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1 TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC) CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) Componentes de un equipo HPLC Tipos de Detectores Fases móviles en HPLC Parámetros cromatográficos Tipos de cromatografía Consideraciones prácticas TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC) Fase Móvil Cromatografía Disposición Fase Estacionaria Cromatografía Abrv. Gas De gases (GC) Columna Líquida Sólida Gas-líquido Gas-sólido GLC GSC Líquida Planar Superficie Sólida En capa fina Sobre papel TLC PC Líquida De líquidos (LC, HPLC) Columna Sólida Ligada Iónica Porosa Adsorción Partición Intercambio iónico Exclusión molecular LSC LLC/BPC IEC SEC/GPC Los métodos cromatográficos se pueden clasificar en función de diversos parámetros: fase móvil, fase estacionaria, mecanismo de retención y forma de contacto

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

• Componentes de un equipo HPLC• Tipos de Detectores• Fases móviles en HPLC• Parámetros cromatográficos• Tipos de cromatografía• Consideraciones prácticas

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Fase Móvil

Cromatografía Disposición Fase Estacionaria

Cromatografía Abrv.

Gas De gases (GC) Columna LíquidaSólida

Gas-líquidoGas-sólido

GLCGSC

Líquida Planar Superficie Sólida En capa finaSobre papel

TLCPC

Líquida De líquidos(LC, HPLC)

Columna SólidaLigadaIónicaPorosa

AdsorciónParticiónIntercambio iónicoExclusión molecular

LSCLLC/BPCIECSEC/GPC

Los métodos cromatográficos se pueden clasificar en función de diversos parámetros: fase móvil, fase 

estacionaria, mecanismo de retención y forma de contacto 

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

ESQUEMA DE UN EQUIPO HPLC

Principales componentes de un equipo de HPLC: (1) reservorios; (2) bomba; (3) inyector automático con diferentes carruseles de muestras; (4) columna cromatográfica; (5) detectores en serie; (6) sistema de tratamiento de datos; (7) botella para desechos.

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

OBJETIVO FINAL

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

PRECAUCIONES A SEGUIR CON LA FASE MÓVIL

Filtrar Siempre Desgasificar Gradientes en baja presión Termostatizar Fases móviles con solventes de bajo punto de ebullición

Fases móviles muy viscosas Agitación Fases móviles complejas con solventes poco miscibles

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INYECTORES

• INYECTOR MANUAL

• INYECTOR AUTOMÁTICO

• Precisión

• Termostatización

• Programabilidad

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

INYECTORES DE BUCLES (LOOP)

La función del inyector es introducir la muestra en la corriente de fase móvil bajo alta presión

Volumen del loop: 5 μL a 5 mLRecomendación: llenar loop con 5 veces su

volumen

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

INYECTORES AUTOMÁTICOS:parámetros

Precisión y linealidad

Volumen de inyección

Refrigeración (Peltier)Compatibilidad con viales, placas

multipocilloCapacidadVolumen interno Tiempo de equilibradoContaminación cruzadaProgramación

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

VIALES para INYECTORES AUTOMÁTICOS

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

REQUERIMIENTOS DEL SISTEMA DE BOMBEO

Debe soportar presiones de hasta 6000 psi (aprox. 400 bar)

Para permitir separaciones en tiempos razonables

Debe proporcionar flujos en el rango 0.1 a 10 mL/min, con saltos de 0.1 mL/min

Control de flujo y reproducibilidad < 0.5%

Resistencia a la corrosión

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Las bombas HPLC son casi exclusivamente de PISTÓN

Un dispositivo eléctrico actúa sobre el pistón que entra en una cámara donde se halla la fase móvil, para comprimirlo y enviarlo a presión al resto del sistema.

El flujo deseado se mide y alcanza en función del número de emboladas por unidad de tiempo.

Incorporan un dispositivo electrónico de medida y control de la presión del sistema, en el que el usuario establece un límite máximo de presión .

