Mtodos microbiolgicos para la enumeracin e identificacin de microorganismos en alimentos

Mtodos microbiolgicos para la enumeracin e identificacin de microorganismos en alimentosMicrobiologa de Alimentos

Aldo Duees Acosta 199419Asesor: Ivan Salmeron Ochoa1

Mtodos de Identificacin Microbiana2

Tincin de GramSeparar a las bacterias en dos grandes grupos.Cristal violeta tambin conocido como violeta de genciana.Safranina.Una mezcla de alcohol-acetona 1:1.

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Bacilos Gram +Bacilos Gram -El cristal violeta aumenta su fijacin a la pared clular bacteriana usando de mordiente al lugol, en la pared bacteriansaa el lugol forma un complejo con el cristal violeta insoluble en agua lo que evita que se disuelva y se pierda el colorante durante el enjuague. La pared de los Gram positivos son ricos en cidos teicoicos no saturados estos muestran gran afinidad por los agentes oxidantes, todos los mordientes por ejemplo el lugol son agentes oxidantes y su efecto en general consiste en dar un caracter mas cidez de los cidos teicoicos lo que aumenta la afinidad de estos por el colorante bsico cristal violeta.3

4Agar MacconkeyIdentificacin de enterobacterias que hidrolizan lactosa.Positivo: color rojo.Negativo: amarillo por utilizacin de peptonas ( pH)5

Agar Sal ManitolAgar selectivo para aislamiento de estafilococos.Alta concentracin salina.Indicador sal manitol.Estafilococos coagulasa + acidifican medio (zona amarilla).Estafilococos coagulasa (zona roja o purpura).

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Agar Salmonella-ShigellaMedio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp.Inhibicin Gram + por sales billiares.Colonias con centro negro, indicativo de produccin H2S.

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Agar Salmonella-Shigella8

MicroorganismoColoniaSalmonella TyphimuriumTransparente, centro negroShigella FlexneriIncoloraShigella SonneiIncoloraProteus MirabilisTransparente, centro negroE. ColiRosadas a rojasKlebsiella pneumoniaeRosadas cremosas y mucosasEnterococcus FaecalisIncoloras, escaso crecimiento9

Prueba de OxidasaIdentificacin de la enzima CitocromoC Oxidasa.Se usa un aceptor de electrones (Tetrametil-p-fenilendiamina o Reactivo de Kovacs).

10http://learn.chm.msu.edu/vibl/content/oxidase/oxidase_test/index.html

En la respiracin hay una secuencia de enzimas hasta llegar al citocromoC, la enzima llamada citocromoC oxidasa le quita electrones al citocromoC, estos electrones son transferidos por la enzima al oxgeno siendoun exceso de electrones puede atraer tomos de Hidrgeno formando dos posibles productos: Agua o perxido de hidrgeno.10Prueba de IndolDeterminar la capacidad de separar indol a partir de triptfano.Formacin de un complejo rojo, indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo.

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Prueba Rojo Metilo.Identificacin de bacterias capaces de producir cidos fuertes de la glucosa.Uso de un indicador rojo de metilo.MO + producen cidos manteniendo un medio de acidez.MO producen acetilmetil carbinol neutro aumentando el nivel de pH.12

Prueba de CatalasaDegradacin de Perxido de Hidrgeno por medio de la enzima Catalasa.13

H2O2 CatalasaH2O + O2Prueba OFPrueba de Oxidacin Fermentacin.Utilizando Dos tubos con indicador azul de brotimol.Al inocularse ambos tubos, uno con tapa semi cerrada y otro se agrega aceite y se cierra completamente.El vire de color por pH indica presencia de acido.14

Prueba Fermentacin de Hidratos de CarbonoDeterminar la capacidad de un Mo para fermentar CHOs para producir cido c/s gas.Indicador Azul de BromitinolIndicacin de produccin de gas se utiliza campana Durham.15

Prueba MIOIdentificacin Enterobacteriaceae en base a Movilidad, Actividad de Ornitina Carboxilasa y Produccin de indol.Movilidad.- Entubecimiento del medio.Ortonina.- Indicador purpura de bromo cresol.Positivo: color purpura. Negativo: color amarillo.Indol.- Adicin reactivo de kovacs.16

16Prueba TSIDiferenciacin de enterobacterias en base a fermentacin , con produccin de gas y determinar la produccin de c. Sulfhdrico.Agar Triple a Azucar. Lactosa, Glucosa y Sacarosa.Rojo de Fenol indicador.Produccin de Tiosulfato de Sodio produce un oscurecimiento.17Prueba TSI18

Pico alcalino, fondo cido (R/A): MO fermenta GPico Acido, Fondo cido: (A/A): MO fermenta G-LPico alcalino, fondo alcalino (R/R): MO no fermenta azcares.

