Técnicas moleculares para el aislamiento, amplificación, secuenciación y expresión de un

fragmento de ADN específico

Esta tecnología se denomina:Tecnología del DNA recombinante, clonación génica o ingeniería genética

Ningún campo de la biología ha permanecido igual tras esta revolución tecnológica

Propiedad básica del DNA que permite su manipulación:

El acoplamiento de cadenas por complementariedad. La extraordinaria especificidad del reconocimiento entre secuencias de bases complementarias constituye un poderoso instrumento para la identificación, aislamiento, clonación,... De fragmentos de DNA complementarios a uno dado

Herramienta básica

Endonucleasas (enzimas) de restricción -> Enzimas de bacterias que reconocen secuencias de DNA específicas y lo cortan por el esqueleto azúcar-fosfato.

• Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de reconocimiento (al azar)

• Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son repeticiones invertidas o palíndromes

5´-acgtattccggaacatcgacctGAATCCactttagcgtagctaccgctcgcag- 3´

3´-tgcataaggccttgtagctggaCTTAGGtgaaatcgcatcgatggcgagcgac- 5´

EcoRI: E. ColiBamHI: Bacillus amyloliquefaciens

Dos tipos de cortes:

• Corte plano: extremos romos

• Corte escalonado:extremos pegajosos o cohesivos

Las enzimas de restricción tipo II:

Proporcionan una forma de cortar el DNA de cualquier origen en secuencias específicas, produciendo por tanto una población heterogénea de fragmentos de extremos idénticos

Clonado de ADN

•DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)

•Vector de clonación (vehículo)

•Organismo huésped (E. Coli)

•Selección de vectores

TEJIDO VECTORES

mRNA DNA

cDNA DNA digerido(doble cadena metilado)

DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR DNA RECOMBINANTE

INTRDUCCION EN CELULA HUESPED

Biblioteca (Screening-subclonado)

Clonado de ADN

VECTORES

Construidos a partir de plásmidos y bacteriófagos naturales

Características

1) ORIGEN DE REPLICACION : Posee secuencias que permiten su propagación

2) MCS: (multiple cloning site) sitio para insertar el DNA a clonar- Posee sitios únicos para varias ER

3) MARCADORES DE SELECCIÓN: Confieren propiedades fenotípicas a la célula huésped.

TIPOS DE VECTORES

1) VECTORES DE CLONADO- Aislamiento de fragmentos de DNA

2) VECTORES DE EXPRESIÓN- Expresión de genes clonados

3) VECTORES ESPECIALES- Permiten estudio de promotores y secuencias regulatorias de la expresión génica

TIPOS DE VECTORES DE CLONADO

PLASMIDOS: Límite clonado 0.1- 10 Kb

FAGOS: Derivados del bacteriófago Lambda, 8-25 Kb

COSMIDOS: Combinación fago l y plásmido, 35-50 Kb

BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) Derivados plásmido F, 75-300 Kb

Vectores derivados de Bacteriofago P1 , 100 Kb

YAC (Yeast artificial Chromosome) cromosoma de levaduras artificial, 100-1000 Kb

PLASMIDOS

Molécula DNA doble cadena circular extracromosomal que replica en forma autónoma dentro de la bacteria (1.6-300 Kb)

FUNCIONES CODIFICADAS POR LOS PLASMIDOS

Resistencia a antibióticos

Degradación de compuestos orgánicos (Pseudomonas)

Producción de toxinas (ej E.coli enterotoxinas)

Producción de bacteriocinas (colicinas, subtilicinas)

Inducción de tumores (plantas)

Sistemas de Restricción-modificación

Producción de antibióticos (ej Streptomyces)

Resistencia a metales pesados

CLASIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS

Nº DE COPIAS: Alto o bajo Nº de copias.

