Título Director E-mail Requisitos para el alumno inicio Desarrollo de nuevos métodos de separación de ingredientes farmacéuticos activos empleando sistemas automáticos de baja presión. Aplicación al control de calidad de fármacos. P2

Acebal Carolina cacebal@uns.edu.ar 240h - agosto

Estudios farmacológicos y químicos de plantas medicinales del sudoeste bonaerense. P3

Bucciarelli Alejandro abucciarelli@uns.edu.ar 240h Actitudinales: Capacidad para el trabajo en equipo. Apertura al diálogo y tolerancia. Responsabilidad durante el trabajo

agosto

Rol de las aminas biogénicas en la comunicación neuroinmune. P4

De Rosa Ma Jose mjderosa@criba.edu.ar 120h Estar cursando el 4to año de la carrera. Promedio ≈ 8 (ocho)(calculado con plazos).

agosto

Aumento de la velocidad de disolución de fármacos poco solubles mediante la incorporación en materiales mesoporosos. P5

Gallo Loreana loreanagallo@hotmail.com 120h - agosto

Efecto de fitoestrógenos y bisfosfonatos en células óseas. P6

Lezcano Virginia A vlezcano@criba.edu.ar 240h Lectura y comprensión de textos en inglés. agosto

Niveles de expresión de genes proapoptóticos y antiapoptóticos en células musculares esqueléticas tratadas con extractos lipídicos de Nicotiana glauca y Lycopersicon esculentum durante la apoptosis. P7

Milanesi Lorena milanesi@criba.edu.ar 200h - febrero

Nano-Hidroxiapatita biomiméticas como sistemas de transporte de principios activos. P8

Messina Paula V pmessina@uns.edu.ar 160h conocimientos mínimos de manejo y seguridad en el laboratorio; conocimientos académicos químicos, físicos y matemáticos

agosto

Empleo de técnicas cromatográficas, con un foco en la Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC), para el aislamiento de clases de lípidos y sus especies moleculares. P9

Oresti G. Martin gmoresti@criba.edu.ar 120h - agosto

Rol de la testosterona frente a la apoptosis en células musculares esqueléticas murinas C2C12: la mitocondria como organela target. P10

Pronsato Lucia lpronsato@criba.edu.ar 200h - febrero

Bases moleculares y modulación farmacológica de la respuesta a stress en el organismo modelo C.elegans. P11

Rayes Diego H drayes@criba.edu.ar 120h -Estar cursando el 4to año de la carrera. -Promedio ≈ 8 (ocho)(calculado con plazos).

agosto

Monitorización de la foto-degradación de dexametasona a diferentes pHs. P12

Razuc Mariela mariela.razuc@uns.edu.ar 240h agosto

Rol de receptores P2 en la modulación de la proliferación, migración y diferenciación de osteoblastos de rata. P13

Santillán Graciela gsantill@criba.edu.ar 120h -Posibilidad de asistir regularmente 4h por semana al laboratorio.

agosto

EFECTOS DE EXTRACTOS LIPÍDICOS DE Nicotiana glauca y Lycopersicon esculentum EN CÉLULAS MUSCULARES ESQUELÉTICAS EN CONDICIONES DE ESTRÉS OXIDATIVO. ROL DEL CITOESQUELETO. P14

Vasconsuelo Andrea avascon@criba.edu.ar 200h -Aprobado el curso de suficiencia de Inglés.

febrero

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Desarrollo de nuevos métodos de separación de ingredientes farmacéuticos activos empleando sistemas automáticos de baja presión. Aplicación al control de calidad de fármacos.

La falsificación y adulteración de medicamentos es una problemática que se ha incrementado en las últimas décadas y constituye un serio inconveniente a nivel mundial, especialmente en países en desarrollo. Para subsanarlo y cuidar la salud de los pacientes, existen sistemas de control cada vez más rigurosos. Sin embargo, con la nueva legislación, que obliga a los médicos a prescribir por nombre genérico y no por medicamento genérico, han resurgido nuevos laboratorios farmacéuticos y farmacias que elaboran preparaciones magistrales y oficinales a costos más bajos. Por esta razón, la implementación de sistemas rápidos y de bajo costo para el análisis de ingredientes farmacéuticos activos (APIs), que además permitan su cuantificación a bajos límites de detección, es de gran importancia. En este sentido, las metodologías de automatización, tales como Análisis por Inyección en Flujo (FIA) y Análisis por Inyección Secuencial (SIA) dan lugar el desarrollo de métodos simples y de bajo costo, que permiten aumentar significativamente la frecuencia de muestreo y disminuir la cantidad de muestra empleada y de residuos generados. El acoplamiento de una columna cromatográfica a un sistema automatizado se presenta como una alternativa que permite la realización de separaciones cromatográficas simples sin una instrumentación costosa como lo es la Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC). Esto ha abierto nuevas posibilidades en el campo del análisis en flujo ya que permite resolver fácilmente problemas relacionados con el análisis de muestras que contienen más de un analito de interés, los cuales pueden ser separados y detectados en un sistema en flujo de baja presión. Además, debido a la gran versatilidad de este tipo de metodologías, es posible incorporar cualquier tipo de pretratamiento de la muestra (SPE, celdas de extracción líquido-líquido) con las ventajas de lograr la automatización total del método a muy bajo costo. Más aún, los requerimientos operacionales para la implementación de este tipo de sistemas son significativamente menores que los exigidos para HPLC, y los tiempos de análisis, en la mayoría de los casos, son más cortos, lo que facilita su transferencia e implementación en los laboratorios de rutina. Por lo tanto el presente plan propone: Desarrollar nuevos métodos de separación automatizados para la determinación de APIs en muestras farmacéuticas, que permitan simplificar los procesos analíticos de medida con el objetivo de facilitar su implementación para el control de calidad de fármacos en los laboratorios de rutina. Particularmente, se trabajará en el desarrollo de métodos para la separación y determinación de fármacos de la familia de las sulfonamidas. Las sulfonamidas son compuestos químicos que contienen un grupo sulfuro unido a un anillo de benceno y grupos amino. Estos fármacos presentan diferente acción terapéutica como por ejemplo antibióticos (sulfametoxazol), diuréticos (furosemida, hidroclorotiazida), hipoglucemiantes orales (glibenclamida, glipizida), antiinflamatorios no esteroideo (inhibidor selectivo de la COX-2), antirretrovirales (fosamprenavir, tipranavir) entre otros. El alumno adquirirá experiencia en: -El uso de técnicas cromatográficas -Tratamiento de muestras farmacéuticas - Sistemas automatizados de análisis El director entrenará al alumno en el uso de las técnicas mencionadas. El alumno realizará tareas independientes de las que esté llevando a cabo su supervisor el cuál acompañará su labor en el laboratorio.