El principal inconveniente de estas bombas es la aparición de oscilaciones en la línea base por cada embolada. Para evitarlo:

Utilizar atenuador de pulsos a la salida de la bombaBombas de dos pistones en serieBombas de dos pistones en paralelo

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

SISTEMA DE BOMBEO

• GRADIENTELa composición de la fase móvil se modifica durante el análisis para ir aumentando su poder de elución.

• ISOCRÁTICOLa composición de la fase móvil no se modifica durante el análisis

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

BOMBAS DE GRADIENTE

Tiempo (min)

Fase Móvil Flujo

0 MeOH:H2O (v/v) 80:20 1,2 ml/min 7 MeOH:H2O (v/v) 80:20 1,2 ml/min 8 MeOH 100% 1,2 ml/min

20 MeOH 100% 1,2 ml/min

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

¿Por qué utilizar gradientes?

1. Para separar mezclas complejas con componentes de polaridad diferente.

0 5 10 15 200

1

2

3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Tiempo (h)

Gra

dien

te (%

Met

anol

)

Res

pues

ta (v

olts

)

Ac. oleico

Oleato de metilo Dioleina

Trioleina

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

2. Para reducir el tiempo total de análisis y eliminar las “colas” de los picos.

Isocrático Gradiente

0 40 80 120 0 20 40Tiempo Tiempo

Seña

l

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FORMACIÓN DE GRADIENTES

MEZCLA A ALTA PRESIÓNUna bomba para cada componente de la fase móvil. La mezcla se realiza en una cámara de mezcla situada entre las bombas y el inyector. La mezcla tiene lugar en el lado de alta presión de la bomba

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

FORMACIÓN DE GRADIENTES

MEZCLA A BAJA PRESIÓN

Una válvula situada antes de la bomba controla la composición abriendo la entrada de cada eluyente durante un tiempo proporcional a la composición deseada. La mezcla se realiza en una cámara situada entre la válvula y la bomba. La mezcla tiene lugar en el lado de baja presión de la bomba

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

COMPARACIÓN BOMBAS DE GRADIENTEALTA PRESIÓN-BAJA PRESIÓN

ALTA PRESIÓN BAJA PRESIÓN

PRECIO Superior Calidad de la mezcla Buena Buena Desgasificación No necesaria Necesaria Flujos bajos Mejor Porcentajes bajos de algún

disolvente Mejor

Volumen “muerto” Pequeño Grande

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Metal: Acero inoxidable 316, Nitronic 50, Níquel 200, EFNI (electroformed nickel), Hastelloy C-22 (aleación de níquel, cromo y molibdeno), Inconel 600, Titanio, etc.

TUBOS DE CONEXIÓN

No metal: PTFE (politetrafluoroetileno), familia a la que pertenece el popularteflón. Son muy resistentes químicamente, pero no tanto frente a las altas presiones o temperaturas.

FEP (fluoroetilenpropileno). También de la familia de los fluorocarbonos, con similares propiedades de resistencia que el PTFE.

PEEK (polieteretercetona). Es el polímero inerte y biocompatible por excelencia. Excelente resistencia química, térmica y a las altas presiones (5000 psi). Sólo es atacado por dimetilsulfóxido, ácido sulfúrico concentrado, ácido nítrico concentrado y cloruro de metileno.

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

TUBOS DE CONEXIÓNDIÁMETRO EXTERNO

1 in = 25.40 mm½ in = 0.5´´ = 12.70 mm¼ in = 0.25´´ = 6.35 mm1/8 in = 0.125´´ = 3.175 mm1/16 in = 0.06´´ = 1.59 mm

DIÁMETROS INTERNOS TÍPICOS DE LOS TUBOS HPLC0.040´´ aprox. 1 mm (0.8 mL por metro)0.020´´ aprox. 0.5 mm (0.4 mL por metro)0.009´´ aprox. 0.2 mm (50 μL por metro)

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

TUBOS DE CONEXIÓN

0.040’’0.009’’

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

TUBOS DE CONEXIÓN

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

UNIONESSirven para conectar los diferentes módulos del HPLC

ACERO: Férula, conoNo se pueden reutilizarNecesario utilizar herramientas

PLÁSTICO (PEEK) IntegradosReutilizablesSe enroscan a mano

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

• Componentes de un equipo HPLC• Tipos de Detectores• Fases móviles en HPLC• Parámetros cromatográficos• Tipos de cromatografía• Consideraciones prácticas

