ANÁLISIS DE EXOMAS PARA EL DIAGNÓSTICO

GENÉTICO DE LA DISCAPACIDAD

INTELECTUAL

Dra. Sara Alvarez

Director Médico NIMGenetics

Zaragoza, 21 de Octubre 2016

1

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

2

1

…..de la definición

al diagnóstico Genético

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

3

Trastornos del Neurodesarrollo: DSM-5

DSM: Diagnostic and Statistic Manual of Mental Disorders

Discapacidad Intelectual

Trastornos de la comunicacion

Trastornos del Espectro Autista

Trastorno por deficit de atencion con hiperactividad

Trastorno especifico del Aprendizaje

Trastornos Motores

Otros Trastornos del Neurodesarrollo

Definición: Alteraciones o retrasos en el desarrollo del SNC que repercuten

en el funcionamiento personal, social, académico u ocupacional.

Carácter evolutivo-madurativo

Manifestación en la etapa infantil (no exclusivo)

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

4

“La discapacidad intelectual se caracteriza por limitaciones

significativas tanto en funcionamiento intelectualcomo en la conducta

adaptativa. Esta discapacidad aparece antes de los 18 años”

McKenzie, K., Milton, M., Smith, G. et al. Curr Dev Disord Rep (2016) 3: 104.

Vissers LE et al Nat Rev Genet. 2016 Jan;17(1):9-18.

Discapacidad Intelectual

Diagnóstico Clínico: CI <70

Presentación Clínica:

• Aislada

• Asociada a otras manifestaciones clínicas:

• Malformaciones congénitas

• Trastornos neurológicos (pej: Trast. del espectro autista o epilepsia)

Severidad: Leve, moderado, grave ó profundo

Incidencia acumulada: 0.62- 1.58 %

Ratio Hombres/Mujeres: 1.2-1.4

Diagnóstico Etiológico: causas exógenas ó genéticas

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5

Cromosomopatías (pej: Síndrome de Down) - 15% de los casos

Expansión de tripletes (Síndrome X frágil, FMR1) - 0.5%

Deleciones ó duplicaciones de material cromosómico (CNVs) – 10-15%

Determinan la heredabilidad

Su identificación permite:

Establecer el pronóstico

Anticiparse a las complicaciones

Mejor evaluación de las opciones terapeúticas.

Mefford, et al N Engl J Med 2012; 366:733-743

La dificultad en el Diagnóstico Genético de la DI es debido a su

elevada Heterogenicidad

Mutaciones de Gen único

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

6

El desarrollo de Tecnologías de alto rendimiento han elevado a >60% la

rentabilidad diagnóstica global de los estudios genéticos en DI

*Excluyendo el Síndrome de Down

*

Array CGH ( 15-23%)

CNVs en el Genoma

Sanger + FISH ( 6-8%)

Mutaciones en 1 gen

CNVs en 1 gen

Exoma ( 24-33%)

Mutaciones en

> 19.000 genes

Genoma ( 26%) Mutaciones

y CNVs en el genoma

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

7

Rentabilidad Diagnóstica en DI

Gilissen, C.; Nature (2014); 511: 344-347

De Vries et al.

AJMG 2006

De Ligt et al.

NEJM 2012

Array + Exoma + Genoma ~ 60% DX in ID

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

8

Mutaciones de Gen único.

Patron de herencia Ligado a X (≈ 100 genes) – 0.1% (10% en varones)

Patron autosomico Recesivo (≈ 300 genes)

Patrón autosómico Dominante (≈ 300 genes)

ArrayCGH

Secuenciación Masiva

(NGS, Next Generation Sequencing)

Más de 700 genes se han asociado a Discapacidad Intelectual aislada ó

asociada a otras manifestaciones Clínicas

Vissers LE et al Nat Rev Genet. 2016 Jan;17(1):9-18.

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

9

Vissers LE et al Nat Rev Genet. 2016 Jan;17(1):9-18.

Solapamiento significativo de los genes implicados en

los trastornos del Neurodesarrollo

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

10

2

Del genoma al Diagnóstico Genético

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

11

El 98% del Genoma NO codifica para proteínas ó RNA funcional

>50% elementos Repetitivos

NO “junk DNA”

1.5%

región codificante

8%

elementos

reguladores

En el exoma se localizan el

85% de las alteraciones

asociadas a enfermedades

Mendelianas

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Hoischen, A. et al. Nat. Genet. 43, 729–731

12

Ng, S. B. et al. Nat. Genet. 42, 30–35.