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Estudios farmacológicos y químicos de plantas medicinales del sudoeste bonaerense En los últimos años, la industria farmacéutica ha focalizado sus esfuerzos en la investigación farmacológica de plantas medicinales como también en el estudio de los compuestos químicos presentes en ellas. Los beneficios de su utilización se fundamentan en que suelen estar disponibles en cantidades apreciables en la naturaleza y su preparación resulta relativamente sencilla y económica. A ello se suma el hecho de tener una acción más moderada que los fármacos sintéticos, ejercida en la mayoría de los casos por la combinación de varios compuestos que logran modificaciones graduales, pero a la vez más equilibradas en el organismo. Además, pueden administrarse durante mayores períodos de tiempo y con menores riesgos de toxicidad, lo que hace interesante el estudio de sus componentes ya que ello podría contribuir a la obtención de tratamientos más racionales contra diversas patologías. Numerosos trabajos sobre medicina tradicional demuestran que el tratamiento de las afecciones del sistema digestivo es uno de los usos más difundidos de las plantas medicinales. Entre las patologías más relevantes se destaca la úlcera gástrica, que constituye un problema médico-social de trascendencia económica debido a su alta incidencia, amplia distribución geográfica y elevados gastos médicos, destacándose como responsables varios factores tales como la ingesta de alcohol, el estrés, la dieta y el consumo de cierto tipo de medicamentos. Considerando que la úlcera gástrica, por sus características etiopatológicas, es de difícil prevención y dado que la utilización de compuestos vegetales, por su variada composición, podría representar una alternativa eficaz para su tratamiento y prevención, el presente plan propone evaluar la actividad farmacológica de ciertas especies argentinas que se desarrollan en la región del sudoeste bonaerense y relacionarla con su composición química. En tal sentido, algunas de estas plantas han sido objeto de estudios preliminares por parte de nuestro grupo de investigación, los que revelaron la presencia de compuestos de interés, tales como carbohidratos, polifenoles, terpenos y saponinas, entre otros. Sin embargo, en escasa cantidad de ellas se ha encontrado evidencia científica acerca de bioensayos que permitan relacionar dichos compuestos con los usos medicinales de las mismas. Tampoco se cuenta con información respecto a sus potenciales efectos tóxicos, lo que acrecienta la necesidad de realizar estudios que permitan garantizar el uso seguro de las mismas. Es por ello que la propuesta del presente plan consiste en estudiar la actividad gastroprotectora de especies vegetales nativas en modelos experimentales de inducción de úlceras. Se propone además realizar la caracterización química de los principales compuestos presentes y estudiar otras actividades biológicas que podrían resultar promisorias, tales como la actividad antitumoral primaria y la capacidad atrapadora de radicales libres, en aquellas especies que presenten significativa capacidad gastroprotectora. Finalmente, en caso de ser posible, se prevé realizar estudios toxicológicos ya que no se cuenta con información científica acerca de su inocuidad, lo que resulta fundamental para su utilización con fines terapéuticos. De esta forma, también se espera avanzar en la búsqueda de nuevas alternativas terapéuticas con principios activos de baja toxicidad y de menor costo, con el aprovechamiento racional de nuestros recursos naturales. El hallazgo de sustancias con estas propiedades permitirá diseñar nuevas estrategias terapéuticas que serían aplicables a pacientes que sufren úlcera gástrica y patologías relacionadas, como también avalar el uso terapéutico de las mismas como seguro. La metodología de trabajo, que será acompañada y supervisada por el Director, comprende: 1) Estudios farmacológicos a) Ensayos in vivo: Evaluación de la actividad gastroprotectora en modelos experimentales. b) Ensayos in vitro: b.1) Ensayo de Artemia salina, b.2) Ensayo de inhibición de la elongación de raíces de trigo, b.3) Evaluación de la actividad atrapadora de radicales libres. 2) Estudios fitoquímicos a) Preparación de diferentes extractos y fracciones de las especies en estudio. b) Desarrollo de perfiles cromatográficos planares de las fracciones principales de los extractos sobre papel y mediante cromatografía en capa fina. c) Fraccionamiento de los extractos mediante diálisis en membrana. d) Cuantificación de hidratos de carbono totales, fenoles totales, ácidos urónicos, terpenos y flavonoides de los extractos originales y aquellos obtenidos luego de la diálisis.

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Rol de las aminas biogénicas en la comunicación neuroinmune