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Respuesta específica a analitos de interés

No afectado por cambios en temperatura o composición de

la fase móvil (ej. gradientes)

Alta sensibilidad (análisis de trazas)

No contribuir al ensanchamiento de bandas, volumen de

celda pequeño

Respuesta rápida

Fácil manejo, duradero y barato

Precisión

Respuesta lineal

CARACTERCARACTERÍÍSTICAS DEL STICAS DEL DETECTOR IDEAL:DETECTOR IDEAL:

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

RUIDO DEL DETECTOR

Frecuencia alta: Toma de tierra, excesiva amplificaciónFrecuencia baja: Fase móvil con impurezas, burbujas, flujo no estable, etc.

Deriva (drift): Uso de gradientes con detectores no adecuados o con fases móviles que absorben, cambio en la Tamb.

Incertidumbre en el valor de la línea base de la señal, en ausencia de un analito.

Corto o frecuencia alta (>1 Hz)

Largo o frecuencia baja(<0.1 Hz)

Deriva

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

LÍMITES DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN

LOD: Cantidad mínima detectable de un analito

LOD LOQ

LOQ: Cantidad mínima cuantificable de un analito

Señal/Ruido = 3 Señal/Ruido = 10

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LINEALIDAD DE UN DETECTOR

bmxy +=

gen en el ori Ordenada b Pendiente m

iónConcentrac x ala muestrspuesta dedonde: y

==== Re

Concentración de analito

Seña

l del

det

ecto

r

Real

IdealIdeal

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Otros parámetros

Volumen de celda:Debe tener una influencia despreciable en la anchura de los picosNo sobrepasar los límites máximos de presión y caudal de cada tipo de celda

Tiempo de respuesta:No debería ser superior a 0.3 segundos para picos muy agudos

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

TIPOS DE DETECTORESTIPOS DE DETECTORES

Generales: Responden a laspropiedades de la fase móvil que varían en presencia de solutos (índice de refracción, viscosimétricos, etc.)

Específicos: Responden a algunapropiedad del soluto, no presente en la fase móvil (absorbancia UV-VIS, masas, etc.)

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Ópticos:• Fotométricos:

Absorbancia UV/VIS: longitud de onda discreta o rango espectral continuo (PDA -fotodiodos)Fluorescencia

• Refractométricos, polarimétricos, evaporativos(light-scattering).

Eléctricos: electroquímicos, conductimétricos.Específicos: radiométricos, viscosimétricos.De técnicas acopladas: espectroscopía de masas, IRTF, AA, ICP.

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Región Longitud de onda (nm)

Ultravioleta lejano 10-200

Ultravioleta cercano 200-380

Visible 380-780

Infrarrojo cercano 780-3,000

Infrarrojo medio 3,000-30,000

Infrarrojo lejano 30,000-300,000

Microondas 300,000-1,000,000,000

El espectro electromagnético está dividido en diferentes regiones espectrales, definidas de acuerdo a la longitud de onda.

DETECTORES FOTOMDETECTORES FOTOMÉÉTRICOSTRICOS

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

DETECTORES DE ABSORBANCIA UV/VISDETECTORES DE ABSORBANCIA UV/VIS

LA MAYORÍA DE LOS COMPUESTOS ORGÁNICOS

ABSORBEN EN ALGUNA ZONA DEL ESPECTRO

ADECUADO PARA TODOS LOS MODOS

CROMATOGRÁFICOS

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

DETECTORES DE ABSORBANCIA UV/VISDETECTORES DE ABSORBANCIA UV/VIS

AMPLIO RANGO DE LINEALIDAD NO AFECTADOS

POR CAMBIOS DE TEMPERATURA

SENSIBILIDAD ALTA

ADECUADO PARA TRABAJAR EN GRADIENTE

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Longitud de onda discretaLongitud de onda discretaDETECTOR DE ABSORBANCIA UV/VISDETECTOR DE ABSORBANCIA UV/VIS

