UNIVERSIDAD DE CUENCA

FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

ESCUELA DE MEDICINA

INMUNOLOGÍA

VALORACIÓN DE LA INMUNIDAD CELULAR IN VITRO

Por: Sofía Jaramillo Q.

OBJETIVOS

GENERALES:

• Identificar los procedimientos de laboratorio que permiten la valoración de la inmunidad celular in vitro.

ESPECÍFICOS:• Identificar los procedimientos

de laboratorio que se emplean para evaluar la inmunidad celular.

• Esquematizar las fases del estudio de la inmunidad celular en los procedimientos de laboratorio.

• Definir los criterios clínicos para la solicitud de éstos análisis.

CONOCIMIENTOS PREVIOS

• Desarrollo, diferenciación, propiedades particulares y funciones de los Monocitos, Neutrófilos, Basófilos, NK, LT y LB.

ORIGEN DE LOS ESTUDIOS SOBRE INMUNIDAD CELULAR

Estudios en otras especies: aves y mamíferos

Pacientes con inmunodeficiencias

Ac. Monoclonales

Análisis funcionales in vitro

• Test de Actividad Fagocítica • Directa• Indirecta

• P. De Proliferación Celular• Ensayo de

Proliferación• Reacción

linfocitaria mixta• LT-CD4• Prueba del IFN-• ELISPOT• Citometría de

Flujo (Citoquinas internas)

• LT-CD8 y NK• ADCC

VALORACIÓN FUNCIONAL

• Microscopía de fluorescencia

• Citometría de flujo• IF• RIA

RECUENTO

• Cualitativa• M.

Inmunoquímico• Células

Formadoras de Rosetas

• Cuantitativa• M. Físicos• S. Magnética• S. Por afinidad

de columnas• M.

Inmunoquímico• -Globulina

Antihumana• Citometría de

Flujo con FACS

IDENTIFICA CIÓN

• M. Físicos• Fycoll-Hypaque• Adhesión

selectiva• Ms: vidrio,

plástico• LB, LT: nylon,

algodón• M.

Inmunoquímicos• Poblaciones• Subpoblaciones

SEPARACIÓN

MATERIALES

SUSTRATO CELULAR:

• Citología: • Suspensiones frescas de sangre (plasma) *

• Histología:• Usual:

• Punción M.O.*• Transoperatorios• Biopsias• Post mortem

• Especial: • Punciones de extracción de líquido

TÉCNICA HISTOLÓGICA

PROCEDIMIENTOS

OBTENCIÓN DE LA MUESTRA PROCESAMIENTO FIJACIÓN INCLUSIÓN

CORTE COLORACIÓN ANÁLISIS

SEPARACIÓN

AISLAMIENTO POR CENTRIFUGACIÓN EN

GRADIENTE DE DENSIDAD: TÉCNICA FICOLL-HYPAQUE

Separación de mononucleares [Ms y Linfocitos (LB, LT)]de granulocitos (Ns, Bas)

SEPARACIÓN POR ADHESIÓN SELECTIVA

Los monocitos se adhieren a superficies de vidrio o plástico y se separan de los linfocitos

Los linfocitos B se fijan a columnas o jeringas en lana de nylon o algodón (se obtienen poblaciones separadas de LB y LT)

TÉCNICA FICOLL-HYPAQUE

ADHESIÓN SELECTIVA

LT Ms

IDENTIFICACIÓN

Cualitativa

M. Inmunoquímico• Células Formadoras de Rosetas

CuantitativaM. Físicos• S. Magnética• S. Por afinidad de columnas• Cargas eléctricas (LB , LT)• Aglutininas

• Maní: Timocitos inmaduros• Soja: LB

M. Inmunoquímico• CD• -Globulina Antihumana• Citometría de Flujo con FACS

CÉLULAS FORMADORAS DE ROSETA E

• Receptor SRBC o CD2• CA linfoide

MÉTODOS FÍSICOS

MAGNÉTICA POR AFINIDAD DE COLUMNAS

Ag para LT

Producción de Ac. a los LT

• Timocitos, LT sp., LT cultivo cont., LT leucémicos cabras o conejos

• Hibridoma murino• Demostración de

especificidad

globulina+fluorocromo

Identificación de los marcadores de LT por el antisuero resultante

• IF Directa• Microscopio de

fluorescencia• Citómetro de

flujo*• Tinción vital con

azul trípano• Análisis de

liberación de Cr51 (RIA)

