Documento Guía Teórica Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución. Hplc

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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN - HPLCQuímica aplicada a la industria-323860

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GUÍA TEÓRICA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN-HPLC

FREDY LEONARDO MELO VELANDIA

InstructorJUAN PABLO MEDINA

Químico Industrial

SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE SENACENTRO DE GESTIÓN INDUSTRIAL- REGIONAL DISTRITO CAPITAL

QUÍMICA APLICADA A LA INDUSTRIABOGOTÁ D.C.

2013

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CONTENIDO

1. CROMATOGRAFÍA.....................................................................................52. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS.............................................................53. CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS EN COLUMNA.............................................................................................................74. DEFINICIÓN ELUCIÓN Y ELUYENTE........................................................75. CROMATOGRAMA.....................................................................................86. MEJORAS PARA DISMINUIR EL ENSANCHAMIENTO DE BANDA.........97. VELOCIDAD DE MIGRACIÓN DE LOS SOLUTOS....................................98. CONSTANTE DE DISTRIBUCIÓN..............................................................99. TIEMPO MUERTO....................................................................................1010. TIEMPO DE RETENCIÓN (tR)...................................................................1011. RELACIÓN DE VELOCIDAD DE FLUJO VOLUMÉTRICO Y VELOCIDAD LINEAL EN CROMATOGRAFÍA..........................................................................1012. FACTOR DE RETENCIÓN........................................................................1113. FACTOR DE SELECTIVIDAD...................................................................1214. RELACIÓN ENTRE EL ENSANCHAMIENTO DE BANDA Y LA EFICIENCIA DE UNA COLUMNA............................................................................................1315. DETERMINACIÓN CUANTITATIVA LA EFICIENCIA DE LA COLUMNA. 1316. DETERMINACIÓN DE NÚMERO DE PLATOS TEÓRICOS.....................1317. VARIABLES AFECTAN LA EFICIENCIA DE LA COLUMNA....................1418. TEORÍA DE LA VELOCIDAD DE LA CROMATOGRAFÍA DE ELUCIÓN. 1619. RESOLUCIÓN DE UNA COLUMNA..........................................................1720. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA....................................................................1821. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)..............1822. RECIPIENTES PARA LA FASE MÓVIL Y SISTEMA DE TRATAMIENTO DE LOS DISOLVENTES USADOS EN HPLC...........................................................1923. INSTRUMENTACIÓN................................................................................2025. SISTEMA DE MEZCLA DE FASE MÓVIL.................................................2527. SISTEMA DE TUBERÍAS Y CONEXIONES EN HPLC.............................3028. COLUMNAS................................................................................................029. EMPAQUE...................................................................................................730. DETECTORES............................................................................................831. ELECCIÓN DE LA COLUMNA Y DE LA FASE MÓVIL...............................0

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32. CLASIFICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN.......................................................................................................133. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN.............................................................................................034. COMPARACIÓN DE LA TÉCNICA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN CON OTRAS TÉCNICAS CONVENCIONALES.................1BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................2

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INTRODUCCIÓN

La cromatografía de líquidos es un método de separación física basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre una fase estacionaria y una fase móvil que en este caso es un líquido. La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual está rellena con la fase estacionaria. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que la fase móvil fluya a velocidades razonables. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.

La cromatografía de líquidos de alta resolución se ha convertido en una herramienta analítica indispensable. En esta guía se considera la teoría la HPLC, incluidas las formas de cromatografía de reparto, adsorción, intercambio iónico, exclusión molecular, de afinidad y quiral. La cromatografía líquida tiene aplicaciones en medicina forense, también en bioquímica, ciencias ambientales, ciencias de la alimentación, química farmacéutica y toxicológica

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GUÍA TEÓRICA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN-HPLC

1. CROMATOGRAFÍA

La cromatografía es un método de separación de diferentes componentes de una muestra, este método logra la separación de los mismos a través del paso de una muestra por una fase estacionaria con la ayuda de la fase móvil, cada componente de la muestra tiene propiedades particulares que permitirá su interacción en forma diferente entre la fase estacionaria y móvil, de esta forma cada componente se retrasa en forma particular y si el caudal, las característica de la fase estacionaria y móvil y la longitud de la columna son las adecuadas se lograra la separación completa de todos los componentes de la muestra.El objetivo principal de un estudio cromatografía es lograr la separación de todos los componentes en una muestra, para ello es necesario jugar con una serie de factores cromatográficos, es por ello que es necesario conocer como están relacionados los diferentes factores experimentales con las ecuaciones cromatográficas. (Douglas A. Skoog, 2005)

2. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

Las técnicas cromatográficas pueden clasificarse según diferentes criterios: atendiendo al modo como las fases de ponen en contacto y atendiendo al fundamento del proceso de separación. En este último caso en definitiva se trata de la naturaleza de las fases y del tipo de interacciones que tiene lugar entre los solutos y las fases utilizadas.

Clasificación atendiendo al fundamento de la separación (naturaleza de las fases y tipo de interacciones):

A. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS (fase móvil liquida)

Fase estacionaria solida: se trata de solidos finamente divididos (con gran superficie especifica)

Cromatografía de adsorción: la fase estacionaria solida retiene a los solutos por un doble efecto de adsorción fisca y química. Las interacciones implicadas son del tipo de fuerzas de van der Waals

Cromatografía de cambio iónico: el sólido a los solutos gracias a atracciones electrostáticas. La fase estacionaria lleva en la superficie cargas electrostáticas fijas, que retienen contraiones móviles que pueden intercambiarse por iones de la fase móvil.

Cromatografía de exclusión: la fase estacionaria es un material poroso, que retiene a las moléculas en función de su tamaño. En ocasiones se

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denomina también cromatografía de filtración sobre geles o de permeabilidad de geles (GPC).

Fase estacionaria líquida:

Cromatografía de reparto: la fase estacionaria es un líquido inmovilizado sobre un material inerte solido que solo actúa de soporte.

Cromatografía de afinidad o de fases enlazadas: la fase estacionaria es generalmente un polímero de tipo liquido inmovilizado sobre un sólido inerte por enlaces covalentes.

En ambos casos la separación se debe a equilibrios de distribución de los solutos entre las fases móvil y estacionaria controlados por la diferente solubilidad de los mismos en las distintas fases.

B. CROMATOGRAFIA DE GASES (fase móvil gaseosa)

cromatografía de adsorción: (o cromatografía gas-solido) la fase estacionaria es un sólido finamente dividido, que retiene a los solutos por adsorción.

Cromatografía de partición o reparto: la fase estacionaria es un líquido por impregnación o por enlace sobre un sólido inerte. Se basa en equilibrios de distribución.

C. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS SUPERCRÍTICOS: (la fase móvil es un fluido supercrítico)

Un fluido supercrítico es un fluido calentado a temperaturas y presiones superiores a las críticas. Posee algunas características propias de un gas y algunas propias de un líquido. La fase estacionaria puede ser liquida o sólida.

Clasificación atendiendo al modo se lleva a cabo la separación (como se ponen en contacto las fases):

Cromatografía en columna: la fase estacionaria se introduce en un tubo estrecho a través del cual se hace pasar la fase móvil. Esta se desplaza por capilaridad, gravedad o presión. Pueden emplearse fases móviles liquidas, gaseosa o fluidos supercríticos.

Cromatografía plana: la fase estacionaria se coloca en un soporte plano. En cromatografía plana el flujo de fase móvil se consigue por capilaridad o por capilaridad y gravedad. Solo pueden emplearse líquidos como fases móviles. Existen:

Cromatografía de papel: la fase estacionaria está constituida por el agua retenida en la celulosa. También existen papeles cambiadores de iones.

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Cromatografía en capa fina: la fase estacionaria es un sólido adsorbente finalmente dividido o un líquido inmovilizado sobre un sólido colocado sobre una placa plana.

3. CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS EN COLUMNA

Clasificación general Método específico Fase estacionaria

Líquido-líquido, o reparto

Tipo de equilibrio

Distribución entre un líquido y una superficie enlazada

Líquido-sólido o adosorción

Sólido Adsorción

Distribución entre líquidos inmiscibles

Líquido fase enlazada

Intercambio iónico

Exclusión por tamañoLíquido en los intersticios de un sólido polimérico Distribución/exclusión

Gas-líquido Líquido adsorbido sobre un sólido

Distribución entre un gas y un líquido

Intercambio iónico

Distribución entre un líquido y una superficie enlazada

Gas-sólido Sólido Adsorción

Especies orgánicas enlazadas a una superficie

sólida

Distribución entre un fluido supercrítico y una superficie enlazada

Gas-fase enlazada

Cromatografía de fluidos supercriticos (SFC) (fase móvil; fluido supercrítico)

Cromatografía de gases (GC) (fase móvil;

gas)

Cromatografía de líquidos (LC) fase

movil;líquida


sólida

Resina de intercambio iónico


sólida

Líquido adsorbido sobre un sólido

Fuente. (Douglas A. Skoog, 2005)

4. DEFINICIÓN ELUCIÓN Y ELUYENTE.

Elución: la elución es un proceso en el cual los solutos son arrastrados a través de una fase estacionaria por el movimiento de una fase móvil. La fase móvil que sale de la columna se conoce como el eluyente.

Elución isocrática: es aquella en la que la composición del disolvente permanece constante.

Elución en gradiente: es aquella en que la composición del disolvente cambia de manera continua o escalonada.

Eluyente: un eluyente es un disolvente que su usa para transportar los componentes de una mezcla a través de una fase estacionaria.

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Eluyentes polares: Rompen más eficazmente las uniones de los compuestos con la fase estacionaria. Arrastran más rápidamente a los compuestos

Eluyentes no polares: no rompen las uniones de los compuestos con la fase estacionaria. Arrastran muy lentamente a los compuestos. (Douglas A.Skoog, 2005)

5. CROMATOGRAMA

Es la representación gráfica de la señal en función del tiempo una vez que la muestra es inyectada a un sistema cromatográfico. Para obtener este cromatograma a la salida de la columna se coloca un sistema de detección y registro, que permite responder a una propiedad de la solución que contiene el analito o del propio analito en función del tiempo.

Los diferentes picos del cromatograma (picos gaussianos) se corresponden a los componentes de la mezcla separada. En el eje X se representa el tiempo de retención, y en el eje Y una señal (obtenida, por ejemplo, a partir de un espectrofotómetro, un espectrómetro de masas o cualquier otro de los diversos detectores) correspondiente a la respuesta creada por los diferentes analitos existentes en la muestra. (Douglas A. Skoog, 2005)

La posición de los pocos sobre el eje tiempo puede usarse para identificar los componentes de la muestra; las áreas bajo los picos proporcionan una medida cuantitativa de a cantidad de cada especie. (Douglas A. Skoog, 2005)

6. MEJORAS PARA DISMINUIR EL ENSANCHAMIENTO DE BANDA

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Para columnas empaquetadas, una variable que afecta a la eficiencia de la columna es el diámetro de las partículas que constituyen el empaquetamiento. En el caso de columnas empaquetadas, el ensanchamiento de bandas se minimiza con diámetros de partícula pequeños. En columnas capilares, el diámetro y la propia columna es una variable importante, en este caso los diámetros pequeños de columna reducen el ensanchamiento de banda. (El coeficiente de difusión tiene mayor efecto en la cromatografía de gases que en la cromatografía de líquidos)(Douglas A. Skoog, 2005).