Las interacciones entre el SN y el SI son esenciales para un correcto funcionamiento del organismo. Estos sistemas se comunican bidireccionalmente para mantener la homeostasis corporal y coordinar una eficaz defensa. En células inmunes se describió la presencia de moléculas que se creían expresadas exclusivamente en SN tales como neurotransmisores y sus receptores. Recíprocamente, en células pertenecientes al SN se reportaron citoquinas y sus receptores. Sin embargo, los roles fisiológicos de estas moléculas en dichos tejidos son poco conocidos. En mamíferos la complejidad de ambos sistemas dificulta el estudio de estas interacciones. Además, el restringido acceso a células nerviosas impide estudiar en simultáneo el impacto de un sistema sobre el otro. C.elegans es un modelo invaluable para obtener información en un organismo completo. Además, este nematodo es ampliamente utilizado para el estudio de vías y moléculas del SN y en mecanismos básicos de inmunidad innata. Nosotros utilizamos este animal para el estudio de interacciones neuroinmunes. Este modelo permite la realización sencilla de ensayos farmacológicos. Por ejemplo se puede estudiar el mecanismo de agonistas y antagonistas de receptores de neurotransmisores debido a que el nematodo permite la incorporación de moléculas a través del intestino y la epidermis. Además, el conocimiento completo de su genoma y su corto ciclo de vida permite fácilmente su manipulación genética. A pesar de las diferencias evolutivas, las enzimas y proteínas involucradas en la síntesis y liberación de neurotransmisores, así como sus receptores, se encuentran altamente conservados entre nematodos y mamíferos. Esto es sumamente ventajoso para nuestro proyecto ya que representa un accesible modelo para la realización de animales mutantes y knock-outs. C.elegans posee únicamente inmunidad innata y carece de células inmunes especializadas. No se conoce con exactitud cómo se desencadena la respuesta inmunológica, sin embargo, se describió que puede activarse por diferentes vías como ser daño tisular o infecciones. El estudio de la inmunidad innata se pospuso por años por considerársela más rudimentaria. Hoy se conoce que es de vital relevancia para mantener la homeostasis del organismo representando la primera línea de defensa. Sin esta primera barrera, los mamíferos no son capaces de desencadenar una respuesta adaptativa y, más grave aún, puede generarse daño del tejido y causar enfermedades. Varios trabajos que utilizan a C.elegans como modelo de inmunidad, lograron describir su regulación por péptidos de origen neuronal y neurotransmisores. Por ejemplo serotonina estaría implicada en la acción de detectar y evitar bacterias patógenas. Otros autores reportan una participación directa en la respuesta inmune, ya que los mutantes que carecen de este neurotransmisor son más sensibles a la infección por Pseudomona aeruginosa. El siguiente plan forma parte de un proyecto en el cual estudiamos la participación de los neurotransmisores en la respuesta inmune. Investigaremos el rol de las aminas biogénicas en la modulación de la inmunidad innata y como nexo entre el SN y el SI. Se aprenderán las técnicas básicas de cultivo del nematodo C. elegans y se realizarán cruzas genéticas las cuales serán genotipadas por la técnica de Reacción de la Polimerasa en Cadena (PCR). Induciremos la respuesta inmune mediante la infección con patógenos y luego evaluaremos la supervivencia del animal. Comenzaremos realizando ensayos farmacológicos por medio del agregado exógeno de tiramina y octopamina, equivalentes en invertebrados a adrenalina y noradrenalina respectivamente. Luego profundizaremos el estudio a nivel genético con mutantes que carezcan de algún paso crítico involucrado en su metabolismo o sus receptores. Combinando estudios realizados en invertebrados con los obtenidos en otros modelos, podremos ahondar en la comprensión de las complejas interacciones entre el SN y el SI y en cómo se mantiene la homeostasis del organismo para conservarse saludable pero a la vez estar rápidamente preparado para defenderse de diversas agresiones.

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Aumento de la velocidad de disolución de fármacos poco solubles mediante la incorporación en materiales mesoporosos Un fármaco atraviesa por diferentes procesos hasta ejercer su efecto farmacológico una vez ingerido desde una forma farmacéutica sólida oral. En primer lugar, la forma farmacéutica se desintegra en gránulos o agregados que posteriormente se rompen y originan partículas individuales. Las partículas del fármaco deben disolverse para que luego puedan absorberse y así producir el efecto terapéutico. Por ende, la etapa de disolución representa el paso limitante para la absorción del fármaco. Sin embargo, más del 40% de los fármacos son poco solubles en agua lo cual limita la formulación de los mismos, su aplicación clínica y comercialización debido a su pobre disolución y biodisponibilidad. Con el fin de mejorar la solubilidad de estos fármacos varias estrategias se han propuesto. Una de ellas es la adsorción del fármaco en matrices de gran área superficial como los materiales de sílice mesoporosos. Estos materiales constituyen una matriz interesante desde el punto de vista farmacéutico debido a su biocompatibilidad y a la posibilidad de controlar el ordenamiento y el tamaño de los poros que permiten determinar la carga del fármaco en la matriz y la cinética de liberación del mismo. En el presente plan de trabajo, considerando las potencialidades de los materiales mesoporosos para aumentar la solubilidad de fármacos, se plantea mejorar la solubilidad del antiparasitario Albendazol. Se seleccionó este fármaco como modelo debido a su baja solubilidad en agua y por su aplicación como antiparasitario en el tratamiento de la hidatidosis. Esta enfermedad es una parasitosis que en nuestro país constituye un importante problema de salud pública por ser una enfermedad endémica. Con el fin de aumentar la solubilidad de Albendazol se plantean las siguientes actividades y metodologías: - Relevamiento bibliográfico: la búsqueda se orientará a reunir bibliografía sobre las características físico-químicas del fármaco modelo, síntesis de material mesoporosos y técnicas de cargado del fármaco en el material. El director y el supervisor guiarán al alumno en la búsqueda bibliográfica. - Caracterización de los materiales mesoporosos sintetizados: se caracterizarán mediante la técnica de difracción de rayos X, el análisis del área superficial BET, el volumen y el diámetro de poro se realizará en el equipo Micromeritics Instrument Corp., asimismo, se medirá la distribución del tamaño de partícula por difracción laser. El director y el supervisor guiarán al alumno en el uso de los equipos mencionados. - Carga del fármaco: se cargará en los materiales sintetizados mediante impregnación a humedad incipiente empleando un solvente adecuado. El director y el supervisor guiarán al alumno para realizar la técnica de cargado del fármaco. - Caracterización de los materiales sintetizados cargados: el estado físico del fármaco y de las muestras de materiales mesoporosos cargados será estudiado mediante calorimetría diferencial de barrido. El director y el supervisor guiarán al alumno en el uso del equipo mencionado. - Estudio de velocidad de disolución: se evaluará por el método de las paletas en un equipo normalizado en farmacopea (USP 34, 2011). Se extraerán muestras a intervalos de tiempo predeterminados y el Albendazol se cuantificará por espectrofotometría UV. Estos ensayos permitirán evaluar los perfiles de liberación. El director y el supervisor guiarán al alumno en el uso de la metodología descripta.

