CROMATOGRAFÍALÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA

(HPLC)

La fase móvil es líquida

Partición o reparto

Adsorción

Intercambio iónico

Exclusión molecular

Cromatografía líquida de alta eficiencia

Características y ventajas

Trabaja con partículas muy pequeñas (< 10 m)

Presiones de 1000 - 6000 psi (pounds square inch

= libras por pulgada cuadrada, 1 atm = psi/14.7)

Rápida

Picos angostos (alta eficiencia)

Separa compuestos no-volátiles o térmicamente

inestables

Cromatografía líquida de alta eficiencia

BOMBA

INYECTOR

CÁMARA DE MEZCLA

PRE-COLUMNA

DETECTOR

COLUMNA

Esquema del equipo de HPLC

Elución con gradienteElución

isocrática

Elución isocrática vs elución con gradiente

Elución isocrática: solvente de composición constante.Elución con gradiente: solventes de distinta polaridad. Se varía la composición de la FM en forma continua o escalonada.

Solventes utilizados como FM

Solventes orgánicos, agua/solventes miscibles, agua/soluciones reguladoras

Alta pureza

Desgasificados

Tratamiento con He

Sistema de desgasificación al vacío

Filtración

Sistemas de bombeo

Requerimientos

Generación de altas presiones (1000 - 6000 psi)

Flujo libre de pulsaciones

Caudales 0.1 – 10 mL/min

Componentes resistentes a la corrosión (acero inoxidable, teflón)

Bomba recíproca o de movimiento alternado

etapa de aspiración

pistón

fase móvil

etapa de descargahacia la columna

Ventajas: pequeño volumen interno, resiste presiones > a 10.000 psi, permite elución con gradiente, caudales constantes e independientes de la contrapresión de la columna y la viscosidad del solvente

Desventaja: produce flujo pulsado (amortiguar)

Sistemas de inyección de muestra

eluyente

Llenado del bucle Inyección de muestra en columna

columna

eluyente

columna

muestra

Sistemas de inyección de muestra

Sistemas de inyección de muestra

Composición similar a la columna cromatográfica

Elimina materia en suspensión y componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la FE

Se usa para mejorar la vida de la columna. Se

reemplaza cuando se contamina.

Precolumna

Tubos de acero inoxidable. Ocasionalmente de vidrio resistente

Rectas (10 - 30 cm de longitud) y 4-10 mm d.i.

Tamaño partículas de relleno: 5–10 m

Columnas termostatizadas: en general se trabaja a T ambiente. La T constante mejora el cromatograma

Columna

Columna

Rellenos

Relleno pelicular. Esferas de vidrio o polímero no porosas de 30 – 40 m de diámetro. En la superficie de las esferas se deposita una capa delgada y porosa de sílica, alúmina, polímero.

Relleno de partículas. Micropartículas porosas de sílica, alúmina o polímero de 3 – 10 m de diámetro. Se recubren con películas orgánicas que unen químicamente o físicamente a la superficie.

Columna

Basados en la medida de una propiedad del eluyente (índice de refracción, constante dieléctrica, densidad)

Basados en la medida de una propiedad del soluto (absorbancia, fluorescencia, corriente límite)

Requisitos

Sensibilidad adecuada

Respuesta lineal amplia

Respuesta rápida y reproducible

Manejo sencillo

Detectores

Celda del detector UV-visible en HPLC

De la columna

DetectorFuente UV

Al desecho

Ventanas de cuarzo

Ensanchamientoextracolumna

Eficiencia de la columna

Tamañopartículas

de empaque

Tamaño de

muestra

10 m

5 m

3 m

H

(cm/min)

H vs para partículas de diferentes diámetros

Tamaño de muestra

adsorción

L-L (k = 2.3)

fase ligada (k = 4.3)

fase ligada (k = 1.2)

H

g muestra/ g empaque

De acuerdo al tipo de FE el efecto es más o menos pronunciado

Ensanchamiento extracolumna

r224 DM

Hex =

Se origina en los tubos que conectan los componentes del sistema cromatográfico (puerto de inyección y columna, columna y detector, etc.)

coeficiente de difusión del soluto en fase móvil [cm2/s]

radio del tubo [cm]velocidad lineal de FM [cm/s]

CROMATOGRAFÍA GASEOSA

G-L y G-FL

G-S adsorción

partición G-LGaseosa

líquida

sólida

FM FE MÉTODO INTERACCIÓN

Cromatografía gaseosa

Ventajas:

