Introducción a la Biotecnología: Fundamentos de la Biotecnología Industrial
BIOTECNOLOGÍA MINERA
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INTRODUCCIÓN A LA BIOTECNOLOGÍA
Miguel Zarzar Maza
Ingeniero Civil Bioquímico
Solubilización de un sulfuro u óxido insoluble mediante la acción de microorganismos.
Tecnología simple y con bajos requerimientos de costos de capital.
Otros términos:Lixiviación bacterianaLixiviación microbianaBiooxidaciónBiohidrometalurgiaBiominería
A.C (Época de los Romanos): Acción bacteriana natural en Minas de Cobre
1947-1953: Demostración de la participación de microorganismos en el proceso de disolución del metal (Aislamiento de especies de Thiobacillus)
1950-1980: Utilización de biolixiviación en botaderos (relaves, ripios) y minerales de baja ley (< 0,5% Cu)
1980-1981: Puesta en marcha de la mina Lo Aguirre de Minera Pudahuel con una planta piloto de Biolixiviación; y patentamiento del proceso de lixiviación TL de Pudahuel
Fenómeno genómico
Fenómenos de Transporte
Fenómeno Biológico
BIOPROCESOSBIOPROCESOS BIOLOGÍABIOLOGÍAMOLECULARMOLECULAR
Conocimiento de los microorganismos lixiviantes y su comportamiento.
Estudio de las condiciones de operación que favorecen la acción microbiana.
MATERIA
PRIMA
PROCESO:•Pretratamiento•Transformación•Recuperación
PRODUCTO
BIOPROCESO: Agentes de BIOPROCESO: Agentes de transformación son célulastransformación son células
LitótrofosAutótrofos (heterótrofos?)Acidófilos
Grupo Primario: ferrooxidantes (autótrofos – CO2)Grupo Secundario: sulfooxidantes (autótrofos)Grupo Terciario: acidofilos heterotrofos (C
orgánico)FerrooxidantesFerroreductoresSulfooxidantes
Microorganismo
Fe oxidantes
Leptospirillum ferroxidans Mesófilo
L. ferriphilum Mesófilo/termotolerante
L. thermoferroxidans Termófilo moderado
Ferrimicrobium acidiphilum Mesófilo
Ferroplasma acidiphilum Mesófilo
S oxidantes
Acidithiobacillus thioxidans Mesófilo
At. caldus Termófilo moderado
Metallosphaera spp. Termófilo extremo
Sulfulobus spp. Termófilo extremo
Fe y S oxidantes
At. Ferroxidans Mesófilo
Acidianus spp. Termófilo extremo
Sulfulobus metallicus Termófilo extremo
Microorganismo
Fe reductores
Acidiphilum spp. Mesófilo
Fe oxidantes/reductores
Acidimicrobium ferrooxidans Termófilo moderado
Fe oxidantes/reductores y S oxidantes
Sulfobacillus spp. Mesófilos y termófilos moderados
Procesos basados en irrigación:Lixiviación en botaderosLixiviación en pilasMinería in situ
Procesos en estanques agitados
H2SO4
Nutrientes
Electroobtención (EW)
COBRE
Pila de mineral
Extracción por solvente (SX)
water & nutrients mineral concentrate
liquid pH adjustment & disposal
make-up tank
primary aeration tanks
secondary aeration tanks settling tank
solids to cyanidation & gold recovery
Operaciones comerciales en estanques de biolixiviación: (a) reactor Sao Bento BIOX, Brazil; (b) Planta Tamboraque BIOX, Peru; (c) Planta Laizhou Mintek-BacTech, China; (d) Planta Sansu BIOX, Ghana (from Rawlings et al., Trends in Biotechnology 21 (2003)
El oxígeno no es un buen oxidante de pirita en comparación al ión férrico:
Regeneración del ión férrico:
2 22 2 43,5 2 2FeS O Fe SO H
3 2 22 2 414 8 15 2 16FeS Fe H O Fe SO H
2 32 214 3,5 14 14 7Fe O H Fe H O
FeS2
Fe3+
Fe2+
Microbio
Sulfuros metálicos insolubles en ácido (FeS2, MoS2 and WS2) Sólo se disuelven vía oxidación del ión férrico
Sulfuros metálicos hidrolizables por ácido (ZnS, NiS, CuS and Cu2S, et al.)Son susceptibles al ataque de protonesTambién son susceptibles a la oxidación por ión
férrico
FeS2
Fe3+
Fe2+ + S2O32-
FeOM
SOM
SO42-
After Schippers and Sand, Appl. Environ. Microbiol. 1999
After Schippers and Sand, Appl. Environ. Microbiol. 1999
ZnS
H+
Zn2+ + Sn2- S8
SO42-
SOM
Se consideraba que ocurría mediante un mecanismo “directo” o “indirecto” (Silverman, M.P., 1967, J. Bacteriology)
En el mecanismo directo, los microbios catalizarían la disolución del sulfuro por una reacción enzimática e implicaría su unión al mineral.
