Cromatografa HPLC

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1 Cromatografía de Cromatografía de líquidos de alta líquidos de alta resolución resolución HPLC HPLC

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Introduccion a la cromatografia de alta resulucion

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Cromatografía de Cromatografía de líquidos de alta líquidos de alta

resolución resolución HPLCHPLC

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Qué es Cromatografía Líquida Qué es Cromatografía Líquida

de Alta Eficiencia?de Alta Eficiencia? ►La cromatografía de líquidos de alta La cromatografía de líquidos de alta

resolución, es un modo de resolución, es un modo de cromatografía en la cual el proceso cromatografía en la cual el proceso de separación y transferencia de de separación y transferencia de masa es entre la fase estacionaria y la masa es entre la fase estacionaria y la fase móvil y una temperatura dada. fase móvil y una temperatura dada.

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► La HPLC, representa una de las herramientas La HPLC, representa una de las herramientas más empleadas en el laboratorio analítico más empleadas en el laboratorio analítico moderno.moderno.

► La cromatografía es un método, usado La cromatografía es un método, usado primariamente para la separación de los primariamente para la separación de los componentes de una muestra, en la cual los componentes de una muestra, en la cual los componentes se distribuyen en dos fases.componentes se distribuyen en dos fases.

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Diferencias. Fase MóvilDiferencias. Fase Móvil► Si es un gas: Modalidad cromatográfica gaseosa.Si es un gas: Modalidad cromatográfica gaseosa.► Si es un líquido: Cromatografía líquida.Si es un líquido: Cromatografía líquida.

►Cromatografía en capa delgada.Cromatografía en capa delgada.►Cromatografía líquida en columna abierta.Cromatografía líquida en columna abierta.►HPLC.HPLC.

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DiferenciasDiferencias► HPLC y GC: Tipo de detectores y la influencia de la HPLC y GC: Tipo de detectores y la influencia de la

fase móvil.fase móvil.► GC: se utiliza para separar mezclas que contienen GC: se utiliza para separar mezclas que contienen

compuestos orgánicos volátiles.compuestos orgánicos volátiles.► En GC es muy simple encontrar detectores que En GC es muy simple encontrar detectores que

diferencien la muestra de la fase móvil. diferencien la muestra de la fase móvil. ► En HPLC es más difícil ya que la fase móvil no sólo no En HPLC es más difícil ya que la fase móvil no sólo no

es inerte sino que su masa es sensiblemente superior.es inerte sino que su masa es sensiblemente superior.

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Clasificación de la Clasificación de la Cromatografía de LíquidosCromatografía de Líquidos

► Cromatografía Líquido-Sólido.(adsorción)Cromatografía Líquido-Sólido.(adsorción)► Cromatografía Líquido-Líquido.(partición)Cromatografía Líquido-Líquido.(partición)► Cromatografía de Fase (normal y reversa)Cromatografía de Fase (normal y reversa)► Cromatografía de Intercambio iónico.Cromatografía de Intercambio iónico.► Cromatografía de Exclusión por Tamaño Cromatografía de Exclusión por Tamaño

(cromatografía en gel)(cromatografía en gel)

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Fase EstacionariaFase Estacionaria► Si la fase estacionaria es un sólido y la fase Si la fase estacionaria es un sólido y la fase

móvil un líquido la Cromatografía se denomina móvil un líquido la Cromatografía se denomina CLS.CLS.

► Análogamente existirán una cromatografía CLL, Análogamente existirán una cromatografía CLL, CGL y CG.CGL y CG.

► Así, la Cromatografía puede clasificarse en Así, la Cromatografía puede clasificarse en modalidades de afinidad y por tamaño modalidades de afinidad y por tamaño molecular.molecular.

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Clasificación por AfinidadClasificación por Afinidad

► Cromatografía en fase normal.Cromatografía en fase normal.

► Cromatografía en fase ligada.Cromatografía en fase ligada.

► Cromatografía de intercambio iónico.Cromatografía de intercambio iónico.

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De Fase LigadaDe Fase Ligada► Reemplazando el tipo común de unión de la fase Reemplazando el tipo común de unión de la fase

estacionaria a su soporte, haciéndola perdurable estacionaria a su soporte, haciéndola perdurable por medio de una unión química covalente.por medio de una unión química covalente.