Hoischen, A. et al.. Nat. Genet. 42, 483–485

Ng, S. B. et al. Nat. Genet. 42, 790–793

2009 Primer estudio que

investiga las Mutaciones

“de novo” en la DI

2010 -2011 Dx de DI Sindrómica

Estudios de pocos pacientes

con Clínica común

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13

Patrones de Herencia y Rentabilidad diagnóstica

.. Autismo, discapacidad intelectual, Retrasos del desarrollo ó del lenguaje.

...Ataxia, convulsiones..

Yaping Yang et al N Engl J Med 2013;369:1502-11.

Rentabilidad diagnóstica superior a la obtenida mediante secuenciación dirigida

a genes únicos (3-15%) ó en paneles de genes seleccionados (13-20%)

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

14

La importancia de las Mutaciones “de Novo” and the novel mutations

Yaping Yang et al N Engl J Med 2013;369:1502-11.

Mutaciones “de novo”: NO aparecen en los progenitores

Nuevas Mutacions: NO aparecen en la literatura, ni en las bases de datos

Clasificación de las variantes:

1º Individuo: Variante de Significado Incierto ó probablemente patogénica

2º Individuo no relacionado: Mutación Patogénica

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15

Objetivo: Ayudar a los Médicos a entender el porque de los

trastornos del desarrollo de sus pacientes

Participantes: 24 servicios regionales de Genética de UK e

irlanda, junto a investigadores del Wellcome Trust Sanger

Institute

Pacientes: DNA e información clínica de >12,000 adultos y

niños con retrasos del neurodesarrollo (…y de sus padres)

Financiación: Wellcome Trust and the UK Department of

Health - and the Wellcome Trust Sanger Institute, and is

supported by the NHS National Institute for Health Research.

…Continuo desarrollo del conocimiento Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

16

For patients referred for genetic identification of rare Mendelian disorders:

“Exome testing is a good primary test for cases with unusual presentations

for which no panel is available or for which currently available tests are very

low yield”

“There is no really good targeted panel that gives you a high-yield answer”

Lee H, et al. JAMA. 2014;312:1880-1887

Yang Y, et al. JAMA. 2014;312:1870–1879

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17

3

Aplicación Clínica del Estudio

Genético mediante Exomas

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

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Demanda creciente de exomas en el entorno clínico

0

20

40

60

80

100

120

140

160

EXOMAS RECIBIDOS 2014EXOMAS RECIBIDOS 2015EXOMAS RECIBIDOS 2016

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

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1.- Permiten analizar simultáneamente múltiples genes incluidos en el diagnóstico

diferencial a un coste y en un tiempo que se acerca al del estudio de un gen único.

2.- Facilitan el análisis de genes previamente no analizados por tecnologías

convencionales

3.- Permiten identificar genes no incluidos en el diagnóstico diferencial. La posibilidad de

“echar la red” es especialmente importante en:

- En enfermedades raras ó con alteraciones en genes de reciente identificación

- En presentaciones clínicas parciales ó atípicas

Las Técnicas de secuenciación masiva aceleran y

simplifican el diagnóstico Genético

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

20

Aplicación de los exomas al diagnóstico Genético

Retos Técnicos:

- Validadación de la Calidad del Ensayo

- Análisis Bionformático

- Validación de los resultados por técnicas alternativas (sanger)

Problemas del Diagnóstico Clínico:

- Pacientes no seleccionados con fenotipos diversos en laboratorios

centralizados.

- El análisis del exoma puede derivar en Hallazgos Incidentales

- Es necesario determinar la aproximación genética para cada caso.

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

21

Todos los estudios deben incluir….

Los tres principios fundamentales antes de solicitar un Exoma:

1.- Árbol o Pedigree familiar, para determinar el patrón de herencia:

• Autosómica dominante

• Autosómica recesiva

• Ligada a X dominante o recesiva

2.- Descripción detallada del fenotipo del paciente

…..Para tener en consideracion las limitaciones del estudio:

• No detecta las repeticiones de tripletes

• No permite el diagnóstico de CNVs ó aneuploidías

• No identifica reordenamientos balanceados

• No detecta alteraciones epigenéticas.

