Sistemas cromatográficos

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA

FM FE MÉTODO

Sistemas a desarrollar

• L convencional/fase ligada reparto• sólida adsorción• resina intercambiadora intercambio iónico• gel poroso tamizado• soporte con ligando unido reacción específica

Líquida

Fuerzas interactivas relacionadas con cromatografía líquida

- Fuerzas iónicas

- Fuerzas polares

- Fuerzas dispersivas

- Enlace de hidrógeno es un ejemplo de fuerzas polares muy fuertes

Fuerzas iónicasSurgen de cargas eléctricas permanentes (netas) de las moléculas. Se usan en cromatografía de intercambio iónico.

Fuerzas polares (van der Waals)Surgen de dipolos permanentes o inducidos en moléculas sin carga neta. La proximidad de una molécula con dipolo permanente a otra molécula polarizable produce un par de cargas opuestas en dicha molécula (polariza) resultando una interacción eléctrica entre cargas inducidas y permanentes. La sílica exhibe fuertes interacciones polares con solutos y solventes debido a su superficie altamente polar con grupos silanol que tienen dipolos permanentes muy fuertes.

Fuerzas interactivas relacionadas con cromatografía líquida

Fuerzas interactivas relacionadas con cromatografía líquida

Fuerzas dispersivas (fuerzas de London)Son las más débiles. Ocurre atracción entre dipolos instantáneos en una molécula. Resultan de fluctuaciones de carga (Ej. fuerzas moleculares que ocurren entre moléculas de hidrocarburos). Las interacciones de solutos y solventes con una fase reversa (considerando ausencia de grupos silanol) son exclusivamente de naturaleza dispersiva.

Cromatografía de reparto

Fase estacionaria LÍQUIDA

Fundamento de separación: diferente solubilidad del analito en FM y FE

Cromatografía de partición o reparto

CL convencional Fase ligada

El líquido (FE) estáadsorbido sobre un soporte sólido inerte

Las cadenas carbonadas (FE) están unidas covalentemente

al soporte sólido inerte

Fase inversaFase móvil polar/ Fase estacionaria no polar

Fase normalFase móvil no polar/ Fase estacionaria polar

Cromatografía L-L convencional

soporte inerte

FE (líquida)

OH

OHOH

SiO

Si

O

Si

HO

O

SiOSi

O

OH

OHOH

OH

La mayoría de las fases ligadas se forman a partir de partículas de sílicagel, a las que se les une covalentemente cadenas carbonadas que actúan como FE

Representación esquemática de partícula de silicagel

Fase unida o ligada

grupo silanol

grupo silanol reactivo

unión siloxano

- HCl+

Si

H

Si OH

OSi

O

C 3

CH3

R

unión siloxano

alquil clorosilano

Si OH

OHSi

O Si

CH3

RCl

CH3

C6H13C8H17C18H37C4H6NC8H9SO etc

Empaques de siloxanos: las fases ligadas más frecuentes (cepillo, oligomérica y voluminosa) son producidas por monocloro, dicloro y triclorosilanos, respectivamente.

Fase unida tipo “cepillo” (brush)

impedimento estérico (grupos metilos unidos al silicio)

más aceptada

Estructura A Estructura B

Los grupos están en posición perpendicular a la superficie generando una estructura de cepillo o brocha

Fase unida tipo “oligomérica”

Alquil diclorosilano

Etapa 1

Fase unida tipo “oligomérica”Etapa 2

Etapa 3

Se trata la sílica en forma alternada con agua y diclorosilano. Se va formando el oligómero que constituye la FE

Fase unida tipo “oligomérica”

Etapa final

Cuando se une la última cadena, se hace reaccionar al grupo silanol remanente con trimetil clorosilano.

Es la fase ligada más difícil de obtener

CH3

Fase unida tipo “voluminosa” (bulk)

Alquil triclorosilano

Etapa 1

Consiste en una película polimérica algo abierta de FE cubriendo la superficie de la sílica

Fase unida tipo “voluminosa”

Etapa 2 La cadena “octildicloro”

reacciona con agua para dar una cadena “octildihidroxo”

Fase unida tipo “voluminosa”Etapa 3

La cadena “octildihidroxo”reacciona con moléculas de triclosilanos y forma la superficie polimérica.

Los grupos clorosilanos tienen libertad de movimiento para reaccionar con silanoles de la superficie (capa de polímero entrecruzado)

� Las fases tipo “cepillo” (brush) se sintetizan de una manera reproducible, y por lo tanto son generalmente recomendadas para la mayoría de las aplicaciones.

� Las fases voluminosas (bulk) tienen alta capacidad retentiva y son adecuadas para sistemas que operarán con mezclas de solventes acuosos con altos contenidos de agua.

