100 µL, se sembraron por esparcimiento en placas de MRS al 2% de NaCl, y se incubaron a

31 °C por 24 h. El plaqueo se realizó por duplicado.

Prueba de hemólisis con hemolinfa de camarón

Las cepas se sembraron en MRS caldo al 2% de NaCl, y se incubaron a 30 ºC por 24 h.

Del cultivo se tomó 1 mL, y se centrifugó a 10,000 x g por 20 min. La actividad en hemolinfa

se realizó en las cepas que presenten hemólisis γ en sangre humana. La técnica utilizada

consiste en una adaptación de la usada por Chin-l et al. (2000). Se extrajo 1 mL de hemolinfa,

17

de camarones adultos, e inmediatamente se transfirió a un tubo Eppendorf con 133 µL de

anticoagulante (buffer de Citrato-EDTA), se agregó el colorante rosa de Bengala para teñir las

células (hemocitos). El contenido del tubo se mezcló en un matraz con 15 mL de medio basal

agar (10 g de Bacto peptona, 5 g cloruro de sodio y 15 g de Bacto agar disuelto en 1000 ml de

agua, con un pH ajustado de 6.8. El medio se esterilizó en autoclave a 121 °C por 15 min, y se

hizo el vaciado a la placa de Petri. Una vez que solidifique el contenido de la placa, se harán

perforaciones con ayuda de un sacabocados. Se inocularon 50 µL del sobrenadante del cultivo

celular, en los pozos de la placa. Como control negativo, se colocaron 50 µL de MRS caldo

con 2% de NaCl. Las placas se incubaron a 30 ºC, por 24 h. Se medió y analizó el halo de lisis.

Prueba de antagonismo contra Vibrio sp.

Se determinó el efecto antagónico de cada cepa de BAL, en contra de una cepa de

Vibrio verde, aislada de camarón, previamente caracterizada, y probada su patogenicidad en

camarón blanco. Se cultivaron las bacterias ácido lácticas en MRS caldo al 2% de NaCl, a 30

°C por 24 h, y Vibrio en TSA caldo al 3% de NaCl, a 37 °C por 24 h. Posteriormente, se tomó

1 mL del cultivo de Vibrio, y se centrifugó a 10,000 x g por 20 min. La pastilla se resuspendió

en solución salina al 3% estéril, y se llevó a absorbancia de 1, a 580 nm. En base a su conteo

de UFC/mL, se hicieron los cálculos correspondientes para sembrar de forma masiva, 1 x 106

UFC/mL, en una placa de TSA al 3% de NaCl. Después de sembrado el Vibrio, se hicieron

pequeños pozos en la placa, con ayuda de un sacabocados. Del cultivo de BAL, se tomó 1 mL,

se centrifugó a 10,000 x g por 20 min, y se tomaron 50 µl del sobrenadante, los cuales se

colocaron en los pozos hechos en la placa de TSA. Las cepas inoculadas, se compararon con

un control negativo, el cual consistió en MRS caldo al 2% de NaCl. Las placas se incubaron a

37 °C, por 24 h, y posteriormente se observó la presencia o ausencia de halos de inhibición.

Morfología y tinción de Gram

La morfología celular se observó bajo el microscopio, con el objetivo 100X, después

de teñir una muestra de cada una de ellas con la tinción Gram.

Adición de las BAL al alimento

La incorporación de las BAL en el alimento balanceado (Camaronina®, Purina,

México) se hizo por medio del aditivo atractante y adherente Dry Oil® (DO) de Innovaciones

18

Acuícolas S.A. de C.V. (Culiacán, México), siguiendo las instrucciones del fabricante.

También se usó DO en el alimento para el control sin probióticos tratando de dar condiciones

similares a todos los tratamientos. Las bacterias fueron cultivadas en 50 mL de MRS caldo e

incubadas a 30 °C por 24 h. El conteo se realizó por el método de diluciones seriadas. La

adición de las BAL al alimento se hizo por aspersión, mezclando los pellets para una adición

homogénea. El alimento se secó a temperatura ambiente y posteriormente se almacenó a 4 °C.

Se preparó alimento con BAL para 10 d, debido a que el tiempo de vida media de este tipo de

microorganismos en el alimento fue determinado por Apún-Molina (2007).

Obtención de juveniles

Detección del virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV)

Los camarones para los bioensayos fueron obtenidos de una granja de Guasave,

Sinaloa. Se extrjo ADN de 100 mg de tejido de pleópodos utilizando el reactivo DNAzol

(Invitrogen). El ADN obtenido fue cuantificado espectrofotométricamente a 260 nm. Los

primers que se utilizaron para la PCR sencilla serán WSSV1 out (sentido) 5’-ATC ATG GCT

GCTTCA CAG AC 3’ y WSSV2 out (contrasentido) 5’-GGC TGG AGA GGA CAA GAC

AT 3’. Para la PCR anidada se utilizaron los primers WSSV1 in (sentido) 5’-TCT TCA TCA

GAT GCT ACT GC 3’ y WSSV2 in (contrasentido) 5’-TAA CGC TAT CCA GTA TCA CG

3’. El tamaño esperado del fragmento de la primera PCR es de 982 pb y de 570 pb para la

PCR anidada. Se utilizaron tubos Eppendorf de 0.2 mL para preparar la mezcla de reacción

para la PCR sencilla y la anidada; la cual incluye 0.4 mM de dNTP, 4 mM de MgCl2, 0.5 µM

de primers (WSSV), 1.25 U de Taq ADN polimerasa (Promega) y 1x de búfer Taq. El

volumen de la reacción fue de 25 µL. En las reacciones de PCR sencilla se utilizarán 2 - 3 ng

de ADN. Para la PCR anidada se utilizará 1 µL de ADN de una dilución 1:100 de la reacción

de PCR sencilla. La amplificación se llevó a cabo en un termociclador iCycler (Biorad) bajo

las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95 °C por 4 min, 40 ciclos a 95 °C por 1

min, 55 °C por 30 s, 72 °C por 1 min y una extensión final a 72 °C por 5 min. Los fragmentos

amplificados se visualizaron (incluido un marcador de peso molecular de 1 kb) en un gel de

agarosa al 1 %, teñido con bromuro de etidio. La visualización del gel se hizo con luz UV

(Kimura et al., 1996; Peinado-Guevara & López-Meyer, 2006).

19

Detección del virus de la necrosis hipodermal y hematopoyética (IHHNV)

La detección d el IHHNV se llevó a cabo mediante PCR. Utilizando 100 ng de DNA

como templado. El análisis de PCR se realizó en un termociclador, usando los

oligonucleótidos reportados por Tang et al. (2000), IHHNV392F.5’-GGGCGA ACC AGA

ATC ACT TA-3’ e IHHNV392R.5’-ATC CGG AGG AAT CTG ATG TG-3’ que amplifican

un fragmento de 392 pb. La mezcla de reacción se preparó con las mismas concentraciones de

reactivos usados en la detección de WSSV; utilizando las mismas condiciones de

amplificación que para la PCR anidada para WSSV. Los fragmentos amplificados se

visualizaron en un gel de agarosa al 1.5 % teñido con bromuro de etidio y un marcador de

peso molecular de 1 kb. Posteriormente el gel se visualizó bajo luz UV.

Bioensayo: Efecto de BAL, adicionadas al alimento, en la sobrevivencia de L. vannamei,

infectado

Se utilizaron camarones con un peso aproximado de 0.19 g, los cuales se analizaron

para determinar la presencia de los virus WSSV e IHHNV. Se probaron 3 mezclas con

potencial probiótico, dos grupos de 4 cepas de BAL cada uno (BAL1 y BAL2) y un grupo de

4 bacterias y una levadura ya probadas en otros trabajos de tesis (BALE). Se trabajó con 4

tratamientos por tripliado: T1) Control negativo (Camaronina + Dry Oil® (DO); T2)

Camaronina + DO + BAL1 (1 x 105 UFC/g); T3) Camaronina + DO + BAL2 (1 x 105 UFC/g);

T4) Camaronina + DO + BALE (5 x 105 UFC/g). Al final del bioensayo, se registró la

supervivencia, el peso y la prevalencia de camarones. Los organismos fueron alimentados al

inicio a razón de 6.5 % del peso corporal, 2 veces al día (08:00 y 18:00 h), siguiendo la tabla

de alimentación de Purina. Se hizo un recambio del 50 % de agua cada 5 días. La limpieza

diaria se hizo por sifoneo. Las condiciones del cultivo fueron: temperatura = 25±1.0 °C, pH=

7.0-8.4, salinidad = 35±1‰, Oxígeno disuelto ≈ 5 mg/L y fotoperíodo natural. Se midió

diariamente la temperatura, el ph, el oxígeno disuelto y la salinidad. Se registró diariamente la

supervivencia y el peso cada 15 días. La toma de los nutrientes (amonio, nitritos y nitratos) se

realizó cada 15 días por métodos químicos ya estandarizados internacionalmente. Al final del

experimento se determinó el factor de conversión alimenticia.

20

RESULTADOS

Aislamiento, pruebas de hemólisis e inhibición contra vibrios de cepas presuntivas de

BAL

Se aislaron 20 cepas presuntivas de bacterias ácido lácticas (BAL, Tabla 1) del

intestino de Penaeus californiensis. En la hemólisis en sangre de vertebrado, 5 cepas

presentaron hemólisis β (total), 1 hemólisis α (parcial) y 14 con hemólisis γ (sin halo de lisis).

A las 5 cepas que presentaron hemólisis β (total) y 1 hemólisis α (parcial) no se les determinó

la hemolisis en hemolinfa de camarón. Las 14 restantes que presentaron hemólisis γ en sangre

de vertebrado, no presentaron hemolisis en hemolinfa de camarón y tampoco tuvieron

actividad inhibidora contra vibrios.

Tabla 1. Cepas presuntivas de BAL aislados del intestino del camarón Penaeus

californiensis. Prueba de hemólisis y antagonismo contra vibrio. HICV= Halo de inhibición contra vibrio (mm). HSH= Hemólisis en sangre de humano. HHC= Hemólisis en hemolinfa de camarón. ND= no determinado.

21

Cepa HSH HHC HICV (mm)

BALCS1 β ND ND BALCS2 γ γ 0 BALCS3 γ γ 0 BALCS4 β ND ND BALCS5 γ γ 0 BALCS6 γ γ 0 BALCS7 γ γ 0 BALCS8 γ γ 0 BALCS9 β ND ND

BALCS10 γ γ 0 BALCS11 β ND ND BALCS12 γ γ 0 BALCS13 γ γ 0 BALCS14 γ γ 0 BALCS15 α ND ND BALCS16 γ γ 0 BALCS17 γ γ 0 BALCS18 γ γ 0 BALCS19 γ γ 0 BALCS20 β ND ND

Cinética de crecimiento de cepas de BAL con potencial probiótico

En la figura 1A y 1B se observan los resultados de la absorbancia contra el tiempo en

horas de 14 cepas selecionadas con potencial probiótico. Las BAL tienen una fase exponencial

que dura aproximadamente entre 92 y 116 horas

22

A

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 102 108 114 120

Tiempo (h)

Abs

orba

ncia

(580

nm

)

BAL2

BAL3BAL5

BAL6

BAL7

BAL8BAL10

B

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 102 108 114 120

Tiempo (h)

Abs

orba

ncia

(580

nm

) BAL12

BAL13

BAL14

BAL16

BAL17

BAL18

BAL19

Figura 1A y B. Crecimiento de cepas presuntivas de BAL cultivadas en MRS

caldo a 30 ºC. La fase exponencial dura aproximadamente entre 92 y 116 horas.

Tinción de Gram, forma celular y arreglo celular

Se hizo el análisis solo de las 14 cepas que no presentaron hemolisis. Las 14 cepas son

cocos (lactococos) Gram (+) en racimos (Tabla 2).

23

Tabla 2. Cepas presuntivas de BAL aislados del intestino del camarón Penaeus californiensis. Tinciónde Gram, forma celular y arreglo celular.

Determinación de WSSV e IHHNV

Al inicio del experimento sobre el efecto de los bacilos en el crecimiento y

supervivencia, se analizaron los camarones para ver si traían los virus WSSV e IHHNV de la

granja. El resultado fue negativo para WSSV, sin embargo, si eran portadores del IHHNV.

Efecto de las BAL en el crecimiento en peso y supervivencia de Litopenaeus vannamei

La supervivencia final en el Control, BAL1 y BAL2 fuel 100%, mientras que en el

tratamiento con BALE fue de 97 % (Fig. 2). Respecto al crecimiento, la TCE en el Control fue

de 3.87 ± 0.10 (%/d), BAL1, 4.08 ± 0.08 (%/d), BAL2 3.8 ± 0.07 (%/d) y BALE 3.81 ± 0.04

(%/d) (Fig. 4). No hubo diferencias significativas entre los tratamientos (p>0.05) (Fig. 3).

.

Cepa Forma Celular Arreglo celular Gram

BALCS2 Cocos Racimos ++ BALCS3 Cocos Racimos ++ BALCS5 Cocos Racimos ++ BALCS6 Cocos Racimos ++ BALCS7 Cocos Racimos ++ BALCS8 Cocos Racimos ++

BALCS10 Cocos Racimos ++ BALCS12 Cocos Racimos ++ BALCS13 Cocos Racimos ++ BALCS14 Cocos Racimos ++ BALCS16 Cocos Racimos ++ BALCS17 Cocos Racimos ++ BALCS18 Cocos Racimos ++

24

0102030405060708090

100

Control BAL1 BAL2 BALE

Tratamientos

Supe

rviv

enci

a (%

)

Figura 2. Supervivencia final de Litopenaeus vannamei.

0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

4.00

4.50

Control BAL1 BAL2 BALE

Tratamientos

Tasa

de

Cre

cim

ient

o Es

pecí

fico

(%/d

)

Figura 3. Tasa de crecimiento específico (TCE) de Litopenaeus vannamei. Barras de error = promedio ± EE. No hubo diferencias significativas entre tratamientos (p>0.05).

25

Análisis de los resultados

La supervivencia fue alta en todos los tratamientos. En el control, BAL1 y BAL2 la

supervivencia fue del 100 %, mientras que en el tratamiento con BALE fue de 97 %. Aunque

en el tratamiento BAL1 la TCE fue mayor, no hubo una ganancia significativa en peso en los

organismos tratados con bacterias en el alimento, en las concentraciones trabajadas; sin

embargo, esta tendencia puede indicar que si se trabaja con concentraciones mayores de

BAL1, podría haber un aumento significativo del peso respecto al control sin bacterias, por lo

tanto se plantea en un futuro realizar un experimento para demostrar lo dicho.

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