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Identificación de los analitos en un detector de fotodiodos (PDA)

Tiempo de retención

λ

Abs

orba

ncia

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

DETECTORES DE FLUORESCENCIADETECTORES DE FLUORESCENCIA

Ventajas:Ventajas:

Alta selectividad y sensibilidad (1 orden de magnitud mayor que UV-VIS)Aplicaciones típicas: Hidrocarburos aromáticos policíclicos (legislación) y en técnicas con derivatización

Desventaja: Desventaja: Doble de precio que UV-VIS

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

DETECTORES DE DETECTORES DE ÍÍNDICE NDICE DE REFRACCIDE REFRACCIÓÓNN

En la celda de detección se observa la variación en la refracción de un haz de luz cuando la fase móvil

lleva un compuesto disuelto respecto a la fase

móvil pura.

Detector general

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

PROPIEDADES DE UN DETECTOR DE PROPIEDADES DE UN DETECTOR DE ÍÍNDICE DE REFRACCINDICE DE REFRACCIÓÓNN

Complementario a detectores UV-VIS100-1000 veces menos sensible que UV-VISSensible a pulsos de presión (ruido)No permite gradientesAplicaciones típicas: carbohidratos, grasas,

polímeros, etc.

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

DETECTORES EVAPORATIVOS DE DETECTORES EVAPORATIVOS DE DISPERSIDISPERSIÓÓN LUMINOSA N LUMINOSA

(LIGHT(LIGHT--SCATTERING, ELSD)SCATTERING, ELSD)

Están basados en los efectos dispersivos que toda partícula produce sobre una radiación.

Rayo incidente

Rayo dispersado

Detector universal!!

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

COMPONENTES DE UN ELSDCOMPONENTES DE UN ELSD

1. Un sistema de nebulizaciónneumática del líquido procedente de la columna.

2. Un tubo evaporador caliente, donde entra el eluyente y se produce la evaporación de la fase móvil.

3. Un detector alejado del eje de la radiación incidente, normalmente un fotomultiplicador emplazado 90-120°de la fuente de radiación.

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

PROPIEDADES DE UN DETECTOR ELSDPROPIEDADES DE UN DETECTOR ELSD

Fácil manejoMayor sensibilidad que índice de refracciónCompatibilidad con los gradientes de elución

Aplicaciones típicas: Azúcares, triglicéridos, ácidos grasos, polímeros

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

DETECTORES ELECTROQUDETECTORES ELECTROQUÍÍMICOSMICOS

En la célula de detección, equipada con dos electrodos, se genera una diferencia de potencial adecuada para provocar la oxidación o reducción de los analitos. Se mide la intensidad de corriente generada en el proceso.

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

EL POTENCIAL ES CARACTERÍSTICO DE CADA SUSTANCIA

LA CORRIENTE DEPENDE DE LA CONCENTRACIÓN DE DICHA SUSTANCIA

Ejemplos de compuestos detectables con detectores electroquímicos

CetonasAldehídos

OximasÁcidos conjugadosÉsteres conjugadosNitrilos conjugados

Insaturaciones conjugadasHalógenos activados

Halógenos aromáticosCompuestos nitro

Anillos heterocíclicos

FenólicosOximas

DihidroxiMercaptanos

PeróxidosHidroperóxidos

Aminas aromáticas, diaminasPurinas

Anillos heterocíclicosCarbohidratos

ReducciónOxidación

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

DETECTORES CONDUCTIMDETECTORES CONDUCTIMÉÉTRICOSTRICOS

Muy útiles para cromatografía de intercambio iónico

La conductividad es proporcional a la fuerza iónica

Su sensibilidad disminuye a medida que aumenta la conductividad de la fase móvil

Pequeño rango lineal

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

DETECTORES DE MASASDETECTORES DE MASAS

HPLC Espectrómetro de masas+

GRAN POTENCIAL

Cuantificar componentes Cuantificar componentes de bajos pesos molecularesde bajos pesos moleculares

SepararSeparar

IdentificarIdentificar

Caracterizar productos de Caracterizar productos de altos pesos moleculares altos pesos moleculares

(p(pééptidos, proteptidos, proteíínas, etc.). nas, etc.).

