INTRODUCCIÓN A LA BIOTECNOLOGÍA

Miguel Zarzar Maza

Ingeniero Civil Bioquímico

Solubilización de un sulfuro u óxido insoluble mediante la acción de microorganismos.

Tecnología simple y con bajos requerimientos de costos de capital.

Otros términos:Lixiviación bacterianaLixiviación microbianaBiooxidaciónBiohidrometalurgiaBiominería

A.C (Época de los Romanos): Acción bacteriana natural en Minas de Cobre

1947-1953: Demostración de la participación de microorganismos en el proceso de disolución del metal (Aislamiento de especies de Thiobacillus)

1950-1980: Utilización de biolixiviación en botaderos (relaves, ripios) y minerales de baja ley (< 0,5% Cu)

1980-1981: Puesta en marcha de la mina Lo Aguirre de Minera Pudahuel con una planta piloto de Biolixiviación; y patentamiento del proceso de lixiviación TL de Pudahuel

Fenómeno genómico

Fenómenos de Transporte

Fenómeno Biológico

BIOPROCESOSBIOPROCESOS BIOLOGÍABIOLOGÍAMOLECULARMOLECULAR

Conocimiento de los microorganismos lixiviantes y su comportamiento.

Estudio de las condiciones de operación que favorecen la acción microbiana.

MATERIA

PRIMA

PROCESO:•Pretratamiento•Transformación•Recuperación

PRODUCTO

BIOPROCESO: Agentes de BIOPROCESO: Agentes de transformación son célulastransformación son células

LitótrofosAutótrofos (heterótrofos?)Acidófilos

Grupo Primario: ferrooxidantes (autótrofos – CO2)Grupo Secundario: sulfooxidantes (autótrofos)Grupo Terciario: acidofilos heterotrofos (C

orgánico)FerrooxidantesFerroreductoresSulfooxidantes

Microorganismo

Fe oxidantes

Leptospirillum ferroxidans Mesófilo

L. ferriphilum Mesófilo/termotolerante

L. thermoferroxidans Termófilo moderado

Ferrimicrobium acidiphilum Mesófilo

Ferroplasma acidiphilum Mesófilo

S oxidantes

Acidithiobacillus thioxidans Mesófilo

At. caldus Termófilo moderado

Metallosphaera spp. Termófilo extremo

Sulfulobus spp. Termófilo extremo

Fe y S oxidantes

At. Ferroxidans Mesófilo

Acidianus spp. Termófilo extremo

Sulfulobus metallicus Termófilo extremo

Microorganismo

Fe reductores

Acidiphilum spp. Mesófilo

Fe oxidantes/reductores

Acidimicrobium ferrooxidans Termófilo moderado

Fe oxidantes/reductores y S oxidantes

Sulfobacillus spp. Mesófilos y termófilos moderados

Procesos basados en irrigación:Lixiviación en botaderosLixiviación en pilasMinería in situ

Procesos en estanques agitados

H2SO4

Nutrientes

Electroobtención (EW)

COBRE

Pila de mineral

Extracción por solvente (SX)

water & nutrients mineral concentrate

liquid pH adjustment & disposal

make-up tank

primary aeration tanks

secondary aeration tanks settling tank

solids to cyanidation & gold recovery

Operaciones comerciales en estanques de biolixiviación: (a) reactor Sao Bento BIOX, Brazil; (b) Planta Tamboraque BIOX, Peru; (c) Planta Laizhou Mintek-BacTech, China; (d) Planta Sansu BIOX, Ghana (from Rawlings et al., Trends in Biotechnology 21 (2003)

El oxígeno no es un buen oxidante de pirita en comparación al ión férrico:

Regeneración del ión férrico:

2 22 2 43,5 2 2FeS O Fe SO H

3 2 22 2 414 8 15 2 16FeS Fe H O Fe SO H

2 32 214 3,5 14 14 7Fe O H Fe H O

FeS2

Fe3+

Fe2+

Microbio

Sulfuros metálicos insolubles en ácido (FeS2, MoS2 and WS2) Sólo se disuelven vía oxidación del ión férrico

Sulfuros metálicos hidrolizables por ácido (ZnS, NiS, CuS and Cu2S, et al.)Son susceptibles al ataque de protonesTambién son susceptibles a la oxidación por ión

férrico

FeS2

Fe3+

Fe2+ + S2O32-

FeOM

SOM

SO42-

After Schippers and Sand, Appl. Environ. Microbiol. 1999

After Schippers and Sand, Appl. Environ. Microbiol. 1999

ZnS

H+

Zn2+ + Sn2- S8

SO42-

SOM

Se consideraba que ocurría mediante un mecanismo “directo” o “indirecto” (Silverman, M.P., 1967, J. Bacteriology)

En el mecanismo directo, los microbios catalizarían la disolución del sulfuro por una reacción enzimática e implicaría su unión al mineral.

El mecanismo indirecto ocurriría vía ión férrico mediante microbios adheridos y plantónicos.