7. VELOCIDAD DE MIGRACIÓN DE LOS SOLUTOS

Es la velocidad relativa con que cada una de las dos o más especies es eluida dentro de la columna cromatográfica, a su vez, esos valores de velocidad están determinados por la relaciones de las concentraciones del soluto en cada una de las dos fases

La velocidad de migración de un soluto es el resultado de la acción de dos factores: uno de adsorción sobre la superficie del material de la columna esto retarda el movimiento, el otro la disolución de componente de la muestra en la fase móvil, que tiende a moverlos juntos con éstas. (Douglas A. Skoog, 2005)

8. CONSTANTE DE DISTRIBUCIÓN

Los equilibrios de distribución implicados en cromatografía se describen por ecuaciones simples que suponen la trasferencia de un analito entre fases estacionaria y móvil, para un soluto en cromatografía es igual a la relación entre su concentración molar en la fase estacionaria y su concentración molar en la fase móvil. (Douglas A. Skoog, 2005)

Para la especie de un soluto A, el equilibro implicado s describe con la ecuación

La constante de este equilibrio K se denomina, constante de distribución y se define como:

Donde CS es la concentración molar de analito en la fase estacionaria y CM es la concentración molar de analito en la fase móvil.

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A partir de la constante de distribución es posibles definir el grado de disociación, las constantes de equilibrio de la reacción que se desarrolla en una de las fases y la actividad de las sustancias disueltas.

9. TIEMPO MUERTO (tM)

Es el tiempo que una especie no retenida tarda en pasar a través de una columna cromatográfica. (UNIÓN INTERNACIONAL DE QUÍMICA PURA Y APLICADA,1995)

10.TIEMPO DE RETENCIÓN (tR)

Es el tiempo que transcurre después de la inyección de la muestra y la aparición de un pico de soluto en el detector de una columna cromatográfica. (UNIÓNINTERNACIONAL DE QUÍMICA PURA Y APLICADA, 1995)

11.RELACIÓN DE VELOCIDAD DE FLUJO VOLUMÉTRICO Y VELOCIDAD LINEAL EN CROMATOGRAFÍA.

VELOCIDAD LINEAL: La velocidad lineal es definida como el cociente entre el espacio recorrido y el tiempo empleado en ello, de un soluto que se mueve a través de una columna cromatográfica. Esta dado por la formula

Velocidad lineal media de la migración del soluto (cm/s) V

v= LtR

Donde L es la longitud del empaquetamiento de la columna y tR es el tiempo de retención.

Velocidad lineal media de las moléculas de la fase móvil (cm/s)

u= LtM

Donde L es la longitud del empaquetamiento de la columna y tS es el tiempo de muerto.

VELOCIDAD DE FLUJO VOLUMÉTRICO: Es la velocidad a la cual un volumen de eluyente (fase móvil) pasa por la salida de la columna

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cromatográfica por unidad de tiempo, generalmente medido en centímetro cúbicos por minuto. (UNIÓN INTERNACIONAL DE QUÍMICA PURA Y APLICADA, 1995)

Vf=(V Solvente)T

Relación entre la velocidad de flujo volumétrico y la velocidad lineal

La velocidad de flujo lineal y la velocidad de flujo volumétrico son dos cantidades diferente, pero relacionadas entre sí. La velocidad de flujo lineal se relaciona con la velocidad de flujo volumétrico a partir del área transversal y la porosidad (columna empaquetada) de la columna.

Para una columna tubular abierta, F está relacionada con la velocidad lineal la salida de la columna Uo

F=(U ¿¿O) (A )=(U ¿¿O)X (πr 2)¿¿

Donde Uo es la velocidad lineal, A es el área transversal del tubo (πr2). En una columna empaquetamiento, no todo el volumen de la columna está disponible para el líquido, por lo que la ecuación debe ser modificada a

F=(π r2)(U ¿¿O)ε¿

Donde ε es la fracción del volumen total de la columna disponibles para el líquido (porosidad de la columna). (UNIÓN INTERNACIONAL DE QUÍMICA PURA Y APLICADA, 1995)

12.FACTOR DE RETENCIÓN

El factor de retención K es la cantidad de tiempo que pasa un soluto en la fase estacionaria en relación con el tiempo que pasa en la fase móvil. El factor de retención KA para un soluto A esta relacionado con la velocidad con la cual A migra a través de la columna

K A=K AV S

VM

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Donde KA es la constante de distribución para el soluto, VS volumen empleado en la fase estacionaria y VM el volumen empleado en la fase móvil. (UNIÓNINTERNACIONAL DE QUÍMICA PURA Y APLICADA, 1995)

13.FACTOR DE SELECTIVIDAD

El factor de capacidad α de una columna, como su nombre lo indica, es un término que define que tan selectiva es una columna para separar dos picos. Es de hacer notar, que la columna puede ser selectiva a una separación, que se identifica por un valor alto de este factor, pero si no se considera la mejora de los parámetros que pueden afectar el ancho de un pico, aun así no se lograría la separación de los mismos. (UNIÓN INTERNACIONAL DE QUÍMICA PURA Y APLICADA, 1995)

Entonces el factor de selectividad de una columna para dos especies A y B se define como:

Escriba aquí laecuación .

Donde B k′ es el factor de capacidad del compuesto B, que es el más retenido y A k′ es el factor de capacidad del compuesto A, que es el menos retenido.

Con esta definición α siempre es mayor que la unidad.

En términos tomados a partir de un cromatograma α se puede calcular como sigue:

14.RELACIÓN ENTRE EL ENSANCHAMIENTO DE BANDA Y LA EFICIENCIA DE UNA COLUMNA.

El número de platos de una columna (eficiencia, N) es una medida del ensanchamiento de la banda cromatográfica. Cuando inyectamos un pequeño

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volumen de analito en una columna forma una banda estrecha en su inicio, pero a medida que el analito migra la banda se va ensanchando. La eficiencia de una columna cromatográfica depende del ensanchamiento de banda que ocurre cuando un compuesto pasa a través de la columna. (Douglas A. Skoog, 2005)

15.DETERMINACIÓN CUANTITATIVA LA EFICIENCIA DE LA COLUMNA

Para las mediciones cuantitativas de la eficiencia de las columnas cromatográficas se emplean dos términos: (1) altura del plato H y (2) cantidad de platos o número de platos teóricos N. Los dos están relacionados por la ecuación:𝑁=𝐿𝐻donde L es la longitud del empaque de la columna (en cm). La eficiencia de las columnas cromatográficas aumenta a medida que es mayor el número de platos N y la altura H es menor. Se observan grandes diferencias en la eficiencia de las columnas como resultado de las diferencias en el tipo de columna y de las fases móvil y estacionaria. En términos de número de platos teóricos, la eficiencia puede variar desde unos centímetros hasta varios cientos de miles; la altura de los platos varía desde unas décimas hasta milésimas de centímetro y son comunes incluso mas pequeñas (Skoog y cols., 2001). (Douglas A. Skoog, 2005)

El ancho de una curva gaussiana esta determinada por la desviación estándar ϭ y la varianza ϭ2. Debido a que las bandas cromatográficas por lo general son gaussianas y como la eficiencia de la columna se refleja en el ancho de lo picos cromatográficos, cuando se trabaja en cromatografía se utiliza la varianza por unidad de longitud de columna, como una medida de la eficiencia de la columna. Es decir la eficiencia de la columna H se define como:

H=ϭ 2L

16.DETERMINACIÓN DE NÚMERO DE PLATOS TEÓRICOS

El número de platos N, y la altura del plato, H, son muy utilizados en la literatura y por los fabricantes de instrumentos, como medidas del comportamiento de la columna, N, se puede determinar a partir de un cromatograma. En este caso se mide el tiempo de retención de un pico tR y ancho de la base de un pico W (en unidades de tiempo). (UNIÓN INTERNACIONAL DE QUÍMICA PURA YAPLICADA, 1995)El número de platos puede calcularse mediante una ecuación sencilla:

N=(tR /W )2

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Para obtener H se mide la longitud de la columna L y se aplica la ecuación.

17.VARIABLES AFECTAN LA EFICIENCIA DE LA COLUMNA

El ensanchamiento de banda refleja una pérdida de eficiencia de la columna. Cuanto mas lentos sean los procesos de transferencia de masa que ocurren cuando un soluto migra a través de una columna, tanto más ancha será la banda a la salida de la columna. Algunas de las variables que afectan la velocidad de transferencia de masa son controlables y pueden ser aprovechadas para mejorar las separaciones.

VARIABLES QUE INFLUYEN EN LA EFICIENCIA DE LA COLUMNA

VARIABLE SÍMBOLO UNIDADES HABITUALES

Velocidad lineal de la fase móvil

u cm.s-1

Coeficiente de DM cm2.s-1

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difusión en la fase móvil*Coeficiente de difusión en la fase estacionaria*

DS cm2.s-1

Factor de retención k Sin unidades

Diámetro de la partículas de empaquetamiento

dp Cm

Espesor del recubrimiento líquido de la fase estacionaria

df Cm

Velocidad lineal de la fase móvil

El grado de ensanchamiento de banda depende de la cantidad de tiempo que la fase móvil esté en contacto con la fase estacionaria, la cual depende a su vez de la velocidad de flujo de la fase móvil. Por esta razón, los estudios de eficiencia se han realizado generalmente mediante la determinación de H en función de la velocidad de la fase móvil. Las gráficas de cromatografía de líquidos y cromatografía de gases que muestran a continuación son típicas de los datos que se obtienen con estos estudios. Aunque ambas muestran un mínimo en H (o un máximo de eficiencia) a bajas velocidades de flujo lineal, el mínimo para la cromatografía de líquidos suele producirse con una velocidad de flujo que se encuentra muy por debajo de los mínimos correspondientes a la cromatografía de gases. Es frecuente que esa velocidad de flujo sea tan baja que el mínimo H no se observe en el caso de la cromatografía de líquidos en condiciones normales de operación.