El Nº de copias depende del tipo de ori de replicación

30 Replicones diferentes

Bajo Nº de copias:1-5 copias

Alto Nº de copias : 20-40 copias (hasta 300 copias)

CONJUGATIVOS O NO

GRUPO DE COMPATIBILIDAD

PLASMIDOS -VECTORES DE CLONADO

CARACTERISTICAS

1) ORI (derivados de ColE1)

2) POLILINKER (MCS)

3) MARCADORES DE SELECCIÓN

4) SECUENCIAS PARA SCREENING: b-Galactosidasa

MARCADORES DE SELECCIÓN

Permiten la selección de aquellas células que poseen el vector :

- Marcadores de resistencia a antibióticos

-Marcadores de auxotrofía (permiten sobrevivir en ausencia de un componente esencial ej aminoácidos)

MARCADORES DE SELECCIÓNAmpicilina: Interfiere con síntesis de pared bacterianaResistencia: gen bla (b-lactamasa)

Tetraciclina: Inhibe síntesis de proteínas por unión a subunidad ribosomal 30sResistencia: gen tet (proteína que se une a membrana bacteriana e impide transporte del antibiótico)

Kanamicina: Se une a ribosomas 70s , produce misreading del mRNAResistencia: gen kan (aminoglicosido fosfo transferasa modifica el antibiótico)

pUC19

Vectores de clonado

•Fago (2 sitios de corte) < 24 kb

•Cromosomas artificiales P1 (derivados del bacteriófago P1, pueden aceptar insertos de 80 y 100 kb

Fago

Formación de placa de lisis

Vectores de clonado•Cósmido: extremos cos + DNA plásmido (origen replicación) + DNA foráneo + cápisde. ~50 kb

•BAC (cromosoma artificial bacteriano): derivado del plásmido F, insertos de 150-300 kb. Usados en la secuencia de genomas

Cósmido

Huésped: E. coli

Introducción del vector recombinante en el huésped:

• Plásmido: transformación (solución diluida cloruro de calcio) y replicación autónoma

• Fago (transducción, inserción en DNA huésped)

• Cósmido (transducción como fago y replicación como plásmido)

Selección de vectores recombinantes

• Plásmido: resistencia a antibióticos

• Fago : Inserción en E. coli (sólo se puede empaquetar el DNA de si contiene el inserto foráneo)

ETAPAS DE CLONADO EN PLÁSMIDOS

DIGESTION con ER : Plásmido y ADN a clonar

LIGACION (in vitro, ligasa)

TRANSFORMACION ( bacterias competentes)

SELECCIÓN

SCREENING

Desfosforilación del vector: fosfatasa alcalina

Como mejorar la reacción de ligación

Ligación como una reacción bimolecular en dos etapas

1º reacción intermolecular entre el vector y el fragmento

2º reacción intramolecular

favorecida por una elevada concentración de extremos

favorecida por una baja concentración de extremos

Como mejorar la reacción de ligación

TRANSFORMACION Y SELECCION

TRANSFORMACION

Bacterias competentes:

Métodos químicos: Cl2Ca, DMSO, etc

Eficiencia:107 cel/ug DNA

Métodos físicos: Electroporación (pulsos electricos )

Ef: 108cel/ug DNA

SELECCIÓN

Presión de selección : crecimiento en presencia de antibiótico

Métodos de selección de clones recombinantes

para detectar la mólecula de plásmido que posee inserto

b-galactosidasa (no es concluyente)

Mapeo de restricción

PCR (colony PCR)

Hibridización in situ en la colonia con sonda específica

Operón Lactosa

Selección de clones recombinantes mediante alfa complementación

Métodos de selección

· Resistencia a antibióticos

La resistencia la confieren genes que porta el vector, en este caso a ampicilina y a tetraciclina

PlásmidopBR322

El ADN foráneo se inserta en el gen de resistencia a Ampicilina

Sin plásmidoSin inserto

· Resistencia a antibióticos

La resistencia la confieren genes que porta el vector

Con ampicilinay tetraciclina

Con plásmidoSin inserto

Con plásmidoCon inserto

Con tetraciclina

Métodos de selección

Vectores de expresiónProteínas expresadas en E. coli

1) Proteínas de fusión:

Región que codifica una proteína “tag” fusionada en marco de lectura a la región que codifica para la proteína target.

Cuando se transcribe y traduce genera una proteína de fusión purificación

protege de proteólisis a la proteína de interés mejora la solubilidad de la proteína estabiliza a la proteína de interés

oriAmpr

ATG A B MCSPromotor

A Secuencia “tag”:*Dominio con función enzimática*Señales topogénicas

B Secuencias consenso paraCorte con una proteasa

MCS Sitio múltiple de clonado

Esquema genérico del vector

Optimización de la expresión de proteínas en E. coli

1) Iniciación de la traducción: Promotor fuerte producirá altos niveles de mRNASe requiere optimizar la traducción.