• Coberturas incompletas

3.- Consentimiento Informado

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Pero antes............El consentimiento Informado!!!!!!!

Debe Incluir:

Objetivos, limitaciones y beneficios del estudio

Información relativa a los hallazgos INCIDENTALES no relacionados

con la indicación clínica de la prueba:

oAceptación obligatoria a recibir la información relativa a las patologías

recogidas en la guía de la ACMG que incluyen cardiomiopatías, canalopatías,

ó cáncer hereditario.

oActitud a seguir en el caso de identificar VUS no relacionadas con el

fenotipo de la enfermedad ó variantes patogenicas en heterocigosis en

enfermedades de HAR

Estudios genéticos alternativas

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

23

Genoma

Exoma

Genes Target

Transcriptoma

Metiloma

Epigenoma

(Histonas)

Illumina

454 Pyroseqg

Helicos

SOLiD

Ion Torrent

Cuantificación y determinación de

la calidad del DNA

Captura de las regiones de interés

Ligación de Adaptadores

Preparación del DNA molde

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24

Categorización DE MUTACIONES:

Mutaciones Patogénicas

Mutaciones de Significado Incierto (VUS)

Mutaciones probablemente Benignas

Mutaciones Benignas

Filtrados en bases de datos de SNPs

>40.000 Variantes

Filtrado y Clasificación de de variantes NGS

400 a 700 Variantes

Filtrado en función de la Variante:

-Localización

-Efecto en la proteína

-Predictores

-Etc…

Filtrado en función del Fenotipo:

- Historia Clínica Detallada

- Acceso a Bases de datos profesionales

- Bases de datos propias

- Revisión de la literatura

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25

Aproximación al Diagnótico basado en exomas

Ventaja: Identificación de mutaciones

filtrando en función del patrón de herencia

Desventaja: Precio

Dirigido a la identificación de

mutaciones GERMINALES “de Novo” en en enfermedades genéticas con

presentación clínica variable e inéspecífica y

con elevada heterogenicidad genética.

Indicaciones: Estudio de enfermedades

Mendelianas asociadas a fenotipos complejos

y progresivos

Ventaja: Precio

Desventaja: No permite determinar el

patrón de herencia. No se identifican

variantes en NUEVOS genes.

Dirigido al estudio de múltiples genes

en enfermedades con heterogenicidad

genética, para la identificación de

mutaciones GERMINALES

Indicaciónes: Estudio de

enfermedades Mendelianas con un

diagnóstico preciso.

Análisis de Paneles Dirigidos (secuenciaciónsolo del probando)

Análisis en Trios (secuenciación del paciente y sus progenitores)

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

26

Dos Diferentes Aproximaciones en función del Fenotipo

N genes

Selección de Genes

19.000 genes

Secuenciación Exónica Análisis de Variantes

EXOMA DIRIGIDO

Genes seleccionados

Panel Virtual

>5700 Genes OMIM

Exoma Clínico

Indicación: - Fenotipo bien definido - Enfermedad No progresiva

Indicación: - Fenotipo > complejo y severo - Enfermedad progresiva

EXOMA TRIO

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

27

Motivo de Consulta:

Varón de 5 años con:

retraso del desarrollo psicomotor (en seguimiento desde los 6 meses)

Marcadas esterotipias (TEA?)

EEG, Analítica completa, estudio metabólico Normal

RM cerebral: Atrofia cortico-subcortical. Resto Normal

4 años: Encefalopatía epiléptica progresiva (EEG: Sdr. de Lenox)

Indicación de Estudio genético mediante Exoma Dirigido

Cariotipo

NORMAL

Array de CGH 180K

NORMAL

Secuenciación Exónica con Análisis

Dirigido a Genes de DI y epilepsia

Genes Candidatos a

Estudio:

MECP2 (Cobertura: 95%)

FOXG1 (Cobertura: 81%)

CDKL5 (Cobertura: 97%)

MEF2C (Cobertura: 100%)

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

28

IQSEC2 c.4160_4173delACTTCATCTTCAGC; p.His1387Profs*215

Sanger Validation

IGV visualization

FENOTIPO CLÍNICO:

Retraso mental

Autismo

Hipotonía

Movimientos estereotipados Rett-like

Estrabismo

Microcefalia

Epilepsia.