Ahora se acepta que el ión férrico solamente es el oxidante de los sulfuros metálicos.

Por lo tanto, los términos mecanismos “directo” e “indirecto” deberían ser reemplazados por mecanismos “con contacto” y “sin contacto”.

FeS2

Fe3+

Fe2+

S2O32-

Células Adheridas(“Lixiviación con contacto”)

FO

B

Fe2+

Fe3+

Células Remotas(“Lixiviación sin contacto”)

FO

B

SO42-, H+S

OB

Crecimiento celular:

CÉLULA

Energía

Nutrientes

CO2

O2

Células

Producto

Calor

Información genética

Fe2+

S red.

NPMgCaK

Fe3+

H+

Condiciones adecuadas de pH y temperatura

Variables de operación que afectan el comportamiento de los microorganismos lixiviantes:MineralCondiciones nutricionalesCondiciones ambientales

Cambios operacionales de mayor impacto en la biolixiviación:Tipo de mineralModalidad de operaciónAireaciónMonitoreo

Oxidados (lixiviación ácida) y Sulfurados (pirometalurgia)

Sulfuros primariosCalcopirita (CuFeS2)Enargita (Cu3AsS4)

Sulfuros secundarios Calcosina (Cu2S)Covelina (CuS)Bornita (Cu5FeS4)

Influye en la velocidad del proceso y en los costos asociados a molienda

Tamaños:Percolación: 13 a 200 mmReactores agitados: 100 μm

AglomeradoMayor permeabilidadMayor homogeneidad

DEMANDA

OFERTA><

l·CO2+m·NH3+p·(Fe2++H+)+n·O2

CdHeOfNg+p·Fe3++t·H2O

CO2+0.17NH3+71.4(Fe2++H+)+16.7O2

CH2.16O0.46N0.17+71.4Fe3++34.9H2O

YCEL/O2 = 0.06

YCEL/CO2 = 1

En la ecuación:

O2/CO2 = 16.7

En el aire:

O2/CO2 = 700

Células

Cu2+

Fe2+, Fe3+

pH, Eh, acidez

Al3+, SO42-

Metales pesados

Cuantificación de microorganismos

Control de disponibilidad de O2 y CO2

Control de pH

Control de temperatura

Aumentar la biomasa por kilo de mineral

Microorganismos más resistentes a inhibiciones

Mayor desafío a futuro:

Lograr un proceso rentable para la biolixiviación de CALCOPIRITA

Bioidentificación y Control del Proceso (biomonitoreo) de Microorganismos: ¿Quiénes, cuántos, que hacen?

Selección de Microorganismos eficientes y control de su crecimiento de acuerdo al diseño del proceso

Optimización del crecimiento de los microorganismos adecuados

Estado del Arte

• ¿Cuántos MO? Técnicas Microbiológicas: Recuento óptico

• ¿Quienes? Técnicas Moleculares: Basadas en extracción de DNA

• ¿Cuán activos? Técnica Respirométrica: Consumo de O2

Técnica de viabilidad por fluorescencia

Comunidad Compleja de Microorganismos

Bio-Identificación

Tecnologías de Biomonitoreo

Tecnologías para identificación y monitoreo de Microorganismos Biomineros

Biomining Screen (BMS). Microarray

Real Time qPCR

Denaturating Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Oxygen Consumption Measurement

Viability determination

Microscopic Microbial Counting

Correlaciona la cantidad de ADN y por tanto de microorganismos, con una señal fluorescente que se puede monitorear en el tiempo (en tiempo real mientras se amplifica el fragmento de DNA)

MÉTODOS DE ANÁLISIS MOLECULAR

qPCR

Aumento de Fluorescencia

Ciclo de PCR

Cinética de amplificación de distintas muestras

Xn = X0(1 + E)n

Se correlaciona con cantidad de microorganismos inicial en la muestra problema

= ADN característico de A. ferrooxidans= dilución 1/10 de ADN característico de A. ferrooxidans

= dilución 1/100 de ADN característico de A. ferrooxidans = dilución 1/1000 de ADN característico de A. ferrooxidans

MÉTODOS DE ANÁLISIS MOLECULAR

DGGE

0.10

Thermithiobacillus tepidarius spp. AF023264

Acidithiobacillus spp. AF339743Acidithiobacillus spp. AF359940

Acidithiobacillus spp. AF023264

Leptospirillum ferrooxidans X86776

At. caldus AB023405

At. caldus Z29975At. caldus AF137369

Group II

Group I

Group III

II-b

Acidithiobacillus spp. AF407402

At. ferrooxidans AF465607

At. ferrooxidans AJ457808At. ferrooxidans AJ278719

At. albertensis AJ459804

Acidithiobacillus spp. AF376020

Tinto 3

T1At. t

hiooxidans

Y11596

At. ferrooxidans AF465604

At. ferrooxidans X75268

Acidithiobacillus DSM612 AJ459802II

-a

I-b

I-a

I-c

MÉTODOS DE ANÁLISIS MOLECULAR

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11A HPYL-D Empty ACSP-1 APSP-1 ANFE-1 ATSP-1 ATSP-7 ATSP-3 ATSP-8 ATSP-10 ATSP-6B ATSP-5 ATSP-9 ATSP-2 ATSP-4 ATTO-1 FNBC-4 FNBC-1 FNBC-3 FNBC-5 FNBC-2 FNBC-6C BRL1-10 BRL1-5 BRL1-13 BRL1-8 BRL1-6 BRL1-4 BRL1-7 BRL1-12 BRL1-9 BRL1-11 BRL1-14D RUS BRL1-2 RUS 90% BR36-3 BR36-4 BR36-1 BR36-2 BR36-6 BR36-5 DSLV-D ECOL-EE ECOL-F ECOL-G ECOL-H EUKA-1 FESP-1 FESP-3 FESP-2 FESP-4 FESP-6 FESP-8 FESP-9F FESP-10 FESP-7 FESP-5 FESP-11 HPYL-2 HPYL-3 PWFE-1 PWFE-2 PWFE-3 LESP-2 LESP-3G LESP-1 LEP2-1 LEP3-5 LEP3-4 LEP3-3 LEP3-1 LEP3-2 MESP-1 PSEU-1 RAND-1 STEN-1H SBSP-1 SLSP-7 SLSP-1 SLSP-8 SLSP-3 SLSP-10 SLSP-2 SLSP-5 SLSP-9 SLSP-4 SLSP-6I THAC-3 THAC-2 THAC-8 THAC-1 THAC-6 THAC-4 THAC-7 THAC-5 TPSP-1 HPYL-D Empty

Acidithiobacillus A. ferrooxidansBRL001BRL036Thermoplasma acidophilumFerroplasma sp.Leptospirillum sp.Sulfolobus sp.

Bio Mine Screen (BMS) diseño bioinformático

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

Resultado:1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F3 especies distintas

Basado en la tecnología de Microarray de DNA. Cada punto representa un organismo y en algunos casos representa una funcionalidad relevante para la biolixiviación

BioMine ScreeningBMS

MÉTODOS DE ANÁLISIS MOLECULAR

Cells hybridized with LEP636 probe (Cy3-labeled)specific for L. ferrooxidans

DAPI-stained cells

Basado en el consumo de oxígeno registrado en muestras sólidas y líquidas indicativo de presencia de organismos aerobios y oxidantes de hierro y/o azufre.

Tecnología basada en detección de luminiscencia que cambia en presencia de oxígeno disuelto o en fase gaseosa

Flexible con el n° de muestras a analizar (depende del número de minisensores )

Muy simple y robusta, permite su uso en operación

AislamientoAislamientoMuestreoMuestreo Cepas purasCepas puras

Propiedad Confidencial de BioSigma S.A.

Objetivo:

•Desarrollo de conocimiento sobre función y regulación de vías metabólicas relevantes relacionadas con biolixiviación.•Detección de genes u operones (grupo de genes regulados en forma conjunta) posibles blancos de manipulación.

C -

d

Bioleaching Culture

Electroporator

Plasmid for transformation

Transformants (GMO)

Propiedad Confidencial de BioSigma S.A.

pBM3 gene X

Transformación por Electroporación

Gene X = Target gene

Cloning X geneand strain

Transformation

Gene Xexpression

Protein X activity

GMO – Genetic Modified Organism with target gene expression stable at pH 4,5 or higher

pBM3 gene X

GeneDNA mRNA Protein

S2O32-

Metabolite

Substrate(minerals)

Extra cellularMetabolites (EPS)

SignalMolecule

GenomeSequencing

MicroarrayAnalysis

CE-MS

GenomeGenome TranscriptomeTranscriptome ProteomeProteome MetabolomeMetabolome

2D gels

Key genes and proteins

In bioleachingMetabolism

SO4-

Cu2+H2Sn

Chalco-pyrite

CuFeS2

Bioleaching Bacteria

Genomic DNA

Gene

mRNA

Protein

Fe2+

Fe3+

Energyfor growth

e-e-

EPSProductionenzymes

Sulfur oxidationenzymes

Ironoxidationenzymes

Bioleaching Heap

Air

Solution

Bioleaching Heap

Air

Solution

EPS

Chalcopyrite (CuFeS2)

Entendimiento del mecanismo biológico de la biolixiviación

Actividad: Sólo un 10% conmparado con condic ideales

1) Identificación de genes claves en la biolixiviación de calcopirita.

2) Identificación de metabolitos clave para mejorar las condiciones de operación y lograr la actividad óptima de los microoraganismos involucrados en la lixiviación en pilas

Pila piloto y prototipo

Amenability tests

Biolixiviación de minerales

Producción de Biomasa

Bio-Identificación Aislamiento

Mejoramiento Genético

*

Diseño e ingeniería de planta

Mon

itore

o de

Mic

roor

gani

smos

qu

iene

s, c

uánt

os y

cuá

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tivos

?

Bioinformática