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

DETECTORES DE MASAS: DETECTORES DE MASAS: MMÉÉTODOS DE IONIZACITODOS DE IONIZACIÓÓNN

EI: IMPACTO ELECTRÓNICO (Therma-Beam). Es poco eficaz

API: INTERFASES A PRESIÓN ATMOSFÉRICA:

Ionización mediante electrospray (ESI, electrosprayionisation)

Ionización química a presión atmosférica (APCI, atmosphericpressure chemical ionisation).

FAB (fast atom bombardment)

MALDI (matrix-assisted laser desorption)

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

• Componentes de un equipo HPLC• Tipos de Detectores• Fases móviles en HPLC• Parámetros cromatográficos• Tipos de cromatografía• Consideraciones prácticas

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Agua (grado MilliQ, tampones)

Disolventes orgánicos:MetanolAcetonitriloIsopropanolDiclorometanoHexano

Disolventes másusados en HPLC

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Características de los eluyentes

Pureza UV CutoffMiscibilidadpHEstabilidadPropiedades físicas y toxicológicas

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

UV Cutoff de algunas fases móviles

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Miscibilidad de disolventes

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

• Componentes de un equipo HPLC• Tipos de Detectores• Fases móviles en HPLC• Parámetros cromatográficos• Tipos de cromatografía• Consideraciones prácticas

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

La resolución de dos picos adyacentes es el cociente entre la distancia que hay entre los máximos de ambos picos y la media aritmética de sus anchuras respectivas (w). Determina la calidad de la separación de dos picos

Resolución

Se calcula dividiendo la longitud de la columna (L) entre el tiempo que necesita la fase móvil para pasar a través de la columna (to)

Velocidad lineal de la fase móvil

Cociente del factor de capacidad de dos picos adyacentes. Es una medida del potencial del sistema cromatográfico para separar dos compuestos.

Selectividad(factor de

separación)

Cociente del tiempo en que el analito está en interacción con la fase estacionaria (tR – to) y el que permanece en la fase móvil (to)

Factor de capacidad

Suma del tiempo que el analito permanece en la fase móvil y el tiempo que interacciona con la fase estacionaria

tRTiempo de retención

SignificadoFórmulaParámetro

1

2

kk

o

o

tttk −= R

0tL

u =

( )21

12

21 ww

ttR+−=

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Indica que para cada sistema cromatográfico existe un flujo (definido por la velocidad lineal) para el cual la altura equivalente de un plato teórico es mínima. En la ecuación, A es la contribución de la difusión de Eddy, B corresponde a la difusión longitudinal y C a la transferencia de masa

Ecuación de van Deemter

Se calcula dividiendo la longitud de la columna entre el número de platos teóricos.

Altura equivalente de platos teóricos

Este nombre refleja el origen del concepto de la teoría de destilación: una cierta longitud de la columna es ocupada por un plato teórico. Se calcula, para un determinado pico, considerando el tiempo de retención y su anchura.

Número de platos teóricos

SignificadoFórmulaParámetro

o

o

tttk −

= R

2

16 ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛⋅=

wtN R

NLHETP =

uCuBAHETP ⋅++=

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

COMPARACIÓN GC-HPLCNÚMERO TÍPICO DE

PLATOS TEÓRICOS

POR COLUMNA POR METRO

GC con columnas

empaquetadas 2000 1000

GC con columnas

capilares 50000 3000

Cromatografía líquida clásica 100 200 HPLC 5000 50000

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

COMPARACIÓN GC‐HPLC

GC HPLC

Separaciones difíciles Posible Posible

Rapidez Sí Sí

Automatización Posible Posible

Forma típica de solucionar los problemas

Cambio de fase estacionaria Cambio de fase estacionaria o

de fase móvil

No aplicable a... Compuestos poco volátiles,

compuestos inestables

térmicamente

Compuestos muy volátiles

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

• Componentes de un equipo HPLC• Tipos de Detectores• Fases móviles en HPLC• Parámetros cromatográficos• Tipos de cromatografía• Consideraciones prácticas

