INTRODUCCIÓN A LA CROMATOGRAFÍA

FASES CROMATOGRAFICAS Y APLICACIONES

Curso Química Analítica Cualitativa

Jorge Yáñez S

Depto. de Química Analítica e Inorgánica Facultad de Ciencias Químicas

Universidad de Concepción

FASES ESTACIONARIAS Y FASES MÓVILES EN CROMATOGRAFÍA

LÍQUIDA • La fase estacionaria requiere materiales estables que no reaccionen con la fase móvil o

que no sufra un deterioro por el paso o condiciones químicas de ésta. - resistencia mecánica (presión, flujo, temperatura) - resistencia química (pH, oxidantes) • Para cumplir estas características se usan materiales relativamente inertes como fase

estacionaria. • La fase estacionaria está constituida generalmente por dos componentes:

- soporte mecánico de llamado relleno - fase ligada

a) Soporte mecánico de llamado relleno - Características importantes del soporte son: - tamaño de grano (generalmente muy pequeño, 5 - 100µ) - regularidad de tamaño (poca dispersión de tamaño), - tamaño de poro (son generalmente porosos) - regularidad de su forma. - Soportes más frecuentes:

♦ Gel de sílice o sílica g el (SiO2 n H2O) ♦ Alúmica (Al2O3 n H2O) ♦ Celulosa ♦ Poliestireno con grupos funcionales

- Gel de sílice o sílica gel (SiO2 n H2O) ♦ Es el más usado que presenta en su superficie grupos ligantes Si-O-H. ♦ La sílice cumple con todas las características de estabilidad mecánica y química. ♦ Generalmente se usan partículas muy pequeñas de sílice (3 - 100 µm de diámetro), las

que se clasifican según su estructura en:

ü Partículas Porosas ü Partículas Peliculares ü Mallas monolítica:

Partículas porosas regulares e irregulares y no porosas o peliculares.

- Alúmica (Al2O3 n H2O) - También presenta grupos ligantes del tipo Al-O-H. - El tipo de cromatografía en que más se usa este tipo de fase estacionaria (sílice y

alúmina) es en la cromatografía de adsorción - Los grupos funcionales hidroxilos (OH-) sirven para establecer uniones débiles del tipo

dopolo-dipolo, puentes hidrógeno y uniones tipo con los solutos y de esta forma se produce la adsorción de moléculas sobre la fase estacionaria.

- Celulosa

Se usa como soporte pero es menos frecuente por su menor estabilidad a condiciones drásticas.

- Poliestireno con grupos funcionales

Grupos carboxílicos, sulfonatos (aniónicos) y grupos áminos (positivos).

b) Fase ligada - En la cromatografía de reparto líquido - líquido (separación por solubilidad) se une

químicamente una fase líquida a la superficie de las partículas de relleno (sílica o alúmina).

- En este caso el relleno actúa como soporte físico de la fase líquida que está ligada. - Esta fase ligada es en escencia la verdadera fase estacionaria que interacciona física y

químicamente con los solutos. - La fase ligada son grupos químicos determinados que pueden unirse químicamente al

soporte según la ecuación general: Ejemplo: CH3 CH3 -HCl Si-OH + Cl - Si - R ------------- Si - O - Si - R CH3 CH3 soporte fase ligada Fase estacionaria ligada

Las fases ligadas se dividen por su grado de polaridad en: - Polares - Poco Polares - Apolares Tabla 1. Fases ligadas más comunes en cromatografía líquida R - Polares R - Apolares comunes (CH2)3-NH2 (amino) (CH2)17- CH3 (octadecilo) (CH2)3- CN (ciano) (CH2)7 - CH3 (octilo)

(CH2)3- OCH (OH) CH2OH (diol) (CH2)3- CH3 (Butilo) (CH2) - CH3 (Etilo) (CH2)3- C6H11 (hexilo) (CH2)3- C6H5 (fenilo)

- Cuando la fase estacionaria presenta grupos apolares y la fase móvil es un solvente

polar o poco polar se habla de: - HPLC en fase reversa o cromatografía en fase reversa (abreviado como RP-HPLC, del

inglés Reverse Phase HPLC). - Cuando la fase móvil es menos polar que la fase estacionaria se habla de

cromatografía en fase normal.