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Efecto de fitoestrógenos y bisfosfonatos en células óseas

La alteración de la homeostasis de la masa ósea es una característica común de muchos trastornos óseos, como la osteoporosis y, eltratamiento de estos cambios depende de una mayor comprensión de los mecanismos celulares que controlan la formación, proliferación, diferenciación y apoptosis de las células óseas. Existe en la actualidad un gran interés en los fitoestrógenos por ser compuestos naturales presentes en alimentos, con acción estrogénica y 2 por su potencial terapéutico alternativo en la osteoporosis. Estos agentes también pueden ser útiles en combinación con los actuales agentes antirresortivos (Bisfosfonatos), ampliando aún más las opciones terapéuticas. Este proyecto comprende investigaciones básicas que contribuirán al conocimiento de las bases moleculares involucradas en supervivencia y proliferación de células osteoblásticas en respuesta a fitoestrógenos o la acción combinada con bisfosfonatos. Como metodología de rutina se realizará la preparación de diferentes soluciones de uso, medios de cultivo, colorantes, buffers, etc. Además, las técnicas que se utilizarán comprenden el cultivo de diferentes líneas celulares así como cultivo primario de osteoblastos, trabajando en condiciones de esterilidad bajo flujo laminar.Para determinar proteínas se utilizará el método colorimétrico de Bradford y se realizará la curva de calibrado correspondiente. Se estudiará la diferenciación osteoblástica en distintos estadios de diferenciación, midiendo la actividad de la enzima marcadora fosfatasa alcalina. La viabilidad celular se evaluará mediante el ensayo colorimétrico MTS. Para medir proliferación se teñirán las células con el colorante azul de trypan y se contarán bajo microscopio óptico, discriminando las que incorporan el colorante azul (muertas) de las que lo excluyen (vivas).Las vías de señalización intracelular involucradas en los procesos biológicos estudiados se evaluaran mediante Western blot. Brevemente, luego de los tratamientos correspondientes, las proteínas obtenidas del lisado celular se separan por electroforesis y se transfieren a una membrana que será incubada con anticuerpos específicos para las proteínas claves de las vías estudiadas. El alumno participará con ayuda del director en los diseños experimentales, obtención de resultados y posterior análisis de los mismos. En todos los casos, el alumno deberá comenzar a manejar el equipamiento acompañado del director y a medida que adquiera conocimiento y confianza, podrá trabajar solo.

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“Niveles de expresión de genes proapoptóticos y antiapoptóticos en células musculares esqueléticas tratadas con extractos lipídicos de Nicotiana glauca y

Lycopersicon esculentum durante la apoptosis”.

Introducción: A mediados del siglo XX se aislaron de distintas especies vegetales sustancias de naturaleza no esteroidal con propiedades estrogénicas (Geuns, 1977) y se las denominó fitoestrógenos. Han sido intensamente investigados debido a su capacidad de interactuar con los receptores estrogénicos (ERs) regulando su actividad transcripcional y actuando como mitógenos débiles in vitro (Kuiper et al., 1998). Nuestro grupo de trabajo ha demostrado la existencia de altos niveles de moléculas estructural y funcionalmente semejantes al estradiol (E2) en extractos lipídicos de hojas, tallos, semillas y cultivos in vitro de Solanum glaucophyllum (S.g), Licopersicon esculentum (L.e) y Nicotiana glauca (N.g) (Milanesi et al, 2004a,b). Nuestro grupo también obtuvo evidencias de la presencia, en estas especies, de moléculas proteicas capaces de unir específicamente tanto el E2 como componentes de los extractos liposoluble propios de la planta. Respecto al conocimiento general sobre los estrógenos, además del rol clásico, éstos han ganado importancia por su acción de tipo protectora sobre diversos tejidos (Kulkarni 2009). Específicamente, en músculo esquelético se ha demostrado la presencia de receptores de estrógenos (ERs), alfa y beta y la acción del esteroide en la fisiología del músculo esquelético. La apoptosis es un proceso activo en el músculo normal durante el ejercicio intenso o en patologías como la distrofia muscular, la denervación muscular y en otras miopatías y sarcopenias. Nuestro grupo ha demostrado que en células de músculo esquelético, C2C12, el E2 ejerce un rol protector frente a la apoptosis. Específicamente a nivel genómico, demostramos que la hormona promueve la expresión de genes antiapoptóticos y reduce la expresión de genes proapoptóticos inducidos por el H2O2 (agua oxigenada, empleado como inductor de la apoptosis). Nuestros trabajos recientes indican que los extractos lipídicos de L.e y N.g. protegen la morfología de las células C2C12 inducidas a apoptosis con H2O2; sin embargo desconocemos si estos extractos, activan los mismos mecanismos moleculares que el E2. Si bien, se ha reportado el uso de extractos estrogénicos de origen vegetal, con propósitos medicinales (Molla et al., 2011; Khan et al., 2011), ya que son capaces de unirse a los ERs y ejercer acciones estrogénicas (Mense et al., 2008), no está totalmente esclarecido a través de cuáles mecanismos moleculares ejercen sus efectos. Objetivo general: Evaluar cambios en la expresión de genes proapoptóticos y antiapoptóticos de las células C2C12 tratadas con extractos lipídicos vegetales e inducidas posteriormente a apoptosis. 1. Modelo Experimental. Se utilizará la línea celular de músculo esquelético murino C2C12 (ATCC). 2. Aislamiento de fracciones liposolubles de N.g. y L.e.: Las fracciones liposolubles serán aisladas por el método de Bligh & Dyer (1959) a partir de hojas de N. g. y L. e. Para determinar el efecto de los extractos de N.g. y L.e. en células C2C12 apoptóticas, los ensayos que se describen se realizarán con células preincubadas con los extractos de ambas especies de manera separada e inducidas posteriormente a apoptosis con H2O2. 3. Inducción a la apoptosis: Los cultivos celulares serán tratados con H2O2 preparada en medio DMEM sin suero (durante 30 min, 1hora, 2 horas y 4 horas) (Vasconsuelo et al., 2008). 4. Evaluación de la apoptosis: Se utilizará un kit comercial para evaluar la fragmentación del ADN nuclear como control de la apoptosis (Pronsato et al, 2016). 5. Ensayos de PCR en tiempo real (qPCR) para medir los niveles de ARN mensajero de los genes de interés: Se evaluará la expresión de los genes de interés que han sido estudiados para E2, midiendo los niveles de expresión de los ARN mensajeros mediante qPCR utilizando el equipo ABI 7500, y nuestros protocolos (Pronsato, 2014). El diseño de los primers se realizó empleando los programas del qPCR ABI 7500 y comprobando la especificidad de los mismos. Nota: todos los reactivos y equipos se encuentran en el laboratorio y son de uso frecuente por parte de nuestro grupo de investigación.

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Nano-Hidroxiapatita biomiméticas como sistemas de transporte de principios activos

El desarrollo de biomateriales compuestos como sistemas de liberación de fármacos ha provocado un gran interés en las últimas décadas por parte de especialistas médicos debido a sus ventajas prácticas. Una de estas ventajas consiste en la mejora de la aplicación local de medicamentos que permiten obtener efectos quimioterapéuticos con cantidades inferiores de fármacos. Específicamente la nueva generación de implantes de hueso debe ser bio-activa, es decir, que debe inducir las respuestas celulares deseadas; lo que lleva a la integración del material en el tejido nativo y a estimular procesos de auto-curación. El uso de nano-hidroxiapatita (nHA, Ca10(PO4)6(OH)2) en ortopedia se considera muy prometedor debido a su similitud química y morfológica con los cristales óseos. La morfología de la nHA es de gran importancia para su rendimiento, por ejemplo, la n-HA con forma de fibras o discos manifiestan un aumento de sus propiedades de adsorción debido a un incremento en las áreas superficiales, mientras que la nHA con formas de hebras o filamentos pueden emplearse para aumentar las propiedades mecánicas de los biomateriales. A su vez, las nHA tienen un gran potencial en la construcción de dispositivos de suministro de fármacos debido a su pequeño tamaño, gran área superficial y excelente bio-compatibilidad. Sin embargo, la preparación de nHA para su aplicación en un sistema de administración de fármaco rara vez ha sido reportada porque la misma presenta una estructura cristalina complicada y es difícil de obtener nHA estables de características morfológicas específicas. La investigación propuesta forma parte de un proyecto de mayor envergadura destinado a mejorar las capacidades físicas, químicas y biológicas de los cementos base a fosfatos de calcio mediante el uso de nano-partículas de hidroxiapatita. (PIP 2014-2016 – 11220130100100CO). La hipótesis que se desee probar con la presente propuesta es si efectivamente las propiedades superficiales y de degradación de las nano-partículas de hidroxiapatita biogénicas preparadas son aptas para su empleo en el transporte y liberación controlada de principios activos con vistas a su aplicación en implantes óseos y dentales.

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Empleo de técnicas cromatográficas, con un foco en la Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC), para el aislamiento de clases de lípidos y sus especies moleculares

El plan de trabajo se enmarca en un proyecto cuyo objetivo final es conocer las propiedades y funciones de lípidos específicos existentes en tejidos y células animales. - Uno de los objetivos particulares es desarrollar un método para el aislamiento preparativo (por HPLC) de ácidos grasos naturales poco conocidos, específicamente los que se encuentran naturalmente en lípidos de membranas de la retina y de los espermatozoides. Se espera poder separar estos ácidos grasos de acuerdo con el número de sus átomos de carbono y de sus dobles ligaduras mediante HPLC, empleando columnas de fase reversa. - El siguiente objetivo particular será el de aislar especies moleculares de lípidos que contienen uno de estos ácidos grasos por molécula, empleando el mismo criterio. Específicamente se aplicará a la resolución de esfingomielinas y ceramidas. - En tercer lugar se propone iniciar el desarrollo de un método para cuantificar las especies moleculares separadas, utilizando el detector con que viene munido el equipo de HPLC. Bajo supervisión, el alumno adquirirá las siguientes habilidades: - Extraer clases de lípidos a partir de células y tejidos animales. - Aislar distintas clases de lípidos aplicando cromatografía en capa fina (TLC) y utilizando mezclas de solventes adecuadas. - Identificar los ácidos grasos que los lípidos de interés contienen, empleando cromatografía en fase gaseosa (CFG), luego de purificarlos y conservarlos adecuadamente para evitar su deterioro, en especial el de los ácidos grasos poliinsaturados. - Una vez lograda la separación, identificación y obtención de especies moleculares puras, en el caso de los ácidos grasos se proyecta estudiar comparativamente los efectos de los mismos al ser agregados a sistemas biológicos (principalmente células en cultivo o partes de células, por ejemplo la membrana plasmática o el retículo endoplásmico). - Con respecto a las esfingomielinas así aisladas, se propone estudiar sus propiedades al incluirlas en sistemas modelo (liposomas) junto con otros lípidos. En todas las etapas del desarrollo del plan el alumno contará con supervisión directa, en especial en aquellas que requieren el uso de equipamiento específico (CFG y HPLC). Aprenderá las funciones y forma de operación correcta de cada parte de estos instrumentos. Se espera que hacia el final del proyecto el alumno logre autonomía en el uso de los mismos.

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Rol de la testosterona frente a la apoptosis en células musculares esqueléticas murinas C2C12: la mitocondria como organela target

Introducción: La apoptosis comprende un conjunto de eventos que culmina en la autodestrucción/muerte celular, sin inflamación ni daño a los tejidos circundantes. Datos experimentales obtenidos con animales de edad avanzada muestran activación de la apoptosis en músculo esquelético, contribuyendo este proceso a la patogénesis de la sarcopenia. En nuestro trabajo experimental ha sido demostrado que la testosterona protege frente a la apoptosis inducida por H2O2 en células musculares esqueléticas C2C12 (Pronsato et al. 2010, 2012, 2013a, 2013b) y el mecanismo involucra al receptor de andrógenos (AR) con localización clásica (nuclear) y no clásica (mitocondrias y microdominios) (Pronsato et al. 2013a). Ha sido demostrado que la mitocondria juega un importante rol en la inducción de apoptosis de las células musculares C2C12, observándose los cambios típicos en la morfología y distribución de las mitocondrias tras el tratamiento con el inductor de apoptosis, H2O2, así como también la pérdida del potencial de la membrana mitocondrial, la apertura del poro de permeabilidad transitoria (PTPm, determinado con calceína AM/CoCl2) y la liberación de citocromo c, lo que va a desencadenar el inicio de la muerte celular por apoptosis (Pronsato et al. 2012, 2013a, 2013b, 2016). Sin embargo, el tratamiento hormonal previo al H2O2, reduce considerablemente los efectos del inductor de apoptosis. El tratamiento con el antagonista específico del AR, flutamida, previo al tratamiento hormonal-apoptótico, reduce el efecto protector de la hormona, sugiriendo la participación del AR en los eventos mediados por el esteroide (Pronsato et al. 2012). El objetivo general de este proyecto es caracterizar la acción de la testosterona en células musculares C2C12, investigando el mecanismo mediante el cual la hormona ejerce su efecto protector en las células tratadas con un agente inductor de la apoptosis (H2O2), focalizando el estudio del efecto hormonal en la mitocondria, como organela target clave en la apoptosis. En base a resultados previos obtenidos en nuestro laboratorio, se plantean los siguientes objetivos específicos: -Estudiar el rol de la testosterona, a través de su receptor, sobre los niveles de expresión del factor de transcripción mitocondrial Tfam. -Estudiar la expresión de genes mitocondriales (COX I, II, III) regulados por Tfam y el rol de la testosterona en la regulación de los mismos. 1. Modelo Experimental. Se utilizará la línea celular de músculo esquelético murino C2C12. 2. Tratamientos: Las células serán tratadas o no con la hormona (Testosterona) a una concentración de 10-9 M por 1 h e inducidas posteriormente a apoptosis (H2O2 1mM preparada en medio DMEM sin suero). En paralelo se realizarán los respectivos controles (con y sin vehículo de la hormona: isopropanol 0,001% en el volumen final) y tratamientos en presencia del antagonista no esteroideo específico del AR: flutamida (10-8M durante 60 min, antes del tratamiento con la hormona y el H2O2). 3. Western blot: Brevemente, para los ensayos se emplearán geles de SDS-poliacrilamida discontinuos (gel de stacking: 4%; gel de separación: 10%) de acuerdo al protocolo de Laemmli (Wagner y Laemmli 1979) y según procedimientos convencionales realizados de rutina en nuestro laboratorio (Milanesi et al. 2004, 2008, 2009; Vasconsuelo et al. 2008, 2010; Pronsato et al. 2010, 2012, 2016). Se analizarán los niveles de expresión de proteínas de las subunidades de la cadena respiratoria mitocondrial (MRC) COX I, II, III y del factor de transcripción mitocondrial Tfam, luego de los distintos tratamientos. 4. Ensayos de PCR en tiempo real (qPCR) para medir los niveles de ARN mensajero de los genes de interés: Se evaluará la expresión de los genes mitocondriales que codifican las proteínas COX I, II, III, así como también de TFam, durante los distintos tratamientos (inducción a apoptosis y tratamiento hormonal), midiendo los niveles de expresión de los ARN mensajeros mediante qPCR utilizando el equipo ABI 7500, y nuestros protocolos (Pronsato et al. 2016). El diseño de los primers se realizará empleando los programas del qPCR ABI 7500 y Primer BLAST, comprobando la especificidad de los mismos. Nota: todos los reactivos y equipos se encuentran en el laboratorio y son de uso frecuente por parte de nuestro grupo de investigación. Todas las actividades realizadas por el alumno serán supervisadas por el director.

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Bases moleculares y modulación farmacológica de la respuesta a stress en el organismo modelo C.elegans Los animales utilizan una gran variedad de compuestos neuroactivos con el objeto de coordinar la percepción sensorial con la actividad de los diferentes tipos celulares que los componen. Al actuar como neurotransmisores, neurohormonas o neuromoduladores estas moléculas permiten la flexibilidad característica de la comunicación intercelular referida tanto a la “privacidad” del mensaje (confinada al espacio sináptico o accesible a muchos tejidos), como a la velocidad y a la duración del mismo. Las aminas biogénicas (AB), moléculas provenientes de la decarboxilación de aminoácidos, representan uno de los grupos más importantes de estos neuromoduladores. Dentro de este grupo de moléculas hay algunas que son específicas de vertebrados (adrenalina y noradrenalina), otras de invertebrados (tiramina y octopamina) y la mayoría de ellas actúan en todo el reino animal, tales son los casos de la dopamina, la serotonina y la histamina. En general, las AB juegan un papel preponderante en la fisiología de los organismos multicelulares a partir de la modulación de procesos metabólicos, cognitivos, del control motor, de la memoria y en la respuesta a stress. Sin embargo, muchos de los mecanismos moleculares a través de los cuales ejercen esta modulación permanecen aún hoy muy poco claros. En el nematodo de vida libre C. elegans, tiramina (análogo invertebrado de adrenalina) es sintetizada únicamente en la neurona RIM, la cual está ubicada en el anillo nervioso faríngeo. Si bien el papel de la señalización tiraminérgica en la respuesta de escape del animal ha sido descripto en gran detalle, la cantidad de conexiones pre-y postsinápticas de RIM sugieren que la liberación de esta amina está también involucrada en otros procesos fisiológicos del animal. Trabajos recientes en C. elegans han demostrado la importancia del control neuronal en la respuesta celular a situaciones de stress. La exposición de estos nematodos a temperaturas elevadas produce un aumento de la transcripción de las proteínas inducibles de respuesta al shock térmico (HSPs) sólo en órganos específicos, independientemente de que todas las células del organismo están sometidas al mismo stress térmico. El control sistémico de la expresión de HSPs es mediado por la actividad de neuronas termosensoriales e interneuronas específicas. La señal sistémica que coordina la actividad de estas neuronas con la respuesta en los diferentes tejidos del nematodo es totalmente desconocida. La simplicidad y el conocimiento de la conectividad sináptica de su sistema nervioso, la conservación evolutiva de gran cantidad de genes con mamíferos y la posibilidad de realizar técnicas genéticas y farmacológicas convierten a C. elegans en un organismo muy atractivo para estudiar los circuitos neuronales y las señales neuroendócrinas en un organismo completo. Nuestro análisis de los circuitos neuronales asociados a la respuesta a stress demuestran que estos convergen en la neurona tiraminérgica RIM, sugiriendo un rol de la tiramina en la respuesta a stress en C. elegans. Mediante la utilización de técnicas genéticas, farmacológicas, de microscopía, de comportamiento, de biología molecular y bioquímicas nos proponemos identificar cual es/son la/s señal/es neuroendócrinas y los receptores involucrados en la integración de la percepción sensorial de la situación de stress con la respuesta en células no neuronales en un organismo multicelular como C. elegans. La regulación neurohormonal de la repuesta celular al stress en este nematodo sugiere que formas similares de regulación se pueden llevar a cabo en otros eucariotas, incluidos los mamíferos. Es posible que disfunciones en esta coordinación sistémica de la respuesta a stress estén implicadas, al menos en parte, en enfermedades neurodegenerativas donde no se observa inducción de mecanismos de protección en los tipos celulares afectados tras la agregación de proteínas. De manera similar, en enfermedades tales como la tiroiditis de Hashimoto, la enfermedad de Graves, la artritis o el cáncer, las células afectadas presentan elevados niveles constitutivos de HSPs, sugiriendo pérdida de los mecanismos de regulación neurohormonal propios del organismo. A partir de este conocimiento en organismos modelos como C. elegans se podrá evaluar, en un futuro, si la perturbación neurohormonal se correlaciona con la aparición o la evolución de patologías con deficiencia o con excesiva expresión de proteínas de respuesta a stress. A su vez, a largo plazo, los conocimientos generados a partir del presente plan pueden ser utilizados por la industria farmacéutica para el desarrollo de fármacos contra este tipo de desórdenes.