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

CLASIFICACIÓN DE LOS PROCESOS CROMATOGRÁFICOS EN HPLC

Proceso cromatográfico

Abreviatura (inglés) Tipos

Adsorción LSC (líquido-sólido) ⎯

Partición BPC (fase ligada) Fase reversa Interacción hidrofílica

Intercambio iónico IEC Intercambio aniónico Intercambio catiónico

Exclusión por tamaño SEC/GPC ⎯

Los distintos tipos de fuerzas entre fase estacionaria y analitos definen los distintos tipos de cromatografía HPLC

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CROMATOGRAFÍA HPLC DE ADSORCIÓN

Líquido-Sólido

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Es el método cromatográfico más antiguo

La interacción, de tipo electrostático, se produce entre la parte polar del analito y los grupos OH de la sílice.

Esta interacción compite con la que tiene lugar entre la fase móvil y los grupos funcionales de la sílice.

Está basada en el mismo principio que la cromatografía en capa fina (TLC) y la cromatografía de columna en gel de sílice

CROMATOGRAFÍA HPLC DE ADSORCIÓN

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

FASES MÓVILES:

HEXANO

ISOOCTANO

CLOROFORMO

ACETATO DE ETILO

FASES ESTACIONARIAS:

SÍLICE

ALÚMINAHIDROXIAPATITO

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

COMPUESTOS QUE PUEDEN SER SEPARADOS

• OLEFINAS• HIDROCARBUROS AROMÁTICOS• HALUROS, SULFUROS• ETERES• NITRO- DERIVADOS• ÉSTERES, ALDEHIDOS, CETONAS• ALCOHOLES, AMINAS• SULFONAS• SULFÓXIDOS• AMIDAS• ÁCIDOS CARBOXÍLICOS

ListadosListados en en

ordenorden crecientecreciente

de de tiempotiempo de de

retenciretencióónn: de : de

menormenor a mayor a mayor

interacciinteraccióónn con con

la la fasefase

estacionariaestacionaria

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

CROMATOGRAFÍA HPLC DE PARTICIÓN

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

SÍLICE: MODIFICACIÓN QUÍMICA

SiO

Si

OH OH

SiO

SiO

Si

OH OH OH

Si OH SiCH3R

CH3

Cl+ SiCH3R

CH3

OSi

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Se obtiene una faseligada establetérmicamente y resistente a la hidrólisis

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

COMPARACIÓN ADSORCIÓN-PARTICIÓN

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

A) CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN EN FASE REVERSA

FASES MÓVILES:ACETONITRILO

METANOLTHF

con agua como componente de la fase móvil

FASES ESTACIONARIAS:

OCTADECIL- C18

OCTIL- C8BUTIL- C4FENIL- C6H5

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

FASE REVERSA“La fase estacionaria es menos polar que la fase móvil”

FASE MÓVIL:POLAR

FASE ESTACIONARIA:

APOLAR

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

La retención está basada en la interacción, de tipo hidrófobo, entre la fase estacionaria y la

región no polar del analito

FASE REVERSA

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Más del 90% de las aplicaciones HPLC de compuestos de bajo peso molecular se

hacen en cromatografía de partición en fase

reversa

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

CONTROL DE LA RETENCIÓNEN FASE REVERSA

Para aumentar el tiempo de retención de

los analitos, AUMENTAR la POLARIDAD

de la fase móvil.

Esto suele conseguirse incrementando el

porcentaje de agua

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Campo de aplicación Ejemplos Farmacia Antibióticos, analgésicos, esteroides Medio ambiente Pesticidas, Herbicidas, Fenoles, PCBs Industria química Detergentes, Polímeros Alimentación Edulcorantes, emulgentes, antioxidantes Bioquímica Proteínas, Hidratos de carbono, Lípidos Clínica y Diagnóstico Análisis de orina y sangre, Dopaje, Hormonas

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

B) CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN POR INTERACCIÓN HIDROFÍLICA (HILIC)

SEPARACIÓN DE COMPUESTOS MUY HIDRÓFILOS

NO RETENIDOS EN HPLC EN FASE

REVERSA:

Coelución

MUY RETENIDOS EN HPLC DE ADSORCIÓN:

Pero no se pueden disolver en fase móvil

apolar

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

EJEMPLOS DE CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÍLICA (HILIC)

Retention time (min)

0 5 10 15 20 25 30

Sign

al (m

Volts

)

0

5

10

15

20

25

30

Glucose

Maltose

Maltotriose

Columna Lichrospher-NH2250 x 4.6 mmCH3CN:H2O 70:30 v/v0.7 mL/min

ORDEN DE ELUCIÓN: DE MENOS POLAR A MÁS POLAR

SEPARACIÓN DE CARBOHIDRATOS

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

EJEMPLOS DE CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÍLICA (HILIC)

SEPARACIÓN DE VITAMINAS

HIDROSOLUBLES

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

FASES ESTACIONARIAS (naturaleza de R)

CIANO -C2H4CNDIOL -C3H6OCH2CHOHCH2OHAMINO -C3H6NH2

DIMETILAMINO -C3H6N(CH3)2

NITRO -C2H4NO2

CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÍLICA (HILIC)

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO

IÓNICO

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

• Grupos cargados como SO3-, COO-, NH3

+ o NR3+ son

incorporados en una resina o en un gel.

• Las moléculas cargadas de analito compiten con los ionesde la fase móvil por los sitios de unión de la faseestacionaria.

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Intercambiador aniónico

Atrae aniones

Intercambiador catiónico

Atrae cationes

+

-

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

ABREVIATURAS EN COLUMNAS DE INTERCAMBIO IÓNICO

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Columna de intercambio catiónico Partisil SCX (25 cm x 4 mm)Fase móvil A: ácido 2-hidroxi-isobutírico en aguaGradiente de 0.03 a 0.07 MDetección VIS a 520 nm tras derivatización con 4-(piridilazo-resorcinol)

SEPARACIÓN DE LANTÁNIDOS

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA IÓNICA

Determinación de aniones en el agua de bebidaDeterminación de nitratos en vegetalesDeterminación de fluoruros en pasta de dientesDeterminación de ácidos orgánicos en bebidasDeterminación de amonio, potasio, nitrato y fosfatos en fertilizantesDeterminación de sodio y potasio en muestras clínicas (transfusiones)

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Análisis de una mezcla de aniones inorgánicos mediante cromatografía HPLC de intercambio iónico. Columna IonPac AG17-C AS17-C Dionex (250 x 4 mm). Fase móvil: hidróxido potásico (1 mM de 0 a 3 min, 1-12 mM de 3 a 10 min, 12-35 mM de 10 a 14 min). Flujo: 1.5 ml/min. Temperatura: 30 °C. Detección de conductividad con columna supresora. Fuente: catálogo de Dionex.

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

CROMATOGRAFO IÓNICO

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

EXCLUSIÓN POR TAMAÑO

GPC/SEC

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Fundamento de la separación

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Aspecto importantes de la separación

La separación tiene lugar en el volumen total de líquido en la columna. Se puede predecir el tiempo total de análisis. Los volúmenes de elución son bajos.

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

DESVENTAJASBaja resolución (picos anchos)

Posible interacción entre la fase estacionaria y la muestra. 

APLICACIONES

Polímeros (GPC, gel permeation chromatography)

Proteínas y otros compuestos biológicos (SEC, size exclusionchromatography)

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Análisis de una mezcla de patrones de poliestireno mediante cromatografía HPLC de exclusión molecular (GPC). Condiciones: columna Chrompack Microgel 3 Mix (Varian) 250 x 7.7 mm, fase móvil tetrahidrofurano, 1.0 ml/min, detector de índice de refracción.

APLICACIONES: POLÍMEROS

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

CROMATOGRAFÍA QUIRAL

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

CROMATOGRAFÍA QUIRAL

Distribución de fármacos aprobados en el mundo de acuerdo a su quiralidad en el periodo 1983-2002

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

1) La fase móvil es quiral, la fase estacionaria no es quiral

2) La fase estacionaria es sólida y además quiral. La fase móvil no es quiral.

POSIBILIDADES EN CROMATOGRAFÍA QUIRAL

Los enantiómeros se pueden separar por cromatografía líquida, siempre y cuando el

sistema sea asimétrico (quiral)

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

• Componentes de un equipo HPLC• Tipos de Detectores• Fases móviles en HPLC• Parámetros cromatográficos• Tipos de cromatografía• Consideraciones prácticas

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

RIESGOS DE TRABAJO EN HPLCRIESGOS DE TRABAJO EN HPLC

Empleo de disolventes tóxicos

Riesgos  derivados  del  empleo  de  altas presiones

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

DESGASIFICACIDESGASIFICACIÓÓN DE LA FASE MN DE LA FASE MÓÓVILVIL

Elimina  los  gases  disueltos  para  prevenir  la 

formación de burbujas. Especialmente importante en 

bombas de mezcla de baja presión.

Sistemas de desgasificación:

Helio

Vacío

Ultrasonidos

Desgasificadores on‐line

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

PRESIÓNLa presión es proporcional al caudal

La presión máxima de trabajo suele venir especificada en la columna:

Columnas de acero con material base de sílice: aprox. 4000-5000 psi

Columnas poliméricas (estireno-divinilbenceno): aprox. 600-1000 psi

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

CAUDAL

El tamaño de partícula, el tipo de relleno, la viscosidad de la fase móvil, la temperatura y las dimensiones de la columna condicionan el caudal.

Para columnas analíticas con base de acero:Material base de sílice: aprox. 0.5-2 mL/minColumnas poliméricas: aprox. 0.3-1 mL/min

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Volumen de inyección:En columnas analíticas, 5-25 µL

VOLUMEN DE INYECCIÓN

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

TROUBLESHOOTINGTROUBLESHOOTINGLO MÁS IMPORTANTE: LOCALIZAR EL PROBLEMA

FASE MÓVIL INYECTORFILTROS DEL SISTEMACOLUMNABOMBAPRECOLUMNATUBOS/CONECTORESDETECTOROPERADOR

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Preparar la muestra para que pueda analizarse en cualquier técnica analítica

HPLCLC – MSEspectrofotometría

Preparación de muestras

GCGC – MS

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Objetivos de la preparación de muestras

Eliminar los compuestos que coeluyen con el analito de interés.

Eliminar impurezas o residuos que puedan producir interferencias

Concentrar muestras para mayor sensibilidad

Eliminar las sales de una muestra

Proteger la columna analítica

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Tipos de preparación de muestras

Filtración

Extracción fase sólida

Extracción líquido – líquido

Precipitación de proteínas

Otros

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

FILTRACIFILTRACIÓÓN DE MUESTRAS Y N DE MUESTRAS Y DISOLVENTESDISOLVENTES

Eliminación de partículas insolubles a través de su paso por una membrana.

Las partículas pueden dañar el equipo, dañar la columna, influir en los resultados

Utilizar los filtros de membrana adecuados: muestrasacuosas - Acetato de celulosa; muestras orgánicas - Nylon, PTFE, PVDF. No utilizar filtros de acetato de celulosa con acetonitrilo

Filtros de las líneas de los disolventes: suelen ser de Titanio, 10 μm poro. Se limpian en sonicador, o pasando NO3H al 1%

Aumenta la vida de la columna

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Extracción en fase sólida (SPE)

Partición selectiva de uno o varios compuestos entre dos fases, donde una de ellas es fase sólida.

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Diferencias entre HPLC y SPE

< 50∼ 10 000No. Platos

∼ 1 cm5 – 30 cmLongitud columna

AltoBajoVol. extra columna

BajaAltaEficacia de empaquetamiento

40-80 μm∼ 5 μmTamaño de partícula

SPEHPLC

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Herramientas para SPE

Cartuchos

Placas

Discos

- Tema 3 -

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Tipo de fuerza a utilizarGravedad

- Tema 3 -

TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Presión positiva

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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)

Estrategias para la SPE

Retener los compuestos de interés y eluir las impurezas.

• Retener las impurezas e interferencias en la matriz y dejar que los compuestos de interés pasen a través del cartucho con la fase.