CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS

DE ALTA RESOLUCIÓN

HPLC High Performance Liquid

Chromatograpy

Comparación HPLC y CG

Volatilidad de la muestra

HPLC

oLa volatilidad no es necesaria

oLa muestras deben ser solubles en la fase

móvil

CG

oLa muestra debe ser volátil

oBajo PM

C.L.S. adsorción

C:L:L: Reparto

Cromatografía líquida

Fase Normal

•Fase Estacionaria polar

•Fase Móvil no polar a lo polar

incremento de la fuerza

eluotrópica

pigmentos separados

Fase Reversa

FE no polar

FM polar a lo no polar incremento

de la fuerza eluotrópica

Hidrófilo

Hidrófobo

Ácidos

carboxílicos

volátiles

Sulfonamidas

Cetonas de

aldehídos

Glifosatos

Aminoácidos Iones inorgánicos

Colorantes

alimentarios

sintéticos

Azúcares Alcoholes de

azúcares

Enzimas

PG, OG, DG

fenoles Glicoles

Nitrilos

Nitrosamina

BHT (butilhidroxitolueno),

BHA (butilhidroxianisol),

THBO antioxidantes

Ácidos grasos

Aflatoxinas

Antibióticos

Flavonoides

Colorantes alim. naturales

Vitaminas solubles en grasas

Anabólicos PAHs

Aminas aromáticas

Alcohol Pesticidas

organofósforos TMS derivado

de azúcares

Epóxidos Aceites esenciales

PCB

Monómeros de polímero Triglicéridos Fosfolípidos

C2/C5 hidrocarburos Metiléster

ácidos grasos Ésteres aromáticos

Volátil No volátil Volatilidad

Polaridad

6

HPLC Isocrático

Bomba

Inyector

Columna

Registrador

Electrometro

Detector

Solvente

Solventes

• Pureza – Grado HPLC

• Filtración – Poro de 0.45 micras

– Nylon

– Teflón

• Desgacificación

Bombas

Se requiere de una bomba que de

una presión alta para forzar al

líquido a pasar por la columna a

una velocidad satisfactoria.

Debe mantener el flujo constante

durante períodos relativamente

largos.

Las Bombas de Pistón dual

INJECTORES

Columnas

acero inoxidable (soportan presiones

hasta 5000 psi)

Diámetro de 1 a 6 mm

Longitud de 10 a 30 cm

El soportes para la fase líquida

tierra de diatomeas, zipax o corasil

Columnas de HPLC

Columna

analítica

Fase móvil

desde la bomba

Precolumna Muestreador

Al detector

Actúa sobre la muestra para

atrapar partículas y

componentes de muestras

retenidos con fuerza.

Las columnas varían en los siguientes aspectos:

• Longitud

• Diámetro interno

• Material de la fase estacionaria

• Tamaño de partícula de la fase estacionaria

La columna

analítica lleva

a cabo la

separación.

17

Columna - Acero inoxidable

estándar

Capilar

Frita de filtro de

acero inoxidable

Tamaño de poro de 2

um

Relleno de

columna

18

Materiales de relleno de columnas -

Sílice

Soles de sílice Xerogeles

Esférico

Irregular Las partículas tienen un diámetro de

3 a 10 mm en las columnas estándar.

19

Materiales de relleno de columnas -

Fases enlazadas

Si R1

R2

Si CH3 H3C

O

O

Si

O O

OH

Poros

Si-OH + Cl-Si-R Si-O-Si-R + HCl

R1

R2

Fase enlazada monomérica

Cadena de carbono

con forma de cepillo

20

Materiales de relleno de columnas - Fases

enlazadas extensamente utilizadas

CH3

|

-0-Si- R

|

CH3

HPLC de fase inversa •C18

•C8

•C4

•C1

•Fenilo

Las columnas de HPLC más utilizadas

Separaciones de proteínas

Dipolo débil - dipolo inducido

Interacciones con analitos polares

HPLC de fase normal o inversa • CN

• NH2

HPLC de fase normal • Diol Separaciones de compuestos con

polaridades muy diferentes

Polaridad intermedia

Intercambio iónico

DEAE (dietilaminoetanol)

QAE (aminoetilo cuaternario)

Carboximetilo

Exclusión de tamaño

Glicerilpropilo

21

Materiales de relleno de columnas Rendimiento

mejorado de desoxinucleósidos utilizando fase

enlazada óptima

mAU

-4

0

4

8

12

DAD1 A, Sig=254,16 Ref=360,100 (H:\NUKE\NUKE0061.D)

min0 2 4 6 8

mAU

0

10

20

30

40

DAD1 A, Sig=254,16 Ref=360,100 (H:\NUKE\NUKE0056.D)

G

C A

T Zorbax SB-C18

92% A : 8% B

6 min

2 min

Zorbax SB-CN 97,5% A : 2,5% B

G

C A

T

LC: HP1090

Columnas: 4,6 x 50

mm, 3,5 µM

Flujo: 1,0 ml / min.

A: 0,1% TFA

B: 90% MeOH:

10% H2O (0,1%

TFA)

Temp.: 30 °C

Detec.: 254 nm

22

Materiales de relleno de columnas -

Soportes de polímeros

Admiten:

l Fase normal e inversa

l Intercambiadores iónicos

l Cromatografía por exclusión de tamaño

CH = CH 2

+

- CH2 - CH - CH-2 - CH - CHC2 - CH - CH22 - -

Estireno Divinil benceno

- CH2 - CH - CH-2 - CH - CHC2 - CH - CH22 - -

CH = CH 2

CH = CH 2

Estireno-divinilbenceno

23

Tamaño de partícula - Efecto en la

eficacia

Fase móvil, 20% ACN/80% acuosa, 0,1% TFA

Columnas Zorbax SB-C8; d.i. de columna, 4,6 mm; ciprofloxacina; 22 °C

3 -µm

5 -µm

10 -µm Velocidad de flujo

N

Teórico

Velocidad de flujo de la fase móvil, ml/min

Núm

ero

de

pla

tos/

met

ro/1

03

24

Número aproximado de platos (N) y volumen

vacío (Vm) para columnas de 5 mm y 3,5 mm Si se reducen simultáneamente la longitud de la columna

(N ) y el tamaño de partícula (N ), se podrá:

◦ Mantener la resolución

◦ Reducir el tiempo de análisis

◦ Reducir el uso de disolventes

Tamaño de la

columna Tamaño de partícula

Número de platos

(N)

Volumen vacío

(V m )

4,6 x 250 mm 5- m m 20.000 2,5 ml

4,6 x 150 mm 5- m m 12.000 1,5 ml

4,6 x 150 mm 3.5- m m Resolución rápida 20.000 1,5 ml

4,6 x 75 mm 3.5- m m Resolución rápida 10.000 0,75 ml

4,6 x 50 mm 3.5- m m Resolución rápida 6.000 0,5 ml

4,6 x 30 mm 3.5- m m Resolución rápida 3.600 0,3 ml

4,6 x 15 mm 3.5- m m Resolución rápida 2.000 0,15 ml

25

Aumentar la velocidad de análisis

mientras se mantiene la resolución

Dimensiones 250 x 4,6 mm 150 x 4,6mm 150 x 4,6 mm 75 x 4,6 mm

Tiempo de análisis (min)

30 min 18 min 18 min 9 min

Residuo de disolvente (ml)

30 ml 18 ml 18 ml 9 ml

N 20.000 20.000 12.000 10.000

5 mm 3,5 mm 5 mm 3,5 mm

40%

Reducción

40%

Reducción

Sin modificar 9% de diferencia

50%

Reducción

50%

Reducción

26

Conseguir todo el potencial con

mayor velocidad de flujo mAU

0 100 200 300

mAU

0 100 200 300

min 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0.6 0.7 0.8 0,9

mAU

0 100 200 300

0

Velocidad

de flujo

3 ml/min

2 ml/min

4 ml/min

Zorbax SB-C18, 3,5 µm, 4,6 x 30 mm

90 bar

133 bar

181 bar

Presión

30 seg

Rs2,1 = 2,1

Rs2,1 = 2,2

Rs7,6 = 2,2

Rs7,6 = 2,2

27

Columnas con diámetro interno pequeño y muy pequeño

Ventajas:

Consumo reducido de disolvente.

Idóneas para análisis de trazas si la cantidad

de muestra es limitado.

Fácil conversión de velocidad de flujo para

cambiar el método de columna analítica a

columna de diámetro muy pequeño.

Inconvenientes:

La instrumentación debe tener un

volumen externo a la columna muy bajo.

Las fritas se deben cambiar con más

frecuencia.

Convencional

Diámetro interno

muy pequeño

4,6 mm

4,6 mm

2,1 mm

d = 10 dmm p

0 2 4 6 8 10

1,00 ml/min

0 4 6 8 10

0,01 ml/min

2

o

1,0 mm 100 mm 200 mm

d = 5 dmm p

d = 5 dmm p

28

Velocidades de flujo típicas d.i. de columna

(partículas de

5

mm )

Flujo

ml/min 4,6 1 –2

3,0 0,4 - 0,8

2,1 0,2 – 0,4

1,0 0,05 – 0,09

29

Longitud de columna - Adaptar la

longitud a la resolución deseada DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0035.D)

DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0032.D)

DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0037.D)

DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0027.D)

DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0038.D)

min0 1 2 3 4 5 6 7 8

Adso

rba

nce

4,6 x 15 mm

4,6 x 30 mm

4,6 x 50 mm

4,6 x 75 mm

4,6 x 150 mm

Ab

sorb

an

cia

SB-C18

Condiciones: LC: Hewlett-Packard HP1100

Columnas: Zorbax SB-C18, 3,5 µm

Fase móvil: 1 mM octano ácido sulfónico, Na sal, pH 2,5: ACN (80:20)

UV: 275 nm; flujo: 2,0 ml / min.; 70 °C

Vol. de inyección: 1 µl

Muestra:

1. Acetoaminofeno (4-acetoamidofenol)

2. Cafeína

3. 2-Ac2-Acetoamidofenol

4. Acetanilida

5. Aspirina (ácido acetilsalicílico)

6. Ácido salicílico

7. Fenacetina (acetofenetidina)

1 2 3 4

5 6 7

los 7 componentes se descomponen en menos de 1 min

30