► Ahora las separaciones se efectúan sobre Ahora las separaciones se efectúan sobre material químicamente modificado, con un material químicamente modificado, con un amplio rango de polaridad y selectividad.amplio rango de polaridad y selectividad.

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Intercambio iónicoIntercambio iónico

►Se emplean rellenos en los cuales Se emplean rellenos en los cuales la partícula está constituida por un la partícula está constituida por un polímero o por sílica gel, en cada polímero o por sílica gel, en cada caso unida a un grupo funcional caso unida a un grupo funcional aniónico o catiónico.aniónico o catiónico.

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Exclusión por TamañoExclusión por Tamaño► Emplea materiales de porosidad controlada, que Emplea materiales de porosidad controlada, que

funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moléculas de la muestra según un orden moléculas de la muestra según un orden decreciente de tamaño molecular.decreciente de tamaño molecular.

► Si se dispone de estándares apropiados, de peso Si se dispone de estándares apropiados, de peso molecular adecuado, puede evaluarse el PM de molecular adecuado, puede evaluarse el PM de un compuesto desconocido.un compuesto desconocido.

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Equipos

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Clasificación de EquiposClasificación de Equipos► Integrados:Integrados: Cada una de sus partes están reunidas en un Cada una de sus partes están reunidas en un

gabinete y su intercambio o conexión con otros gabinete y su intercambio o conexión con otros componentes es difícil.componentes es difícil.

► Modulares:Modulares: Los módulos son instrumentos individuales Los módulos son instrumentos individuales

que permiten no solo armar el equipo según las que permiten no solo armar el equipo según las necesidades, sino aumentar su complejidad según esa necesidades, sino aumentar su complejidad según esa necesidad varíe.necesidad varíe.

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Componentes principalesComponentes principales

► SolventeSolvente► Bomba de alta presión Bomba de alta presión ► InyectorInyector► ColumnaColumna► Detector Detector ► GraficadorGraficador

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Partes del cromatógrafo Partes del cromatógrafo En el caso más simple, el cromatógrafo líquido está En el caso más simple, el cromatógrafo líquido está constituido por:constituido por:Un reservorio de solvente que alimenta al sistema con la fase Un reservorio de solvente que alimenta al sistema con la fase móvil.móvil.Un sistema para forzar el pasaje de la muestra por la columna: Un sistema para forzar el pasaje de la muestra por la columna: Bomba.Bomba.Un sistema que permite la introducción de la muestra: Inyector.Un sistema que permite la introducción de la muestra: Inyector.Un sistema de monitoreo de la solución que emerge de la Un sistema de monitoreo de la solución que emerge de la columna: Detector.columna: Detector.Un sistema de registro de los datos proveniente del detector. Un sistema de registro de los datos proveniente del detector.

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Diagrama Básico de un Diagrama Básico de un sistema de HPLCsistema de HPLC

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EsquemaEsquema

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Bases de la separaciónBases de la separación► Cuando la fase móvil y la muestra son forzadas a Cuando la fase móvil y la muestra son forzadas a

atravesar la fase estacionaria, se presentan atravesar la fase estacionaria, se presentan diferentes tipos de interacciones: hidrofóbicas, diferentes tipos de interacciones: hidrofóbicas, puentes de Hidrógeno, interacciones dipolares y puentes de Hidrógeno, interacciones dipolares y electrostáticas, éstas son responsables de la electrostáticas, éstas son responsables de la mayor o menor afinidad de cada uno de los mayor o menor afinidad de cada uno de los componentes de la muestra por alguna de las componentes de la muestra por alguna de las fases.fases.

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SeparaciónSeparación

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Figura, 41 ExplicarFigura, 41 Explicar

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► La eficiencia de una columna cromatográfica y, La eficiencia de una columna cromatográfica y, por lo tanto, su poder separativo se mide en por lo tanto, su poder separativo se mide en función de su número de platos teóricos.función de su número de platos teóricos.

► Para lograr la separación de dos componentes Para lograr la separación de dos componentes dados, no sólo deben eluir a distintos tiempos de dados, no sólo deben eluir a distintos tiempos de retención, sino que el ancho de los picos debe ser retención, sino que el ancho de los picos debe ser tan bajo como sea posible.tan bajo como sea posible.