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Monitorización de la foto-degradación de dexametasona a diferentes pHs La dexametasona es un glucocorticoide sintético que posee actividad antinflamatoria e inmunosupresora. Es ampliamente utilizada tanto en medicina humana como en veterinaria. La misma puede ser administrada por diferentes vías según el efecto deseado. Dentro de las vías de administración más utilizadas se pueden mencionar: oral, intravenosa, subcutánea, administración ótica, ocular y piel. Debido a su elevado uso a nivel mundial es de suma importancia conocer el efecto que diferentes factores ambientales, tales como la radicación UV o la temperatura tienen sobre este fármaco. Tales estudios son relevantes desde el punto de vista medioambiental, farmacéutico y médico. En lo que respecta al cuidado del medio ambiente, estos estudios permiten predecir la estabilidad del mismo bajo diferentes condiciones ambientales conociendo su perpetuidad en el ambiente, así como los productos de degradación generados. Por otra parte, desde el punto de vista farmacéutico tales estudios brindan información acerca de las condiciones ambientales óptimas durante la producción y almacenamiento de los mismos. Y, por último, también permiten conocer los cuidados que deben tener los pacientes a la exposición UV una vez administrado el fármaco, principalmente cuando el mismo se administra sobre piel u ojos, zonas expuestas a factores ambientales. A pesar de su gran importancia, existen muy pocos estudios destinados a conocer el comportamiento de dexametasona en presencia de radiación UV. En tales artículos, la foto degradación es realizada tomando alícuotas del medio de reacción con posterior determinación de los analitos en cuestión utilizando HPLC acoplado a diferentes detectores. El HPLC es una técnica muy útil en la determinación de mezclas multi-componentes, debido a su elevada eficacia de separación. A pesar de ello, es una técnica costosa debido al elevado costo del equipo y la gran cantidad de solventes de alta calidad empleados. Por tal motivo, es interesante desarrollar nuevos métodos destinados a obtener información similar, pero que poseen un menor costo, mayor accesibilidad y que generen menor cantidad de desechos. Una alternativa, consiste en el empleo de un sistema de foto-degradación en línea con detección espectroscópica, y posterior análisis de datos mediante técnicas multivariadas. Normalmente, los datos espectrales se analizan en un modo univariante, es decir, ciertas longitudes de onda se asignan a los compuestos estudiados en la mezcla de reacción. Sin embargo, a menudo hay una superposición espectral y falta de selectividad en las bandas espectrales. En este sentido, un tratamiento multivariado de los datos espectrales podría ser útil para averiguar más sobre el proceso que se está llevando a cabo. Cuando se aplican los llamados métodos multivariados de resolución de curvas (MCR-ALS) a los datos espectroscópicos obtenidos de la monitorización de una reacción química, es posible estimar los perfiles de concentración de cada especie que intervienen en la reacción, así como los correspondientes espectros puros. El objetivo del presente trabajo es desarrollar un método analítico destinado a determinar la cinética de foto-degradación de dexametasona y de sus foto-productos en diferentes medios de reacción. Para tal fin, se llevará a cabo la fotodegradación en un sistema en línea con detección espectroscópica UV en función del tiempo de reacción. Los datos así obtenidos serán analizados mediante MCR-ALS. Adicionalmente, se contrastarán los resultados obtenidos a través del método propuesto con los obtenidos al utilizar cromatografía liquida. En este caso, se recurrirá a un tipo de cromatografía más económica y que utiliza menor cantidad de solventes que el HPLC. Durante el desarrollo del trabajo el alumno utilizará los siguientes materiales y métodos: espectrofotómetro UV-DAD, bomba peristáltica, cromatografía liquida, foto-reactor, sistema de flujo y programas de análisis de datos.

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Rol de receptores P2 en la modulación de la proliferación, migración y diferenciación de osteoblastos de rata El trifosfato de adenosina (ATP), otros nucleótidos relacionados y adenosina pueden actuar como moléculas de señalización extracelular al unirse a receptores de la membrana plasmática, llamados receptores purinérgicos o P. Los receptores P se dividen en dos familias, los receptores P1 que responden al nucleósido adenosina y los receptores P2 que se activan por nucleótidos de purinas y/o pirimidinas. Los receptores P2 han sido clasificados en dos subfamilias: receptores ionotrópicos P2X, canales iónicos activados por ligando, y receptores metabotrópicos P2Y, acoplados a proteína G (Ralevic y Burnstock, 1998; Burnstock, 2006). Actualmente, siete proteínas que integran la subfamilia P2X (P2X1-7) y ocho subtipos de receptores P2Y (P2Y1, 2, 4, 6, 11, 12, 13 y 14) han sido clonados y funcionalmente caracterizados en vertebrados (Burnstock, 2006; von Kugelgen, 2006; Erb et al., 2006). Los receptores P2X sólo son activados por ATP, permiten el influjo de sodio y calcio y eflujo de potasio, provocando la despolarización de la membrana plasmática y la acumulación de calcio en el citoplasma (North y Surprenant, 2000; North, 2002). Los receptores P2Y son activados por nucleótidos de adenina y uridina. Los receptores P2Y(1,2,4,6,11) estimulan la vía de fosfolipasa C (PLC)/ inositol trifosfato (IP3)/ [Ca2+]i; los P2Y11 también estimulan a adenilil ciclasa y los subtipos P2Y(2,4,12,13,14) la inhiben (Abbracchio et al., 2006). Los osteoblastos de rata, expresan todos los subtipos de receptores P2 a excepción del subtipo P2Y11 (Orris et al., 2010). Diversos estímulos (fuerzas mecánicas, producidas en los movimientos corporales, o injuria e inflamación ocasionadas en traumatismos y fracturas óseas), a los que están expuestas las células óseas, aumentan la liberación de nucleótidos al medio extracelular. Estímulos similares han sido asociados con incrementos en la síntesis de proteínas morfogenéticas óseas (BMPs por Bone Morphogenetic Proteins) o inductoras de la formación de hueso. Nuestros trabajos sugieren que ATP y UTP aumentan la proliferación y diferenciación celular de células calvariales de rata, involucrando aumentos en la expresión de BMP-2, 4 y 5 y activación de la vía PI3K/Akt (Ayala et al., 2013; Laiuppa A. y Santillán G. 2016). Sin embargo, los mecanismos de señalización y subtipos de receptores purinérgicos P2 involucrados en la respuesta de los osteoblastos al ATP, aún no han sido totalmente elucidados. Se propone evaluar el efecto del ATP y/o nucleótidos relacionados sobre la proliferación, migración y diferenciación de osteoblastos, utilizando cultivos primarios de calvaria de rata neonata (dado que éstos están enriquecidos en células de linaje osteoblástico y preosteoblastos, con capacidad de diferenciarse a osteoblastos maduros). En todos los casos el alumno accederá a los equipos con Tutor. El alumno observará las tareas desarrolladas por el Tesista y a medida que vaya tomando confianza y seguridad comenzará a participar en el desarrollo de las distintas metodologías, comenzando por las más sencillas como preparación de medios de cultivo y soluciones de uso común en el laboratorio, recuentos de células, obtención de cultivo primario de osteoblastos, cultivo celular, tratamiento celular con los agonistas, observaciones microscópicas y determinación de migración celular, observar la preparación de experimentos de QPCR y observación y discusión de los resultados obtenidos.

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EFECTOS DE EXTRACTOS LIPÍDICOS DE Nicotiana glauca y Lycopersicon esculentum EN CÉLULAS MUSCULARES ESQUELÉTICAS EN CONDICIONES DE ESTRÉS OXIDATIVO. ROL DEL CITOESQUELETO

La presencia de 17β-estradiol (E2) ha sido reportada en diferentes especies vegetales. A mediados del siglo XX se aislaron de las plantas sustancias de naturaleza no esteroidal con propiedades estrogénicas y se las denominó fitoestrógenos. Sorprendentemente, estas sustancias de origen vegetal interactúan con los receptores estrogénicos (ERs) de vertebrados. Coincidiendo con esas evidencias, hemos detectado altos niveles de moléculas estructural y funcionalmente semejantes al E2 en extractos de Licopersicon esculentum (L.e) y Nicotiana glauca (N.g) (Milanesi et. al, 2004). El hecho que estas plantas produzcan moléculas estructuralmente relacionadas con la hormona esteroidea y además con capacidad de unirse a los ERs de mamíferos llevó a considerar, la posibilidad que sean capaces de ejercer efectos estrogénicos en células animales y posean potencial terapéutico. Además de su rol clásico, como hormona sexual el E2 ejerce una acción de tipo protectora en diversos tejidos. Específicamente en músculo esquelético, donde se ha demostrado la presencia de ERs, el E2 protege a este tejido del daño oxidativo. Utilizando la línea celular C2C12 (músculo esquelético murino) demostramos que la hormona inhibe la muerte celular por apoptosis inducida por estrés oxidativo (Vasconsuelo et al., 2008). La apoptosis es un proceso activo en el músculo esquelético normal durante el ejercicio intenso; o en patologías como la distrofia muscular, miopatías y sarcopenias que implican disminución de la performance muscular. Estas patologías suelen relacionarse con déficit de E2 provocado por envejecimiento/postmenopausia o ciertos trastornos hormonales. El presente plan tiene por objetivo estudiar si los extractos lipídicos de N.g. y de L.e, se comportan como el E2 protegiendo el tejido múscular frente el estrés oxidativo. La línea de investigación de nuestro grupo tiene como objetivo general, el estudio de los mecanismos moleculares que subyacen a los efectos de dichos extractos en el músculo. El alumno focalizará sus estudios en el citosqueleto de células musculares, analizando su morfología bajo estrés oxidativo inducido por peróxido de hidrógeno en presencia y ausencia de los extractos vegetales. Para ello el alumno aprenderá generalidades sobre microscopia de fluorescencia y confocal, se usarán técnicas de inmunocitoquímica y cultivo celular. Todo el trabajo, (cultivos, tratamientos con estractos vegetales, microscopia, uso de equipos específicos y toda actividad experimental que se requiera realizar) el alumno lo hará bajo supervisión del director.