CROMATOGRAFÍA

SEPARAR-IDENTIFICAR-CUANTIFICAR

Permite separar analitos muy similares en sus propiedades físicas y químicas.

Preguntas que puedo resolver con una cromatografía:

1- ¿Qué alcoholes y en qué concentración tiene un vino?

2- ¿Hay residuos de pesticidas en las cáscaras de naranjas?

3- ¿Qué cantidad de proteínas formadoras de gluten tienenlos granos de trigo? (gluteninas y gliadinas)

Enfermedades

fúngicas

Generalidades de cromatografía

Cromatografía:

Fase estacionaria

Fase móvil

Soporte

Generalidades de cromatografía

Fase estacionaria contenida en un soporte

Se coloca la muestra en un extremo:punto de Inyección de la muestrapunto de siembra de la muestra

Muestra: dos analitos muy similares que necesito separar

Descripción general de una cromatografía

Generalidades de cromatografía

Fase estacionaria contenida en un soporte

Fase móvil: circula atravesando la fase estacionaria y empuja a la muestra

Descripción general de una cromatografía

Generalidades de cromatografía

Fase estacionaria contenida en un soporte

Fase móvil: circula atravesando la fase estacionaria y empuja a la muestra

Descripción general de una cromatografía

https://www.youtube.com/watch?v=WO0OsxaPYs8Video de divulgación científica

Generalidades de cromatografía

FASE ESTACIONARIA (FE): fija en un soporte sólida o líquida gaseosa cuanto más homogénea sea , más eficiente será la cromatografía

FASE MÓVIL (FM): «empuja» a la muestra a través de la fase estacionaria líquida o gaseosa sólida

FM líquido: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDAFM gas: CROMATOGRAFÍA GASEOSA

la eficiencia de la cromatografía se relaciona con la velocidad de FM

SOPORTE: cromatografía plana: vidrio, vidrio con un sólido molido en su superficie (capa fina); papelcromatografía en columna: vidrio; vidrio con relleno sólido; capilares

1- Toda cromatografía pone en contacto dos fases inmiscibles.2- La FM «empuja» a los analitos atravesando la FE.

3- Los analitos se desplazan a diferentes velocidades dependiendo de su afinidad por cada fase.

Generalidades de cromatografía

Clasificación de las cromatografías según el estado de agregación de las fases:

Fase móvil Fase estacionaria Cromatografía

Gas Liquida CGL

Sólida CGS

Líquida Liquida CLL

Sólida CSL

Clasificación de las cromatografías según el soporte que contiene a la fase estacionaria:

PLANA COLUMNA

Placa de vidrio con un sólido finamente molido en su superficie

Tubo de vidrio relleno con un sólido finamente molido

Papel Whatman N°1 Capilar

Generalidades de cromatografía

Clasificación de las cromatografías según el proceso fisicoquímico que se pone en juego para la separación de analitos (mecanismo de separación):

Nombre Algunas características

C. de Adsorción FE sólida y FM líquido / gasDiferencias en la polaridad

C. de Reparto FE líquido y FM líquido / gas Diferencias en la polaridad

C. de intercambio iónico FE resina (sólido) con grupos cargados unidos covalentemente. FM líquidoReacción entre iones de carga opuesta.

C. de Exclusión molecular FE gel porosoFM líquido / gasTamaños

C. de Afinidad FE especialmente diseñada para atrapar a un analito particular. Muy selectiva

Trabajo

práctico

Trabajo

práctico

Generalidades de cromatografía

Cromatografía de reparto:

Los analitos se reparten entre dos líquidos inmiscibles (fase estacionaria y fase móvil) según la polaridad de cada analito y la polaridad de cada una de las fases.

Fase normal: FE polar FM apolar (lo van a usar en cromatografía de papel)

Fase reversa: FE apolar FM polar

Fase estacionaria: agua (retiene analitos polares)

Fase móvil: solvente (lleva con facilidad a los analitos menos polares)

Generalidades de cromatografía

Cromatografía de intercambio iónico

FE: resina con carga positivaIntercambiadora de aniones

cationes

aniones

FE: resina con carga negativaIntercambiadora de cationes

Trabajo práctico

Fase estacionaria puede ser: Resina con grupos sulfónicos (cargas negativas)

Resina con aminas cuaternarias (cargas positivas)

Generalidades de cromatografía

C. PLANA

C. COLUMNA

Generalidades de cromatografía

CROMATOGRAFÍA PLANA

Cromatografía en capa finaSólido finamente molido y acomodado uniformemente sobre una placa de vidrio, aluminio o plástico.(Sólido seco o sólido con una mínima película de líquido)

Cromatografía en papelPapel secoPapel con una película mínima de líquido impregnada

Frente de la

fase móvil

Línea de

siembra

Fase móvil

(líquido)

Soporte Frente de la

fase móvil

Línea de

siembra

Parámetro

Rf: RELACIÓN DE FRENTES

Rf= distancia recorrida por el analito/distancia

recorrida por la fase móvil

Rfx=dx/dFM

CROMATOGRAFÍA PLANA

REVELADO: permite poner en evidencia donde

quedó cada uno de los analitos separados

C. plana ascendente

Fase estacionaria????

Cromatografía de reparto:

Los analitos se reparten entre dos líquidos inmiscibles (fase estacionaria y fase móvil) según la polaridad de cada analito y la polaridad de cada una de las fases.