Gandomi, S.K. et al. J Genet Counsel (2014)

Patrón de Herencia: Ligado a X

¿Consejo Genético?

Variante “de Novo”

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

29

Mutación

“de novo”

19.000 genes 19.000 genes

500 variantes

Enf. Autosómicas recesivas

Dobles heterocigotos Mutación en hemicigosis

Madre Padre

Diferentes Aproximaciones en función del Fenotipo: EXOMA TRIO Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

30 30

Motivo de Consulta:

Varón de 3 años con:

sinostosis craneal

Hipertelorismo

retraso del desarrollo motor y del lenguaje

Indicación de Estudio genético mediante Trios

Cariotipo

NORMAL

Array de CGH

NORMAL

Análisis mutacional de FGFR3

NORMAL

Secuenciación Exónica con Análisis de Tríos

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

31

PACS1:

-Proteína que regula el tráfico a

través de la membrana de Golgi.

-Se expresa durante el desarrollo

embrionario del SNC. Sus niveles

de expresión descienden

significativamente tras el

nacimiento.

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

32 Janneke H.M The American Journal of Human Genetics 91, 1122–1127, December 7, 2012

Mutación patogénica

“de novo”

CAUSAL el fenotipo del

paciente

MRD17 Syndrome

“mental retardation, autosomal

dominant 17”

(MIM# 615009).

Incidencia: 6 casos

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

33

Las Respuestas que aporta un diagnóstico Genético.... Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

34

1 3

5

4

6 7 8

11 13 15 16

Clinical delineation of the PACS1-related syndrome-Report on 19 patients.

Schuurs-Hoeijmakers JH et al. Am J Med Genet A. 2016 Mar;170(3):670-5.

1.Rasgos faciales carácterísticos

2.Retraso del desarrollo motor

3.El 31% de los pacientes TEA

4.Hipotonía en fases precoces del desarrollo.

5.DI leve o moderada con un marcado retraso en el desarrollo del leguaje.

6.Crisis epilépticas en 62% de los casos. Controladas en 100% de los casos con fármacos

7.Problemas de alimentación en el 25% de los casos por alta sensibilidad orofacial.

PACS1 c.607C>T

Síndrome MRD17

(N=19 pacientes)

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

3

5

Exoma dirigido (Paneles Virtuales)

Ampliación de Estudio

Diagnóstico

SI NO

Cobertura completa de Genes de Interés

Exoma dirigido

Exoma trio

Exoma clínico

Validación Sanger

Estudios de Segregación familiar (patrón de herencia de la variante)

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

36

N= 40 casos analizados por exoma SIN diagnóstico Genético

Nº de casos diagnosticados tras el reanálisis: 4 (10%)

Wenger AM, et al Genet Med. 2016 Jul 21.

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

37 Wenger AM, et al Genet Med. 2016 Jul 21.

Mayor automatización y Desarrollo de bases de datos actualizadas son las bases para asegurar una máxima rentabilidad de los estudios de NGS

Incremento progresivo de la información genética

*HGMD: Database of human gene mutation data

Fenotipos OMIM con base molecular conocida

Fen

oti

po

s O

MIM

Variantes Patogénicas

en HGMD*

Va

rian

tes P

ato

gén

ica

s

> Genes Candidatos confirmados Mejor interpretación de las variantes

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

38

4

Rentabilidad Diagnóstica y económica

del Análisis en Tríos

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

39

Enero, 2014

> 500 casos secuenciados

Octubre, 2016

Exomas dirigidos

370 casos

Analisis de Trios

204 casos

Base de datos de >1000 exomas

Desarrollo de Scripts Bioinformáticos de priorización

Rentabilidad Diagnóstica:

Variantes Diagnósticas (Patogénicas y probablemente patogénicas): 34%

Variantes Probablemente Diagnósticas (VUS): 19%

Casos no

diagnósticados tras

realización de Array

CGH y secuenciación

de genes ó paneles

dirigidos.