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►Aspectos técnicosAspectos técnicos

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► HPLC utiliza una fase móvil líquida para HPLC utiliza una fase móvil líquida para separar los componentes de la mezcla. El separar los componentes de la mezcla. El solvente trabaja a una presión de 6,000 psigsolvente trabaja a una presión de 6,000 psig

► Los componentes o analitos deben ser Los componentes o analitos deben ser disueltos en un solvente y se pasan por la disueltos en un solvente y se pasan por la columna cromatográfica a altas presiones.columna cromatográfica a altas presiones.

► La resolución depende de la interacción La resolución depende de la interacción entre el soluto , los componentes y la fase entre el soluto , los componentes y la fase estacionaria. estacionaria.

Qué es Cromatografía Qué es Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia?Líquida de Alta Eficiencia?

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Elección del SolventeElección del Solvente

Características:Características:

► Disponible comercialmente Disponible comercialmente ► Precio Precio ► Pureza y Estabilidad. En la actualidad Pureza y Estabilidad. En la actualidad

contamos con productos de calidad de contamos con productos de calidad de pureza cromatográfica. Bajo contenido de pureza cromatográfica. Bajo contenido de impurezas. impurezas.

► Disolver la muestra Disolver la muestra ► Miscible con otros solventes para formar Miscible con otros solventes para formar

mezclas útiles mezclas útiles

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Eleccción del SolventeEleccción del Solvente

Características:Características:

► No degradar o disolver la fase estacionaria No degradar o disolver la fase estacionaria ► Tener baja viscosidad para reducir las Tener baja viscosidad para reducir las

caídas de presión caídas de presión ► Ser compatible con el detector utilizado. Ser compatible con el detector utilizado.

Transparencia óptica (cuando se usan Transparencia óptica (cuando se usan detectores UV) detectores UV)

► Se prefieren solventes de punto de Se prefieren solventes de punto de ebullición intermedio.ebullición intermedio.

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Tipos de solvente

NameName MWMW BPBP I.R.I.R. UVUV ViscosidaViscosidadd µµ

      [°C][°C]   [nm[nm

]][cP][cP] [Deby[Deby

e]e]

AcetonitrileAcetonitrile 4141 8282 1.3411.341 195195 .358.358 3.373.37

DioxaneDioxane 8888 101101 1.4211.421 215215 1.261.26 0.450.45

EthanolEthanol 4646 7878 1.3591.359 205205 1.191.19 1.681.68

MethanolMethanol 3232 6565 1.3261.326 205205 .584.584 1.661.66

IsopropanolIsopropanol 6060 8282 1.3751.375 205205 2.392.39 1.681.68

TetrahydrofuraTetrahydrofurann

7272 6666 1.4041.404 215215 2.202.20 1.701.70

WaterWater 1818 100100 1.3331.333 185185 1.001.00 1.841.84

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Filtración y Desgasificación de Filtración y Desgasificación de solventessolventes

►Las partículas pueden ocasionar Las partículas pueden ocasionar costosos daños a la bomba HPLC, al costosos daños a la bomba HPLC, al guarda columnas, y en general causar guarda columnas, y en general causar desgaste del sistema de HPLC. Los desgaste del sistema de HPLC. Los fabricantes de los instrumentos tienen fabricantes de los instrumentos tienen en cuenta este problema y en cuenta este problema y recomiendan que se filtre ( 0.45 o 0.22 recomiendan que se filtre ( 0.45 o 0.22 micras) y desgasifique los solventes micras) y desgasifique los solventes HPLC antes de usarlos. HPLC antes de usarlos.

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Filtración y Desgasificación de Filtración y Desgasificación de solventessolventes

► El El Oxígeno DisueltoOxígeno Disuelto puede producir puede producir mayor interferencia en los detectores de mayor interferencia en los detectores de fluorescencia y electroquímicos.fluorescencia y electroquímicos.

► El El Nitrógeno DisueltoNitrógeno Disuelto es el otro es el otro componente de la atmósfera que puede componente de la atmósfera que puede producir burbujas en la columna de HPLC y producir burbujas en la columna de HPLC y cuando el solvente entra al detector cuando el solvente entra al detector produce picos falsos y desviaciones de la produce picos falsos y desviaciones de la línea base. línea base.