IDENTIFICACIÓN LT: MARCADORES ESPECÍFICOS

TIPO DE CÉLULA DETECTADO CD

Timocitos de la cortezaCélulas de Langerhans CD1

Células formadoras de rosetasLTNK

CD2

LT madurosReceptor para Ag. En LT CD3

LT colaboradores/inductoresMonocitos CD4

LT maduros CD6

TimocitosNK CD7

LT supresores/ctx.NK CD8

Relación LT-CD4/LT-CD8:

2/1

RECUENTO

Microscopía de fluorescencia

Citometría de flujo

IF

RIA

CITOMETRÍA DE FLUJO

PROCEDIMIENTO: RESULTADOS:

APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

Tipificación del Fenotipo

Leucocitario

• Inmunodeficiencias• Pronóstico• Seguimiento de

inmuno y quimioterapia

• Seguimiento de la reconstitución inmunitaria

TIPIFICACIÓN DEL FENOTIPO

TUMORAL

• Clasificación de leucemias y linfomas

• Determinación de la clonalidad

• Diferenciación entre neoplasias de células hemato y no hematopoyéticas

• Pronóstico

ANÁLISIS DEL ADN

• Aneuploidía• Cinética del ciclo

celular

OTRAS APLICACIONES

• Reticulocitos• Detección de Ig.

Relacionadas con Px.

• Pruebas cruzadas en transplantes

• Citogenética

VALORACIÓN FUNCIONALTest de Actividad

Fagocítica

Migración

Ingestión

Digestión•Degranulación: Fagocitosis frustrada

•Muerte Intracelular: NBT, Quimioluminiscencia, 502ª de S. aureus

Prueba de Proliferación

Celular

Ensayo de Prolifera ción•Leucocrito+Mitógeno (específico)

•Medir el estado global de la respuesta celular

Reacción linfocitaria mixta•CPA (MHC-II)•Inmunidad transfucional

•Dx. Exposición previa

LT-CD4

Prueba del IFN-

ELISPOT

Citometría de Flujo

(Citoquinas internas←Ac.)

LT-CD8 y NK

LT-CD8: Determinación de lisis celular

(CMH-I)←Cr51

NK: Líneas de

células

tumorales

ADCC

Células+Ac

Ms, Ns, Es, NK

ACTIVIDAD FAGOCÍTICA

PROLIFERACIÓN CELULAR

ENSAYO DE PROLIFERACIÓN REACCIÓN LINFOCITARIA MIXTA

LT-CD8: CITOTOXICIDAD

NK Y CÉLULAS TUMORALES

ADCC

IMPORTANCIA

FISIOLÓGICA

Inmunidad antiinfecciosa

Inmunidad transfusional

Inmunidad tumoral

PATOLÓGICA

Trastornos de inmunodeficiencia

Enfermedades autoinmunitarias

AVERIGUAR

• Nombres de mitógenos específicos.• Importancia del cultivo mixto linfocitario en la medicina transfusional.• Líneas de células tumorales empleadas en los ensayos de laboratorio para la

valoración de la actividad de los NK.• Citoquinas implicadas en la :

– Migración– Adherencia – Lisis mediada por Ms.

• Indique la importancia de la citometría de flujo en la estadificación del VIH.• Consultar las causas de variación (en ↓ y en ↑) de la relación LT-CD4/LT-CD8.• Señale las diferencias entre Th1 y Th2.• Enumere los Ag. Relacionados con células leucémicas.

BIBLIOGRAFÍA• Balcells, A.; Soriano, M. La Clínica y el Laboratorio. 9na. Edición. Editorial Marín.

Barcelona – España. 1973.• Henry, B.; et all. Laboratorio en el Diagnóstico Clínico. Editorial Marbán Libros. Madrid

– España. 2010.• Kindt, T.; Goldsby, R.; Osborne, B. Inmunología de Kuby. 6ta. Edición. Editorial Mc

Graw-Hill. México D.F.-México. 2007. • Prieto, J. Yuste, J. La Clínica y El Laboratorio Balcells. 21era. Edición. Editorial Elsevier

Masson. Barcelona – España. 2010.• Regueiro J., López C., González S., Martínez E. Inmunología. 4ta. Edición Revisada. Ed.

Médica Panamericana. Madrid - España. 2012.• Rojas, W., Anaya J., Aristizábal B., Cano L., Gómez L., Lopera D. Inmunología de Rojas.

15ta. Edición. Corporación para las Investigaciones Biológicas. Medellín – Colombia. 2010.

• Stites, D.; Stobo, J.; Wells, J. Inmunología Básica y Clínica. 6ta. Edición. Editorial El Manual Moderno. México D.F. – México. 1988.

• Stites, D.; Terr, A. Inmunología Básica y Clínica. 7ma. Edición. Editorial El Manual Moderno. México D.F. – México. 1993.