UAAGGAGGAUUCCUCC AUG5’ 3’

mRNA

3’ 5’16S rRNA

small ribosomal subunit

Secuencia de Shine Dalgarno: Secuencia complementaria a región en 16S rRNA

(subunidad pequeña del ribosoma)

Secuencia 6-8 nt a -10 nt del AUG

Problemas cuando se expresan proteínas eucarióticas en cél procariotas:Inestables.

Sin actividad biológica.Contaminantes procarióticos.

Soluciones: se han desarrollado sistemas de expresión en eucariotas• Esp. importantes para proteínas terapéuticas.• Necesidad de que tengan idénticas propiedades bioquímicas, biofísicas y funcionales a la

proteína natural.

Modificaciones post-traduccionales– Formación de uniones disulfuro correctas.– Clivaje proteolítico del precursor inactivo.– Glicosilación- agregado de residuos de azúcar– Alteración de aminoácidos en la proteína: fosforilación, acetilación, agregado de

grupos sulfato, agregado de ácidos grasos

Vectores de expresión eucariotas

Elementos para clonado en bacteriasori de replicaciónMarcador de selección bacterianoSitios múltiples de clonado

Elementos específicos de vectores eucariontes

Promotor eucariotaSeñal de poliadenilaciónSecuencias Kozak y codón ATGIntrónTags-proteínas de fusiónori de replicación eucarionte como el de SV40 (opcional)Marcador de selección para células eucariontes (para transfecciones estables)Segmentos de DNA para recombinación homóloga

Vector de expresión eucariota

Vector de fusión a EGFP

                                                                                                                                     

Expresión de proteínas fluorescentes

Proteína fluorescente verde

Hay dos tipos básicos de bibliotecas de ADNGenómicas cDNA

Para que se construyen librerías:

- Identificar genes.- Identificar secuencias regulatorias. - Identificar genes expresados diferencialmente.- Secuenciar genomas- Conocer secuencias de aminoácidos, en librerías de cDNA.

Es una colección de moléculas de DNA consistiendo de fragmentos del genoma entero (Librería genómica) o copias de todos los RNAm producidos por una célula o tipo celular (Librería de cDNA) insertado en un vector de clonación e introducido en una célula hospedera.

Bibliotecas de ADN o genotecas

Fuentes de RNA???.

Clonado de gDNA y cDNA

Caminar sobre DNA

Construcción Biblioteca de ADNc

1. Purificación de ARNm 2. Síntesis de la primera ADNc.3. Síntesis de la segunda cadena del ADNc.4. Clonado en el vector

Purificación ARN

Purificación ARN

Oligo (dt)Celulosa

T T T T T

Poly A, hibridizacon Oligo (dt)

A A A A

100 Mm NaCl

10 Mm Tris1mM EDTA

Poly mRNA eluido

Purificación de mRNA

A A A A T T T T

A A A A T T T T

A A A A T T T T

A A A A T T T T

A A A A A A

A A A A A A

A A A A A A

A A A A A A

A A A A

A A A A

T T T T T

T T T T TT

• Primer método

Síntesis de la primera cadena de cDNA

• Segundo método

Síntesis de la primera cadena de cDNA

Ligación al vector

Adaptadores

Ligación

Cómo obtener un animal genéticamente modificado

Ratón transgénico: microinyección del ADN de interés en el pronúcleo.

Ratón knockout: inyección de células embrionarias modificadas con el gen de interés en el blastocisto.

Microinyección pronuclear para hacer un ratón transgénico

Los que desarrollan se llaman fundadores y son hemicigotas para el transgen.

Diferencias entre transgénico y knockout

target

targetingvector

neor

neor

homologous recombination

“knockout”

gene microinjection

gene

“transgenic”

TK

Embryonic Stem Cells

• totipotent/pluripotent in vivo/in vitro• extraordinary proliferation potential in vitro• homologous recombination

Positive and Negative Selection of Targeted ES Cells

Recombinants with random insertion

Selection for neor positive

Con antibiótico G418

Selection for TK negative

ES cells with homologous recombination

neor TKES Cells

target

X

Generation of Chimeras

Targeted ES cells

Goal: obtain germline transmission

Cómo “construir el transgen”

ADNc

Promotor UTR

Intrón

Vector

Peces fluorescentes para todos!