CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA
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CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA
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CROMATOGRAFÍA
LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA
High Performance Liquid Chromatography
¿Qué significa HPLC?
Originalmente…
Ahora…
eficiencia
High Pressure Liquid Chromatography
Bandas finas
Automatización de la cromatografía
líquida tradicional.
Se logran mejores separaciones en
períodos de tiempo más cortos, utilizando:
partículas de relleno muy pequeñas
columnas de pequeño diámetro
alta presión de fluído
Cromatografía líquida de alta eficiencia
Características
Presiones de 1000 - 6000 psi (pounds square inch
= libras por pulgada cuadrada, 1 atm = psi/14.7)
Partículas de relleno muy pequeñas (< 10 mm)
Ventajas
Rápida
Bandas angostas (alta eficiencia)
Separa compuestos no-volátiles o térmicamente
inestables
Desventajas
Necesita operador entrenado
Utiliza gran cantidad de solventes orgánicos
Cromatografía líquida de alta eficiencia
La fase móvil es líquida
Partición o reparto
Adsorción
Intercambio iónico
Exclusión molecular
Según la
naturaleza
de la FE
Cromatografía líquida de alta eficiencia
BOMBA
INYECTOR
CÁMARA DE
MEZCLA
PRE-COLUMNA
DETECTOR
COLUMNA
Esquema del equipo de HPLC
Deben ser herméticos para evitar:
Evaporación del solvente (cambios en los
tiempos de retención)
Solubilización de gases atmosféricos (oxígeno)
Reservorios
de fase móvil
Fase móvil (solvente)
La FM puede modificar la selectividad de las
separaciones (diferencia con CG) Alto grado de pureza
Debe solubilizar completamente a la muestra.
Evitar precipitación en inyector o en columna.
Puede quedar el sistema bloqueado o arruinarse
la columna en forma irreversible
Fase móvil (solvente)
Baja reactividad: con la muestra y/o FE
Compatibilidad con el detector utilizado (de
absorción, fluorescencia, electroquímicos,
espectrómetro de masa, etc)
Baja viscosidad
Se usan: solventes orgánicos, agua/solventes
miscibles, agua/soluciones reguladoras
6
210
pd
µLP
Fase móvil (solvente)
Sistema más utilizado: REPARTO
• Fase normal
hexano, diclorometano; isopropanol; metanol
• Fase reversa
agua, metanol, acetonitrilo, tetrahidrofurano
Fase móvil (solvente)
Aumento fuerza de elución
Reacciones entre gases y componentes de
la muestra.
Las burbujas producen oscilaciones de
presión → irregularidades en el flujo →
fluctuaciones en la respuesta del detector →
cambio en la línea base y/o señales parásitas
(se afecta la reproducibilidad).
La fase móvil no debe contener gases disueltos
Fase móvil (solvente)
Desgasificación
Tratamiento con He
Sistema de desgasificación al vacío
Filtración
He
Fase móvil (solvente)
Elución con
gradiente Elución
isocrática
Elución isocrática: solvente de composición constante.
Elución con gradiente: solventes de distinta polaridad.
Se varía la composición de la FM en forma continua o
escalonada.
Elución isocrática vs elución con gradiente
Elución isocrática:
solvente de composición constante.
B=acetonitrilo
Elución isocrática vs elución con gradiente
Elución en gradiente:
solventes de distinta polaridad. Se varía la
composición de la FM en forma continua o escalonada.
Elución isocrática vs elución con gradiente
Sistemas de bombeo
Requerimientos
Generación de altas presiones (1000 - 6000 psi)
Flujo libre de pulsaciones
Caudales 0.1 – 10 mL/min
Componentes resistentes a la corrosión (acero
inoxidable, teflón)
Bomba recíproca o de movimiento alternado
etapa de aspiración
pistón
fase móvil
etapa de descarga
hacia la
columna
Ventajas: pequeño volumen interno, resiste presiones > a
10.000 psi, permite elución con gradiente, caudales
constantes e independientes de la contrapresión de la
columna y la viscosidad del solvente
Desventaja: produce flujo pulsado (amortiguar)
Bomba recíproca de doble pistón
Comparación de las líneas de base
Bomba de pistón simple
Bomba de doble pistón
Bomba isocrática marca Waters
Sistemas de inyección de muestra
eluyente
Llenado del bucle Inyección de
muestra en
columna
columna
eluyente
columna
muestra
Sistemas de inyección de muestra
Inyección manual versus inyección automática
> precisión
Composición similar a la columna cromatográfica
Elimina materia en suspensión y componentes de
la muestra que se unen irreversiblemente a la FE
Se usa para mejorar la vida de la columna. Se
reemplaza cuando se contamina.