El mecanismo indirecto ocurriría vía ión férrico mediante microbios adheridos y plantónicos.
Ahora se acepta que el ión férrico solamente es el oxidante de los sulfuros metálicos.
Por lo tanto, los términos mecanismos “directo” e “indirecto” deberían ser reemplazados por mecanismos “con contacto” y “sin contacto”.
FeS2
Fe3+
Fe2+
S2O32-
Células Adheridas(“Lixiviación con contacto”)
FO
B
Fe2+
Fe3+
Células Remotas(“Lixiviación sin contacto”)
FO
B
SO42-, H+S
OB
Crecimiento celular:
CÉLULA
Energía
Nutrientes
CO2
O2
Células
Producto
Calor
Información genética
Fe2+
S red.
NPMgCaK
Fe3+
H+
Condiciones adecuadas de pH y temperatura
Variables de operación que afectan el comportamiento de los microorganismos lixiviantes:MineralCondiciones nutricionalesCondiciones ambientales
Cambios operacionales de mayor impacto en la biolixiviación:Tipo de mineralModalidad de operaciónAireaciónMonitoreo
Oxidados (lixiviación ácida) y Sulfurados (pirometalurgia)
Sulfuros primariosCalcopirita (CuFeS2)Enargita (Cu3AsS4)
Sulfuros secundarios Calcosina (Cu2S)Covelina (CuS)Bornita (Cu5FeS4)
Influye en la velocidad del proceso y en los costos asociados a molienda
Tamaños:Percolación: 13 a 200 mmReactores agitados: 100 μm
AglomeradoMayor permeabilidadMayor homogeneidad
DEMANDA
OFERTA><
l·CO2+m·NH3+p·(Fe2++H+)+n·O2
CdHeOfNg+p·Fe3++t·H2O
CO2+0.17NH3+71.4(Fe2++H+)+16.7O2
CH2.16O0.46N0.17+71.4Fe3++34.9H2O
YCEL/O2 = 0.06
YCEL/CO2 = 1
En la ecuación:
O2/CO2 = 16.7
En el aire:
O2/CO2 = 700
Células
Cu2+
Fe2+, Fe3+
pH, Eh, acidez
Al3+, SO42-
Metales pesados
Cuantificación de microorganismos
Control de disponibilidad de O2 y CO2
Control de pH
Control de temperatura
Aumentar la biomasa por kilo de mineral
Microorganismos más resistentes a inhibiciones
Mayor desafío a futuro:
Lograr un proceso rentable para la biolixiviación de CALCOPIRITA
Bioidentificación y Control del Proceso (biomonitoreo) de Microorganismos: ¿Quiénes, cuántos, que hacen?
Selección de Microorganismos eficientes y control de su crecimiento de acuerdo al diseño del proceso
Optimización del crecimiento de los microorganismos adecuados
Estado del Arte
• ¿Cuántos MO? Técnicas Microbiológicas: Recuento óptico
• ¿Quienes? Técnicas Moleculares: Basadas en extracción de DNA
• ¿Cuán activos? Técnica Respirométrica: Consumo de O2
Técnica de viabilidad por fluorescencia
Comunidad Compleja de Microorganismos
Bio-Identificación
Tecnologías de Biomonitoreo
Tecnologías para identificación y monitoreo de Microorganismos Biomineros
Biomining Screen (BMS). Microarray
Real Time qPCR
Denaturating Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
Oxygen Consumption Measurement
Viability determination
Microscopic Microbial Counting
Correlaciona la cantidad de ADN y por tanto de microorganismos, con una señal fluorescente que se puede monitorear en el tiempo (en tiempo real mientras se amplifica el fragmento de DNA)
MÉTODOS DE ANÁLISIS MOLECULAR
qPCR
Aumento de Fluorescencia
Ciclo de PCR
Cinética de amplificación de distintas muestras
Xn = X0(1 + E)n
Se correlaciona con cantidad de microorganismos inicial en la muestra problema
= ADN característico de A. ferrooxidans= dilución 1/10 de ADN característico de A. ferrooxidans
= dilución 1/100 de ADN característico de A. ferrooxidans = dilución 1/1000 de ADN característico de A. ferrooxidans
MÉTODOS DE ANÁLISIS MOLECULAR
DGGE
0.10
Thermithiobacillus tepidarius spp. AF023264
Acidithiobacillus spp. AF339743Acidithiobacillus spp. AF359940
Acidithiobacillus spp. AF023264
Leptospirillum ferrooxidans X86776
At. caldus AB023405
At. caldus Z29975At. caldus AF137369
Group II
Group I
Group III
II-b
Acidithiobacillus spp. AF407402
At. ferrooxidans AF465607
At. ferrooxidans AJ457808At. ferrooxidans AJ278719
At. albertensis AJ459804
Acidithiobacillus spp. AF376020
Tinto 3
T1At. t
hiooxidans
