PROFESORADO EN BIOLOGÍA PARA LA EDUCACIÓN

SECUNDARIA

INSTITUTO SUPERIOR DE FORMACIÓN PROFESIONAL “LA MERCED” N° 8.155

MATERIA:

PROFESORA: DANIELA BARRAZA

AÑO: 2013

UNIDAD III

2- Amplificación del ADN, reacción en cadena de la polimerasa.

3- Aplicaciones prácticas de la Ingeniería Genética: obtención de productos de mamíferos y de vacunas mediante organismos genéticamente modificados, ingeniería genética de plantas agrícolas, ingeniería genética en animales y en genética humana.

1- Enzimas de restricción, clonación molecular, plásmidos como vectores de clonación, el bacteriófago lambda como vector de clonación.

.

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Se denominan también endonucleasas de restricción, y tienen como función reconocer ciertas secuencias específicas en el ADN y cortarlo.

Las enzimas de restricción mas utilizadas por la ingeniería genética son las del tipo II.

Estas enzimas se encargan de cortar o escindir los enlaces fosfodiester que unen a los nucleótidos en cada hebra de ADN.

CARACTERISTICAS DEL CORTE

Cortan secuencias palindrómicas.

Sistema restricción- metilación

Es un mecanismo de defensa que utiliza la célula para proteger su propio ADN de la acción de las

enzimas de restricción.Las enzimas de restricción y las de metilación reconocen la misma secuencia en el ADN.

La metilación de las bases impide la unión de la enzima de restricción, con lo que el ADN propio no es hidrolizado.

CARACTERISTICAS DEL CORTE

CARACTERISTICAS DEL CORTE

Pueden dejar extremos romos o cohesivos.

CARACTERISTICAS DEL CORTE

Las enzimas que reconocen secuencias no palindrómicas, realizan el corte cerca de la secuencia pero no dentro de ella.

ANÁLISIS DEL ADN MEDIANTE ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

1- Las enzimas de restricción fragmentan la molécula de ADN a nivel de secuencias específicas.

2- Separación de los fragmentos de ADN generados por la enzima de restricción, mediante una técnica denominada ELECTROFORESIS.

ELECTROFORESIS

Procedimiento por el cual, moléculas cargadas migran en un campo eléctrico, su velocidad de migración estará determinada por la carga y el tamaño de la molécula.

En electroforesis en gel, las moléculas se separan en un gel que puede ser de agarosa o poliacrilamida.

El gel es una malla compleja de fibrillas , el tamaño del poro que se forma es controlado por el experimentador, permitiéndole controlar la separación de determinadas moléculas.

ELECTROFORESIS

MIGRACIÓN

Los ácidos nucléicos están cargados negativamente.

Una vez que se aplique corriente eléctrica, la velocidad de migración con la que se desplace el ADN dependerá de la forma y del tamaño de la molécula.Moléculas pequeñas o compactas migran más rápido que las de mayor tamaño.

ELECTROFORESIS

REVELADO

Se realiza una vez finalizada la corrida electroforetica.

Se tiñe el gel con un compuesto que se une al ADN.

Si se utiliza Bromuro de etidio, las bandas de ADN fluorescen bajo la luz ultravioleta.

La Electroforesis puede utilizarse para la separación de fragmentos de ADN, para Mapeo de genes o Hibridación.

TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN

Se desnaturaliza el ADN, para formar moléculas hibridas con otras moléculas (ADN monocatenario o ARN), que posean secuencias complementarias o casi complementarias (SONDAS).

La Hibridación es útil para encontrar secuencias similares en elementos genéticos diferentes o localizar un gen específico en una muestra compleja.

Southern desarrollo una técnica para hibridar con sondas, fragmentos de ADN que han sido separados por electroforesis en gel.

SOUTHERN

Los fragmentos de ADN del gel se trasfieren a una membrana y se desnaturalizan.