Fases ligadas

Fase unida o fase ligada

Fase normal Fase reversa

La FE es más polar que la

muestra y la FM

La FE es menos polar que la muestra y la FM

� FM de baja polaridad/ FE polar

� Solutos poco polares eluyen primero

� Incrementar la polaridad de la FM tiene el efecto de reducir el tiempo de elución.

� R-Polar: ciano, diol, amino, dimetilamino.

� FM de baja polaridad: etil éter, cloroformo, hexano

Fase normal

H HN

NO2

---

---

Ejemplo de interacción con fase normal

enlace de hidrógeno entre el analito y la ciano-superficie

� Más ampliamente utilizada

� Las fuerzas interactivas entre FE y soluto (o solvente) son de naturaleza dispersiva: fuerzas de dispersión de London.

�Solvente de alta polaridad-solutos de alta polaridad eluyen primero.

�R más comunes: C8 (n-octil) y C18 (n-octildecil)

�Cuanto mayor es el número de átomos de carbono en R mayor es la eficiencia.

�Elución a pH>7.5 puede producir hidrólisis del siloxano

Fase reversa

Ejemplos de fases ligadas reversas

Hexil, C6

Octil, C8

Octadecil, C18

fenil

Alquil fluorada

(reactivo = perfluorooctil dimetil clorosilano)

Ejemplos de fases ligadas

C-18 C8

C1

PFPOxy-Phenyl(pentafluorofenil)

Efecto de la longitud de la cadena en la eficienciade columna de fase reversa

1 uracilo, 2 fenol, 3 acetofenona, 4 nitrobenceno, 5 metil benzoato, 6 tolueno

R= C3 R= C8 R= C18

Índice de polaridad: describe cuantitativamente la polaridad del solvente en el reparto

Fluoroalcanos < -2

Ciclohexano 0.04

Tolueno 2.4

Cloroformo 4.1

Etanol 4.3

Acetato de etilo 4.4

Metanol 5.1

Nitrometano 6.0

Etilenglicol 6.9

Agua 10.2

SOLVENTE ÍNDICE DE POLARIDAD (P’)

Series eluotrópica de solventes

Fase normal Fase reversa

Hexano

Benceno

Cloroformo

Acetato de etilo

Metanol

Agua

Agua

Metanol

Acetonitrilo

POLARIDAD

POLARIDAD

FUERZA

+

+

+

- -

-

Orden de eluciónPolaridades de los solutos: A > B > C

Aplicaciones de la cromatografía de reparto

CAMPO MEZCLAS TÍPICAS

Fármacos Antibióticos, analgésicos, sedantes, esteroides

Bioquímica Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos

Alimentos Edulcorantes, aditivos, aflatoxinas, antioxidantes

Industria química Aromáticos condensados, tensioactivos,colorantes

Contaminantes Pesticidas, herbicidas, fenoles, HPAs

Química forense Drogas, venenos, narcóticos, alcohol en sangre

Medicina clínica Ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrógenos

Cromatografía de adsorción

Fase estacionaria sólida

Fundamento de separación: el analito interacciona con sitios activos de la superficie de la FE. Intervienen fuerzas de van der Walls, enlaces de hidrógeno, etc.

Adsorbentes: silicagel*, alúmina*, C*, CaCO3, MgCO3

Microscopía electrónica de barrido de soportes cromatográficos porosos

sílica de forma irregular

partículas esféricas de

sílica

monolítica de sílicapolímeros orgánicos monolíticos

OH

Si Si

OH

OO

H

solvente débil

analito

Si Si

OH

OO

H

HO R

O

R

solvente fuerte

analito solvente

Cromatografía de adsorción

Sílicagel

cloroformo n-heptanosoluto

sílica

Solvente fuerte: sorción

cloroformo n-heptano

soluto soluto

sílica

Solvente débil: desplazamiento

sílica

Sílica cubierta con bicapa de solvente

Soluto interactuando con 2da capa de solvente B (sorción)

Soluto interactuando con 1er capa de B (desplazamiento)

Solvente B desplazado

Soluto interactuando con 1er capa de B (sorción)

Soluto interactuando con sílica (desplazamiento)

Solvente A desplazado

Soluto interactuando con 1er capa de A (sorción)

Soluto interactuando con sílica (desplazamiento)

Fuerza del solvente (energía de adsorción del solvente por unidad de área del adsorbente). Se mide con el parámetro de Snyder (ε°).