Precolumna
Tubos de acero inoxidable. Ocasionalmente
de vidrio resistente
Rectas (10 - 30 cm de longitud) y 4-10 mm d.i.
Tamaño partículas de relleno: 5–10 mm
Columnas termostatizadas: en general se
trabaja a T ambiente. La T constante mejora el
cromatograma
Columna
Columna
Columna Rellenos Relleno pelicular. Esferas de vidrio o
polímero no porosas de 30–40 µm de
diámetro. En la superficie de las esferas
se encuentra la fase estacionaria: fase
ligada, grupos silanol (adsorción),
grupos intercambiadores de iones
Relleno de partículas porosas.
Micropartículas porosas de sílica,
alúmina o polímero de 3–10 µm de
diámetro. La superficie externa de la
partícula y los poros están recubiertos
con fase estacionaria
Columna
Partículas superficialmente
porosas Partículas porosas
↓ Resistencia
transferencia de masa
↑ EFICIENCIA
Alta permeabilidad axial (interconectividad) → baja
contrapresión (rápida transferencia de masa y rápidas
separaciones)
Matriz sólida continua, de naturaleza porosa, que contiene
pasos de flujo interconectados.
Columna
Columnas monolíticas: se fabrican con fases homogéneamente
continuas y no con partículas individuales y pueden fabricarse
con base polimérica o sílice.
Basados en la medida de una propiedad del
eluyente (índice de refracción, constante
dieléctrica, densidad)
Basados en la medida de una propiedad del soluto
(absorbancia, fluorescencia, corriente límite)
Requisitos
Sensibilidad adecuada
Respuesta lineal amplia
Respuesta rápida y reproducible
Manejo sencillo
Detectores
Detectores
De la columna
Detector Fuente UV
Al desecho
Ventanas
de cuarzo
De la columna
Detector Fuente UV
Al desecho
Ventanas
de cuarzo
De la columna
Detector Fuente UV
Al desecho
Ventanas
de cuarzo
De la columna
Detector Fuente UV
Al desecho
Ventanas
de cuarzo
De la columna
Detector Fuente UV
Al desecho
Ventanas
de cuarzo
Celda del detector UV-visible en HPLC
Eficiencia de la columna
Tamaño
partículas
de
empaque
Tamaño
de
muestra
Ensanchamiento
extracolumna
10 mm
5 mm
3 mm
H
m (cm/min)
H vs m para partículas de diferentes diámetros
Tamaño de muestra
adsorción
L-L (k = 2.3)
fase ligada (k = 4.3)
fase ligada (k = 1.2)
H
mg muestra/g empaque
De acuerdo al
tipo de FE el
efecto es más
o menos
pronunciado
Ensanchamiento extracolumna
pr2m
24 DM Hex =
Se origina en los tubos que conectan los
componentes del sistema cromatográfico (puerto de
inyección y columna, columna y detector, etc.)
coeficiente de difusión del
soluto en fase móvil [cm2/s]
radio del tubo [cm] velocidad lineal de
FM [cm/s]
CROMATOGRAFÍA DE GASES
La fase móvil es gaseosa
Partición gas-líquido
Adsorción
Cromatografía de gases
Compuestos que pueden ser analizados
Compuestos con puntos de vaporización bajos (≤ 250 °C)
Compuestos que al ser pirolizados producen un producto
de descomposición cuya concentración se relaciona
proporcionalmente con el compuesto original
Compuestos que pueden ser “derivatizados” en un
producto que tenga un punto de vaporización ≤ 250 °C
Compuestos que pueden analizarse “indirectamente”
mediante alguna reacción química
Cromatografía de gases
Cromatógrafo de gases
Esquema de un cromatógrafo de gases
cromatografía de elución
MEDIDORES DE
PRESIÓN Y
CAUDAL
GAS PORTADOR
- No interactivo
- Químicamente inerte
- De alta pureza
-Debe ser compatible con el detector
Fase móvil: Gas portador
Ejemplos: Helio, hidrógeno, argón, nitrógeno
DETECTOR GAS PORTADOR
Conductividad térmica Helio
Ionización de llama Helio, nitrógeno
Captura electrónica Nitrógeno seco, argon
FLUJOS
25 – 250 mL/min (columnas empacadas) y
< 5 mL/min (columnas capilares)
Fase móvil: Gas portador
Puertos de inyección (columnas capilares)
Inyección
con división
Inyección
sin división
Inyección
en columna
0.5-5 mL
Puerto de inyección (columnas rellenas)
HORNO
Controla la temperatura a la cual se lleva a cabo la cromatografía
Efecto de la temperatura en el cromatograma
Isotérmica a 45 °C
Isotérmica a 145 °C
Programada
Columnas
tubulares abiertas
(capilares)
Columnas
rellenas
Columnas
Rellenas
Capilares: diámetro interno 100-250 μm
WCOT (wall-coated open tubular): pared recubierta
SCOT (support-coated open tubular): soporte recubierto
FSOT (fused-silica open tubular): sílica fundida
PLOT (porous layer open tubular): capa porosa
Columnas macrocapilares (megabore):
diámetro interno 530 μm
Columnas
Columnas tubulares abiertas (capilares)
Columnas
PLOT
SCOT WCOT
FSOT
Capilares vs. empacadas
Abiertas
• Ventajas
– Alta resolución
– Alta eficiencia (N)
– Cortos tiempos de análisis
– Alta sensibilidad
• Desventajas
– Baja capacidad de carga
– Elevado costo
– Columnas más frágiles
Empacadas
• Ventajas
– Alta capacidad de carga
– Bajo costo
– Resistente
• Desventajas
– El largo finito limita R y N
– No compatible con algunos detectores
Columnas
Fundamento de la separación
- Polaridad de la fase estacionaria y del analito - Volatilidad relativa del analito
Cromatografía gas-sólido
Cromatografía gas-líquido
Fuerzas adsortivas
Partición gas-líquido
FE no-polar poli(dimetilsiloxano)
CG de 10 compuestos en FEs de distintas polaridades
Los compuestos aparecen casi en orden creciente de sus
puntos de ebullición. El determinante principal de la retención
en esta columna es la volatilidad de los compuestos
69
117
102
98
138
126
hexano
butanol
3-pentanona
heptano
pentanol
octano
5
6
7
8
9
10
80 metil etil cetona 4
97 propanol 3
36 pentano 2
56 acetona 1
PE (°C) Compuesto
La FE muy polar retiene los solutos polares. Los primeros que se eluyen son
los 4 alcanos, le siguen las 3 cetonas y por último los 3 alcoholes. La fuerza
determinante de la retención es el enlace de hidrógeno con la FE.
propanol butanol pentanol
FE polar poli(etilenglicol)
69
117
102
98
138
126
hexano
butanol
3-pentanona
heptano
pentanol
octano
5
6
7
8
9
10
80 metil etil cetona 4
97 propanol 3
36 pentano 2
56 acetona 1
PE (°C) Compuesto alcanos
cetonas
CG de 10 compuestos en FEs de distintas polaridades
Detector de conductividad térmica (TCD)
DETECTORES
Detector de ionización de llama (FID)
terminal de la columna
gas portador
H2
aire
llama
electrodo colector
DETECTORES
Detector de captura electrónica
(63Ni, 90Sr)
aislante
de la columna al desecho
emisor radiactivo b
+ electrodo
- electrodo
DETECTORES
CONDUCTIVIDAD
TÉRMICA
IONIZACIÓN
DE LLAMA
CAPTURA
ELECTRÓNICA
COMPUESTOS Orgánicos e
inorgánicos. Algunos
dañan los filamentos
(HCl, Cl2, haluros de
alquilo)
Orgánicos.
No responde
a CO, CO2,
SO2, H2O
Con átomos
electronegat.(halu
ros de alquilo,
organometálicos,
organofosforados)
GAS PORTADOR H2, He N2, He N2, Ar
SENSIBILIDAD Moderada Muy buena Muy buena
LINEALIDAD Buena Amplia Limitada
TEMPERATURA
LÍMITE
400 °C 400 °C 225 °C (3H, tritio)
350 °C (63Ni)
OTROS No destructivo.
Afectado por
variaciones de
temperatura y caudal
Destructivo,
requiere 3
gases y
electrómetro
No destructivo,
requiere licencia,
muestras secas y
electrómetro
Análisis cuantitativo en CL y CG
Área S
[S] [S]/[P]
Área S Área P
Uso de patrones
externo e interno
S P S
Uso de patrón externo
Área Sx
Sx
Área Sx
Área P
Sx
P
CROMATOGRAFÍA ACOPLADA A
ESPECTROMETRÍA DE MASAS
Un espectrómetro de masas acoplado a un
cromatógrafo líquido o a un cromatógrafo de gases es
un potente detector para análisis cualitativo y
cuantitativo
La espectrometría de masas se basa en ionizar
moléculas gaseosas, acelerarlas en un campo
eléctrico y separarlas de acuerdo a sus masas
Un espectro de masas es un gráfico que muestra la
abundancia relativa de cada fragmento que llega al
detector de un espectrómetro de masas