Generalmente, los cromatogramas de líquidos se obtienen con velocidades de flujo lineal más bajas que los cromatogramas de gases. Además, como muestra la figura, las alturas de plato para las columnas cromatográficas de líquidos son de uno o dos órdenes de magnitud más pequeñas que las que encontramos en las columnas cromatográficas de gases. Esta ventaja se contrarresta por el hecho de que no resulta práctico usar columnas cromatográficas de líquidos de longitud mayor de 25 a 50 cm. ya que se producen fuertes caídas de presión. En cambio, las columnas cromatográficas de gases pueden ser de 50 m o más de longitud. En consecuencia, el número total de platos, y por ende la eficiencia general de la columna suele ser superior con las columnas cromatográficas de gases. (DouglasA. Skoog, 2005)

Coeficiente de difusión

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El coeficiente de difusión (D) es la cantidad de una determinada sustancia que se difunde por unidad de área en 1 s, bajo la influencia de un gradiente unidad. Normalmente se expresa en cm2 s-1. (Douglas A. Skoog, 2005)

Coeficiente de difusión en la fase estacionaria (DS o DL)

Es el coeficiente de difusión que caracteriza la difusión en la fase estacionaria. En cromatografía de reparto con una fase estacionaria líquida, se puede utilizar el símbolo DL para expresar este término. (UNIÓN INTERNACIONAL DE QUÍMICAPURA Y APLICADA, 1995)

Coeficiente de difusión en la fase móvil (DM o DG)

Es el coeficiente de difusión que caracteriza la difusión en la fase móvil. En cromatografía de gases, donde la fase móvil es un gas, se puede utilizar el símbolo DG para expresar este término. (UNIÓN INTERNACIONAL DE QUÍMICAPURA Y APLICADA, 1995)

Espesor de fase estacionaria (df)

Es un término que se utiliza para las columnas abiertas, y expresa el espesor medio de la película de fase estacionaria líquida que recubre la pared interna del tubo. (UNIÓN INTERNACIONAL DE QUÍMICA PURA Y APLICADA, 1995)

18.TEORÍA DE LA VELOCIDAD DE LA CROMATOGRAFÍA DE ELUCIÓN

¿Por qué las bandas se hacen más anchas conforme descienden por la columna?La teoría de la velocidad de la columna cromatográfica describe las formas y el ancho de los picos de elución en términos cuantitativos basados en un mecanismo aleatorio para la migración de moléculas a través de la columna. (Douglas A.Skoog, 2005)

Los cromatograma que se presentan en esta técnica son muy parecidos a los de una curva Gaussiana o curva de error normal. Las curvas de error normal se explican suponiendo que la incertidumbre asociada con cualquier medición simple es la suma de un número mucho mayor de incertidumbres aleatorias pequeñas, que no se detectan individualmente, y cada una de las cuales tiene la probabilidad de ser positiva o negativa. De manera semejante la forma gaussiana típica de una banda cromatográfica puede atribuirse a la combinación aditiva de los movimientos aleatorios de las moléculas que forman una banda a medida que desciende por la columna.

Resulta útil suponer que una sola molécula de soluto sufre miles de transferencias entre la fase estacionaria y la fase móvil durante la elución. El tiempo de residencia de la fase es irregular. La transferencia de una fase a otra requiere energía y la molécula debe adquirir esta energía del medio que la rodea. Así el

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tiempo de residencia en una de las fases después de algunas transferencias y relativamente largo después de unas más. El movimiento de descenso en la columna solo puede ocurrir sólo mientras la molécula está en la fase móvil. Como consecuencia algunas partículas viajan rápidamente en virtud de su inclusión accidental en la fase móvil durante la mayor parte del tiempo, mientras que otras no lo hacen por que fueron incorporadas en la fase estacionaria durante un tiempo que puede ser mayor al promedio. Estos resultados de aleatorios individuales es una dispersión simétrica de velocidades alrededor del valor medio, lo que representa el comportamiento de la molécula promedio del analito. (Douglas A.Skoog, 2005)

19.RESOLUCIÓN DE UNA COLUMNA

La resolución R, de una columna indica cuál es la separación entre dos bandas en relación con su anchura. La importancia de este término se ilustra en la figura, que representa cromatogramas para las especies A y B en tres columnas con diferentes poderes de resolución. (Douglas A. Skoog, 2005)La resolución de cada columna se define como:

En la figura es evidente que la resolución 1,5 produce una separación de A y B esencialmente completa, mientras que la resolución 0,75 no la produce. A una resolución de 1,0, la zona A contiene cerca de 4% de B y la zona B contiene un 4% de A aproximadamente. A una resolución de 1,5, el solapamiento es de

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aproximadamente 0,3%. La resolución de la fase estacionaria puede mejorar alargando la columna, lo cual incrementa el número de platos. Sin embargo, una consecuencia adversa de los platos añadidos es que el tiempo necesario para separar los componentes se prolonga.

La resolución de la cromatografía de líquidos mejora al disminuir el tamaño de partícula de la fase estacionaria. Si el soluto puede difundirse con rapidez entre las fases móvil y estacionaria, la altura equivalente de plato teórico disminuye, y la eficiencia de un tramo dado de columna aumenta. (Douglas A. Skoog, 2005)

20.CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA La fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes y la fase estacionaria un sólido que interactúa con las sustancias que se desea separar (cromatografía líquido-sólido), o bien un líquido inmiscible con la fase móvil, depositado en la superficie de un sólido (cromatografía líquido-líquido). Esta forma de cromatografía puede realizarse con diferentes arreglos experimentales: en columna, en capa delgada o en papel. En el primer caso, la fase estacionaria se encuentra rellenando un tubo; en el segundo, se dispersa sobre una lámina de vidrio o aluminio formando un lecho de espesor uniforme; en la cromatografía en papel, la fase estacionaria es la solución acuosa contenida en el interior de las celdas formadas por las fibras de la celulosa, y es por tanto una forma de cromatografía líquido-líquido. (Douglas A. Skoog, 2005)

21.CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

En las primeras etapas del desarrollo de la cromatografía de líquidos, los científicos se dieron cuenta de que se podían conseguir grandes aumentos en la eficacia de la columna disminuyendo el tamaño de las partículas de los rellenos. Sin embargo, no fue sino hasta finales de los años ochenta cuando se desarrolló la tecnología adecuada para producir y utilizar rellenos de tamaño de partícula del orden de los 3 o 10 μm. De forma simultánea, se desarrollaron detectores para la monitorización continua de los efluentes de la columna.

La cromatografía líquida de alta resolución HPLC es un tipo de cromatografía en la que se utiliza una fase móvil líquida y una fase estacionaria muy finamente dividida. Para lograr una velocidad de flujo satisfactoria, el líquido debe someterse a una presión de cientos de libras por pulgada cuadrada. Esta tecnología requiere una instrumentación sofisticada, que contrasta con las simples columnas de vidrio de la cromatografía de líquidos clásica. Para distinguir estos procedimientos más nuevos de los métodos básicos, que todavía se utilizan

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con fines preparativos, se emplea la denominación de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC).

Es incuestionable que la cromatografía de líquidos de alta resolución es la técnica de separación más ampliamente utilizada, con unas ventas anuales de equipos de HPLC que se aproximan a la cifra de cientos de miles de millones de pesetas. Las razones de la popularidad de esta técnica son su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial interés en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos materiales incluyen los aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, drogas, terpenoides, plaguicidas, antibióticos esteroides, especies organometálicas y una cierta variedad de sustancias inorgánicas. (Douglas A.Skoog, 2005)

22.RECIPIENTES PARA LA FASE MÓVIL Y SISTEMA DE TRATAMIENTO DE LOS DISOLVENTES USADOS EN HPLC

Los aparatos de HPLC modernos están equipados con uno a más recipientes de vidrio, cada uno de los cuales contiene 500 mL o más de un disolvente. FrecuentementeIncluyen accesorios para eliminar los gases disueltos y partículas en suspensión de los líquidos. De ellos, los primeros producen burbujas en la columna y pueden causar ensanchamiento de la banda además tanto las burbujas como las partículas interfieren en el rendimiento de muchos detectores. Los desgasificadores pueden consistir en un sistema de bomba de vacío, uno de destilación, un dispositivo para calentamiento y agitación o, un sistema de burbujeo o sparging, en el que los gases disueltos se extraen de la disolución mediante burbujas finas & un gas inerte que es insoluble en la fase móvil.

Se denomina elución isocrática a la elución con un único disolvente o una mezcla de disolventes de composición constante. En la elución en gradiente, se usan dos o más sistemas de disolventes que varían de manera significativamente en su polaridad. Las proporciones de los dos disolventes se varían de manera programada durante la separación, bi8en de forma continua o de modo escalonado. Como se muestra en la figura la elución en gradiente mejora loa eficiencia de la separación. Los instrumentos HPLC modernos suelen estar equipados con válvulas de dosificación o electroválvulas, las cuales introducen líquidos de dos o más recipientes en proporciones que pueden variar de manera continua. (Douglas A. Skoog, 2005)

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23. INSTRUMENTACIÓN

Un equipo HPLC se puede esquematizar de la siguiente manera:

Para alcanzar velocidades de flujo razonables con los empaques de 3 a 10 µm que comúnmente se emplean en la cromatografía de líquidos moderna es necesario aplicar presiones de varios cientos de atmósferas. Debido a estas presiones tan altas, el equipo HPLC es mucho más elaborado y costoso que el que se emplea en otros tipos de cromatografía. A continuación se presenta un diagrama de los componentes más importante de un equipo HPLC. (MuseoNacional de Ciencias Naturales)

Si bien es cierto que para realizar una cromatografía líquida tan solo es necesario disponer de las dos fases implicadas en el proceso y de la columna, la moderna cromatografía de líquidos de alta resolución, debido al pequeño diámetro de las partículas de fase estacionaria que se utilizan, requiere de la utilización de unos dispositivos que constituyen el equipo. Los componentes básicos de un equipo HPLC son:

- Dispositivo suministro de eluyentes (bombas y dispositivo de mezclado de eluyentes)

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- Dispositivo de inyección- Conducciones y conexiones- Columna- Detector y registrador (Museo Nacional de Ciencias Naturales)

24.SISTEMAS DE BOMBEO

Sistema necesario para conseguir una presión y velocidad de flujo de la fase móvil regular durante todo el proceso analítico. La misión de la bomba es la de suministrar un caudal constante y libre de pulsos de la fase móvil a través de la columna, sin que el flujo sea influido por la presión en la cabeza de la columna, ya que ésta puede variar por obstrucción de las líneas de conducción, del filtro de la cabeza de la columna, etc. (Museo Nacional de Ciencias Naturales)

Requisitos para los sistemas de bombeo en HPLC

Un sistema de bombeo ideal debe cumplir las siguientes características:

Estar construido por materiales químicamente inertes frentes a la fase móvil.

Ser capaz de trabajar a presiones elevadas. (600 psi) Proporcionar un flujo libre de pulsaciones o llevar asociado un amortiguador

de éstas ya que las pulsaciones, aunque no afecten a la separación en sí, pueden contribuir al ruido de fondo del detector y por lo tanto disminuir la sensibilidad.

El caudal que suministra debe ser constante a lo largo del tiempo, ya que de él depende la reproducción de los tiempos de retención.

Suministrar flujos adecuados para los diferentes tipos de columnas. El rango de caudales para las columnas que se utilizan habitualmente varía desde los 10 µL/min hasta los 10 mL/min (columnas microbore, analíticas y semipreparativas)

El control y reproducibilidad del caudal mejor del 0,5% relativa Facilidad de desmontaje y reparación

TIPOS DE BOMBAS

Una primera clasificación de las bombas utilizadas en HPLC, se pueden realizar atendiendo a la fuerza motriz y a su modo de trabajo.

CLASIFICACIÓN DE ACUERDO A SU FUERZA MOTRIZ

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Se utilizan tres tipos de bombas, cada una con sus propias ventajas y desventajas: bombas recíprocas, bombas de jeringa o de desplazamiento y bombas neumáticas o de presión constante. (Museo Nacional de Ciencias Naturales)

BOMBAS RECIPROCAS

Las bombas recíprocas, que se utilizan en aproximadamente el 90% de los sistemas de HPLC comercializados, consisten, por lo general, en una pequeña cámara en la que el disolvente es impelido por el movimiento de vaivén de un pistón accionado por un motor. Dos válvulas con cierre de bola, que se abren y cierran alternativamente, controlan el flujo del disolvente hacia dentro y hacia afuera de un cilindro. Las bombas recíprocas tienen la desventaja de que producen un flujo con pulsaciones, las cuales se han de amortiguar dado que su presencia se manifiesta como ruido en la línea base en el cromatograma. Entre las ventajas de las bombas recíprocas se pueden citar su pequeño volumen interno (35 a 400 mL), sus altas presiones de salida (por encima de los 500 kg/cm2), su fácil adaptación a la elución con gradiente, y sus caudales constantes, que son prácticamente independientes de la contrapresión de la columna y de la viscosidad del disolvente. (Museo Nacional de Ciencias Naturales)

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BOMBAS DE JERINGA O DE DESPLAZAMIENTO

Las bombas de desplazamiento consisten por lo general en unas grandes cámaras como una jeringa, equipadas con un émbolo que se activa por un mecanismo de tornillo accionado mediante un motor paso a paso. Las bombas de desplazamiento también producen un flujo que tiende a ser independiente de la viscosidad y de la contrapresión. Además, el flujo que resulta está libre de pulsaciones. Las desventajas incluyen una capacidad de disolvente limitada ( » 250 mL) y una notable incomodidad para el cambio de disolventes. (MuseoNacional de Ciencias Naturales)

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BOMBAS NEUMÁTICAS O DE PRESIÓN CONSTANTE

En las bombas neumáticas más simples, la fase móvil se encuentra en un recipiente plegable colocado en una vasija que puede presurizarse mediante gas comprimido. Las bombas de este tipo son baratas y están exentas de impulsos; aunque tienen una limitada capacidad y presión de salida, y además el caudal depende de la viscosidad del disolvente y de la contrapresión de la columna. Además, no son utilizables en la elución con gradiente y están limitadas a presiones menores de unos 2.000 psi. (Museo Nacional de Ciencias Naturales)

CLASIFICACIÓN DE ACUERDO A SU MODO DE TRABAJO

Se dividen en:

Bombas isobáricas. Bombas binarias Bombas cuaternarias Bombas capilares Bombas preparativas

AMORTIGUADORES DE PULSOSMuchos de los detectores utilizados en HPLC son sensibles a variaciones de flujo. Un método sencillo de amortiguación contiene un fuelle flexible o un gas compresible en la porción superior cerrada de un tubo en T para absorber parte de la energía de pulsación. Cuando la bomba se rellena esta energía se libera para ayudar a suavizar la pulsación de presión. Los amortiguadores electrónicos de pulsos proporcionan una carrera hacia delante corta y rápida del pistón, y

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enseguida la carrera rápida de recarga de la bomba. El pequeño impulso hacia delante amortigua el pulso de flujo llevando disolvente a la presión del sistema.(Museo Nacional de Ciencias Naturales)

25.SISTEMA DE MEZCLA DE FASE MÓVIL

En cromatografía de líquidos, es posible trabajar en dos modalidades; isocrotico, cuando la fase móvil mantiene la misma composición durante la elución, y en gradiente, cuando la composición se la fase móvil cambia según una función dependerá del tiempo.

Para trabajar en la modalidad de gradiente es necesario que el equipo cromatográfico Tenga un dispositivo capaz de retirar mezclas de disolventes con un control preciso y reproducible.

Los principales métodos de mezclado de los componentes de la fase móvil se conocen como mezclado a alta presión y mezclado a baja presión. (MuseoNacional de Ciencias Naturales)

MEZCLADO A ALTA PRESIÓN

Este sistema de mezclado utiliza una bomba para cada uno de los disolventes que se van a mezclar, estando la salida de cada bomba conectado a una conexión de “T” o a una pequeña cámara de mezcla. La denominación de mezcla en alta presión es debida a que la mezcla se realiza una vez los disolventes han pasado la bomba y, por lo tanto, han adquirido la presión de trabajo.

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El mayor inconveniente de este sistema de mezcla, es el alto costo de las bombas si se requieren mezclas con un porcentaje inferior a un 5% de uno de los componentes, ya que en este caso deben utilizarse bombas de alta presión y, además, se necesita una bomba para cada uno de los disolventes a mezclar. Como ventajas, se pueden señalar una buena reproducibilidad de las mezclas, una rápida respuesta en los cambios de concentración y, además, la posibilidad de utilizar cada una de las bombas por separado para trabajar con sistemas isocráticos independientes. (Museo Nacional de Ciencias Naturales)

MEZCLADO A BAJA PRESIÓN

En los equipos de mezclas de baja presión, el mezclado de los diferentes componentes se lleva a cabo antes de estos entre en la bomba (en la zona de baja presión del sistema), controlándose el caudal del sistema cromatográfico por medio de una sola bomba. El mezclado de los componentes se realiza por medio de válvulas porcentuales controladas por relés, que están calibradas para dar la mezcla adecuada. El dispositivo de control simplemente abre cada válvula durante un periodo de tiempo adecuado, que será unción del porcentaje de cada componente que se precisa en la mezcla.

La principal ventaja de este equipo de mezclado, es que el coste del equipo se reduce considerablemente. El mezclado en baja permite la mezcla de dos o más compontes de la fase móvil con una bueno reproducibilidad, aunque con unos tiempos de retardo algo mayores al respecto a la mezcla de alta presión como principal desventaja, se tiene la baja reproducibilidad que se obtiene en mezclas donde uno de los componentes se encuentra en una proporción de menos del 5%.(Museo Nacional de Ciencias Naturales)

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26.SISTEMAS DE INYECCIÓN DE MUESTRA

A menudo, el factor limitante en la precisión de las medidas en cromatografía de líquidos es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. El problema se acentúa por el ensanchamiento de banda que acompaña a la sobrecarga de las columnas. Por ello, los volúmenes que se emplean han de ser muy pequeños de unas pocas décimas de microlitro a tal vez 500mL. Además, se ha de poder introducir la muestra sin despresurizar el sistema.

El método de introducción de la muestra en HPLC, es de importancia capital, pues un mal sistema de inyección puede dar lugar a ensanchamientos de la banda cromatográfica que deterioren la eficiencia del sistema cromatográfico. (MuseoNacional de Ciencias Naturales)

Un inyector ideal debe tener las siguientes características:

Introducir la muestra en la columna como una banda lo más estrechamente posible.

Ser de fácil manejo. Dar lugar a resultados reproducibles, tanto en la cantidad de muestra

inyectada como el ensanchamiento que origina en la banda cromatográfica.

Ser capar de trabajar a presiones elevadas.

Fundamentalmente existen dos tipos de inyectores manuales: los de jeringa y los de válvula. (Museo Nacional de Ciencias Naturales)

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INYECTORES DE JERINGA:

En este tipo de inyectores, la introducción de la muestra en la columna se realiza por medio de una jeringa cuya aguja entra en el sistema cromatográfico a través de una membrana (“septum”), lo que permiten depositar la muestra en la cabeza de la columna. (Museo Nacional de Ciencias Naturales)

Las ventajas de este tipo de inyector, radican en su facilidad de construcción y en que permiten sacar todo el partido a la eficacia ofrecida por la columna; por el contrario, son inyectores que presenta una gran falta de reproducibilidad, tiene una presión de trabajo limitada que presentan una gran falta de reproducibilidad, tienen una presión de trabajo limitada y son de gran dificultad de manejo. (MuseoNacional de Ciencias Naturales)

INYECTORES DE VÁLVULA

Este sistema de inyección consiste en una válvula de seis vías, dos de las cuales están conectadas entres si por medio de una espira (“loop”). Esta espiral es un tubo de volumen conocido, cuya misión es la de contener la muestra antes de efectuarse la inyección.

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La introducción de la muestra en la columna se lleva a cabo en dos etapas; la primera se realiza a presión atmosférica, y consiste en cargar la muestra en la espira con ayuda de una jeringa; en la segunda, mediante un giro de la válvula, se hace pasar eluyente a través de la espira hacia la columna.

La inyección mediante válvulas es con mucho la más utilizada, ya que reúne prácticamente todas las características exigibles a un inyector. (Museo Nacionalde Ciencias Naturales)

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Cuando se realiza un método en cromatografía la fuente de error más frecuente es la irreproducibilidad en la inyección de un volumen muy pequeño en la cabeza de la columna, para ello se emplean sistemas de inyección automatizados para eliminar dicho error. Los cuales consisten en el mismo sistema de inyección manual, pero la diferencia consiste, en que la toma de muestra es controlada por un ordenador y realizada por un sistema robótico. (Museo Nacional de CienciasNaturales)

27.SISTEMA DE TUBERÍAS Y CONEXIONES EN HPLC

Tuberías

La presencia de volúmenes muertos es uno de los grandes problemas de los equipos de cromatografía de líquidos, ya que estos dan origen a perdidas en la eficacia del sistema y, por lo tanto, en la capacidad de separación. En particular, todas las conducciones y conexiones entre el inyector y la columna, y entre la columna y el detector son de la máxima importancia.