Alta resolución

Alta velocidad

Alta sensibilidad

Separación de compuestos con PE ~

Limitaciones:

Muestras volátiles o fácilmente vaporizables

Deficiente para compuestos iónicos o de PM > 600

Deficiente como técnica cualitativa y preparativa

Cromatografía gaseosa

Cromatógrafo de gases

Esquema de un cromatógrafo de gases

gas portador

puerto de inyección

columna

registro

medidor flujo

sitio de referencia

Detector

cromatografía de elución

Puerto de inyección

vidrio

entrada gas portador

columna

cámara de vaporización

salida de excedenteBloque de metal

calentado

salida de purga del septo

septo de goma

Columnas tubulares abiertas (capilares)

Columnas rellenas

Columnas

flujoDiámetro interno(100 a 700 m)

Sílice fundidapoliimida

Soporte recubierto con FE líquida

SCOTWCOT FSOT

Columnas tubulares abiertas (capilares)

Columnas

Columnas

FSOT WCOT SCOT Rellena

Fases estacionarias Nombre comercial

Polidimetilsiloxano OV-1, SE-30

Poli(fenilmetildimetil)siloxano [10% fenil] OV-3, SE-52

Poli(fenilmetil)siloxano [50% fenil] OV-17

Poli(trifluoropropildimetil)siloxano OV-210

Polietilenglicol Carbowax 20M

Poli(dicianoalildimetil)siloxano OV-275

Ejemplos de algunas fases estacionarias usadas en cromatografía de gases

FE no-polar poli(dimetilsiloxano)

CG de 10 compuestos en FE de distinta polaridad

Los compuestos aparecen casi en orden creciente de sus puntos de ebullición. El determinante principal de la retención en esta columna es la volatilidad de los compuestos

6911710298138126

hexanobutanol3-pentanonaheptanopentanoloctano

5678910

80metil etil cetona497propanol336pentano256acetona1PE (°C)Compuesto

La FE muy polar retiene los solutos polares. Los primeros que se eluyen son los 4 alcanos, le siguen las 3 cetonas y por último los 3 alcoholes. La fuerza determinante de la retención es el enlace de hidrógeno con la FE.

propanol butanol pentanol

CG de 10 compuestos en FE de distinta polaridad

FE polar poli(etilenglicol)

6911710298138126

hexanobutanol3-pentanonaheptanopentanoloctano

5678910

80metil etil cetona4

97propanol3

36pentano2

56acetona1

PE (°C)Compuestoalcanos

cetonas

Efecto de la temperatura en el cromatograma

Isotérmica a 45 °C

Isotérmica a 145 °C

Programada

Detector de conductividad térmica

Detector de ionización de llama (FID)

terminal de la columna

gas portador

H2

aire

llama

electrodo colector

Detector de captura electrónica

(Ni63, Sr90)

aislante

de la columnaal desecho

emisor radiactivo

+electrodo

-electrodo

CONDUCTIVIDAD TÉRMICA

IONIZACIÓN DE LLAMA

CAPTURA ELECTRÓNICA

COMPUESTOS Orgánicos e inorgánicos. Algunos dañan los filamentos (HCl, Cl2, haluros de

alquilo)

Orgánicos. No responde a CO, CO2,

SO2, H2O

Con átomos electronegat.(haluros de alquilo, organometálicos, organofosforados)

GAS PORTADOR H2, He N2, He N2, Ar

SENSIBILIDAD Moderada Muy buena Muy buena

LINEALIDAD Buena Amplia Limitada

TEMPERATURA LÍMITE

400 °C 400 °C 225 °C (Tr)350 °C (63Ni)

OTROS No destructivo. Afectado por variaciones de temperatura y caudal

Destructivo,requiere 3 gases y electrómetro

No destructivo, requiere licencia, muestras secas y electrómetro

Análisis cuantitativo en CL y CG

Área S

[S] [S]/[P]

Área SÁrea P

Uso de patrones externo e interno

S PS

Uso de patrón externo

Área Sx

Sx

Área SxÁrea P

SxP

CROMATOGRAFÍA ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS

Un espectrómetro de masas acoplado a un cromatógrafo líquido o a un cromatógrafo de gases es un potente detector para análisis cualitativo y cuantitativo

La espectrometría de masas es una técnica basada en ionizar moléculas gaseosas, acelerarlas en un campo eléctrico y separarlas de acuerdo a sus masas

Un espectro de masas es un gráfico que muestra la abundancia relativa de cada fragmento que llega al detector de un espectrómetro de masas