Validación de los métodos microbiológicos

INTRODUCCION A LA VALIDACION DE METODOS MICROBIOLOGICOS

Norma ISO 17025

Bqca. QM Alicia I. Cuesta, Consultora Internacional de la FAO

Objetivos Generales a desarrollar Validación de métodos:

Concepto de validación.

Definición de parámetros a determinar para validar métodos microbiológicos cualitativos y cuantitativos.

Conceptos teóricos sobre las características de los resultados de ensayo microbiológicos.

Métodos estadísticos: Cálculos de parámetros a determinar para validar métodos microbiológicos cualitativos y cuantitativos.

Protocolo de validación.

Objetivos Generales a desarrollar Validación de métodos:

Intentaremos contestar las siguientes preguntas:

• ¿Qué es validar un método?

• ¿Por qué y para qué valido un método?

• ¿Cuándo valido un método?

• ¿Cómo valido un método?

Objetivos de la clase

1. Presentar el concepto de validación de métodos microbiológicos.

2. Definición de parámetros a determinar para validar un método microbiológico: Especificidad Sensibilidad Límite de detección Exactitud. Desviación positiva y Desviación negativa Límite de cuantificación Repetibilidad y reproducibilidad Robustez

Ejemplo: Un laboratorio diseñó una nueva metodología para la detección de E coli O157:H7 basada en el uso de anticuerpos monoclonales para evaluar la inocuidad y calidad de alimentos cárnicos.¿ Qué características tendrán que tener los resultados que arroja dicho método?¿Puedo emplearlo inmediatamente para emitir resultados que impliquen una decisión de conformidad o no con las especificaciones alimentarias vigentes?

La respuesta es: Antes de usar un método

debo asegurarme quehaya sido validado

Necesito que el método sea: Adecuado para el propósito.

Los datos que arroja un ensayo le permiten al usuario tomar decisiones técnica y administrativamente correctas para un propósito preestablecido.

¿ Por qué es necesario validar un método?

Respuesta: Para saber si ese ensayo sirve para lo que lo quiero usar.

El laboratorio microbiológico tiene la responsabilidad de garantizar que los resultados que él produce son exactos, validos y confiables de modo de proporcionar información útil acerca de la inocuidad y calidad sanitaria de los alimentos.

Para conocer el comportamiento del método.

Si el resultado de un ensayo no es confiable, el ensayo no presenta ninguna utilidad y sería mejor no realizarlo.Cuando un cliente recurre a un laboratorio microbiológico a solicitar un análisis, lo hace porque necesita resolver un problema y no puede hacerlo por sí mismo y espera poder confiar en los resultados.

¿ Por qué es necesario validar un método?

Buenos resultados del ensayo

Se identifican 6 principios de la práctica analítica, los cuales cuando se implementan

simultáneamente conducen a una buena práctica:

Principios de la práctica analítica:

• Las mediciones analíticas deben hacerse de forma tal que satisfagan un requerimiento acordado (un objetivo definido)

• Deben realizarse utilizando métodos y equipos que hayan sido probados para asegurar que son aptos para un determinado propósito.

• El personal que realiza las mediciones debe ser competente y estar calificado.

Principios de la práctica analítica:

4. Debe haber una verificación independiente (externa) y periódica de la competencia técnica del laboratorio.5. Las mediciones analíticas realizadas en un laboratorio deben ser consistentes con las que se realizan en cualquier otro lugar.6. Los laboratorios que realicen ensayos deben tener procedimientos bien definidos de control de calidad y de aseguramiento de la calidad.

En nuestro caso ejemplo:

La presencia de E.coli O157:H7 en un alimento puede ocasionar, para un determinado grupo poblacional, enfermedad y muerte.

También, cuando se desee comercializar, la partida de alimento será rechazada en los sitios de control provocando un daño económico y de pérdida de imagen.

PROBLEMAS DE INOCUIDAD Y CALIDAD.

En nuestro caso ejemplo: (cont)Por lo tanto, este método propio desarrollado por el laboratorio debe ser capaz de:

Detectar ese microorganismo.Detectar la presencia del microorganismo en muy pequeñas cantidades. Dar los mismos resultados cuando lo repito.Detectar la presencia de ese microorganismo y no de otro.

Definición: VALIDACION*

Confirmación, mediante el aporte de pruebas objetivas, de que se han cumplidos los requisitos para el uso pretendido o una aplicación específica.

*[ISO 9000: 2000]

Evidencias objetivas:¿Cómo puedo aportarlas?En el marco de un adecuado criterio microbiológico, tengo dos herramientas fundamentales que permiten sacar conclusiones:

Diseño de experimentos estadísticamente válidos.Análisis de los resultados usando métodos estadísticos.

Antes de realizar la validación se deben especificar:

• ALCANCE: Matriz Concentración en la que se aplica. • Se deben declarar los CRITERIOS DE APTITUD PARA LOS FINES (teniendo en cuenta los requisitos particulares para un uso específico previsto).

Validación Métodos de ensayo microbiológicos CUALITATIVOS

Deben ser validados estimando, cuando sea apropiado:

1º Descripción detallada del método de ensayo.

SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD

REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD

EXACTITUD RELATIVA

LÍMITE DE DETECCIÓN

EFECTO MATRICIAL

DESVIACIÓN POSITIVA Y DESVIACIÓN NEGATIVA

Validación Métodos de ensayo microbiológicos CUANTITATIVOS

Deben ser validados estimando, cuando sea apropiado:

SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD

REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD

EXACTITUD

DESVIACIÓN POSITIVA Y DESVIACIÓN NEGATIVA

1º Descripción detallada del método de ensayo.

LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN.

Definición: LÍMITE DE DETECCIÓN.

Es el número mínimo de microorganismos que pueden ser detectado por el método, pero en cantidades que no pueden estimarse con precisión.

(Aplicado a análisis microbiológicos cualitativos)

LÍMITE DE DETECCIÓN:

Los resultados de los análisis cualitativos deben expresarse como :“detectado/no detectado en una cantidad o volumen definidos”.

Determino el límite de detección antes de evaluar la sensibilidad.

Ejemplo: DISEÑO DE EXPERIMENTO MÉTODO MICROBIOLÓGICO

--NO Target 5

--NO Target 4

--NO Target 3

--NO Target 2

-+NO Target 1

+-Target 5

++Target 4

++Target 3

++Target 2

+-Target 1

Método de referencia

Método a validar

Matriz naturalmente o artificialmente contaminada

Definición: MÉTODO DE REFERENCIA.

Método investigado a fondo, que describe con claridad y exactitud las condiciones y los procedimientos necesarios para medir los valores de una o más propiedades.

Que ha demostrado tener una exactitud y una precisión apropiadas para el uso que pretende hacerse del mismo, de manera que puede utilizarse para evaluar la exactitud de otros métodos empleados para realizar la misma medición y, en particular, para caracterizar un material de referencia.

En general se trata de un método normalizado nacional o internacional.

DN + NV-/- (NV)-/+ (DN)Negativo

DP + NV

+/- (DP)

Resultado asignado

NEGATIVO *

NPV + DNTotal

PV + DP+/+ (PV)Positivo

TotalResultado asignado

POSITIVO*

RESULTADO DEL ENSAYO

A VALIDAR

*por método de referencia o por inoculación de cepa de referencia.

Definición: Desviación negativa (DN).

Ocurre cuando: el método a validar da un resultado negativo sin confirmación y el método de referencia da un resultado positivo.

Esta desviación se convierte en un resultado negativo falso cuando puede demostrarse que el resultado verdadero es positivo.

Definición: DESVIACIÓN POSITIVA (DP).

Ocurre cuando: el método a validar da un resultado positivo sin confirmación y el método de referencia da un resultado negativo.

Esta desviación se convierte en un resultado positivo falso cuando puede demostrarse que el resultado verdadero es negativo.

FALSOS POSITIVOS: es la probabilidad que el ensayo arroje un resultado positivo cuando la muestra no contiene el analito. F + = DPc/ DP + NV = 1- ESPECIFICIDAD

FALSOS NEGATIVOS: es la probabilidad que el ensayo arroje un resultado negativo cuando la muestra contiene el analito. F - = DNc/ DN + PV = 1- SENSIBILIDAD

SENSIBILIDAD: Definición: Fracción del número total de cultivos o colonias POSITIVOS que soncorrectamente asignados con el método utilizado. [ISO 13843:2000] Sensibilidad %= PV/(DN c + PV) x100

“Capacidad del método de dar positivo cuando las muestras tienen el analito”

Resultado del caso ejemplo: Sensibilidad %= 3/5x100= 60%

ESPECIFICIDAD: Definición: Fracción del número total de cultivos o colonias NEGATIVOS que son correctamente asignados con el método utilizado. [ISO 13843:2000]

Especificidad %= NV/(DPc + NV) x100

“Capacidad del método de dar negativo cuando las muestras no tienen el analito”

Resultado del caso ejemplo: Especificidad %= 4/5x100= 80%

EXACTITUD RELATIVA:

Grado de concordancia entre los resultados del método evaluado ylos obtenidos utilizando un método de referencia reconocido

EXACTITUD RELATIVA %= PV + NV/(PV + NV + DN + DP) x100

Definición: LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN.

Número mínimo de microorganismos dentro de una variabilidad definida que puede determinarse en las condiciones experimentales del método evaluado.

Tengo en cuenta la incertidumbre del método para valores bajos.

(Aplicado a análisis microbiológicos cuantitativos)

Robustez

DEFINICIÓN: INSENSIBILIDAD DE UN MÉTODO ANALÍTICO A PEQUEÑOS CAMBIOS EN EL PROCEDIMIENTO.

PARA EXAMINAR LA ROBUSTEZ ES ACONSEJABLE ABUSAR DEL MÉTODO EN UN CAMINO CONTROLADO.

Estimación de la Incertidumbre de medición en microbiología

la incertidumbre de medición es un parámetro

asociado al resultado de la medición, que caracteriza la

dispersión de los valores que podrían ser razonablemente asignados al mesurando.

(método cuantitativo)

En nuestro caso ejemplo: Ensayo de Detección de E.coli O157:H7 en un alimento Dijimos que: Necesito un método capaz de detectar ese

microorganismo.=Sensibilidad Necesito un método capaz de detectar la presencia del

microorganismo en muy pequeñas cantidades.= Límite de detección

Realizo muchas veces el método y los resultados del ensayo se repitan = repetibilidad y reproducibilidad

Necesito un método capaz de detectar la presencia de ese microorganismo y no de otro = Especificidad