El tubo de conducción puede considerarse como un volumen muerto del sistema y, por tanto, es de vital importancia la utilización para esta finalidad de tubos capilares en los que el diámetro interno sea pequeño y evitar al máximo posible la utilización de grandes longitudes de tubos de conexión; de este modo, se consigue reducir en la medida de lo posible el volumen muerto del sistema. Es posible calcular la pérdida de eficiencia producida por el volumen muerto de la conducción, en la siguiente tabla se muestra una guía de longitud de la tubería entre el inyector y el detector, en función de las características de la columna, para no dar un incremento máximo del 5% en el ancho de banda. (Museo Nacional deCiencias Naturales)

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Características de las columnasLargo máximo (cm) para un incremento de un 5% en el

ancho de la bandaL (mm) ID (mm) dp (µm) N Diámetro interno de la tubería

0.18 mm 0.25 mm 0.50 mm3350100150250250250250

4.64.64.64.64.64.62.01.0

333510555

44006677133331200010000200002000020000

2233671675562785012

914276822811420*

****14***

L=longitud de la columna, ID= diámetro interno dp= diámetro de la partícula, N= número de platos teóricos, determinados a una unidad de 1mL/min, excepto de (a) 0.2 mL/min y (b) 0.05 mL/min, (*) =menos de 8 cm.

También es importante conocer la naturaleza del tubo utilizado, ya que este debe ser inerte frente a la fase móvil y a las substancias a separar; en general se utiliza tubo de acero inoxidable, pero en casos especiales, se utilizan tubos de titanio (no

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sufren a taque por ion Cl- ) y en otros casos, de materiales sintéticos (principalmente PTFE). (Museo Nacional de Ciencias Naturales)

Conexiones

Las conexiones tiene la misma importancia que el tubo, ya que en ellas es también necesario el lograr eliminar la presencia de volúmenes muertos.

Existen dos tipos de conexiones: las uniones, que se emplean para conectar tubos del mismo diámetro, y las reducciones, que se emplean para modificar el diámetro de la conducción encontrándose, por lo general, las reducciones únicamente en los extremos de la columna. En ambos casos; es imprescindible la eliminación de los volúmenes muertos. (Museo Nacional de Ciencias Naturales)

Conexión de unión

Volumen muerto originado por una unión

28.COLUMNAS

La columna es el elemento fundamental de un equipo HPLC, puesto que es en ella donde tiene lugar la separación; por lo tanto, resulta fundamental una correcta elección de la columna adecuada para cada separación, ya que con una columna inadecuada o de mala calidad nunca se obtendrán buenos resultados, las partes que componen una columna cromatográfica se presentan a continuación. (Museo Nacional de Ciencias Naturales)

Las características de la columna que influyen sobre su capacidad de separación son:

- Diámetro interno- Longitud- Conexiones

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CENTRO DE GESTIÓN INDUSTRIAL – SENAASEGURAR LA CALIDAD DE LOS ENSAYOS DESARROLLADOS EN EL LABORATORIO

GUÍA TEÓRICA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓNHPLC

- Relleno(reducciones)- Tamaño de partícula

DIÁMETRO DE LA COLUMNA

La elección del diámetro de la columna se hace en función de la cantidad de muestra a separar. Para las separaciones de escala analítica (algunos µg de muestra por inyección) se suelen usar columnas de pequeños diámetros (1 a 6mm) mientras que en los trabajos a escala preparativa se superan los 10mm de diámetro interno. Esta selección de diámetros se debe a la pérdida de la eficacia, por sobrecarga en la columna, cuando se inyecta una excesiva masa de solutos a separar. Se ha comprobado empíricamente que en fase normal, la sobrecarga comienza a partir de 50µg de muestra por gramo de relleno, mientras que en fase reversa es necesario sobrepasar los 100 µg/g de relleno; parece lógico, por lo tanto pensar que mayores diámetros de columna, manteniendo iguales los restantes parámetros, permiten separar mayores cantidades de muestra sin variación de la eficacia del sistema. (MuseoNacional de Ciencias Naturales)

El inconveniente de las columnas de gran diámetro consiste en el elevado consumo de disolventes, puesto que se necesitan flujos elevados para conseguir la misma velocidad lineal eluyente que en las de pequeño diámetro.(Museo Nacional de Ciencias Naturales)

LONGITUD DE LA COLUMNA

Como se puede comprobar en las ecuaciones que rigen los procesos cromatográficos, la eficacia de la columna depende, entre otros factores, de la longitud de la columna e igual que otros parámetros, mayores longitudes de columna permitirán obtener mayores eficacias.

Por otra parte, debe tenerse en cuenta que, a mayor longitud de la columna. La presión en cabeza se eleva considerablemente, por lo que hay que alcanzar equilibrio entre la eficacia y la caída de presión a la hora de seleccionar la columna. Para tamaños de partícula de 3 µm, la longitud e columna no podrá ser superior a 20 cm sin riesgo de que la presión en cabeza de columna sea excesivamente elevada. (Museo Nacional de Ciencias Naturales)

CONEXIONES

En los extremos de la columna se montan sistemas de conexión para poderlas unir al detector y a los sistemas de inyección y bombeo de Eluyentes. La conexión, en esta caso, es realmente la unión reductora de compresión radial, que permite una perfecta unión del tubo de columna capilar que la conecta a los demás dispositivos del HPLC. Estas uniones no deben presentar volúmen muerto, deben permitir el paso de secciones anchas de tubo a capilares, y deben ser fácilmente montables y desmontables.

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Por otra parte y como cierre del tubo se colocan los llamados fritados, que son mallas con un tamaño de poro inferior al diámetro de la partícula de relleno, de esta forma, se deja pasar al eluyente evitando que el relleno salga de la columna. (Museo Nacional de Ciencias Naturales)

RELLENO

Todas las separaciones cromatográficas tienen lugar sobre la fase estacionaria. Las fases estacionarias en cromatografía de líquidos, están constituidas generalmente por partículas de materiales rígidos o semirrígidos y en la gran mayoría de rellenos se suele utilizar sílice con este fin, aunque también es posible encontrar rellenos basados en polímeros sintéticos.

En la mayoría de rellenos de columnas cromatografía líquida realiza una de las tres funciones siguientes:

- Superficie adsorbente. En este caso los propios grupos activos de la superficie de la sílice (grupo silanol) son los responsables de la separación.

- Soporte de la fase estacionaria. Esta se impregna a la superficie de la sílice o se encuentra químicamente ligada a ella (sílice modificada químicamente).

- Actuación como substrato microporoso. En este caso, la sílice permite la selección de moléculas en función de su tamaño. (Museo Nacional deCiencias Naturales)

SÍLICE

Los avances técnicos en la preparación de sílices de estructura conocida, con modificaciones químicas en la superficie, con poros y formas controladas y con una buena granulometría han permitido que este material, en multitud de presentación, sea el relleno más utilizado en las HPLC. La sílice ha terminado por desplazar como relleno a polímeros sintéticos que, debido principalmente a su inercia química y a la facilidad de modificar químicamente su superficie estaban tomando cierto auge en cromatografía líquida. La sílice se está introduciendo en campos de la cromatografía líquida en los que la base del relleno era por excelencia polimérica, como son los casos de la cromatografía por exclusión molecular y la cromatografía de intercambio iónico. (MuseoNacional de Ciencias Naturales)

Las propiedades de la sílice que propician su utilización como soporte se puede resumir en:

PROPIEDADES DE LA SÍLICE QUE PROPICIAN SU UTILIZACIÓN COMO SOPORTE

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Gran resistencia mecánica

Lo que le permite a las columnas empaquetadas con sílice resistir mayores presiones de trabajo. En general

los polímeros sintéticos no permiten trabajar a presiones por encima de los 18 bar (1800 psi)

Amplia gama de formas,

tamaños y diámetros

de poro

Estas características permiten conseguir una gran variedad de estructuras. En la actualidad es posible

preparar una sílice prácticamente a conveniencia, así es posible encontrar sílices esféricas, irregulares o

poligonales, lo que puede tener gran importancia en el empaquetado de la columna (presiones resultantes y permeabilidad del relleno al paso del eluyente) y en la

posterior eficacia de ésta.Gran

variedad de sílices en cuanto a

superficie esférica

Este hecho permite encontrar sílices de gran reactividad o de relativa inercia y, por lo tanto, es

posible tener amplia gama de capacidades de separación y de posibilidades de ligar químicamente

moléculas a su superficie.

TAMAÑO DE PARTÍCULA

El tamaño de partícula juega un papel importantísimo en la calidad y eficiencia de la columna. Como se puede ver en la ecuación de Van Deemter, la altura equivalente del plato teórico es función del diámetro de la partícula de relleno.

Donde dp es el diámetro de las partículas y u la velocidad lineal de la fase móvil.De esta ecuación se desprende la importancia del diámetro de partícula, ya que a diámetros menores se obtendrá una menor altura equivalente de plato teórico y, por lo tanto, una mayor eficacia del sistema. (Museo Nacional de CienciasNaturales)

Las partículas inicialmente utilizadas para rellenos en cromatografía líquida, eran bastante grandes (de más de 40 µm) y totalmente porosas. Este tipo de partículas presenta una gran superficie específica y, por lo tanto, las columnas preparadas con ellas presentan una gran capacidad de carga (admiten gran capacidad de muestra) pero, como contrapartida, dan lugar a un gran ensanchamiento de la banda cromatográfica ya que influyen significativamente sobre los términos de transferencia de masa de la ecuación de Van Deemter.

Como solución parcial a este problema, se comenzaron a utilizar los recubrimientos de estas partículas por capas de fase estacionaria (adsorbente

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o intercambiadora de iones). Este tipo de rellenos (rellenos peliculares) dan lugar a picos más estrechos aunque no son la solución óptima.

a) CL convencional; b) HPLC con partículas peliculares; c) HPLC con partículas microporosas

Los mayores avances se han realizado al reducir los tamaños de las partículas de relleno a unos niveles en los que se consiguen grandes incrementos en la eficacia de la columna sin que por ello se tengan unas presiones tan excesivamente elevadas en la cabeza de columna que hagan inviable el análisis.

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En la actualidad, los tamaños de partícula habituales se encuentran entre 10 y 3 µm. En la figura que se presenta a continuación, se evidencia como el tamaño de partícula de 3µm permite menores alturas equivalentes de plato teórico, incluso a velocidades elevadas de fase móvil, permitiendo este tipo de partículas lograr separaciones muy buenas junto con tiempos de análisis reducidos. (Museo Nacional de Ciencias Naturales)

En cuanto menor sea el tamaño de partícula, la presión de cabeza de columna se incrementa de forma proporcionalmente inversa al cuadrado del tamaño de la partícula. Por este motivo, es fácil entender por qué no se encuentran en el mercado rellenos con un tamaño de partícula de menos de 3 µm.

Las columnas de cromatografía liquida usualmente se elaboran con tubos de acero inoxidable, si bien a veces se utilizan los tubos de vidrio o Tygon para aplicaciones de baja presión (<600 psi). La mayoría de las columnas tienen una longitud de 10-30 cm y diámetro interno de 2-5 mm. Los empaquetamientos de las columnas suelen ser de partículas de 3-10 µm. Las columnas de este tipo proporcionan 40000 - 60000 platos por metro. Recientemente, han aparecido en el mercado microcolumnas con un diámetro interno de 1 - 4.6 mm y longitud de 3 - 7.5 cm. Estas columnas, empaquetadas con partículas de 3 a 5 µm, contienen hasta 100000 platos por metro y poseen la ventaja de su velocidad y mínimo consumo de disolvente. Esta última propiedad es de importancia considerable, dado que los disolventes de alta pureza necesarios en la cromatografía liquida son muy costosos y tienen que desecharse después de usarlos. En la Figura 32.7 se ilustra la velocidad con la que puede efectuarse una separación en este tipo de columna En ella los ocho componentes de diversos tipos se separan en unos 15 s. La columna tiene 4 cm de longitud y un diámetro interno de 4 mm; está empaquetada con partículas de 3 µm.

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PRECOLUMNAS

Con frecuencia se coloca una precolumna pequeña delante de la columna analítica para extraer partículas y contaminantes de los disolventes y prolongar así la vida de la columna analítica. Además, en la cromatografía de liquido-liquido la columna sirve para saturar la fase móvil con la fase estacionaria, de modo que se minimicen las pérdidas de la fase estacionaria en la columna analítica. La composición del empaquetamiento de la precolumna suele ser similar a la de la columna analítica, si bien el tamaño de partícula tiende a ser mayor para minimizar la caída de presión. (Museo Nacional de CienciasNaturales) (Douglas A. Skoog, 2005)

TERMOSTATOS PARA LA COLUMNA

En muchas aplicaciones, no es necesario el control estricto de la temperatura de la columna, y las columnas se usan a la temperatura ambiente. Sin embargo, es frecuente que se obtengan mejores cromatogramas al mantener temperaturas de columna constantes a unas décimas de grado Celsius. Muchos instrumentos comerciales modernos están equipados ahora con calentadores, que controlan la temperatura de la columna a unas décimas de grado, desde la temperatura casi ambiente hasta 150 °C. A las columnas también se les puede adaptar camisas de agua que se alimentan con un baño a temperatura constante para lograr un control preciso de la temperatura.(Museo Nacional de Ciencias Naturales)

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29.EMPAQUE

El empaquetamiento más común en la cromatografía liquida se prepara con partículas de sílice que se sintetizan por aglomeración de partículas submicrónicas de sílice en condiciones que producen partículas más grandes y de diámetro muy uniforme. Las partículas resultantes suelen cubrirse con películas orgánicas fina, que se enlazan química o físicamente con la superficie. Otros materiales de empaquetamiento son las partículas de alumina, partículas de polímeros porosos o resinas de intercambio iónico.

El soporte más común en HPLC son las partículas microporosas de sílice pueden tener un área superficial de hasta 300 m2/g. Su superficie contiene unos 8 mol/ m2 de grupos Silanol (Si-OH). (Douglas A. Skoog, 2005), (MuseoNacional de Ciencias Naturales)

Partículas de sílice de tamaño de poro de 10 nm

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Partículas de sílice de 5 µm

30.DETECTORES

Un detector para cromatografía es un dispositivo que permite medir, a la salida de la columna, una propiedad física del eluyente, que deberá depender de la composición de éste. La detección en cromatografía, se realiza habitualmente e continuo aunque es posible la utilización de colectores de fracciones para la identificación y cuantificaciones de pequeñas fracciones de eluyente. Los detectores de HPLC deben tener un volúmen muerto bajo para minimizar el ensanchamiento de banda adicional de columna. El detector debe ser pequeño y compatible con el flujo de líquido. No se cuenta con un sistema detector universal altamente sensible para HPLC del tipo de los usados en la cromatografía de gases.

Un detector ideal para HPLC debe ser sensible a pequeñas concentraciones de analito, dar una respuesta lineal amplia, tener poco ruido de fondo y ser estable en el tiempo que dura el cromatograma. Además, en caso de que se utilice gradiente debe ser insensible a los cambios de composición de la fase móvil. Es también importante que la celda de flujo del detector tenga un volúmen mínimo para no provocar ensanchamiento de las bandas. La mayoría de los detectores empleados responden a alguna propiedad característica de los compuestos a analizar aunque existen también detectores que responden a la variación de una propiedad de la fase móvil debido a la presencia de solutos.(Museo Nacional de Ciencias Naturales)

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CARACTERÍSTICAS DE DETECTORES

RESPUESTA

Es la señal ofrecida por le detector ante una determinada variación de la propiedad física del eluyente que es medida.

Esta propiedad debe ser proporcional a la derivación de masa del soluto que sale de la columna o a su

concentración. La respuesta de un detector suele ser lineal (en un rango más o menos ancho según el tipo de detector),

lo que implica que la señal generada por el detector varía linealmente con la concentración o la masa de soluto que,

por unidad de tiempo sale de la columna.

RUIDO

Es cualquier perturbación de la señal generada por el detector y que no es originada por la salida del soluto de la

columna. El ruido a su vez se compone de otros dos tipos de ruido: ruido de corto alcance (perturbaciones de una

frecuencia mayor que la inversa del ancho del pico de soluto) y ruido de largo alcance (perturbaciones con

frecuencia del mismo orden que la inversa del ancho del pico del soluto).

DERIVAEs la variación de la señal de base a lo largo del tiempo que

origina una variación lenta y progresiva de la línea de la base.

SENSIBILIDAD

La sensibilidad se define como la mínima concentración o cantidad de soluto que debe pasar por el detector para que

la señal a que éste da lugar sea dos veces mayor que el ruido de fondo. Este parámetro indica la cantidad mínima de

soluto que es posible detectar, y es dependiente del ruido del detector.

LÍMITE DE DETECCIÓN

Está definido como la mínima cantidad de sustancia que puede producir una señal que sea el doble del nivel de ruido.

CORRIENTE DE FONDO

Señal constante de salida generada por el proceso en el que un detector está operativo sin que alguna sustancia pase a través de él. Esta señal es muy importante, ya que permite diagnosticar el buen o mal funcionamiento del detector. La separación efectuada se conserva en un registro individual llamado cromatograma. Un cromatograma es una imagen que traduce visualmente en una pantalla o en un papel la

evolución, en función del tiempo, de un parámetro que depende de la concentración instantánea del soluto a la

salida de la columna. Este gráfico se obtiene gracias a un detector situado a la salida de la columna (Rouessac y

Rouessac, 2003).LINEALIDAD Rango de masa ó concentración de muestra sobre el cual el

detector mantiene una sensibilidad constante sin una desviación arbitraria. El significado práctico de la linealidad del detector es el que le indica al analista la concentración para la cual el detector es confiable. Hay dos límites en la

curva de linealidad:

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El límite de concentración inferior, que es dado por el límite de detección.

El límite Superior, definido por un porcentaje de desviación arbitrario de la curva de linealidad.

RANGO DINÁMICO

Es el rango de concentraciones de soluto entre las cuales el detector produce una respuesta dependiente de la

concentración de soluto a la salida de la columna. El valor mínimo, se corresponde con la sensibilidad del detector, y el máximo, con la concentración de soluto a partir de la cual la respuesta del detector es constante (saturación). El rango

dinámico lineal, es la zona del anterior en el que la respuesta del detector es lineal frente a la concentración del

soluto.

Así pues, el detector usado depende de la naturaleza de la muestra, los detectores en cromatografía de líquidos son de dos tipos básicos. Los detectores basados en una propiedad de la disolución responden a una propiedad de la fase móvil, tal como el índice de refracción, la constante dieléctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por contraste, los detectores basados en una propiedad del soluto responden a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, o intensidad de difusión, que no son propias de la fase móvil. En la Tabla se indican los detectores más comunes empleados en HPLC y algunas de sus propiedades más importantes. Un informe de 1982 sobre 365 trabajos publicados en los que tenía un papel importante la cromatografía de líquidos, reveló que el 71 % se utilizaban en la detección de la absorción UV, el 15% la fluorescencia, el 5,4% el índice de refracción, el 4,3% empleaba medidas electroquímicas y el 4,3% restante otras medidas. (Museo Nacional de CienciasNaturales)

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CARACTERÍSTICAS DE LOS LECTORES DE LC

Detector HPLCDisponible

comercialmente

Límite de detección de masa típico

Intervalo lineal

(decenas)Absorbancia Si 10 pg 3-4

Fluorescencia Si 10 fg 5Electroquímica Si 100 pg 4-5

Índice de refracción Si 1 ng 3Conductividad Si 100 pg- 1 ng 5

Espectrometría de masas Si < 1 pg 5

FT-IR Si 1 µg 3Dispersión de la luz Si 2 µg 5

Actividad óptica No 1 ng 4Selectivo de elementos No 1 ng 4-5

Fotoionización No < 1 pg 4

Los detectores más usados en cromatografía líquida se basan en la absorción de radiación ultravioleta o visible. Se fabrican comercialmente fotómetros y espectrofotómetros diseñados específicamente para su uso con columnas cromatográficas, los primeros emplean frecuentemente las líneas de 254 y 280 nm de una fuente de mercurio, ya que muchos grupos funcionales orgánicos absorben en esa región, Las fuentes de deuterio o de filamentos de tungsteno con filtros de interferencia también proporcionan una manera sencilla de detectar las especies absorbentes. Algunos instrumentos modernos están equipados con ruedas de filtros, que contienen varios filtros de interferencia, de rápida sustitución. Los detectores espectrofotométrico son mucho más flexibles que los fotométricos. Además de usarse mucho mas ampliamente en los instrumentos de alta resolución. En equipos modernos, se usan detectores de diodos integrados, que permiten mostrar el espectro completo de un analito que sale de la columna. La combinación de la HPLC y el detector de espectrómetro de masas se están haciendo muy frecuentes. Estos sistemas de cromatografía liquida espectrometría de masas permiten identificar los analitos que salen de la columna de HPLC. (Douglas A. Skoog, 2005)

A continuación se presenta una tabla con los detectores que se presentan en los equipos HPLC.

Nombre Ventaja Desventaja

Se mide la desviación de un haz luminoso al variar la composición del lado de la muestra en relación con la del

lado de referencia a medida que eluye la muestra a través del detector.

Baja sensibilidad frente a las partículas sólidas y a las

burbujas de aire que puedan penetrar en la cubeta y la

posibilidad de cubrir el intervalo completo de índices de refracción (desde 1,000 hasta 1,75), con una única

cubeta fácilmente equilibrable

Alto costo y, como consecuencia del crítico

emplazamiento de la cubeta en el centro de la óptica, su difícil manejo, lo que impide limpiar,

quitar o remplazar fácilmente la cubeta cuando se forma en ella

película o se atasca.

Detector de reflexión

Al entrar la muestra en una de las cubetas la luz se refracta con un ángulo diferente, con lo cual a la salida de la fotocélula habrá variado su intensidad no su dirección. El consiguiente equilibrio del detector genera un cambio en la energía eléctrica de su señal de salida. También en este caso, la diferencia entre la señal de la cubeta de la

muestra y la de la referencia se transmite a un registrador o a un sistema de tratamiento de datos en

forma de variación del voltaje de salida.

Gran sensibilidad potencial, puesto que su óptica permite

una mayor concentración dela señal en un determinado

intervalo de índice de refracción de lo que es

posible en los detectores de alto intervalo; posibilidad de operar caudales sumamente

Necesidad de cambiar los prismas para adaptarse al índice de refracción de los disolventes

(que pueden tenerlo muy elevado o bien muy bajo) así como la necesidad de ajustar

manualmente el camino óptico al cambiar de disolvente.

DETECTORES HPLC

Descripción Imagen

Detector de índice

de refracción

Se basa en los cambios del índice de refracción del disolvente a causa de las moléculas del analito. A

diferencia de muchos de los detectores mencionados, el detector de índice de refracción es general, no selectivo,

y responde a la presencia de todos los solutos. La detección se basa en equilibrar el detector, a caudal constante, con fase móvil pura y medir el cambio de

índice de refracción cuando aparece la muestra eluida junto con la fase móvil.

Detector universal

Posee una sensibilidad hasta cierto punto limitada. Necesidad de requilibrar el detector cada

vez que se produce un pequeño cambio en la composición de la

fase móvil.

Detector de

desviación

1



Detectores de UV/VIS

Detectores de longitud

de onda variable

Los detectores de longitud de onda variable son particularmente útiles en tres casos:

a) En el caso de que se pueda obtener una mayor sensibilidad a una longitud de onda distinta de 254 nm o de otras longitudes de onda para las que existen filtros.b) En el caso de que los distintos componentes de la

muestra presenten gran absorción a diferentes longitudes de onda y, por tanto, el trabajo a una única

longitud de onda reduzca la sensibilidad e incluso pueda resultar imposible la detección de algunos de los

componentes de la muestra.c) En el caso de que se desee la operación con paro de flujo combinada con un registro de espectro completo de

Sencillez de manejo, amplio uso, sofisticados

Cuando se hace pasar una radiación electromagnética a través de compuestos que presentan determinados

grupos funcionales, estos experimentan una excitación electrónica a causa de la absorción de la energía, a una longitud de onda que será especificada para cada grupo funcional. Esta energía provoca el paso de un electrón desde el estado fundamental hasta un nivel de energía superior. La absorción de la energía, se traduce en la

disminución de la intensidad de un haz luminoso que se ha hecho pasar a través de la muestra, pudiéndose

medir esta disminución de la intensidad haciendo medir el haz sobre la fotocélula.


Detectores de longitud de onda fija

La fuente luminosa mas corrientemente utilizada en los detectores UV, emite la mayor parte de energía a una

longitud de onda fija de 253,7nm. Es posible seleccionar, por medio de filtros adecuados, una de las longitudes de onda, retirando las de emisión más débil. La mayoría de

los detectores que trabajan con una longitud de onda fijan, utilizan una línea de 254nm, que presenta una gran

estabilidad de emisión y permite tener una alta sensibilidad, pudiéndose medir incluso cantidades por

debajo del nanogramo en sustancias que presentan una


2



Detectores de UV/VIS

Detector de

fotoiodos

La importancia en HPLC se hace cada vez mayor, ya que permite en tiempo real conocer el espectro de

UV/VIS en cualquier instante del cromatograma. La base del funcionamiento de los espectrofotómetros de matriz

de diodos es simple; el haz de radiación que ha atravesado una cubeta de flujo continuo, a través de la

que circula la fase móvil procedente de la columna cromatográfica, es dispersado por medio de una red de difracción fija, siendo recogidas simultáneamente todas las longitudes de onda dispersadas mediante una matriz

de fotodiodos.


Ligeramente menos sensible que la detección por UV

tradicional.

Detector de fluorescencia

Los detectores de fluorescencia representan el tercer tipo de detectores mas comúnmente utilizados en la moderna CL. Para los compuestos que presentan

fluorescencia natural, así como para los que pueden convertirse en fluorescentes por medio de una

derivatización simple, es el tipo de detección mas sensible que se puede aplicar de rutina a la CL;

normalmente a sensibilidad del detector de fluorescencia es de 1000 veces mayor que la del detector UV

Aumenta la sensibilidad, aumenta la especificidad,

permite barridos de excitacipon como de emisión

Fuente. (Museo Nacional de Ciencias Naturales)

3



Detectores electroquímicos

Este tipo de detectores, están basados en la oxidación del analito eluido mediante un electrodo adecuado,

registrándose la intensidad de la corriente, mantenida mediante la electrolisis de los analitos, a lo largo del

cromatograma.

Gran campo de aplicación, gran especificidad y elevada

sensibilidad

A pesar de sus ventajas, los detectores electroquímicos

presentan también una serie de limitaciones; básicamente, estas

son:- La fase móvil debe ser

conductora de la corriente eléctrica, lo cual normalmente se consigue por la adición de

una sal adecuada. Esto limita o impide la realización de muchas separaciones en fase normal, en

las que se utilizan hexano u otras fases móviles polares.

- La fase móvil debe ser purgada de oxigeno, contaminantes

metálicos y haluros, para reducir la corriente de fondo y, por lo tanto, el ruido y la deriva de la

línea de base.- Los componentes de la

muestra deben ser oxidables, a un valor de potencial que no de lugar también a la electrolisis en la fase móvil o en los restantes componentes de la muestra.

Detector de conductividad electrolítica

En los detectores de la conductividad electrolítica se mide de manera continua la conductividad de la fase

móvil que eluye en la columna, indicándose la presencia de una analito por medio de un cambio de conductividad.

La respuesta de los detectores conductimétricos

es lineal frente a la concentración en un intervalo muy amplio, de manera que

es posible cuantificar la señal de salida por medio de una

correcta calibración preliminar.

Inestabilidad debido a variaciones térmicas de la

cubeta, por lo que son necesarios buenos sistemas de

termotatización

31.ELECCIÓN DE LA COLUMNA Y DE LA FASE MÓVIL

La elección del sistema cromatográfico debe hacerse en función de la naturaleza de las sustancias a separar.

El conocimiento de la naturaleza de la sustancia va a permitir, a priori, orientar al analista sobre que mecanismo de separación puede ser el más apropiado o dicho de otro modo, cual es la propiedad para la que existen diferenciad mas notables entre las sustancias a separar (tamaño, carga, polaridad, etc), lo que dará una idea de la fase estacionaria que puede ser apropiada.

Con tantos tipos distintos de fases estacionarias para cromatografía, ¿cómo se elige cuál utilizar?

Suele haber varias formas adecuadas de separar los componentes de una mezcla dada. Si en las publicaciones sobre el tema ya se describió un procedimiento razonable, la mayoría de las personas utilizarán el método conocido, en vez de crear uno nuevo. Si no se ha descrito antes un método, o si no se dispone de la columna requerida, a continuación se presenta un diagrama para elegir un punto de partida.

Si el peso molecular del analito es menor de 2 000, se utiliza el diagrama de Peso molecular menor a 2000; si es mayor se utiliza el diagrama de Peso molecular mayor 2000. (Harris)

Diagrama peso molecular <2000

1



Diagrama peso molecular >2000

Fuente. (Harris)

32.CLASIFICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

Los diferentes tipos de cromatografía líquida se pueden clasificar de diferentes maneras pero la más habitual de clasificación es la realizada en base a la naturaleza de la fase estacionaria, ya que ésta le impone fundamentalmente el mecanismo de separación.

TIPOS DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

Cromatografía de adsorción (líquido-

sólido)

La fase estacionaria es una adsorbente y la separación se basa en repetidas etapas de adsorción-

desorciónCromatografía de

reparto/adsorción (fases ligadas químicamente)

La separación en este caso, se basa en un reparto del soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria

2



Cromatografía de fase normal

La fase estacionaria presenta puntos activos de alta polaridad y las interacciones que se producen con el

soluto son específicas del grupo activo. La fase estacionaria puede ser un sólido adsorbente (sílica o

alumina), o bien, un soporte al que se unen químicamente moléculas orgánicas que presentan grupos funcionales de alta polaridad (ciano, amino,

etc.)Cromatografía de fase

reversaLa fase estacionaria tiene una naturaleza apolar (cadenas hidrocarbonadas, grupos fenilo) y las

interacciones que se producen son inespecíficas (efecto solvóbofo)

Cromatografía de intercambio iónico

Este tipo de cromatografía, se da cuando la fase estacionaria presenta en su superficie grupos

ionizados capaces de retener selectivamente a los iones de signo contrario que circulan en la fase móvil.

Cromatografía de exclusión molecular

La fase estacionaria, en este caso, es una material poroso de tamaño de poro controlado, que permite la

entrada de ciertas moléculas de manera selectiva, dejando fuera otras de mayor tamaño.

Cromatografía de afinidad

La fase estacionaria es un sólido, como la agarosa, o un lecho de vidrio poroso, en el cual se inmoviliza el

ligando de afinidadCromatografía quiral Fases estacionarias quirales o aditivos quirales de

fase móvil, el agente quiral se inmoviliza sobre la superficie de un sólido

A continuación se presenta una tabla con la definición, tipo de empaquetamiento, fase móvil, fase estacionaria y aplicación de los diferentes tipos de cromatografía líquida de alta resolución HPLC.

CROMATOGRAFÍA HPLC

Nombre Descripción Empaquetamiento Fase móvil Fase estacionaria Aplicaciones

Cro

mat

ogra

fía d

e re

part

o Fase normal

Es el tipo de cromatografía más usada en

HPLC en la que la fase

estacionaria es un segundo

líquido inmiscible con la fase móvil líquida. Puede

dividirse ne variantes líquido-

líquido y de líquido-fase enlazada.

Muchos empaquetamientos de fase enlazada se

preparan por reacción de un organoclorosilano con los

grupos -OH formados en la superficie de partícula de

sílice por hidrólisis en ácido clorhídrico diluido caliente.

El producto es un organosiloxano. Otros

grupos funcionales orgánicos que se han

enlazado en superficies de sílice son las aminas

alifáticas, éteres y nitrilos, así como hidrocarburos

aromáticos. Así pues, están disponibles muchas

polaridades distintas para la fase estacionaria enlazada.

Hexano o i-propil éter Trietilenglicol, agua

Campo Mezclas típicas

Productos farmacéuticos

Antibióticos, sedantes, esteroides, analgésicos

Bioquímica

Aminoácidos, proteínas,

carbohidratos, lípidos

Productos de alimentación

Edulcolorantes artificiales,

antioxidantes, aflatoxinas,

aditivos

Fase reversa

Disolvente polar como el agua, metanol.

Acetonitrilo, hidrofurano

Hidrocarburos, grupos fenilo

Productos de la industria química

Aromáticos condensados, tensoactivos, propulsores, colorantes

ContaminantesPlaguicidas, herbicidas,

fenoles PCBs

Química forense Drogas, venenos,

1



CROMATOGRAFÍA HPLC


alcohol en sangre,

narcóticos

Medicina clínica

Ácidos biliares,

metabolitos de drogas,

extractos de orina,

estrógenos.

Cro

mat

ogra

fía d

e ad

sorc

ión

Es la forma clásica de la

cromatografía de líquidos. Con

pocas excepciones las características

de adsorción de los dos

adsorbentes son similares.

Las únicas fases que se utilizan en HPLC líquido-sólido son la sílice y la

alúmina, siendo la primera la que se prefiere para casi

todas las aplicaciones debido a su mayor

capacidad de carga y a su mayor diversidad de

presentaciones.

Disolvente orgánico o mezcla de disolventes

orgánicos

Partículas finamente divididas de sílice o

alúmina; pero se prefiere la sílice por su mayor

capacidad de muestra y su mayor variedad de formas

útiles.

En la actualidad la HPLC de líquido-sólido se usa mucho en separaciones

de compuestos orgánicos relativamente no polares ni

hidrosolubles cuya masa molecular es menor de unos 5000. Una ventaja especial de la cromatografía de

adsorción, que no comparten otros métodos, es su capacidad de

resolución de mezclas de isómeros, como las formas meta y para de

derivados del benceno.

Cr o ma to gr afí La cromatografía Históricamente, en Suelen ser disoluciones Sílice enlazada La cromatografía de intercambio

2



CROMATOGRAFÍA HPLC


a ió

nica

iónica está relacionada con

los métodos modernos y

eficaces para la separación y

determinación de iones que se

basan en el uso de las resinas de

intercambio iónico.

cromatografía de intercambio iónico se han

empleado pequeñas partículas esféricas porosas

que se forman en la copolimerización del

estireno y del divinilbenceno emulsionados. La presencia

de divinilbenceno (normalmente en un 8%)

origina una polimerización entrecruzada que imparte estabilidad mecánica a las

bolitas.

acuosas que pueden contener cantidades

moderadas de metanol u otros disolventes

orgánicos miscibles con el agua; estas fases móviles,

a menudo contienen especies iónicas en forma de disolución reguladora.

químicamente con grupos funcionales ácidos o

básicos. Los grupos más comunes son el ácido sulfónico y las aminas

cuaternarias.

iónico se ha aplicado a una variedad de sistemas orgánicos y bioquímicos incluyendo drogas y sus metabolitos, sueros, conservantes de alimentos, mezclas de vitaminas, azúcares y

preparaciones farmacéuticas.

Cro

mat

ogra

fía d

e ex

clus

ión

mol

ecul

ar

La cromatografía de exclusión por

tamaños, que también se ha denominado

cromatografía en geles

permeables o de filtración en

geles, es una técnica muy

valiosa que se aplica

particularmente a

Los rellenos para la cromatografía de exclusión

por tamaños están constituidos por pequeñas partículas (de unas 10 μm) poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de poros en los que pueden

difundir las moléculas del soluto y del disolvente.

La fase móvil utiliza para este tipo de

cromatografía, debe reunir las siguientes

características: Debe solubilizar perfectamente

a la muestra; No debe disolver la fase

estacionaria; no debe interactuar ni con la

muestra ni con la fase estacionaria.

La gama de rellenos existentes es muy variada,

atendiendo a sus características químicas, pero siempre se puede

controlar una constante en todos ellos: los de poro

caracterizan los rangos de peso molecular de las

moléculas a separar, hasta el punto de que sus fases se caracterizan en función de los pesos moleculares de las sustancias que se

Industria de alimentos y bebidas (vino, cerveza, jugo de frutas, etc.) o de muestras fisiológicas en donde la mayoría de los ácidos del ciclo de

Krebs están presentes, determinación rápida de la masa molecular o la

distribución de masa molecular de polímeros grandes o productos

naturales.

3



CROMATOGRAFÍA HPLC


especies de alto peso molecular.

pueden separar al existir, en general, una relación

Cro

mat

ogra

fía d

e af

inid

ad

La cromatografía de afinidad separa las proteínas

(analitos) en función de su

especificidad de fijación de ligandos.

Los ligandos de afinidad son moléculas poliméricas

que sirven de soporte porque están unidas

covalentemente sobre la columna cromatográfica o matriz inerte que debe de tener una estructura de

poro abierta y estabilidad en condiciones de cambio de pH, detergentes y agentes

disociantes, para así, retener y adsorber

específicamente a las proteínas, la fase

estacionaria es sólida.

Lafase móvil de la

cromatografia por afinidad tiene dos funciones

distintas; debe favorecer el enlace fuerte de las

moléculas del analito con el ligando y una vez

retiradas las especies no deseadas, la fase móvil

debedebilitar o eliminar la interacción analito-

ligando, de modo que sea posible la elución

del analito.

Sólido, como la agarosa, o un lecho de vidrio poroso, en el cual se inmoviliza el

ligando de afinidad.

Casi todas las aplicaciones de la cromatografía de afinidad inciden en el campo de la Bioquímica, donde se utilizan las interacciones específicas en las que están implicados enzimas y sustratos o coenzimas, anticuerpos y antígenos, receptores y hormonas,

etc.

Cro

mat

ogra

fía q

uira

l La cromatografía quiral se basa en la separación de

determinados enantíomeros contenidos en

una mezcla racémica

aunque hay diversos

Las partículas de relleno de silica utilizadas para la producción de fases

quirales tienen un diámetro entre 3 y 5 Pm y el tamaño

de poro se encuentra comprendido entre 100 y

200 A. La separación enantioselectiva en CSPs

está basada

Disolventes o aditivos quirales

Fases de intercambio de ligando quirales: fases de

afinidad; fases poleméricas helicoidales; fases de

cavidad; fases de tipo Pikle

Separación de enantiómeros. Las principales aplicaciones e encuentran en la industria farmacéutica donde los compuestos quirales tienen diferentes

actividades biológicas en un organismo, la adecuada separación

de estos compuestos es de vital importancia en esta industria

4



CROMATOGRAFÍA HPLC


métodos de separación de compuestos quirales se

considera que los métodos

fundamentalmente en las diferencias energéticas

entre los diasteroisómeros formados temporalmente

por interacciones entre los enantiómeros del analito y

33. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

A continuación se presenta de manera resumida las principales ventajas y desventajas de la cromatografía de líquidos de alta resolución.

VENTAJAS DESVENTAJAS

- Proceso automático- Alta velocidad, toma sólo unos

pocos minutos para producir el resultado.

- A comparación con la cromatografía de líquidos que utiliza la gravedad la tecnología HPLC utiliza una bomba de alta velocidad para forzar compuestos a través de un tubo densamente empaquetado.

- Diversidad de aplicaciones- Los resultados obtenidos son

de alta resolución.- Tiene gran reproducibilidad de

resultados con la facilidad de un proceso automatizado.

- Dificultad de detectar la coelución (dos compuestos que escapan de la tubería a la vez), lo que puede dar a la categorización de compuesto incorrecto.

- Alto costo del equipo.- Su funcionamiento puede ser

complejo y requiere de un técnico entrenado para operar.

- Debido a la velocidad del proceso, el equipo tiene una baja sensibilidad a algunos compuestos

Con esta técnica es usual obtener separaciones en minutos e inclusive en algunos casos en segundos. Por lo tanto se requieren columnas de alta eficacia y sistemas de bombeo de alta presión, ya que las separaciones rápidas requieren de flujos rápidos de fase móvil y esto a su vez requiere presiones elevadas. Su resolución permite obtener y separar mezclas complejas; como algunos fluidos biológicos es el caso de la orina humana.

Los métodos de HPLC proporcionan información de tipo cualitativo, de gran precisión y sensibilidad.

Entre las ventajas de esta técnica, la más importante es la diversidad de sus aplicaciones tanto en compuestos orgánicos como inorgánicos. Las únicas muestras que no son susceptibles de poderse analizar con facilidad son las gaseosas.

Teniendo en cuenta sus limitaciones, el instrumental es costoso y representa una gran inversión para los laboratorios, otra limitación es que el personal que utiliza estos métodos tenga experiencia para poder operar el equipo, lo cual

1



requiere de 6 a 12 meses de experiencia para que llegue a ser eficiente. (Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2009)

34. COMPARACIÓN DE LA TÉCNICA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN CON OTRAS TÉCNICAS CONVENCIONALES

Modalidad clásica

Es un proceso lento Es un proceso poco eficaz tanto por la capacidad de separación,

como por el número de solutos que se pueden separar. Es una técnica laboriosa No proporciona directamente la composición de las fracciones Solo se pueden separar muestras del orden de gramos a mg.

Cromatografía Moderna

Aumentar la eficacia de la separación Se reduce el tiempo de separación Permite acoplar un sistema de detección continuo a la salida de la

columna, (online). Permite separar sustancias que estén en el orden de los μg.

Comparación de la cromatografía líquida de alta resolución y la cromatografía de gases.

COMPARACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN FRENTE A LA CROMATOGRAFÍA DE GAS LÍQUIDO

CARACTERÍSTICAS DE AMBOS MÉTODOS

VENTAJAS DE LA HPLC VENTAJAS DE LA CG

Efectivos, muy selectivos y de aplicación amplia

Sólo se requiere una pequeña muestra

Suelen ser no destructivos con la muestra

De fácil adaptación al análisis cuantitativo

Pueden usarse con compuestos no volátiles ni termoestables

Aplicable en general a iones orgánicos

Equipo sencillo y de bajo costo

Rapidez Resolución no igualable

(con columnas capilares)

Es fácil establecer la interface en la espectrometría de masas

Fuente. (Douglas A. Skoog, 2005)

2



BIBLIOGRAFÍA

Douglas A. Skoog, D. M. (2005). Fundamentos de química analítica. Octava edición. International Thomson Editores S.A.

Harris, D. C. (s.f.). Análisi químico cuantitativo. Iberoamérica.Museo Nacional de Ciencias Naturales, M. (s.f.). Museo Nacional de ciencias

Naturales. Recuperado el 2 de Mayo de 2013, de http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio//es_ES//investigacion/cromatografia/cromatografia_liquida_de_alta_eficacia.pdf

UNIÓN INTERNACIONAL DE QUÍMICA PURA Y APLICADA, D. D. (16 de Febrero de 1995). Sociedad Española de Cromatografía y Técnicas Afines. Recuperado el 12 de Mayo de 2013, de http://www.secyta.org/secyta/documentos/nomenclatura/Libro_Completo_Nomenclatura.pdf

Universidad Nacional Mayor de San Marcos, (. d. (2009). Scribd. com. Recuperado el 4 de Julio de 2013, de http://es.scribd.com/doc/17065477/HPLC-Aplicaciones-en-compuestos-organicos

Documento Guía Teórica Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución. Hplc

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