La membrana se expone luego a una sonda marcada para permitir que se formen híbridos, si la sonda llegase a ser complementaria a cualquiera de los fragmentos. Los sitios de hibridación pueden detectarse revelando el marcaje que se ha unido a la membrana. Las sondas pueden marcarse con radioactividad o con agentes que producen compuestos coloreados e incluso emiten luz.

SOUTHERN BLOT: ADN en gel y sonda de ADN o ARN.

TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN

NORTHERN BLOT: ARN en gel y sonda de ADN o ARN.

WESTERN BLOT: proteína en el gel y sonda anticuerpo.

CLONACIÓN MOLECULAR

Tiene como finalidad aislar grandes cantidades de genes específicos o fragmentos cromosómicos en forma pura.

La estrategia básica de la clonación molecular consiste en trasladar el gen o región deseada desde un genoma grande y complejo a otro pequeño y sencillo.

LOS PLÁMIDOS COMO VECTORES DE CLONACIÓN

Son vectores naturales por que llevan otros genes que confieren propiedades importantes a sus hospedadores.

PROPIEDADES

Tamaño, mucho menor que el de un cromosoma.

Origen de replicación independiente de la replicación del cromosoma.

Numero múltiple de copias.

Poseen marcadores de selección.

PBR322

USO DE PBR322 COMO VECTOR DE CLONACIÓN

EL BACTERIÓFAGO LAMBDA COMO VECTOR DE CLONACIÓN

Se conoce bien su genética.

Puede retener mas ADN que la mayoría de los plásmidos.

El ADN puede ser empaquetado eficientemente in vitro dentro de partículas del fago.

La infección por el fago es mas eficiente que la transformación.

CLONACIÓN CON LAMBDA

1- Aislamiento del ADN del vector a partir de partículas de fago y digestión con una enzima de restricción apropiada.

2- Ligación de los fragmentos de lambda con fragmento de ADN foraneo usando ADN ligasa (el ligando debe tener el tamaño adecuado para poder ser empaquetado).

3- Empaquetamiento del ADN, añadiendo extractos de fago que contengan las proteínas de la cabeza y de la cola, y permitan la formación de partículas de fago viables.

4- Infección de E. coli y aislamiento de clones de fago, recogiendo las placas de lisis generadas por una cepa.

5- Detección del ADN clonado en el fago recombinante, mediante hibridación de ácidos nucléicos u observación de propiedades genéticas.

CÓSMIDOS

Son vectores plasmídicos que contienen ADN foraneo y el sitio cos (extremos cohesivos) procedente del genoma Lambda.

A diferencia de los plásmidos puede clonar grandes fragmentos de ADN.

Las partículas víricas son mucho mas estables que los plásmidos.

AMPLIFICACIÓN DEL ADN (PCR)

Puede multiplicar moléculas de ADN hasta miles de millones de veces en un tubo de ensayo.

Utiliza la ADN polimerasa para copiar moléculas de ADN.

Es necesario disponer de oligonucleótidos cortos (primers o iniciadores) complementarios de secuencias presentes en el gen o genes de interés.

ETAPAS DE LA PCR1- En un sintetizador de nucleótidos se fabrican los dos oligonucleótidos iniciadores que flanquean el ADN diana y se añaden en gran exceso al ADN diana desnaturalizado por calor.

2- Cuando se ah enfriado la mezcla, el exceso de iniciadores relativos al ADN diana asegura que la mayor parte de las cadenas diana hibriden con iniciadores y no entre sí.

ETAPAS DE LA PCR

3- La ADN polimerasa alarga los iniciadores usando las bandas diana como moldes.

4- Después de un periodo de incubación adecuado, se calienta de nuevo la mezcla para separar las cadenas. Luego se enfría la mezcla para permitir que los iniciadores se hibriden con las regiones complementarias del ADN recién sintetizado y se repite todo el proceso.

APLICACIONES DE LA PCR

Para amplificar y clonar ADN de fuentes tales como los restos humanos, muestras de animales o plantas ya extinguidos.

Amplificar y analizar ADN sin necesidad de hacer crecer microorganismos, alcanzando un importante valor en el diagnóstico microbiológico.

Herramienta forense.