FE polar FM apolar (lo van a usar en cromatografía de papel)

Fase estacionaria: agua (retiene analitos polares)

Fase móvil: solvente (lleva con facilidad a los analitos menos polares)

Generalidades de cromatografía

Ejemplos de cromatografía plana

Pigmentos de hojas de espinaca

Pigmentos de cáscara de mandarinas

Frente de la

fase móvil

Línea de

siembra

Parámetro

Rf: RELACIÓN DE FRENTES

Rf= distancia recorrida por el

analito/distancia recorrida por la fase

móvil

Rfx=dx/dFM

CROMATOGRAFÍA PLANA

0 ≤ Rf ≤ 1

Si la FE polar y la FM no polar entonces valores bajos de Rf para analitos polares y valores altos de Rf para analitos no polares.

RF como criterio de identificación

Solución X(mm) Y(mm) Rf

Maltosa 20 144 0,1388

Glucosa 30 144 0,2083

Sacarosa 25 144 0,1736

Fructosa 33 144 0,2292

JUGO25,429,7

1440,17630,2062Malt Gluc Sac Fruc JUGO

Placa de vidrio (soporte) con silicagel(FE)FM:butanol-acético-aguaRevelado: resorcinol (universal para azúcares)

Línea de siembra

Frente del solvente

Y

X

Rf como criterio de NO IDENTIDAD

Cromatografía plana para detectar un pesticida P en cáscaras de naranjas:

1- En el sistema cromatográfico utilizado el pesticida P tiene un Rf= 0,60

2- Preparo los extractos de cáscaras de naranja que voy a controlar

3- Siembro en una cromatografía plana los extractos preparados y un patrón conocido del pesticida P

Interpretación:

frente de FM

Línea de siembra

P N1 N2 N3 N4

Rf= 0,6Posible presencia del Pesticida P (debo confirmar)

N2 y N3 están libres de Pesticida P

Problema para resolver:

La tabla muestra los resultados de Rf obtenidos para muestras de hojas de avena de distintos lotes (A1, A2 y A3) derivados de una cromatografía en capa fina para analizar la presencia de un compuesto tóxico (T). En las hojas de avena de cada lote se encontraron más de un compuesto separado (más de un dato de Rf en la tabla). A)Explique el significado de Rf y sus valores extremos. B) En base a los resultados obtenidos qué conclusión puede obtener respecto a los lotes de avena? Justifique. C) Si la Fase estacionaria utilizada es polar y la fase móvil es un solvente de baja polaridad, los compuestos obtenidos en el lote 2 son más polares o menos polares que el compuesto T? Justifique.

Muestra Rfs

Compuesto T 0,68

Avena lote 1 0,27

0,69

0,78

Avena lote 2 0,25

0,54

Avena lote 3 0,34

0,67

https://www.youtube.com/watch?v=g71IWP2O5pgVideo de cromatografía en capa fina, adsorción.

Fase estacionaria

Fase móvil

Soporte: columna

muestra(A y B)

Cromatografía en columna

Parámetro en función del tiempo

tr: TIEMPO DE RETENCIÓN

tr neto= tr-t0

t0: tiempo muerto de la columna

ELUCIÓN

A B

FM= eluyente

Fase estacionaria

Fase móvil

Soporte: columna

muestra(A y B)

Parámetro en función del

volumen de fase móvil que

circuló por la columna

Vr: VOLUMEN DE RETENCIÓN

Vr neto= Vr-V0

V0: volumen muerto de la columna

Cromatografía en columna

ELUCIÓN

A B

FM= eluyente

Cromatógrafo gaseoso

FM: gas

Tubos de gas y válvulas

reguladoras de presión

https://www.youtube.com/watch?v=9nYpjtRx0Zs

Detector de CG: Conductividad térmicaFID (detector de ignición a la llama)

Componentes de un cromatógrafo gaseoso

Cromatógrafo HPLC (cromatografía líquida)

Detectores CL: índice de refracción; espectrofotometría UV-Vis.

Componentes de un HPLC (cromatógrafo líquido de alta resolución)

Reservorio de fase móvil

Ejemplos de cromatogramas registrados en un cromatógrafo

Señ

al d

el d

etec

tor

Tiempo

Separación cromatográfica de una mezcla de aminoácidos

tr corresponde al tiempo en el que se presenta el máximo de cada pico.

Comparación de la composición de ácidos grasos de distintos aceites

Columna rellena, 10 cm de largo y 0,3 cm diámetro

FE: Polímero Acclaim Trinity P2FM: Acetonitrilo – Buffer pH 4Temperatura 60° CCaudal: 0,50 mL/minVol de inyección: 5 µL

Contenido de azúcares en una etapa de la fermentación

Datos del cromatograma:

tr: identifica al analito.

Área bajo el pico: indica la

cantidad de analito.

Ancho de la base: relacionado

con la eficiencia de la

cromatografía.

grande

EFICIENCIA: prolijidad que se logra con cada analito, se relaciona con el tr y el W de cada pico.

N = 16 (tr/W) 2

RESOLUCIÓN: separación ente analitos, relaciona dos picos consecutivos.

R = Diferencia de los tr / promedio del ancho de base

Otros datos del cromatograma:

Bibliografía

Química analítica cuantitativa. R.A.Day, JR.A.L. Underwood. 5ta. Edición. Prentice-Hall Hispanoamericana, S.A.1r. Edición 1989. Capítulos 17 y 18.

https://www.youtube.com/watch?v=dXR9wcK-LUo High Performance Liquid Chromatography HPLC . Fecha de acceso 6/11/19

https://www.youtube.com/watch?v=e_ZAsfZ1AUo Cromatografía gaseosa en español. Fecha de acceso 6/11/19

Cromatografía de intercambio iónico

FE: resina con carga positivaIntercambiadora de aniones

cationes

aniones

FE: resina con carga negativaIntercambiadora de cationes

Trabajo práctico

Fase estacionaria puede ser: Resina con grupos sulfónicos (cargas negativas)

Resina con aminas cuaternarias (cargas positivas)

Generalidades de cromatografía