137

Capítulo 2

PropósitoConoce, determina muestras y comportamientos de los organismos, para su reproducción y control de los mismos, en laboratorios y en la industria.

Capítulo 2 Análisis de procesos microbiológicos

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Capítulo 2

139

Capítulo 2

Introducción

Para determinar la carga microbiana como medio preventivo, se puede realizar una inspección por medio de un análisis microbiológico de alimentos.

Entonces, no se puede lograr un aumento de la calidad microbiológica mediante el análisis microbiológico, por lo que es más pertinente, determinar en la Industria cuáles son los puntos de riesgo, tanto en la contaminación o la multiplicación microbiana (a los cuales llamaremos Puntos Críticos del proceso) y anularlos siguiendo un código estricto de Buenas Prácticas de Elaboración y Distribución del alimento (BPE).

Al evitar el uso de productos de baja calidad en la manufactura, estamos contribuyendo con la prevención para evitar la baja calidad microbiológica de los ya elaborados (con esto se presenta una relación costo beneficio muy baja, cuando se analiza una gran cantidad de muestras).

140

Capítulo 2

141

Capítulo 2

Unidad 1 Preparar muestras de materia prima para su análisis microbiológico

1.1 RAP Identifica las características generales de la prepa-ración de muestras, así como los procedimientos y valores de referencia

1.1.1 Generalidades sobre la toma de muestras y el análisis microbiológico de los productos finales

Cuando es desigual la distribución de los microorganismos en las mues-tras, se hace necesario continuar un esquema de toma de muestras para obtener resultados representativos.

El primer paso para la toma de muestras es seleccionar los puntos de mues-treo y con la ayuda de un muestreador microbilógico se recoge la muestra y se lleva a una caja Petri previamente preparada con un agar adecuado a los microorganismos que se deseen evaluar. La distribución de la muestra en la caja Petri se puede llevar a cabo extendiendo la muestra en líneas formando un ángulo o en puntos distribuidos homogéneamente en todo el espacio de la caja Petri, Figura 1.

Esquema 1: Caja de petri donde se pueden observar diversos microorganismos de una sola muestra.

142

Capítulo 2Capítulo 2

En la Figura 2 se muestran los diferentes tipos de microorganismos que se pueden encontrar en un muestreo de control de alimentos, exudados fluidos corporales etc.ras.

Esquema 2: Los diversos tipos de microorganismos.

143

Capítulo 2

Transporte de muestras: Es importante evitar que durante el transporte de las muestras se produzca:

• Multiplicación de los microorganismos presentes y;• Inactivación de algún microorganismo.

1.1.3Necesidaddevaloresdereferencia

Al comparar los resultados con valores microbiológicos de referencia, estos valores no pueden ser considera-dos como muestra típica aceptable, sino que son valo-res logrados cuando la producción del alimento se ha ajustado a las BPE (Buenas Prácticas de Elaboración).

La Microbiología de alimentos puede evaluar el riesgo asociado a estos valores de referencia y cuantificar los valores asociados a un alimento concreto para medir su alejamiento de la referencia (y por tanto de las BPE).

1.1.2 Fundamentos de los procedimientos analíticos

La variedad en la presencia de microorganismos en los alimentos es un factor muy importante en el análisis, por lo cual este muestreo incluye:

(a) Que para evitar la distorsión provocada por los microorganismos, es necesario evaluar la muestra que encontramos dentro de la superficie de canales, máquinas o sistemas de alimentos diversos como ensaladas, platos, congelados, entre otros.

(b) Remover el microorganismo muestra de una manera óptima el lugar adoptado como parte del muestreo.

(c) La evitación de la contaminación ambiental durante la toma o transporte de muestras.

144

Capítulo 2

Unidad 2 Selección y preparación demuestras microbiológicas

2.1 RAP Conoce y determina los tipos de muestreo, análisis y muestras representati-vas, para el uso en laboratorio y la industria

2.1.1 Muestreo único

Cuando se obtiene una muestra de una partida única de alimento, hay que considerar que los datos impor-tantes son los que proporcionan las normas de elabo-ración y conservación del alimento. Esto es esencial en lotes de alimentos importados, y más en los enlatados.

Es claro que ningún muestreo puede dar una garantía total de calidad microbiológica del alimento; si se ana-lizan un promedio de 30 muestras de un lote grande y no aparece ninguna en malas condiciones microbio-lógicas, aún hay una probabilidad razonable de que el 10% del lote sea microbiológicamente malo.

Debe ser una norma general, cuando es un lote desco-nocido, es pertinente realizar un análisis en un número de muestras equivalente al 1%, si éste es grande y al 10% si es pequeño, por lo que estos valores hay que ajustarlos a las condiciones reales.

Cuando la muestra es única el mejor criterio para ana-lizarlo, y darle seguimiento, será de acuerdo con las especificaciones del fabricante, por lo que las muestras únicas siempre tendrán una alta probabilidad de falsos negativos.

145

Capítulo 2

2.1.2 Análisis repetido Se pueden encontrar dos tipos de riesgo microbioló-gico: (a) el riesgo de que los que consumen acepten la probabilidad de lotes substándard y (b) el riesgo de que el fabricante tenga una alta probabilidad de rechazo de lotes substándard.

Cuando hay 10 muestras al azar, puede que en el muestreo al azar haya un rechazo del lote de produc-tos cuando se detecte un defecto, obligando al fabri-cante a tomar medidas de seguridad suficientes para proteger adecuadamente al consumidor.

En la Figura 3 se muestra la evolución de ciertos microorganismos que fue-ron muestreados y sembrados en la caja Petri, por lo que se puede realizar la evaluación de los organismos pre-sentes en la muestra.

2.1.3 Toma de muestras representativas

Estadísticamente es representativa la muestra, cuando se utilizan las tablas de número al azar. En el caso de alimentos haya que homogeneizar la muestra con batidoras o mezcladoras, para lograr que esta muestra sea representativa.

Esquema 3

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Capítulo 2

147

Capítulo 2

Unidad 3 Preparación de métodos de cultivo, solu-ciones y diluciones; esterilización

3.1 RAP Identifica los diferentes tipos de métodos de culti-vo, su preparación, clasificación, para su uso en laborato-rios y la industria

3.1.1 Preparación de una muestra para el análisis microbiológico

Al llevar a cabo un análisis, resulta importante llevar la muestra a condi-ciones adecuadas. La solubilización de la muestra es una operación que debe realizarse, en gran medida a casi todas éstas; así mismo, cuando deben analizarse compuestos inorgánicos, la eliminación de compuestos orgánicos que a veces los acompañan e interfieren en los ensayos de dichas sustancias inorgánicas. Los métodos mas frecuentes para la pre-paración de las muestras son la trituración, pulverización y finalmente la homogenización.

Esquema 4: Trituración de una muestra empleando un mortero con pistilo.

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Capítulo 2

3.1.3 Clasificación de los medios de cultivo

Se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en forma líquida o en forma sólida. Usualmente para preparar un medio sólido se parte de un medio líquido al que se le añade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la sílicagel.

Medios de cultivo generales. En ellas se da el crecimiento de una gran variedad de microorganismos. Se encuentran en esta categoría: las infusiones de extractos de carne y peptona, una mezcla de composición similar a la de los líquidos orgánicos, que se utiliza para muchas bacterias patógenas (causantes de enfermedades).

Medios de cultivo selectivos. Se da el crecimiento de un género o de una especie concreta de microorganismos. Son útiles para aislar ciertos microorganismos a partir de una población mixta. Por ejemplo, si a un cultivo se le añade un inhibidor del crecimiento de bacterias Gram +, como el cristal violeta, nos aseguramos de que en ese cultivo sólo van a crecer bacterias Gram-.

3.1.2 Preparación de medios de cultivo

Lo que permite el crecimiento de microorganismos son los medios de cultivo con una mezcla de nutriente, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, por lo que su control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos dentro de los laboratorios de microbiología. El cultivo es el crecimiento de poblaciones microbianas en ambientes artificiales (medios de cultivo) y bajas condiciones de laboratorio (temperatura, humedad, presión de oxígeno y pH óptimos para el crecimiento del microorganismo concreto y sin presencia de microorganismos contaminantes).

149

Capítulo 2

Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Es más común que se prefiera el uso de los medios de cultivo deshidra-tados porque simplifican el trabajo, obteniéndose mayor probabilidad de alcanzar resultados reproducibles.

Los medios de cultivo se utilizan en una de las formas siguientes:

Medios Líquidos o caldos de cultivo. Una vez preparados se mantienen en estado líquido. Se utilizan para realizar la suspensión de disolución de la muestra por analizar con el fin de conseguir la disolución madre. Pue-den presentarse en bolsas de 5 litros, en frascos de 250 ml, o en tubos de un solo uso.

Medios sólidos. Contiene un agente espesante, por lo general agar, en una concentración del 1,5 %. El agar es un derivado de algas. Es sólido en temperaturas inferiores a los 40 o 45ºC.

Medios semisólidos. Tienen una consistencia intermedia entre la de los anteriores. Suelen contener una concentración de agar del 0,7 %.

Esquema 5: Esquema representativo en la preparación de medios de cultivo.

Medio de cultivo

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Capítulo 2

Para su preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos: • Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que su-ministren productos de calidad. • Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y físico-química adecuada. • Utilizar materiales de vidrio bien lavado y enjuagado con agua destilada o desmineralizada. • Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización. • Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante.

3.1.4 Medios de cultivo más utilizados

Medio EMB (Agar de Eosina y Azul de metileno)

Se utiliza para la identificación, diferenciación y aisla-miento de enterobacterias; determina la funcionalidad del medio de cultivo con microorganismos típicos. Por su composición de lactosa y sacarosa podemos diferenciar en el primocultivo: salmonellas y shigellas, Proteus vulga-ris, Citobacter y Aeromonas.

Lo que entorpece el aislamiento de los gérmenes es la microflora, de interés médico y es ampliamente inhibida por los colorantes de la fórmula, sobretodo la flora Gram positiva. En este medio también es posible la identificación de Cándida albicans (incubación en CO2) y a veces se logra asilar Nocardia.

Se compone: Peptona de gelatina (10g), lactosa (5g), sacarosa (5g), fosfato dipotásico (2g), agar (13.5g), eosina (0.4g) y azul de metileno (0.065g). *pHf = 7.2 ±0.2

Medio Agar de Mac Conkey

Se ocupa para aislar e identificar selectivamente a enterobacterias como salmonellas, shigellas y coniformes, a partir de heces fecales, orina, aguas negras y diversos alimentos.

Los microorganismos Gram-positivos son acabados por las sales brillantes y el cristal violeta. Las

Desarrollo de microorganismos me-diante la selección adecuada del medio de cultivo puesto en una caja petri

151

Capítulo 2

Caldo nutritivo

Es un medio acuoso, elaborado de acuerdo con la fórmula del APHA y en el cuál se desarrollan una gran variedad de microorganismos que no son tan exigentes con respecto a sus necesidades nutricionales. Utilizado ampliamente en muchos procedimientos de laboratorio, tal y como viene preparado o bien adicionado de indicadores, carbohidratos, líquidos orgá-nicos, sales, etc.

Sal Manitol Rojo de Fenol

Es selectivo y muy empleado para aislar estafilococos patógenos de mate-riales clínicos diversos (orina, genitales, heridas, exudados faríngeos, etc.). La degradación del manitol con producción de ácidos cambia el color del medio de rosado a amarillo. Debido a su gran contenido de NaCl, puede hacerse una siembra masiva del material en estudio.

Por lo general se incuban las placas unas 36 hrs; pasado el tiempo, las colonias de estafilococos no patógenos se presentan de tamaño pequeño y rodeado de una zona roja; en cambio, las colonias de estafilococos patógenos fermentadores del manitol, se presentan colonias más grandes y rodeadas de una zona amarilla.

Está compuesto: Extracto de carne (1.0g), mezcla de peptonas (10.0g), NaCl (75g), D-Manitol (10.0g), agar (15.0g), rojo de fenol (0.025g) *pHf = 7.4 ±0.2

enterobacterias fermentadoras de la lactosa disminuyen el pH del medio que es detectado por el indicador rojo neutro dando colonias rosadas o rojas; Las no fermentadoras presentan colonias transparentes, incoloras o ambarinas.

Por otro lado, también crecen los bacilos Gram-negativos que no per-tenecen a la familia enterobacteriae como pseudomonas y aeromonas. Éstas pueden desarrollarse en número reducido de colonias puntiformes de Streptococcus fecales (enterococos) de color rojo y de algunos estafi-lococos cuyas colonias son pequeñas, opacas de color rosa pálido. Puede usarse en la diferenciación de Mycobacterium

Su composición: Peptona de caseína (17g), peptona de carne (3g), lactosa (10g), mezcla de sales biliares(1.5g), NaCl (5g), rojo neutro (0.03g), cristal violeta (0.001g), agar-agar (13.5g). *pH (37ºC) = 7.1 ±0.1

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Capítulo 2

3.1.5 Preparación de diluciones y soluciones

Las diluciones se utilizan en los análisis microbiológicos; para la contabi-lización de microorganismos presentes en la muestra representa un pro-blema, es decir, cuando se sospecha que un número de microorganismos opta por realizar una dilución para evitar errores en la cuenta.

Supongamos el siguiente ejemplo:

Considérese el caso de una muestra de suelo a la que se le desea con-tabilizar por cierto método la cantidad de tres microorganismos diferen-tes. Ya que la concentración de estos es muy alta como para realizar la medición directamente, normalmente se procede a diluir la muestra, antes de realizar la medición propiamente dicha.

Supóngase entonces que se toman 25 ml de la muestra original en un matraz aforado y se diluyen a 250 ml con agua destilada, (Solución A). Luego de homogenizar la solución recién preparada, se toman ahora 10 ml de esta solución en un matraz aforado y se diluyen nuevamente con agua

Medio SIM

Es un medio semisólido frecuentemente usado para diferenciar e identifi-car en cultivos puros de enterobacterias, la producción de sulfuros, indol y movilidad de las mismas. La coloración obscura indica producción de sulfuros. El desarrollo sólo a lo largo de la punción indica inmovilidad. La movilidad del germen se revela por una turbidez difusa en el seno del medio, y la producción de indol por medio de los reactivos Ehrlich o de Kovacs que dan una coloración rojo púrpura si es positiva.

También puede usarse para el mismo propósito, la tira de papel filtro impregnada con una solución de ácido oxálico. Esta se coloca seca, en la boca del tubo virando a un color rosado en caso de formación de indol.

Composición: Peptona de caseína (20.0g), peptona de carne (6.1g), sulfato de hierro y amonio (0.2g), tiosulfato de sodio (0.2g), agar (3.5g). *pHf = 7.3 ±0.2

153

Capítulo 2

destilada a 250 mls, (Solución B). Si posteriormente se realizan las deter-minaciones sobre la solución B y se encuentra que en ella las concentra-ciones son 15, 45 y 85, ¿cual será entonces la concentración de estos elementos en la muestra original?

Si se toman 10 ml de la solución A y se diluyen en un volumen de 250 ml con agua destilada, todas las substancias que se hallaban disueltas en A, estarán ahora en la solución B, 25 veces más diluidas (250/10). En general, en las operaciones de dilución, el volumen final al cual se lleva una dilución, dividido por el tamaño de la alícuota, se conoce como el “Factor de Dilución”.

El factor de dilución es el número por el cual se debe multiplicar la concentración de un soluto en una solución diluida, para reproducir la concentración de la muestra original.

Así, el factor de dilución para pasar de la muestra ori-ginal a la Solución A, será igual a 250 mls / 25 mls = 10. A su vez, el factor de dilución para pasar de la Solución A, a la Solución B, sería igual a 250 mls / 10 mls = 25. Por lo tanto, el factor de dilución para pasar de la muestra original a la Solución B, será igual a 10 × 25 = 250. Esto significa que la concentración en la muestra original es 250 veces mayor que la concen-tración en la solución B, donde se realiza la medida.

Factor de dilución = ____________________Volumen total

Volumen de alícuota

Esquema 6: Preparación de diluciones y soluciones.

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Capítulo 2

Solucionesapartirdeunsolutosólido:

Los cálculos para preparar una solución a partir de un soluto sólido son los siguientes:

1. Conocer el peso molecular del soluto para poder calcular la masa molecular. 2. Establecer la concentración de la solución por pre-parar y el volumen necesario de la misma.

Ejemplo: ¿Cuántos gramos de NaOH se necesitan para preparar 200 ml de solución 0,3 mol/ml?

Soluciones

Una solución es una mezcla homogénea de un soluto en un solvente. Un Soluto es la sustancia en la que se disuelve un compuesto químico de-terminado y el solvente es la sustancia en la cual se disuelve un soluto.

Esquema7:Soluciones.

155

Capítulo 2

1Actividad

Autoevaluación

Práctica

C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84

C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0

C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86

C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2

C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35

Investigar en la tabla periódica la masa atómica de los componentes del NaOH.

1Paso

2Paso Cálculo de la Masa molecular del

NaOH (1x23) + (1 x 16) + (1 x 1) = 40 g

Una vez obtenido este valor, lo que debe hacerse en el laboratorio es pesar 2,4 g de NaOH y disolverlo en aproximadamente 150 ml de agua y luego aforar el matraz colocando agua hasta que llegue a 200 ml. Y se tendrá una solución de NaOH al 0,3 molar.

Masa contenida en los 200 ml de NaOH.

Cálculo de la Masa de NaOH en 1.000 ml (1L) de solución 0,3 mol/L Planteamiento: Si 1 mol de NaOH equivale a 40 g de NaOH, 0,3 mol de NaOH a cuanto equivale:

3Paso

4Paso

156

Capítulo 2

3.1.6 Esterilización

Para la eliminación o muerte de todos los microorganismos la esteriliza-ción es un medio útil que contiene un objeto o sustancia, acondicionados en tal forma que no pueden contaminarse nuevamente.

Existen diversos métodos entre los cuales se encuentran los:

• físicos, • mecánicos y;• químicos.

A continuación, se presenta una clasificación más general de los méto-dos de esterilización empleados en la industria y en los laboratorios de análisis clínicos:

Esquema 8: Clasificación de los métodos de esterilización.

157

Capítulo 2

Vapor a presión (autoclave)

Se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión. El modelo más usado es el de Chamberland. Esteriliza a 120° a una atmósfera de presión (estas condiciones pueden variar) y se deja el material durante 20 a 30 minutos. El vapor a presión proporciona elevadas temperaturas con penetración y humedad en grandes cantidades que facilitan la coagulación de las proteínas.

Equipo: una caldera de cobre, sostenida por una camisa externa metálica, que en la parte inferior recibe calor por combustión de gas o por una resistencia eléctrica, ésta se cierra por la parte superior con una tapa de bronce. Esta tapa posee tres orificios, uno para el manómetro, otro para el escape de vapor en forma de robinete y el tercero, por una válvula de seguridad que funciona por contrapeso o por resorte.

Funcionamiento: Se coloca agua en la caldera, previendo que su nivel no alcance a los objetos que se disponen sobre una rejilla de metal. Se cie-rra perfectamente la tapa, sin ajustar los bulones y se da calor, dejando abierta la válvula de escape hasta que todo el aire salga por completo y comience la salida de vapor en forma de chorro continuo y abundante.

3.1.7 Métodos físicos

Calor Húmedo

Se utilizar calor, su eficacia depende de dos factores: el tiempo de expo-sición y la temperatura. Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la acción del calor. El calor provoca desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de las membranas y/o procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos.

El calor húmedo provoca desnaturalización y coagulación de proteínas; se deben principalmente a dos razones:

1) El agua es una especie química muy reactiva y muchas estructuras biológicas son producidas por reacciones que eliminan agua y 2) El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más elevado que el aire.

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Capítulo 2

Radiaciones ionizantes

Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los ácidos nucleicos, estructuras proteicas y lipídicas, y componentes esenciales para la viabilidad de los mi-croorganismos, dando lugar a mutaciones en los micro-organismos que los incapacitan metabólicamente para producir una enzima esencial y sobreviniendo la muerte bacteriana. Las radiaciones tienen gran penetrabilidad y se les utiliza para esterilizar materiales termolábiles (ter-mosensibles) como jeringas descartables, sondas, etc. Se utilizan en escala industrial por sus costos.

Calor Seco

El calor seco produce desecación de la célula, es esto tóxico por niveles elevados de electrolitos. Estos efectos se deben al cambio de calor des-de los materiales hasta los microorganismos que están en contacto con estos. La acción destructiva del calor sobre las proteínas y los lípidos requieren una elevada temperatura cuando el material está seco o la ac-tividad de agua del medio es baja.

Esquema 9: Esquema general de una autoclave.

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Capítulo 2

3.1.8 Métodos químicos

Estos métodos provocan la perdida de viabilidad de los microorganis-mos.

a) Óxido de etileno: Es un agente alquilante que se une a compues-tos con hidrógenos lábiles como los que tienen grupos carbxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc. Se utiliza en la esterilización gaseosa, general-mente en la industria farmacéutica. Destruye todos los microorganismos incluso virus; es un agente micro-biano de amplio espectro, destruye bacterias en estado vegetativo, in-cluyendo al bacilo de la tuberculo-sis, las esporas y los virus. Por otra parte, sirve para esterilizar material termosensibles como el descartable (goma, plástico, papel, etc.), equipos electrónicos, bombas cardiorrespira-torias, metal, etc. Es altamente pe-

Rayos Gamma: Su empleo sus cimientos parten de los conocimientos sobre la energía atómica. Este tipo de esterilización se utiliza en los productos o materiales termolábiles y de gran importancia en el campo industrial. Puede esterilizar antibióticos, vacunas, ali-mentos, etc.

Rayos X: Penetran bien, pero requieren mucha energía, son pocos operativos para su empleo masivo, su uso es muy costoso; por lo tanto, casi no se utiliza para fines de esterilización.

Rayos Ultravioletas: Afectan a las moléculas de DNA de los microorganismos. El ADN absorbe una longitud de onda de 260 nm y libera energía ocasionado la mejora de enlaces químicos; son escasamente penetrantes, se utilizaron para superficies y en la esterilización en quirófanos.

ligroso por ser inflamable y explosi-vo, y además cancerígeno. b) Aldehídos: Son agentes alquilan-tes que actúan sobre las proteínas, provocando una modificación irre-versible en enzimas e inhiben la ac-tividad enzimática. Estos compues-tos destruyen las esporas.

c) Glutaraldehído: Consiste en pre-parar una solución alcalina al 2% y sumergir el material por esterilizar de 20 a 30 minutos, y luego un enjuague de 10 minutos. Este méto-do tiene la ventaja de ser rápido y ser el único que esteriliza de mane-ra efectiva en frío. Puede esterilizar plástico, goma, vidrio, metal, etc.

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Capítulo 2

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Capítulo 2

Para esto se utilizan medios de cul-tivo líquidos que mediante alguna estrategia de selección (composición química, temperatura de incubación, etc.) permitan la proliferación hasta niveles detectables de los microor-ganismos que se desean aislar. Si además se buscan microorganismos con alguna actividad metabólica o característica particular, para ‘po-nerlos en evidencia’ debemos hacer que nuestros medios sean diferen-ciales, es decir, que nos permitan detectar de alguna manera la pre-sencia de la estructura o actividad buscada.

Unidad 4 Aislamiento e inoculación

4.1 RAP Identifica los diferentes tipos de métodos de cultivo, su preparación, clasificación, para su uso en laboratorios y la industria

4.1.1 Aislamiento de microorganismos

El aislamiento y la purificación de bacterias a partir de muestras ambienta-les requieren la aplicación de metodologías pautadas en función del grupo bacteriano que se desee estudiar.

Cuando se trabaja con comunidades de microorganismos, generalmente sólo una fracción minoritaria (entre el 0,1 y el 10%) puede ser cultivada en medios artificiales. Cuando el objetivo es el estudio de microorganis-mos cultivables que se encuentran en muy baja proporción en la muestra original, conviene realizar cultivos de enriquecimiento.

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Capítulo 2

El aislamiento de cepas puede llevarse a cabo utilizando las técnicas empleadas normalmente en microbiología; se pudiera seguir el siguiente esquema a partir de una muestra de suelo:

1. La muestra de suelo se suspende en agua estéril. 2. El sobrenadante se diluye 10-1 a 10-10 veces. 3. Muestras de estas series de diluciones (c.a. 100 µL) se siembran sobre varios medios de cultivo (dependiendo del tipo de microorganismos que que-ramos aislar) y luego se incuban. 4. Se aíslan colonias separadas de distinta morfo-logía y se purifican por resiembra. 5. Los cultivos puros se mantienen en tubos de ensayo como cultivos en medio sólido listos para realizar las pruebas de selección.

Esquema 10: Mecanismo general para el aislamiento de un microorganismo de interés.

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Capítulo 2

El procedimiento de selección puede ser acelerado frecuentemente probando la actividad biológica de los aislados iniciales directamente..

164

Capítulo 2

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Capítulo 2

Unidad 5 Diferentes aspectos de la microbiologíay fuentes de obtención de microorganismos

5.1 RAP Identifica y conoce los aspectos más importantes de la microbiología y la fuente de obtención de microorganismos

5.1.1Seleccióndemicroorganismos

Búsqueda: Detección y aislamiento de microorganismos de interés industrial de una población compleja de organismos, utilizando procedimientos selectivos.

Búsqueda Primaria: Detección y aislamiento de microorganismos potencialmente útiles.

Búsqueda Secundaria: Estudio de los microorganismos aislados en la búsqueda primaria para separar los que tienen interés potencial de los que tienen interés real y mejorar estas cepas seleccionadas.

Para llevar a cabo una búsqueda primaria generalmente se parte de una población mixta (suelo, fermentaciones naturales, etc.) donde existe, tanto una gran cantidad como variedad de microorganismos potencialmente útiles que debemos seleccionar. Lo primero que debemos utilizar son medios selectivos donde crezca el tipo de microorganismo que nos interesa aislar. A este medio se le pueden añadir inhibidores para eliminar los que no nos interesan.

Por ejemplo, si queremos obtener un microorganismo aerobio lo creceríamos en presencia de O2 con lo que los anaerobios no crecerían; o bien, si queremos seleccionar hongos, añadiríamos cloranfenicol, antibiótico que actúa frente a bacterias, pero que no afecta a los hongos.

Los parámetros generales que tenemos que tener en cuenta son la fuente de carbono, fuente de nitrógeno, aireación, temperatura, pH e inhibidores. Posteriormente se reaislan en cultivo puro aquellos microorganismos que hemos aislado para su posterior estudio.

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Capítulo 2

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Capítulo 2

Unidad 6 Técnicas de cultivo y conservación de mi-croorganismos

6.1RAPDeterminalastécnicasdecultivomásadecuadas, laobtención, aislamiento y conservación de microorganismos

6.1.1 Fuentes de obtención de microorganismos

1. Fermentaciones naturales: vino, pan, queso, materiales en descomposición. 2. Animales y plantas enfermos: vacunas. 3. Suelo: es el mayor almacén; también es el más difícil de manejar, ya que se pueden encontrar todo tipo de microorganismos y en una concentración de 100 millones por gramo de suelo (gran variedad y cantidad). 4. Colecciones internacionales de cultivos tipo. Para el aislamiento de nuevos productos metabólicos, se intentan aislar cepas a partir de ambientes extremos o poco corrientes esperando que de que tales cepas sean capaces de producir nuevos metabolitos. Por ejemplo, se están examinando microorganismos de las grandes altitudes, hábitats fríos, aguas marinas, profundidades de los océanos, desiertos, géiseres, campos de petróleo, etc.

Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos:

a) Aislamiento por estrías b) Aislamiento por dilución

Existen distintas técnicas, el objeto es obtener colonias aisladas. Una de ellas consiste en cargar el asa con la muestra y hacer estrías paralelas en la cuarta parte de la superficie de la placa, Esquema 11 (d) y (e); se quema el asa, Esquema 11 (a) y (b) se enfría, se gira la placa 90° y se vuelve a estriare tocando 3 y 4 veces el área sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de placa. Esquema 11 (c).Por último, sin quemar el asa, se estría el resto de la superficie sin sembrar.

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Capítulo 2

En algunos otros métodos se realizan en forma las siembras en forma radial, Es-quema 11 (f); o en forma de “T” Esquema 11 (g); o de contorno, Esquema 11 (h).

Esquema 11: Esquema de técnicas de aislamiento.

Esquema 12: Métodos de siembra.

11 a) 11 b) 11 c)

11 d)

11 e) Cuadrante

11 g) Forma de T

11 f) Radiante

11 h) Continuo

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Capítulo 2

6.1.2 Aislamiento por dilución

Se emplean, tanto el método de siembra incorporada como el de siembra en superficie. Suele ser necesario diluir la muestra.

Para ello se pueden preparar las diluciones decimales en condiciones asépticas usando suero fisiológico o algún otro diluyente.

La siembra incorporada se realiza obteniendo una dilución y sembrándola antes de gelidificar el agar sobre la placa, es decir, incorporando el inóculo en el agar. También se pueden preparar las diluciones directamente en tubos de agar fundido, se agita por rotación entre las manos y se vierte en placas de Petri estériles.

Para llevar a cabo las diluciones para siembras de micro-organismos, se toma un mililitro de líquido de cultivo y se pasa a un frasco cuya capacidad sea superior a 100 milili-tros y se le agregan 99 mililitros de agua destilada, se agita la nueva solución y se toma de está un mililitro y se pasa a otro frasco cuya capacidad sea superior a 100 mililitros y se agregan 99 mililitros de agua destilada. Con lo que tendremos una disolución 1:10,000.

Nuevamente del último frasco se toma un mililitro de la solución y se pasa a un tercer frasco cuya capacidad sea superior a 100 mililitros y se le agregan 99 mililitros para tener una dilución 1:1’000, 000.

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Capítulo 2

Se toma un mililitro del segundo frasco dilución 1:10, 000 y se siembra en una caja Petri (No. 1); luego de ese frasco se toma un mililitro de la solución con 9 mililitros de agua destilada y se siembran en otra caja Petri (No. 3), se toma un mililitro del último frasco y se siembra en otra caja Petri (No. 2), y luego se vuelve a tomar 1 mililitro de este frasco con 9 mililitros de agua para tener una dilución 1:10’000,000 (No. 4). Esquema 13

Esquema 13. Método de diluciones para sembrar microorganismos.

A

1 ml

B C

171

Capítulo 2

Se pasa un mililitro de muestra de cultivo a otro recipiente de capacidad superior a los 100 ml y se completa con agua destilada a 100 ml. (esto es se agregan 99 ml); dando una dilución de 1:100. Luego de este frasco se toma un mililitro y se pasa a otro frasco de igual capacidad (mayor o igual a 100 ml) y se completa con agua destilada a 100 ml, dando una dilución de 1:10,000 respecto al cultivo inicial.

Finalmente de este frasco se toma un mililitro y se pasa a otro frasco de igual capacidad que los anteriores y se com-pleta, de igual forma a 100 ml, de tal forma que se tendrá una dilución de 1:1’000,000 respecto al cultivo inicial. En esta forma se ha logrado tener una siembra por dilución de un cultivo original.

172

Capítulo 2

173

Capítulo 2

7.1.2 Algunos tipos de microorganismos

LevadurasLas levaduras se utilizan desde hace miles de años para la fabricación de pan y bebidas alcohólicas. La levadura que sin duda fué la primera y la que aún se sigue utilizando.

Saccharomyces cerevisiae de estas se emplean diferentes cepas para la fabricación de cerveza, vino, sake, pan y alcoholes industriales.

Kluyveromyces fragilis es una especie fermentadora de la lactosa que se explota en pequeña escala para la producción de alcohol a partir del suero de la leche.

Yarrowia lipolytica es una fuente industrial de ácido cítrico. Trichosporum cutaneum desempeña un importante papel en los sistemas de

Unidad 7 Control de microorganismos y su importancia industrial

7.1RAPDeterminaycontrolalosmicroorganismosdeinteréspara la industria

7.1.1 Microorganismos de interés industrial

Un microorganismo de uso industrial debe producir la sustancia de interés; debe estar disponible en cultivo puro; debe ser genéticamente estable y debe crecer en cultivos a gran escala. Otra característica importante es que el microorganismo industrial crezca rápidamente y produzca el producto deseado en un corto período de tiempo. El microorganismo debe también crecer en un medio relativamente barato de cultivo disponible en grandes cantidades. Además, un microorganismo industrial no debe ser patógeno para el hombre o para los animales o plantas.

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Capítulo 2

Hongos filamentosos

Los hongos tienen una gran importancia económica, no tan sólo por su utilidad, sino también por el daño que pueden causar. Estos son responsables de la degrada-ción de gran parte de la materia orgánica de la Tierra, una actividad enormemente beneficiosa, ya que permite el reciclaje de la materia viva.

Por otro lado, los hongos causan enfermedades en plantas y animales; del mismo modo pueden destruir alimentos y materiales de los que depende el hombre. Los efectos perjudiciales que causan están contrarres-tados por su utilización industrial.

digestión aeróbica de aguas residuales debido a su enorme capacidad de oxidación de compuestos orgánicos, incluidos algunos que son tóxicos para otras levaduras y hongos, como los derivados fenólicos.

Esquema 14: Esquema de levaduras.

Saccharomycescerevisiae Kluyveromyces fragilis

175

Capítulo 2

Son la base de muchas fermentaciones como la combinación de soja, ha-bichuelas, arroz y cebada que dan lugar a los alimentos orientales miso, shoyu y tempeh. Los hongos son también la fuente de muchos enzimas comerciales (amilasas, proteasas, pectinasas), ácidos orgánicos (cítrico, láctico), antibióticos (penicilina), quesos especiales (Camembert, Roquefort) y, evidentemente, de las setas.

Bacterias

Entre las especies bacterianas de interés industrial están:

a) Las bacterias del ácido acético, Gluconobacter y Acetobacter que pueden convertir el etanol en ácido acético. El género Bacillus es pro-ductor de antibióticos (gramicidina, bacitracina, polimixina), proteasas e insecticidas. Del género Clostridium cabe destacar Clostridium acetobutylicum que puede fermentar los azúcares originando acetona y butanol.

b) Las bacterias del ácido láctico incluyen, entre otras, las especies de los géneros Streptococcus y Lactobacillus que producen yogur. Cory-nebacterium glutamicum es una importante fuente industrial. Tienen un olor característico a tierra mojada; se debe a compuestos volátiles (geosmina) producidos por Streptomyces, aunque su importancia radi-ca en la producción de antibióticos como anfotericina B, kanamicina, neomicina, estreptomicina, tetraciclina, etc.

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Capítulo 2

Actividad

Autoevaluación

Práctica

C 27,06 / M 100 / Y 100 / N 27,84

C 19,61 / M 10,98 / Y 19,61 / N 0

C 44,71 / M 41,96 / Y 100 / N 16,86

C 69,02 / M 53,73 / Y 34,51 / N 10,2

C 100 / M 90,98 / Y 32,55 / N 22,35

1. Los criterios utilizados para juzgar la calidad microbiológica de los alimentos debe ser: b

a) Al máximo b) Al mínimo c) Medio d) Ninguna de las anteriores e) Medio y mínimo

2. La variedad en la presencia de microorganismos incluye alguna de las siguientes opciones. ¿Cuál de ellas corresponde? d

a) La contaminación ambiental durante la toma o transporte de muestra.b) No será necesario evaluar la muestra que encontramos dentro de la superficie. c) Provocar a los microorganismos evaluando la muestra dentro de superficies. d) Que para evitar la distorsión provocada por los microorganismos es necesario evaluar la muestra que encontramos. e) Plantar un microorganismo como parte de muestreo.

3. ¿Cuál es el porcentaje que se le asigna a un lote pequeño de muestras? ca) 14% b) 1% c) 10% d) 20% e) 9%

4. Los riesgos microbiológicos se representan de dos formas; indica cuál de las opciones las menciona d

a) Que los que consumen no acepten lotes substàndar y el riesgo del fabricante b) El rechazo de un lote de productos y obligar al fabricante a tomar medidasc) Obligar a tomar un muestreo al azar y proteger al consumidor. d) El riesgo de que los que consumen acepten la probabilidad de los totes subtàndar y el riesgo de que el fabricante tenga probabilidad de rechazo de lotes.e) Ninguna de las anteriores

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Capítulo 2

5. ¿Cuáles son los métodos mas frecuentes que se utilizan para la preparación de las muestras? c a) la trituración, ionización, la pulverización b) la pulverización, sulubilizaciòn, homogenización c) la trituración , la pulverización, homogenización d) ionización , subutilización trituración e) pulverización , homogenización, ionización

6. Dentro de la clasificación de los medios de cultivo, ¿ cuál es que se mantiene en un estado liquido y se utiliza para realizar suspensión de disolución c a) cultivos generales b) cultivos selectivos c) caldos de cultivod) sólidose) semisólidos

7. Es uno de los medios más utilizados, el cual menciona que la degradación del minitol con producción de ácido cambia el color del medio de rosa a amarillo. C a) Medio EMB b) Agar de Mac Conkey c) Sal Manitol d) Caldo nutritivo e) SIM

8. Es la sustancia en la que se disuelve un compuesto químico determinado. b a) Un solvente b) Un soluto c) Una solución d) Un químico e) Un compuesto

9. ¿Cuál de las siguientes opciones representan los métodos de esterilización físicos? a) Oxido de etileno, radiaciones ionizantes b) Aldehídos, glutaraldehìdos c) Vapor a presión aldehídos d) Oxido de etileno vapor a presión e) Calor húmedo, calor seco

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Capítulo 2

10. ¿Cual de la selecciones de microorganismos menciona que para rea-lizarse es necesario partir de una población mixta? c a) La secundaria b) La terciaria c) La primaria d) La secundaria y la primaria e) Terciaria y primaria

11. Una fuente de obtención de microorganismos que se da a través del vino, el pan y queso. ca) Animales b) Colecciones internacionales de cultivoc) Fermentaciones naturales d) Sueloe) El aire

12. ¿Cuál de las siguientes opciones menciona uno de los métodos de siembra? ba) Aldehídos b) Cuadrante c) Circular d) Semisólido e) Rectangular

13. Dentro de los tipos de microorganismos que causan enfermedades en plantas y animales, así mismo destrucción de alimentos. c a) Levaduras b) Bacterias c) Hongos d) Suelo e) Microbios

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Capítulo 2

1. b2. d3. c4. d5. c6. c7. c8. b9. e10. c11. c12. b13. c

Respuestas a la autoevaluación

180180

Capítulo 3