► El El Dióxido de CarbonoDióxido de Carbono disuelto algunas disuelto algunas veces puede ser la causa de los cambios de veces puede ser la causa de los cambios de pH en el sistema de solvente pH en el sistema de solvente

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Métodos de Filtración de Métodos de Filtración de Solventes en HPLCSolventes en HPLC

►Hay tres(3) métodos comunes que Hay tres(3) métodos comunes que se utilizan hoy para la filtración se utilizan hoy para la filtración previa de los Solventes en HPLC :previa de los Solventes en HPLC :

►Filtro a la Entrada del Solvente Filtro a la Entrada del Solvente ►Filtración al Vacío Filtración al Vacío ►Filtración en LíneaFiltración en Línea

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Métodos de Desgasificación Métodos de Desgasificación de Solventes en HPLCde Solventes en HPLC

► Existen cuatro métodos comunes usados Existen cuatro métodos comunes usados para desgasificar solventes en HPLC previos para desgasificar solventes en HPLC previos a su uso:a su uso:

► Sonificación Sonificación ► Burbujear Helio Burbujear Helio ► Desgasificación Electrónica en la Línea del Flujo Desgasificación Electrónica en la Línea del Flujo ► Desgasificación al Vacío en Línea Desgasificación al Vacío en Línea ► TemperaturaTemperatura

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Preparación de fase móvilPreparación de fase móvil

► Ajuste de pH, parámetro critico en la Ajuste de pH, parámetro critico en la retención de solutos ionizables ( medir antes retención de solutos ionizables ( medir antes de dosificar modificador orgánico)de dosificar modificador orgánico)

► El pH de la solución aumenta con la El pH de la solución aumenta con la incorporación de un modificador orgánico.incorporación de un modificador orgánico.

► A valores pH mayores de 7.5 disolución de A valores pH mayores de 7.5 disolución de sílice ( sangrado) sílice ( sangrado)

► A pH menor a 2 se hidroliza la unión entre A pH menor a 2 se hidroliza la unión entre la sílice y la fase enlazada.la sílice y la fase enlazada.

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BombasBombas

Requisitos o aspectos más importantes Requisitos o aspectos más importantes que debe reunir una bomba o sistema que debe reunir una bomba o sistema de bombeo:de bombeo:

►Debe producir presiones estables Debe producir presiones estables hasta 6000 psi. hasta 6000 psi.

►Mantener el flujo libre de pulsaciones Mantener el flujo libre de pulsaciones ►Generar intervalos de caudales de Generar intervalos de caudales de

flujo (0,1 a 10 ml/min).flujo (0,1 a 10 ml/min).

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BombasBombas

►Control y reproducibilidad del flujo de Control y reproducibilidad del flujo de

solvente solvente ►Componentes de la bomba resistentes Componentes de la bomba resistentes

a la corrosión a la corrosión

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►Las bombas que se usan en HPLC se Las bombas que se usan en HPLC se pueden clasificar según su pueden clasificar según su funcionamiento y diseño en:funcionamiento y diseño en:

►Mecánicas Mecánicas Recíprocantes Recíprocantes De desplazamiento contínuo De desplazamiento contínuo

►Neumáticas Neumáticas

BombasBombas

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BombasBombas

Principio de la bomba reciprocante

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►Velocidad de flujo (0.01 a 0.5 ml/min, 0.1 Velocidad de flujo (0.01 a 0.5 ml/min, 0.1 y mayores con presión de 0 hasta 6000 y mayores con presión de 0 hasta 6000 psipsi

►Exactitud de flujo 0.5 % +/- 1.0 %Exactitud de flujo 0.5 % +/- 1.0 %►Precisión +/- 0.1 % a 0.3 %Precisión +/- 0.1 % a 0.3 %►Ruido : pulsaciones en intervalos de Ruido : pulsaciones en intervalos de

tiempotiempo►Deriva: cambios en intervalos de Deriva: cambios en intervalos de

tiempotiempo

Bomba w 600Bomba w 600

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Programación del SolventeProgramación del Solvente

► Existen dos métodos de programación de Existen dos métodos de programación de Solvente en HPLC:Solvente en HPLC: Isocrático Isocrático

Gradiente de Elución. Es un término que Gradiente de Elución. Es un término que se utiliza para describir el proceso se utiliza para describir el proceso mediante el cual se cambia la mediante el cual se cambia la composición de la fase móvil. Pueden composición de la fase móvil. Pueden efectuarse de dos maneras: efectuarse de dos maneras:

►A baja presión A baja presión ►A alta presión A alta presión

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Sistemas de Inyección de Sistemas de Inyección de muestramuestra

►Estos sistemas han variados durante la Estos sistemas han variados durante la historia del sistema de HPLC, en un historia del sistema de HPLC, en un principio de utilizaba la inyección de la principio de utilizaba la inyección de la muestra con jeringas de alta presión muestra con jeringas de alta presión cuales ya están de desuso. Hoy se cuales ya están de desuso. Hoy se utiliza el sistema de Válvulas utiliza el sistema de Válvulas inyectorasinyectoras

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Sistemas de Inyección de Sistemas de Inyección de muestramuestra

►Generalmente se usa una válvula Generalmente se usa una válvula muestreadora con jeringa.muestreadora con jeringa.

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►Válvula muestreadoraVálvula muestreadora

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ColumnaColumna

►Actualmente todas las columnas Actualmente todas las columnas son de acero inoxidable 316 con son de acero inoxidable 316 con diámetro interno de 2.6 a 3 mm o 4.6 diámetro interno de 2.6 a 3 mm o 4.6 a 5 mm , casi todas con un diámetro a 5 mm , casi todas con un diámetro externo de ¼ de pulgada externo de ¼ de pulgada

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Fase estacionariaFase estacionaria

► Principales parámetros de la fase Principales parámetros de la fase estacionariaestacionaria

► Tamaño de partícula: 3 a 10 µm Tamaño de partícula: 3 a 10 µm ► Distribución de partícula : con una Distribución de partícula : con una

desviación máxima del 10 % desviación máxima del 10 % ► Tamaño de poro : 70 a 300 Å; Tamaño de poro : 70 a 300 Å; ► Área superficial : 50 a 250 mÁrea superficial : 50 a 250 m22/g /g ► Densidad de la fase (numero de sitios Densidad de la fase (numero de sitios

activos por unidad de área): 1 a 5 por 1 nmactivos por unidad de área): 1 a 5 por 1 nm22

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La tabla que se muestra presenta los parámetros principales de algunos adsorbentes comerciales

NombreNombreVporVpor

ooDporDpor

ooÁrea Área Sup.Sup.

Distribución Distribución de partículade partícula

densidad densidad de la de la fasefase

   ml/gml/g ÅÅ mm22/g/g %% µM/mµM/m22

IB-Sil Phen.IB-Sil Phen. 0.750.75 125125 165165 5.55.5 2.742.74

Hypersil C4 (3)Hypersil C4 (3) 0.60.6 300300 5050 2.02.0 4.804.80

Supelcosil C8 Supelcosil C8 (3)(3) 0.60.6 100100 170170 8.58.5 --

Spherisorb C8Spherisorb C8 0.50.5 8080 220220 6.06.0 2.512.51

Novapak C18Novapak C18 0.30.3 6060 120120 7.07.0 3.03.0

IB-Sil C18IB-Sil C18 0.750.75 125125 165165 11.011.0 3.273.27

Spherisorb Spherisorb C18C18 0.50.5 8080 220220 12.012.0 2.722.72

Prodigy C18Prodigy C18 1.171.17 150150 310310 18.718.7 3.303.30

Inertsil C18Inertsil C18 1.11.1 150150 320320 18.518.5 3.233.23

Hypersil C8Hypersil C8 0.70.7 120120 170170 7.07.0 3.853.85

Hypersil C18 Hypersil C18 (3)(3) 0.70.7 120120 170170 10.010.0 2.842.84

Selectosil C18Selectosil C18 0.90.9 300300 110110 7.07.0 2.932.93

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ColumnaColumna

►Fuentes de daño de una columna de Fuentes de daño de una columna de HPLC: HPLC: Obstrucción por partículas pequeñas en Obstrucción por partículas pequeñas en

los solventes o fases móviles los solventes o fases móviles Obstrucción por materiales no eluídos Obstrucción por materiales no eluídos

en las muestras en las muestras Variación de las características de Variación de las características de

retención por incremento de materiales retención por incremento de materiales no eluídos no eluídos

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DetectoresDetectores

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DetecciónDetección

► La eficiencia de un detector cromatográfico La eficiencia de un detector cromatográfico depende de la relación entre la cantidad física depende de la relación entre la cantidad física medida y la composición del efluente, así como medida y la composición del efluente, así como también de las características de las señal de también de las características de las señal de transferida.transferida.

Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en:Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en:► Detectores basados en una propiedad de la fase Detectores basados en una propiedad de la fase

móvil . móvil . Ejemplo: Detector de Indice de RefracciónEjemplo: Detector de Indice de Refracción ► Detectores basados en una propiedad de la Detectores basados en una propiedad de la

sustancia a separar.sustancia a separar. Ejemplo: Detector de Fluorescencia, Detector Ejemplo: Detector de Fluorescencia, Detector UltravioletaUltravioleta

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DetecciónDetección

►Detector UV. Hay básicamente tres Detector UV. Hay básicamente tres tipos: tipos:

Detector de Longitud de Onda Fija Detector de Longitud de Onda Fija Detector de Longitud de Onda Variable Detector de Longitud de Onda Variable Detector de Arreglo de Diodos Detector de Arreglo de Diodos

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DetecciónDetección

► Detector UV. Hay básicamente tres tipos: Detector UV. Hay básicamente tres tipos: Detector de Longitud de Onda Fija Detector de Longitud de Onda Fija

El espectro se divide en :El espectro se divide en : infrarrojo (IR)infrarrojo (IR) 2,500 - 50,000 2,500 - 50,000 Infrarrojo cercanoInfrarrojo cercano800 - 2,500 800 - 2,500 VisibleVisible 400 - 800 400 - 800 Ultravioleta (UV)Ultravioleta (UV) 190 - 400 nm190 - 400 nm

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DetecciónDetección

►Detector de Índice de Refracción. Detector de Índice de Refracción. Existen muchos diseños de estos Existen muchos diseños de estos detectores, pero solamente existen detectores, pero solamente existen ahora dos tipos: ahora dos tipos:

Tipo Deflexión Tipo Deflexión Tipo Fresnel Tipo Fresnel

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DetecciónDetección

►Detector de Fluorescencia. Detector de Fluorescencia. Este detector solamente puede detectar Este detector solamente puede detectar

compuestos que tengan fluorescencia compuestos que tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatización . nativa o inducida por derivatización .

►Detector de Fluorescencia Inducida Detector de Fluorescencia Inducida por Laser por Laser Según la Fuente de Excitación Según la Fuente de Excitación Según el sistema óptico Según el sistema óptico

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CatálogoCatálogo

►Revisar catalogoRevisar catalogo Preparación de la muestraPreparación de la muestra Características de columnasCaracterísticas de columnas Aplicaciones especificasAplicaciones especificas

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Problemas más comunes Problemas más comunes encontrados en HPLCencontrados en HPLC

► Esta es una lista de los problemas Esta es una lista de los problemas normalmente encontrados en HPLC, sus normalmente encontrados en HPLC, sus posibles causas posibles, y cómo posibles causas posibles, y cómo solucionarlos. solucionarlos.

► Presión AltaPresión Alta Posible causa:Posible causa: Obstrucción de la Columna de HPLC o Obstrucción de la Columna de HPLC o

Guarda Columna por partículas. Guarda Columna por partículas. Solución: Solución: Invierta la Columna y Enjuagar con solvente, Invierta la Columna y Enjuagar con solvente,

teniendo la columna desconectada del detector. Si esto no teniendo la columna desconectada del detector. Si esto no funciona reemplace el fritado a la entrada de la columna. funciona reemplace el fritado a la entrada de la columna. Si la presión sigue alta reemplace la columna. Si la presión sigue alta reemplace la columna.

Solución a largo plazo:Solución a largo plazo: Asegurase que todas las fases Asegurase que todas las fases móviles se filtren apropiadamente antes que entren a la móviles se filtren apropiadamente antes que entren a la bomba de HPLC . También filtre todas las muestras antes bomba de HPLC . También filtre todas las muestras antes de inyectarlas.de inyectarlas.

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Problemas más comunes Problemas más comunes encontrados en HPLCencontrados en HPLC

► Pérdida de la ResoluciónPérdida de la Resolución

Posible causa:Posible causa: Obstrucción de la Columna Obstrucción de la Columna de HPLC ó del Guarda Columna por de HPLC ó del Guarda Columna por partículas. partículas.

Solución: Solución: vea la sección de Presión Alta vea la sección de Presión Alta Solución a largo plazo:Solución a largo plazo: Filtrar todo antes Filtrar todo antes

de que se introduzcan las fases móviles de que se introduzcan las fases móviles en el sistema de HPLC. en el sistema de HPLC.