NIMGenetics es un CENTRO DE DIAGNÓSTICO ANALÍTICO CON UNIDAD DE

GENÉTICA, autorizado y habilitado para emitir diagnósticos clínicos por la Comunidad de Madrid

(Laboratorio de Diagnóstico Clínico, Licencia de Actividad Sanitaria con nº de registro CS10673)

ESHG 2015 (50 casos) J. Botet et al PM08.20

ESHG 2016 (130 casos) M. Pena-Vilabelda P08.24

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

40 JAMA. 2014;312(18):1880-1887

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

41

0

5

10

15

20

25

Diagnóstico DiagnósticoProbable

Diagnóstico DiagnósticoProbable

DI NO SINDRÓMICA (n=32) DI SINDROMICA (n=70)

Cas

os

Homocigotos

Heterocigotas compuestas

Hemicigotas

de novo

Rentabilidad Dx: 18% (6/32) Rentabilidad Dx: 50% (45/70)

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

42

AL MEDICO RESPONSABLE una intervención clínica definida: seguimiento,

tratamientos, procedimientos diagnósticos basados en el conocimiento de la enfermedad

A LOS PADRES les reduce la ansiedad y permite establecer un riesgo de

recurrencia más ajustado para futuros embarazos.

AL PACIENTE una atención médica dirigida con posibilidades de acceso a

nuevos fármacos, evitando procedimientos diagnósticos innecesarios, ofreciendole una

explicación del curso de su enfermedad (pronóstico, riesgos asociados, etc..)

Un diagnóstico de Certeza tiene consecuencias tanto para el

paciente como para sus familias

¿ CUAL ES EL IMPACTO ECONÓMICO AL SISTEMA DE SALUD LA

APLICACIÓN DE ESTAS TECNOLOGÍAS?

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Sarah, E. Soden et al, Sci Transl Med 6, 265ra168 (2014)

Impacto Económico del Diagnóstico Genético

Los estudios previos al estudio genético, incluían:

Analíticas,

Procedimientos radiológios

electromiogramas, estudios

de conducción nerviosa.

Los procedimientos diagnósticos realizados fuera de la institución fueron omitidos

Coste Total

$19,100 por familia

(rango: $3248 a $55,321)

Asumiendo la realización de 2,55 WES por familia (puesto que se habían realizado

tanto casos de exoma dirigido como de tríos) se demostro que este estudio era coste

efectivo dado que suponía un gasto de $2996 por individuo.

Análsisi de 100 familias con 119 niños con trastornos del neurodesarrollo

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

44

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

45

El diagnóstico mediante Exomas es una herramienta

actualmente disponible en la práctica clínica

Esta aproximación diagnóstica NO es más dificil de manejar que la

situación actual con pacientes sin diagnosticar ó mal diagnósticados

Es actualmente una herramienta diagnóstica disponible, asequible y

rentable.

Permite centrar el diagnóstico evitando la confusión, las pruebas

diagnósticas innecesarias mejorando la calidad de vida del paciente y de su

familia.

Facilita la identificación de genes causales, punto de partida para el

desarrollo de terapias dirigidas.

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Laboratorio de NGS:

Javier Botet

Paolo Maietta

Mº del Mar Peña Vila-Belda

Mónica Martinez García

Irene Díez

Rocío Sánchez

Celia Rodriguez

Marta Carcajona

David Rodríguez

Noelia Sánchez

Gema Benito

… A nuestros Médicos y Genetistas:

Hospital Universitario Quiro n, Madrid

Hospital Universitario de Getafe, Madrid

Hospital Ruber Internacional, Madrid

Hospital Niño Jesus, Madrid

H. Universitario Gregorio Marañón, Madrid

Hospital Clínico San Carlos, Madrid

Hospital Universitario de la Princesa, Madrid

Hospital Miguel Servet, Zaragoza

Cli nica Universidad de Navarra, Pamplona

Hospital Universitario Reina Sofi a, Cordoba

Hospital Universitario Materno Infantil de Canarias, Las Palmas

Centro de Estudios Geneticos de Andaluci a, Granada

Hospital Virgen del Rocío, Sevilla

Complejo Hospitalario Universitario de Albacete

Hospital El Angel, Ma laga

Instituto Neurolo gico Dr. Mateos, Oviedo

Hospital Sant Joan de Deu, Barcelona salvarez@nimgenetics.com

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