Fases Móviles más comunes en Cromatografía líquida Solventes químicos con las siguientes características: - ser de alta pureza, ya que generalmente las impurezas dañan o inactivar sitios activos

de la fase estacionaria - ser un buen disolvente para los compuestos a separar (para no producir

precipitaciones dentro del sistema) - no reaccionar con los solutos - estar libre de gases para no producir volumen muerto por aparición de burbujas en el

sistema, y también debe poseer características físicas y químicas definidas como: - polaridad - pH - temperatura - fuerza iónica

- propiedades ópticas que puedan afectar la detección de los solutos

Fases Móviles más usadas:

Solvente ε° (para la alúmina) Solvente ε° (para la alúmina) Fluoroalcanos -0.25 diclorometano 0.42

n-pentano 0.00 tetrahidrofurano 0.45

i-octano 0.01 1,2-dicloroetano 0.49

n-heptano 0.01 2-butanona 0.51

n-decano 0.04 acetona 0.56

ciclohexano 0.04 dioxano 0.56

ciclopentano 0.05 acetato de etilo 0.58

disulfuro de carbono 0.15 acetato de metilo 0.60

tetracloruro de carbono 0.18 1-pentanol 0.61

1-cloropentano 0.26 dimetilsulfóxido 0.62

eter isopropilico 0.28 anilina 0.62

cloruro de isopropilo 0.29 nitrometano 0.64

tolueno 0.29 acetonitrilo 0.65

1-cloropropano 0.30 piridina 0.71

clorobenceno 0.30 2-propanol 0.82

benceno 0.32 etanol 0.88

bromoetano 0.37 metanol 0.95

eter dietilico 0.38 1,2-etanodiol 1.11

cloroformo 0.40 acido acetico Largo

1. Mezclas de solventes en F.M. - Los solventes son usados generalmente en mezcla para conseguir así una fase móvil de

polaridad definida.

Por ejemplo: Fase móvil constituida por metanol y agua, la polaridad de esta mezcla aumenta a medida que se incrementa la proporción de agua y vice versa.

Otras características como el pH son reguladas utilizando tampones en su composición química.

- Elución isocrática (1 solo solvente) Ø Si para la elución de los compuestos separados en una columna o en capa fina se usa un

solo solvente como fase móvil durante toda la elución. - Elución en gradiente Ø Si la elución se realiza con una mezcla de solventes y la composición de la mezcla se

varía durante la elución, se habla de elución con gradiente de solventes. Ø La elución con gradiente puede ser dinaria (dos solventes), terciaria (tres solventes) y

cuaternaria (cuatro solventes). Ø La elución en gradiente se utiliza preferentemente para aumentar la velocidad de

elución de los compuestos retenidos en la fase estacionaria.

Ejemplo de elusión en gradiente e isocrática

Cómo seleccionar el tipo de cromatografía a usar para una separación Ø Basarse en las características físico-químicas de los analitos: - peso molecular - la solubilidad - carga iónica - acidez Ø Con estos datos se debe también seleccionar la fase móvil y la fase estacionaria a

utilizar.

fase ligada: C1 - C18

Cromatografí a en fase reversa

solubles en solventesapolares y/o poco polares

C6 - CHCl3

fase ligada: sí lice, ciano, amino, diol

Cromatografí a en fase normal

solubles en solventes demayor polaridadCHCl3 o CH3OH

soluble en solvente orgá nico

fase ligada: ciano, amino, diol

Cromatografí a en fase normal0

Cromatografí a en fase reversa

No ió nico

Cromatografí a de intercambio ió nico

ió nico

soluble en agua

peso molecular < 1000

fase ligada: C4 - C8 - C18

Cromatografí a en fase reversa

Tamañ o molecularmenor a 30 nm

Cromatografí a de exclusió n molecular

Tamañ o molecularmenor a 30 nm

soluble en solvente orgá nico

fase ligada: C4 - C8 - C18

fenilo o poliester

Cromatografí a en fase reversa

Tamañ o molecularmenor a 30 nm

Cromatografí a de exclusió n molecular

Tamañ o molecularmenor a 30 - 400 nm

No ió nico

Cromatografí a de intercambio ió nico

ió nico

soluble en agua

peso molecular > 1000

Configuración general de un sistema de cromatografía líquida de alta eficiencia

(HPLC)

Los componentes modulares de un cromatógrafo de HPLC son:

Ø Una bomba de alta presión Ø Recipientes de la fase móvil (uno o más solventes) Ø Una unidad de gradiente Ø Válvula de inyección de la muestra Ø Un detector que permite identificar la salida de los solutos separados. Ø Un registrador gráfico de las señales del detector

pre-columna columna

Horno Termostatizado(optativo)

F l o w r a t e : 2 m L / m i n

carrier

Sistema de Elución conGradiente (optativo)

Sistema de Inyeccion

válvula

Probe 9 200 µL

autosampler (optativo)

Soluciones de Elución (1 ó más)

Bomba HPLC(isocrática)

Flowrate: 2 mL/min

Sistema de Detección

integrador(optativo)

Sistema de Presentaciónde Señales y

cuantificación de datos

UV-VIS

Conductividad

Fluorescencia

Refractométrico

Electroquímico

Polarimétrico

computador consoftware

Sistema de Separación

Sistema de Columnas

Ejemplos de distintas columnas utilizadas en HPLC

20 cm

EJEMPLOS DE SEPARACIONES UTILIZANDO HPLC 1.- Separación de alcanos lineales mediante cromatografía de reparto Sólo se puede considerar el número de carbonos como característica diferenciadora para una separación cromatográfica. A continuación se presenta la separación de alcanos lineales (C5 hasta C17) en una muestra sintética. Ø Condiciones de la separación cromatográfica Cromatografía de reparto en fase reversa (RP-HPLC) Fase móvil metanol 100% (poco polar) Fase estacionaria columna cerrada con material de relleno sílica gel con fase ligada C18

ó octadesilo (ODS) Detector UV-VIS (los alcanos absorben luz en el rango ultravioleta, 215nm) Mientras más larga la cadena carbonada del alcano, mayor tiempo permanecerá éste en la fase estacionaria apolar (C18, octadecilo) y su tiempo de retención será mayor.