Presencia de burbujas o ruptura del medio, produccin de gas.

Ennegrecimiento del medio, produccin de cido sulfhdrico.

Prueba LIADiferenciar MO, especialmente, Salmonella por descarboxilacin/desaminacin de Lisina, y produccin c. Sulfhdrico.Indicador Purpura de Bromocresol.Amarillo cond. cidas.Violeta condiciones Bsicas.

Descaboxilacin de lisina produce amina cadaverina, produce viraje purpura. Descaboxilacin en medio cido inducido por fermentacin.Desaminacin de lisina produce cido alfa-ceto-carbonico, dormando color rojizo por sal de hierro y presencia de oxideno.

Ac. Surfhdrico reacciona para producir sulfuro de hierro oscureciendo el medio.19Prueba LIA20

DescaboxilacinPositiva : Pico Violeta / Fondo VioletaNegativa: Pico Violeta / Fondo Amarillo

Desaminacin:Pico Rojizo / Fondo Amarillo

Ennegrecimiento del medio, produccin de cido sulfhdrico.Prueba Agar citratoIdentificacin de bacterias mediante la utilizacin de citrato.Indicador Azul de bromotinol.

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Prueba UreaIdentificacin de Mo por actividad de la enzima eureasa.Indicador rojo de fenol.Medio cido: color amarilloMedio alcali: color rojo.Conversin de la urea a amoniaco e hidrgeno, produciendo un medio alcali.

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Interpretacin de Resultados.23

Realiza el conteo total de microorganismos presentes en el alimento.

Se considerara un indicador de las caractersticas higinicas generales del alimento.

Los microorganismos por analizar sern miembros de poblaciones diferentes.Caractersticas del medio utilizado.Condiciones de incubacin.Mtodos de numeracin de MO.24Cuenta PlacaUna muestra es pipetiado en una caja petri esteril mezclndose con un agar.Agar a temperatura de 40, evitar shock termico.Es aceptado una cuenta de 25-250 colonias.Recomienda realizar disoluciones antes de la numeracin, para obtener cuanta deseada.Para obtener mayor confianza, duplicar los resultados.

25X= media de coloniasV= volumend= disolucinNmero ms ProbableInoculacin de tubos con diferentes tamaos de muestra.Se realiza con replicas (3,4,5).Por medio de tablas se determina el nmero mximo en un lote.

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Food microbiologyMtodo de Tincin.Usado en la industria lctica.Teido por redox. Toma e de los sistemas bioquimicos activos, cambiando de color.Las sustancias ms usadas son:Azul de metilo.Resazurina.

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Filtro por membranasMembranas porosas que retienen a las bacterias.Una vez retenidas son inoculadas en un agar para su posterior conteo.

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Filtro de epifluorecencia directaVariacion del mtodo de filtro.Usando teidores y microscopio fluorecentes.32

Microcolonias en DEFTUna variacin del Filtrado de epifluorecencia, son filtradas , inoculadas e incubadas.Determina clulas viables nicamente.Observacin por microscopio.Dependiendo del periodo de incubacin seran detectados lo microorganismos.Gram 3 hrs.Gram + 6 hrs.Coliformas, pseudomonas, staphyllococos 8 hrs.33Direct Epifluorescent Filter Techniques Cuenta colonias por Microscopio.Recuento de colonias de un agar sobre un portaobjetos, previamente inoculado y encubado.34

Goteo de agarGotear una muestra mezclada con cultivo en caja petri vaca.Realizar disoluciones y proceder con el goteo en otra caja petri.35Pelculas secasDos pelculas plsticas juntas, una de ellas contiene el medio de cultivo y un agente gelificante soluble en agua fra.Muestra diluida se coloca entre las pelculas, se realiza la incubacin.Las microcolonias se colorearan por la accin de tetrazolium durante la fase de teido.36Tubos rodantesEfectivo para conteo de bacterias anaerobias.Tubos con agar fundido e inoculado a in tubo con rosca,37BibliografaAdams M., Moss M. (2000) Food Microbiology, 2nd Edition, UK., Real Society of Chemistry.Jay J. (2000) Modern Food Microbiology, 6th Edition, USA, Aspen Publishers.Miramontes S. Manual de Laboratorio de Microbiologia General, UACH, Facultad de Ciencias Qumicas.Virtual Interactive Bacterology Laboratory Michigan State University http://learn.chm.msu.edu/vibl/index.html

38Gracias39