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Problemas más comunes Problemas más comunes encontrados en HPLCencontrados en HPLC

► Picos HendidosPicos Hendidos

Posible causa :Posible causa : Obstrucción de la Columna Obstrucción de la Columna de HPLC o del Guarda Columna por de HPLC o del Guarda Columna por partículas. partículas.

SSolución: olución: La columna se desatornilla. Si es La columna se desatornilla. Si es necesario reemplazar la columna. necesario reemplazar la columna.

Solución a largo plazo: Solución a largo plazo: Filtrar todo antes Filtrar todo antes que se introduzcan las fases móviles en el que se introduzcan las fases móviles en el sistema de HPLC. sistema de HPLC.

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Problemas más comunes Problemas más comunes encontrados en HPLCencontrados en HPLC

► Variación en los Tiempos de RetenciónVariación en los Tiempos de Retención

Posible causa :Posible causa : Aire atrapado en la bomba Aire atrapado en la bomba debido a gases disueltos en fase móvil. debido a gases disueltos en fase móvil.

Solución: Degasificación de la Solución: Degasificación de la BombaBomba Solución a larga plazo:Solución a larga plazo: Asegurase fase Asegurase fase

móvil este propiamente y adecuadamente móvil este propiamente y adecuadamente desgasificada. Si usa desgasificación desgasificada. Si usa desgasificación electrónica en la línea asegurarse de que electrónica en la línea asegurarse de que la cadencia del flujo no es demasiado alto. la cadencia del flujo no es demasiado alto.

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Problemas más comunes Problemas más comunes encontrados en HPLCencontrados en HPLC

► Variaciones de la Línea BaseVariaciones de la Línea Base

Posible causa:Posible causa: Burbujas del aire atrapados Burbujas del aire atrapados en la celda del detector debido a una en la celda del detector debido a una mala desgasificación de los solventes de mala desgasificación de los solventes de la fase móvil. la fase móvil.

Solución:Solución: Asegurese que todas las fases Asegurese que todas las fases móviles estén debidamente móviles estén debidamente desgasificadas y considerar el uso de un desgasificadas y considerar el uso de un restrictor de la presión a toma de restrictor de la presión a toma de corriente del detector.corriente del detector.

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Problemas más comunes Problemas más comunes encontrados en HPLCencontrados en HPLC

► Línea Base con mucho RuidoLínea Base con mucho Ruido

Posible causa: Posible causa: Aire atrapado en celda del Aire atrapado en celda del detector o en la bomba. detector o en la bomba.

Solución:Solución: Enjuage el sistema y purge la Enjuage el sistema y purge la bomba de HPLC . Use Solventes bomba de HPLC . Use Solventes desgasificados adecuadamente para desgasificados adecuadamente para mantener constante la velocidad de flujo mantener constante la velocidad de flujo de la fase móvil del sistema. de la fase móvil del sistema.

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Problemas más comunes Problemas más comunes encontrados en HPLCencontrados en HPLC

► Picos Falsos (Detectores Electroquímicos y Picos Falsos (Detectores Electroquímicos y de Fluorescencia)de Fluorescencia)

Posible causa:Posible causa: Oxígeno Disuelto Oxígeno Disuelto Solución:Solución: Desgasificar adecuadamente las Desgasificar adecuadamente las

fases móviles para reducir la fases móviles para reducir la concentración de oxígeno disuelto. concentración de oxígeno disuelto.

Solución a largo plazo: Solución a largo plazo: Agregar un Agregar un sistema de filtración al vacío en línea. sistema de filtración al vacío en línea. Periódicamente chequear el nivel de Periódicamente chequear el nivel de oxígeno disuelto. oxígeno disuelto.

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Problemas más comunes Problemas más comunes encontrados en HPLCencontrados en HPLC

► Baja ó Ninguna PresiónBaja ó Ninguna Presión

Posible causa: Posible causa: Trabajar con bombas, Trabajar con bombas, sellos ó pistones expuestos por mucho sellos ó pistones expuestos por mucho tiempo a partículas en suspensión en la tiempo a partículas en suspensión en la fase móvil. fase móvil.

Solución:Solución: Reemplace los sellos o pistones, Reemplace los sellos o pistones, si es necesario.si es necesario.