Y11596
At. ferrooxidans AF465604
At. ferrooxidans X75268
Acidithiobacillus DSM612 AJ459802II
-a
I-b
I-a
I-c
MÉTODOS DE ANÁLISIS MOLECULAR
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11A HPYL-D Empty ACSP-1 APSP-1 ANFE-1 ATSP-1 ATSP-7 ATSP-3 ATSP-8 ATSP-10 ATSP-6B ATSP-5 ATSP-9 ATSP-2 ATSP-4 ATTO-1 FNBC-4 FNBC-1 FNBC-3 FNBC-5 FNBC-2 FNBC-6C BRL1-10 BRL1-5 BRL1-13 BRL1-8 BRL1-6 BRL1-4 BRL1-7 BRL1-12 BRL1-9 BRL1-11 BRL1-14D RUS BRL1-2 RUS 90% BR36-3 BR36-4 BR36-1 BR36-2 BR36-6 BR36-5 DSLV-D ECOL-EE ECOL-F ECOL-G ECOL-H EUKA-1 FESP-1 FESP-3 FESP-2 FESP-4 FESP-6 FESP-8 FESP-9F FESP-10 FESP-7 FESP-5 FESP-11 HPYL-2 HPYL-3 PWFE-1 PWFE-2 PWFE-3 LESP-2 LESP-3G LESP-1 LEP2-1 LEP3-5 LEP3-4 LEP3-3 LEP3-1 LEP3-2 MESP-1 PSEU-1 RAND-1 STEN-1H SBSP-1 SLSP-7 SLSP-1 SLSP-8 SLSP-3 SLSP-10 SLSP-2 SLSP-5 SLSP-9 SLSP-4 SLSP-6I THAC-3 THAC-2 THAC-8 THAC-1 THAC-6 THAC-4 THAC-7 THAC-5 TPSP-1 HPYL-D Empty
Acidithiobacillus A. ferrooxidansBRL001BRL036Thermoplasma acidophilumFerroplasma sp.Leptospirillum sp.Sulfolobus sp.
Bio Mine Screen (BMS) diseño bioinformático
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
Resultado:1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F3 especies distintas
Basado en la tecnología de Microarray de DNA. Cada punto representa un organismo y en algunos casos representa una funcionalidad relevante para la biolixiviación
BioMine ScreeningBMS
MÉTODOS DE ANÁLISIS MOLECULAR
Cells hybridized with LEP636 probe (Cy3-labeled)specific for L. ferrooxidans
DAPI-stained cells
Basado en el consumo de oxígeno registrado en muestras sólidas y líquidas indicativo de presencia de organismos aerobios y oxidantes de hierro y/o azufre.
Tecnología basada en detección de luminiscencia que cambia en presencia de oxígeno disuelto o en fase gaseosa
Flexible con el n° de muestras a analizar (depende del número de minisensores )
Muy simple y robusta, permite su uso en operación
AislamientoAislamientoMuestreoMuestreo Cepas purasCepas puras
Propiedad Confidencial de BioSigma S.A.
Objetivo:
•Desarrollo de conocimiento sobre función y regulación de vías metabólicas relevantes relacionadas con biolixiviación.•Detección de genes u operones (grupo de genes regulados en forma conjunta) posibles blancos de manipulación.
C -
d
Bioleaching Culture
Electroporator
Plasmid for transformation
Transformants (GMO)
Propiedad Confidencial de BioSigma S.A.
pBM3 gene X
Transformación por Electroporación
Gene X = Target gene
Cloning X geneand strain
Transformation
Gene Xexpression
Protein X activity
GMO – Genetic Modified Organism with target gene expression stable at pH 4,5 or higher
pBM3 gene X
GeneDNA mRNA Protein
S2O32-
Metabolite
Substrate(minerals)
Extra cellularMetabolites (EPS)
SignalMolecule
GenomeSequencing
MicroarrayAnalysis
CE-MS
GenomeGenome TranscriptomeTranscriptome ProteomeProteome MetabolomeMetabolome
2D gels
Key genes and proteins
In bioleachingMetabolism
SO4-
Cu2+H2Sn
Chalco-pyrite
CuFeS2
Bioleaching Bacteria
Genomic DNA
Gene
mRNA
Protein
Fe2+
Fe3+
Energyfor growth
e-e-
EPSProductionenzymes
Sulfur oxidationenzymes
Ironoxidationenzymes
Bioleaching Heap
Air
Solution
Bioleaching Heap
Air
Solution
EPS
Chalcopyrite (CuFeS2)
Entendimiento del mecanismo biológico de la biolixiviación
Actividad: Sólo un 10% conmparado con condic ideales
1) Identificación de genes claves en la biolixiviación de calcopirita.
2) Identificación de metabolitos clave para mejorar las condiciones de operación y lograr la actividad óptima de los microoraganismos involucrados en la lixiviación en pilas
Pila piloto y prototipo
Amenability tests
Biolixiviación de minerales
Producción de Biomasa
Bio-Identificación Aislamiento
Mejoramiento Genético
*
Diseño e ingeniería de planta
Mon
itore
o de
Mic
roor
gani
smos
qu
iene
s, c
uánt
os y
cuá
n ac
tivos
?
Bioinformática