Fluoroalcanos 0.00 -0.25Ciclohexano 0.01 -0.2Tolueno 0.22 0.29Cloroformo 0.26 0.40Acetato de etilo 0.48 0.58Etanol 0.70 0.88Metanol 0.75 0.95Etilenglicol 0.90 1.11Agua grande grande

SOLVENTE εO (SiO2) εO (Al2O3)

Elección de la fase móvil

fase móvil interactiva fase móvil no-interactiva

reparto, adsorción, intercambio iónico

CG y exclusión molecular

los tiempos de retención están fuertemente influenciados por el tipo de FM utilizada

participación activa en la separación

los tiempos de retención son independientes de la FM utilizada

la FM solo transporta la muestra a través de la FE

Se produce un equilibrio entre fuerzas intermoleculares de soluto, FE y FM

hidrocarburos<éteres<ésteres<cetonas<aldehídos<amidas<aminas<<alcoholes<agua

Se elige la polaridad de FE bastante similar a la de los analitos y para eluir se usa FM de polaridad considerablemente distinta

Polaridad creciente

Cromatografía de intercambio iónico

FE cargada

Fundamento de separación:intercambio reversible de iones entre el analito y la FE funcionalizada. Intervienen fuerzas electrostáticas.

Fase estacionaria: resinas y geles de intercambio iónico, intercambiadores iónicos inorgánicos

Fase móvil: ácidos y bases inorgánicos y orgánicos (KOH, NaOH, HClO4, HCl, ácidos tartárico, dipiconílico, metanosulfónico, etc), sales (carbonato de sodio, perclorato de sodio, etc.), con o sin mezcla de solventes orgánicos (metanol, acetonitrilo, etc.)

Detector: conductímetro

Fases estacionarias

Resinas de intercambio iónicoSe usan para moléculas pequeñas (PM<500). Penetran en los poros pequeños de la resina

Geles de intercambio iónicoSe usan para moléculas más grandes (proteínas y ácidos nucleicos)

Intercambiadores iónicos inorgánicos (óxidos hidratados de Zr, Ti, Sn y W)Separaciones que exigen condiciones químicas fuertes (alta temperatura, agentes oxidantes fuertes, radiación)

Cromatografía Iónica

� La cromatografía iónica es una variante de la cromatografía líquida de alta presión (HPLC) para la separación y determinación de iones, basado en el uso de resinas de intercambio iónico.

� Se utilizan columnas de intercambio iónico especialmente diseñadas para este tipo de cromatografía.

� Los conectores del cromatógrafo iónico son poliméricos (en vez de ser de acero inoxidable). El más común es el PEEK (polyether ether ketone).

� Se utilizan detectores conductimétricos, amperométricos, UV, etc, aunque el más común es el conductímetro.

� El resultado es un cromatograma donde la posición de los máximos nos indica el ión presente (carácter cualitativo) y su área nos indica que cantidad existente de dicho ión (carácter cuantitativo).

Cromatografía Iónica

SO4-2

NO3

-

F-

PO4-3

Cl-

NO2

-Inject

Minutes0

Br-

Hace 25 años….

Análisis de aniones en la actualidad

Intercambiador Grupo Nombre comercial

catiónico

ácido fuerte ácido sulfónico Dowex 50, Amberlite IR120,Ionac CGC-240

ácido débil ácido carboxílico Amberlite IRC 50, Ionac CGC-270

Aniónico

base fuerte ión amonio cuaternario Dowex 1, Amberlite IRA 400, Ionac AGA-542

base débil grupo amina Dowex 3, Amberlite IR-45Ionac AGA-316

Resinas de intercambio iónico

Resinas de intercambio catiónico: ácido fuerte

Resinas de intercambio catiónico: ácido debil

Resinas de intercambio aniónico: base fuerte

Resinas de intercambio aniónico: base debil

Diferentes empaques en intercambio iónico

vidrio

película intercambiadora: microesferas de sílica o vidrio (1 - 2 µm) cubiertas con intercambiador iónico

30 – 40 µm

Resina pelicular

Resina macroreticular

macroporos

x RSO3 H+ + Mx+ (RSO3 )xMx+ + x H+

sólido solución sólido solución

El intercambio de cationes se ilustra con el equilibrio

El intercambio de aniones se ilustra con el equilibrio

x RN(CH3)3+ OH- + Ax- [RN(CH3)3

+]x Ax- + x OH-

sólido solución sólido solución

Se aplica elución en gradiente con fuerza iónica creciente o mediante cambios de pH

Un gradiente de fuerza iónica es semejante a gradiente de solvente o de temperatura

0.005 M

Ni

Mn

CoCu

Fe

Zn

12 M HCl

6 M

4 M

volumen de retención

cc

Ejemplo: Separación de iones metálicos como cloro complejos en un intercambiador aniónico fuertemente alcalino con gradiente de elución con HCl

0.5 M

2.5 M

El Ni prácticamente no forma complejo con el Cl- y eluye primero, sin quedar retenido. Le sigue el Mn y así sucesivamente hasta llegar al Zn que forma el complejo más estable y es el más retenido

DetectorEl conductímetro es el detector universal de iones

Problema: gran concentración iónica del eluyente → elevada conductividad de FM → línea de base alta en el cromatograma → se reduce la señal del analito y por lo tanto la sensibilidad

Solución: columnas supresoras (colocadas inmediatamente después de la columna), que reducen la línea de base

Contienen una segunda resina de intercambio iónico que convierte los iones del disolvente en especies moleculares

poco ionizadas, sin alterar los iones del analito

Se requiere “suprimir” la señal del eluyente

Cromatografia de aniones con supresión iónica

COLUMNA DE SUPRESIÓN

Intercambiador catiónico fuerte

muestra KNO3/CaSO4

eluyente Na2CO3

COLUMNA DE SEPARACIÓNIntercambiador aniónico fuerte

conductímetro

desecho

Se retienen los aniones de la muestra

Reacción del eluyente con el supresor

2Na++CO32- +2H+ 2Na+ +H2CO3

Especie poco disociada

Sin supresión

contraiones SO42-

SO42-

Tiempo de elución

NO3-

NO3-

Con supresión química

Tiempo de elución

cccc

Otro ejemplo de cromatografía de aniones con supresión iónica

Eluyente NaOH

bomba

NaBrNaOHNaClNaF

HBrH2OHClHF

detector

NaBr, NaCl, NaF, NaOH(diluyente)inyector

residuosTiempo

cc

Columna separadora

Columna supresora

Cromatografia de cationes con supresión iónica

COLUMNA DE SUPRESIÓN

Intercambiador aniónico fuerte

eluyente HCl

COLUMNA DE SEPARACIÓNIntercambiador catiónico fuerte

conductímetro

desecho

muestra KNO3/CaSO4

H+ + Cl- + OH– Cl– + H2O

K+

tiempo de elución

ccCa2+

Inconveniente de las columnas supresoras: necesidad de regenerarlas periódicamente a fin de convertir sus rellenos a la forma ácida o básica original.

Actualmente se dispone de supresores de membrana que operan continuamente. El eluyente y la solución supresora fluyen en direcciones opuestas en ambos lados de membranas permeables de intercambio iónico: para aniones → membranas intercambiadoras de cationes y para cationes →

intercambiadoras de aniones.

Ejemplo: para eliminar los Na+ del eluyente, en la corriente supresora fluye continuamente HCl para la regeneración. Los Na+ migran a través de la membrana y se intercambian con los H+ del reactivo regenerador. El dispositivo tiene una velocidad de intercambio muy alta.

¿Con o sin supresión?

Cromatografía de exclusión molecular

FE: geles porosos

Hidrofílicos Hidrofóbicos

Filtración en gel Permeación en gel

Fundamento de separación: separación en base a forma y tamaño del analito

Fase estacionaria: geles hidrofílicos (Sephadex), geles de poliacrilamida (biogeles), geles rígidos de sílica o vidrio con determinados tamaños de poro.

Exclusión molecular

Exclusión molecular

K = 0.2 K = 0.5Rta

Volumen

VSVM

Exclusión total

Permeación selectiva

Permeación total

102

104

106

Volumen

PM

VR - VM

VS

K =

K = 0 K = 1

Exclusión molecular

Utiliza la alta especificidad de las reacciones biológicas del tipo antígeno-anticuerpo, hormona-receptor.

Un ligando se une al soporte de la FE. Cuando la muestra atraviesa la columna solo se retiene la sustancia capaz de reaccionar con dicho ligando.

Concluida la separación, se provoca la salida de la sustancia que dio la reacción específica.

Cromatografía de afinidad

ligando unido covalentemente

empaque

muestra

analito

etapa de lavado

etapa de elución

columna regenerada

solución con analito puro

+

etapa de interacción

Cromatografía de afinidad

Métodos de Elución

Elución bioespecífica: La FM contiene un ligando de bajo peso molecular, capaz de desplazar a la macromolécula del sitio activo de la FE.Normal (interacción ligando-muestra)Inversa (interacción ligando-ligando de afinidad)

Elución no específica: La fase móvil provoca la desnaturalización de la muestra, del ligando de afinidad o de los dos.

Cromatografía de afinidad

proteínas no

deseadas

columna conteniendo polímero unido a

ligando específico para la proteína de interés

mezcla de proteínas

la proteína de interés se eluye con solución de ligando

proteína de interés

ligando

ligando unido a polímero

ligando

Cromatografía de afinidad

proteína unida a residuos de glucosa (G) ligada a la fase estacionaria

adición de glucosa (G)

proteína liberada por unión a glusosa (G) adicionada

proteína

Cromatografía de afinidad

102

103

104

105

106

PM

no polar iónicopolar no iónico

Aumento de la polaridad

adsorciónintercambio

iónico

particiónfase

reversafase

normal

exclusión

permeación en gel

filtración en gel

Elección del sistema cromatográfico

Reacciones específicas: afinidad