2.- Separación de fenilalcanos mediante cromatografía de reparto En sus características químicas, los fenilalcanos son prácticamente iguales. La interacción con la fase móvil y la fase estacionaria es del mismo tipo y sólo se puede considerar el número de carbonos de la cadena unida al fenilo como característica diferenciadora para una separación cromatográfica. A continuación se presenta la separación de los fenil alcanos (fenil-C0 hasta fenil-C5) en una muestra sintética. Ø Condiciones de la separación cromatográfica Cromatografía de reparto en fase reversa (RP-HPLC) Fase móvil metanol 100% (poco polar) Fase estacionaria columna cerrada con material de relleno sílica gel recubierta por

grupos ligados octadesilo o C18 (ODS) Detector UV-VIS (todos los compuestos cíclicos absorben luz en el rango ultravioleta, alrededor de 254nm)

Si se quisiera disminuir el tiempo de análisis y acortar los tiempos de retención, se podría disminuir la polaridad de la fase móvil, agregando por ejemplo acetonitrilo (metanol/acetonitrilo = 50/50%v/v).

3.- Separación de anilinas (colorantes) mediante cromatografía de adsorción En sus características químicas, las anilinas (o-, m- y p-nitronanilina) son prácticamente iguales. La interacción con la fase móvil y la fase estacionaria es del mismo tipo, pero se puede considerar la diferencia de la interacción dipolo-dipolo de los 3 ordenamientos estructurales de las anilinas y la fase estacionaria como principio para una separación. A continuación se presenta la separación de las o-, m- y p-nitronanilinas en una muestra sintética. Condiciones : Cromatografía de adsorción en sílica gel Fase móvil heptano/tetrahidrofurano (87/13%v/v), apolar Fase estacionaria columna cerrada con material de relleno sílica gel Detector UV-VIS (todos los compuestos cíclicos absorben luz en el rango ultravioleta, alrededor de 254nm). Interacción dipolo-dipolo de anilinas y fase estacionaria (sílica gel). Interacción óptima menor débil

OH

NO2

H2N

OH

NO2

H2N

OH

H2N NO2

OH OHOH

Cromatograma de esta separación:

4.- Separación de proteinas de diferente peso molecular (tamaño) mediante permeación o filtración en gel Las proteinas pueden ser separadas en base a su tamaño mediante una fase estacionaria que posee retículos de tamaño determinado en donde son incluidas las proteinas durante su paso por la columna. A continuación se presenta la separación de proteinas ovoalbúmina, quimotripsinógeno A, citocromo C y lisozima. Condiciones de la separación Cromatografía de filtración en gel o exclusión por tamaño Fase móvil buffer fosfato pH 7 Fase estacionaria columna cerrada con material de relleno polieter hidroxilado con

tamaño de partícula de 10 µm y poros de 130 A (rango de pesos moleculares a separar 500-80.000 Daltons)

Detector UV-VIS (todos las proteinas absorben luz en el rango ultravioleta, alrededor de 214nm)

Cromatograma de esta separación:

Peak de identificación Peso Molecular 1.- Tiroglobulina 660000

2.- Serino albúmina de bovino 67000 3.- B-Lactoglobulina 35000

4.- Mioglobina 17000 5.- Citocromo C 13000 6.- Tetraglicina 216

Columna: PE TSK G2000SW 7,5 mm x 30 cm (x2) Fase Móvil: NaCl 0.3 M en buffer fosfáto 0.1 M, pH 7.0

Velocidad de elusión: 0.5 mL/min.

5.- Separación de cationes por cromatografía de intercambio iónico Los cationes pueden ser separados en base a su carga y tamaño mediante una fase estacionaria que posee grupos aniónicos en los cuales se produce la interacción de cargas. A continuación se presenta la separación de cationes Li+, Na+, NH4

+, K+, Mg++, Sr++, Ba++ en una muestra sintética. Condiciones de la separación Cromatografía de intercambio iónico Fase móvil ácido ftálico 10 mM, tampón tris pH 5 (tris-hidroximetil

aminometano) Fase estacionaria columna cerrada con resina de intercambio catiónico (grupos

sulfonatos) Detector conductividad eléctrica

Resina de intercambio catiónico (sulfonatos)

Cromatogramas: