Manual de Análisis Microbiológicos

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CENTRO DE BACHILLERATO TECNOLÓGICO industrial y de servicios No 43 MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO DE: ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS CORRESPONDIENTE A LA ESPECIALIDAD DE: Producción Industrial de Alimentos ELABORADO POR: Ing. Martín Balderas Nares

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CENTRO DE BACHILLERATO TECNOLÓGICO

industrial y de servicios No 43

MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO DE:

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS

CORRESPONDIENTE A LA ESPECIALIDAD DE:

Producción Industrial de Alimentos

ELABORADO POR:

Ing. Martín Balderas Nares

Período: Septiembre 2012 – Enero 2013

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PRACTICA #1

IDENTIFICACIÓN DE MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO

Competencia a alcanzar: El alumno identifica con precisión los materiales y equipos microbiológicos, así como la utilidad de cada uno de ellos.

Materiales y equipos:

Material Utilización

Tubos de ensayo

Tubos de fermentación

Placas de Petri

Pipetas graduadas

Matraces Erlenmeyer

Matraces Kitasato

Probetas

Portaobjetos

Cubreobjetos

Portaobjeto excavado

Campana Durham

Vasos de precipitado

Material diverso

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Asa en loop

Asa recta

Discos de antibióticos

Mechero Bunsen

Porta pipetas

Papel pH

Cestillo metálico

Aparatos

Microscopio óptico

Autoclave

Horno Pasteur

Refrigerador

Incubadora o Estufa

Cuenta colonias

Ph metro o potenciómetro

Destilador

Instrucciones:

1. Estudia previamente las formas, características y utilidad de cada material y

equipo de laboratorio.

2. Con el material en la mesa y con mucho cuidado de no dañar los materiales,

preguntarse unos a otros entre los integrantes de equipo cada uno de los

materiales:

El nombre del material

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La utilidad del mismo.

3. Una vez que todos los integrantes de equipo tengan la seguridad de reconocer

cada material y su utilidad acudir al profesor para presentar un examen oral

correspondiente.

4. Elaborar un informe en equipo de la práctica el cual deberá presentarse a las 2

siguientes clases y comprenderá lo siguiente:

Hoja de presentación: incluyendo número y nombre de la práctica, grupo,

número de equipo, integrantes de equipo.

Imágenes o dibujos de lo realizado.

Conclusión.

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PRÁCTICA # 2:

EL MICROSCOPIO COMPUESTO

OBJETIVOS:

1. Recordar las partes mecánicas y ópticas del microscopio.

2. Comprender la interrelación entre parte óptica y mecánica.

3. Manejar perfectamente el mecanismo de enfoque del microscopio.

INTRODUCCIÓN

El microscopio ( mikrós , pequeño y skopéoo , observar) fue acuñado con este nombre

por Jean Faber en 1624. Ya los antiguos babilonios utilizaban lupas; pero el verdadero

impulsor del microscopio fue Anton van Leeuwenhöek (1632-1723) que construía

microscopios con lentes convexas y observaba distintas estructuras, fue el primero que

dibujó y observó Protozoa .

Hay diversas clases de microscopios, simple, de contraste de fases, electrónico, de

barrido, etc; nosotros usaremos el compuesto, que consta:

a) Parte mecánica, b) Parte óptica c) Sistema de iluminación.

MATERIAL:

* Microscopios

* 4 Portaobjetos

* hojas de plantas, fibra de gajos de cítricos, trozo de cebolla, agua sucia.

1 . PARTES ÓPTICAS E ILUMINACIÓN DEL MICROSCOPIO

1.1. SISTEMA DE REFRACCIÓN

Un microscopio compuesto tiene dos lentes, objetivo (situado cerca del objeto) y ocular

(situado cerca del ojo). El aumento primario del objeto es producido por el objetivo, y el

aumento final se realiza en el ocular.

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El poder de resolución es la capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy

cercanos. Cuanto mayor sea el poder de resolución, mayor será la definición del objeto .

El poder de resolución depende de ë (longitud de onda utilizada) y de AN : APERTURA

NUMÉRICA (característica de la lente que depende del índice de refracción del medio y

del seno del ángulo de apertura). Como ë es constante, el poder de resolución depende

de AN , la apertura numérica.

El ojo tiene un poder de resolución de 0,1 mm; y el microscopio de 0,12 F . Un diámetro

de 0,2 F m, si se aumenta 1000 veces aparecerá como un objeto de 0,2 mm

El poder de resolución por lo tanto es directamente proporcional a ë , e inversamente

proporcional a AN1

Un factor que afecta a la apertura numérica es, además, de la talla de la lente, el medio a

través del cual atraviesa la luz. Mientras el objetivo está separado del objeto por el aire, la

AN nunca es mayor que 1; si se desean valores mayores que 1, el objetivo deberá estar

inmerso en aceite de cedro que aumente el índice de refracción entre 1,2 y 1,4 (esta lente

se denomina lente de inmersión y se diferencia de las otras con la palabra oil. Este

objetivo nunca se utiliza sin aceite y una vez utilizado hay que limpiarlo rápidamente para

que no se seque el aceite.

1.2. SISTEMA DE ILUMINACIÓN

Este sistema es importante, ya que la luz debe enfocarse sobre la preparación mediante

el condensador; subir o bajar el condensador hace que el foco de luz se disponga en un

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punto. El diafragma controla el diámetro del círculo de luz que alcanza el objeto. Si la luz

es brillante se deberá cerrar el diafragma.

Otro aspecto que varía la nitidez de la observación es la profundidad de campo (espesor

de la preparación). A mayor aumento la profundidad es menor de 1 F m. La profundidad

de campo es inversamente proporcional al aumento utilizado.

2. MANEJO DEL MICROSCOPIO

El microscopio es un aparato delicado y de precisión, en consecuencia, su manejo ha de

realizarse con sumo cuidado. Bajo ningún concepto se desmontará pieza alguna, ya que

este hecho podría acarrear desajustes de difícil solución.

1. Colocar la platina en una posición alejada de los objetivos, con el Objetivo de menor

aumento preparado para su utilización. La platina debe estar Dirigida hacia el observador.

2. Colocar en cada portaobjetos cada una de las muestras a observar (hojas, película de

cebolla, fibra de los gajos de un cítrico, etc.). Poner la preparación sobre la platina y

centrarla.

3. Conectar la luz y abrir completamente el diafragma.

4. Subir la platina hasta la proximidad del objetivo, o bajar el objetivo hacia la proximidad

de la preparación con el mando macrométrico. Para hacer esta operación no mirar por el

ocular.

5. Mirar por el ocular y alejar el objetivo de la preparación (bien alejando el objetivo o la

platina) con el macrométrico hasta que se vea con claridad.

6. Graduar la intensidad de la luz con el diafragma. Cuanto menor sea el aumento deberá

estar más cerrado.

7. Fijarse en el aumento del objetivo y pasar a otro objetivo moviendo exclusivamente el

revolver. Ahora se manejará el tornillo micrométrico para enfocar.

8. Para retirar la preparación: poner el objetivo de menor aumento y alejar el objetivo de la

preparación con el tornillo micrométrica.

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3. PARTES DEL MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO

Anotar los nombres de la partes del microscopio

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a) Definir los siguientes términos: micrométrico Revólver Objetivo oíl Tornillo de enfoque Pie Platina Aceite de cedro Diafragma Ocular Condensador Lámpara Enfoque Micrométrico Brazo b) De qué partes del microscopio depende la correcta iluminación? c) A qué parte del microscopio debe dirigirse la luz de la lámpara? d) Cómo varía la iluminación al abrir o cerrar el diafragma? e) Cómo varía la iluminación al desplazar el condensador? f) Interpreta el funcionamiento de los tornillos macro y micrométrico. g) Cómo se calcula el aumento total del microscopio? h) Por qué es interesante centrar lo que nos interesa observar de la preparación si queremos observarlo a gran aumento?

ANOTA TUS CONCLUSIONES:

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PRÁCTICA # 3:

TÉCNICAS DE SEMBRADO EN PLACA Y EN TUBO

OBJETIVOS: 1. Practicar las técnicas de sembrado de m.o. en placa y en tubo analizadas

previamente.2. Practicar la forma correcta del vaciado de medios de cultivo en placas y tubos.

INTRODUCCIÓN

La población microbiana existente en nuestro entorno es grande y compleja. Cientos de especies microbianas habitan normalmente en distintas partes de nuestro cuerpo, incluidas la boca, el tracto intestinal y la piel. Al nacer, los microbios inmediatamente empiezan a colonizar nuestros cuerpos, así como a casi todos los objetos del mundo. Ellos flotan alrededor hasta que entran en contacto con una superficie que ofrezca comida y resguardo. Se encuentran más frecuentemente en la oscuridad, en objetos húmedos que a menudo entran en contacto con la comida, la suciedad o la vegetación. Las superficies del baño, los cepillos para el cabello, los refrigeradores, los lavaplatos y las tablas de cocina tienen a menudo muchos microbios. Las manijas y las paredes tienen menos porque son pobres en nutrientes y secos.

Un estudio adecuado de microorganismos que hay en estos hábitat requiere técnicas que permitan conocer y ordenar la compleja población mixta o cultivo mixto, separándole en sus distintas especies como cultivos puros. Un cultivo puro consta de una población de células derivadas todas ellas de una célula parental. Los microorganismos se cultivan en el laboratorio sobre materiales nutritivos denominados medios. Se dispone de una gran cantidad de medios y la clase que se debe de utilizar depende de muchos factores, uno de los cuales es la clase de microorganismos que se va a cultivar. El material que se inocula sobre el medio se denomina inóculo mediante alguna técnica de siembra, ya sea por estría en placa o siembra en masa en placa, o bien en tubo aunque normalmente esto se realiza para pruebas bioquímicas de identificación. Una vez realizada la siembra se realiza la incubación a 37:C , las células microbianas individuales se reproducen tan rápidamente que en un lapso de 18 a 24 horas producen masas visibles de células denominadas colonias.

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MATERIAL: asa bacteriológica loop asa bacteriológica recta 1 caja petri por cada integrante de

equipo 1 tubo de fermentación por cada 2

integrantes de equipo Mechero de bunsen Pinzas para capsula de porcelana Tripie Tela de asbesto Vaso de pp de 500 ml Guantes de asbesto

SUSTANCIAS: Gelatina (simulando medio de

cultivo) Alimento con carga microbiana Alcohol etílico Algodón Cinta masking tape

PROCEDIMIENTO:

I. Vaciado del medio de cultivo en cajas y tubos1. Por ser una práctica de sembrado, se partirá de cajas petri y tubos que

tengan gelatina simulando un medio de cultivo. Para ello en un vaso de p.p. de 500 ml se prepara la gelatina pero con la mitad de agua que marque las instrucciones para que la consistencia se mas similar a la de los medios de cultivo.

2. Antes de que se enfrie el medio de cultivo (gelatina) se vacia en cada una de las cajas petri previamente lavadas y esterilizadas (simulada su esterilización) hasta la mitad de su capacidad de volumen. Para ello las cajas petri deben colocarse debajo del mechero dejar la base sobre el mechero y conservar la tapa en su mano izquierda (nunca la ponga sobre la mesa) y con la mano derecha vacíe el medio de cultivo (gelatina).

3. Colocar la tapa 4. Llenar los tubos de fermentación con el medio de cultivo (gelatina) hasta

ligeramente arriba de la mitad (como 1 cm arriba de la mitad). Hacerlo mediante un embudo limpio y estéril (esterilización simulada) ya que la boca del tubo es muy angosta. Nunca dejar el tapón del tubo sobre la mesa.

5. Colocar el tapon de rosca en el tubo y colocarlo de tal manera que la parte superior del tubo (la que tiene el tapon, este recargada en la base de una gradilla.

6. Dejar enfriar para que solidifique el medio de cultivo de las cajas y tubos.7. Una vez solidificado invertir las cajas petri y etiquetar con cinta masking

tape anotando grupo y equipo, al igual que los tubos los cuales se colocan dentro del vaso de pp. De 500 ml previamente lavado.

8. Entregárselo a la encargada de laboratorio para que lo almacene en el refrigerador hasta el desarrollo de la siguiente etapa.

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II. Técnicas de sembrado en cajas1.-Técnica de siembra para aislamiento:

1.1.-ESTRÍA MÚLTIPLE:

Con un asa loop de siembra, previamente esterilizada en el mechero y enfriada a pocos centímetros de la flama (para no matar m.o. ni derretir la gelatina), se toma una muestra del cultivo de microorganismos del alimento contaminado o en estado de putrefacción y se extiende sobre un área pequeña de la superficie de la placa con el medio de cultivo (gelatina), en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no dañar el agar. Hacer la operación cerca del mechero sin dejar la tapa sobre la mesa como se muestra en la figura:

O bien dejarla sobre la mesa cerca del mechero con la boca hacia arriba.

Asi sería la primera etapa del sembrado

Se flamea el asa, se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías.

Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estría.

No olvidar esterilizar el asa al final.

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NOTA: Mediante esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado número de gérmenes.

1.2-TÉCNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES:

Se divide la placa en cuatro cuadrantes. Se esteriliza el asa loop en el mechero, se enfria cerca de el y se toma el inóculo del alimento con carga microbiana y se siembra consecutivamente en 1-2-3-4, pero sin volver a esterilizar el asa ni volver a tomar inoculo del alimento, solo sembrar el primer cuadrante, luego el segundo y asi sucesivamente. Esterilizar el asa al final.

En el cuarto cuadrante, al menos, obtendríamos colonias aisladas.

1.3.- SIEMBRA POR AGOTAMIENTO (O EN SUPERFICIE)

Se esteriliza el asa loop en el mechero, se enfría cerca de el y se toma el inóculo del alimento con carga microbiana y se realiza una estría continua por toda la placa.

2.-Técnica de siembra para aislamiento:

NOTA: Existen otras técnicas de sembrado en placa llamadas siembra por recuento que se desarrollaran posteriormente en conjunto con diluciones.

III. Técnicas de sembrado en tubo

3.1.- SIEMBRA EN SUPERFICIE INCLINADA

Se quita el tapón de rosca del tubo cerca del mechero, sosteniéndolo con el dedo meñique de la mano izquierda.

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Se esteriliza el asa loop en el mechero, se enfría cerca de él y se toma el inóculo del alimento con carga microbiana.

Se realiza una estría continua por toda la superficie del agar inclinado del tubo. No dirigir la boca del tubo hacia la persona.

Flamear la boca del tubo unos 2 segundos al igual que el tapón y cerrarlo.

Esterilizar el asa.

3.2.- SIEMBRA POR PICADURA O SEMBRADO EN PROFUNDIDAD

Se quita el tapón de rosca del tubo cerca del mechero, sosteniéndolo con el dedo meñique de la mano izquierda.

Se esteriliza el asa RECTA en el mechero, se enfría cerca de él y se toma el inóculo del alimento con carga microbiana.

Se introduce el asa por el centro del tubo hasta que el asa recta llegue casi al fondo del tubo y retirar el asa de tal manera que siga la misma trayectoria de entrada.

III.3. SEMBRADO EN SUPERFICIE Y PICADURAEs la combinación de los 2 procedimientos anteriores pero usando el asa recta tanto en el sembrado en picadura como el de superficie.

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CUESTIONARIO

1.- Qué es un cultivo puro de microorganismos?

2.- Qué es in inóculo?

3.- Físicamente en un medio de cultivo de microorganismos cuando se dice que no forma un cultivo puro?

4.- Qué tipo de técnicas empleaste para la siembra de microorganismos?

5.- ¿Cuándo se aplican las técnicas de sembrado en placas y cuando en tubo?

6.- ¿Cómo podemos controlar la contaminación microbiana?

ANOTA TUS CONCLUSIONES:

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PRÁCTICA # 4:

EMPACADO DEL MATERIAL Y ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

OBJETIVOS:

1. El alumno aprenderá el procedimiento para empacar diversos materiales de uso

en microbiología.

2. El alumno aprenderá el procedimiento de la esterilización por calor seco de estos.

INTRODUCCIÓN

EMPACADO DEL MATERIAL

Antes de iniciar un empaque del material que se desea esterilizar, es necesario que

todas las prácticas que se realicen estén en condiciones de esterilidad y se debe, en

primer lugar, limpiar el área de trabajo con alguna sustancia desinfectante y encender el

mechero. Se emplearán distintos agentes germicidas y desinfectantes (soluciones de

hipoclorito de sodio, cloroxilenol, formaldehído, etc.) para desinfectar superficies.

  El material a esterilizar se deberá de empacar correctamente con papel estraza Una

de las razones de la importancia del papel en nuestra vida cotidiana es la enorme

cantidad de usos que se le pueden dar a este producto. De la misma manera, el papel

puede adaptarse a las diferentes utilidades que se vayan a realizar llegando a

contabilizarse hasta 457 variedades diferentes de papel. Las variedades dependen de una

serie de características físicas que hacen que el papel se pueda adaptar a diferentes usos

como: Impedir el ingreso de microorganismos al interior, Sellar en forma completa para

evitar contaminación, Soportar la tracción y manipulación habitual sin sufrir deterioro y

hacer permeable al método de esterilización seleccionado. Todo esto se logra

Empacando en primer lugar en campo de algodón, y posteriormente en empaque mixto

o en polipropileno de acuerdo con el tamaño del material.

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ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

La muerte microbiana se produce por una esterilización, ya sea como

consecuencia de mecanismos de transferencia de energía, además de la oxidación. En la

esterilización por Calor seco existe una destrucción de los microorganismos oxidando

sus constituyentes químicos, desnaturalizando las proteínas y los ácidos nucleicos de las

células así como fragmentando las membranas celulares. Para materiales que deben

permanecer secos como ciertos instrumentos de vidrio de laboratorio tales como: cajas de

petri, pipetas, así como aceites, polvos ( por ser impermeables al vapor), los materiales

que no se pueden esterilizar por calor seco son: Material textil (algodón, sedas, lino, etc.),

Gomas y Materiales sintéticos.

Todo material que se altere a la temperatura de trabajo se dispone de hornos eléctricos

por los que circula aire caliente, en vista ¡de que el calor es menos eficaz en materiales

secos, se acostumbra a aplicar una temperatura de 160·C a 170·C durante una hora o

más. Para materiales de vidrio de laboratorio es suficiente una exposición de dos horas

de duración a 160·C ( 320 ·F) para que quede esterilizado. Otras formas útiles de calor

seco incluyen incineración para objetos que deben ser destruidos y flameados por pasaje

de agujas o pequeños instrumentos a través de la llama de un mechero bunsen.

MATERIAL: 1 Matraz Erlenmeyer 2 Tubos de ensaye Horno a 170·C 1 Pipeta de 10 ml 1 pipeta de 5 ml 4 Cajas de petri Papel estraza Algodón 1 Escobillón

SUSTANCIAS: Agua destilada Detergente

PROCEDIMIENTO

I) EMPACADO DEL MATERIAL

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l.- Lava el material de laboratorio, principalmente la cristalería con detergente , enjuaga

con abundante agua de la llave y enseguida con agua destilada.

2.- Secar el material utilizando papel absorbente para acelerar el secado

3.-Empaca el material correctamente

A) CAJAS DE PETRI

Corta el papel estraza, en forma de rectángulos adecuados para la cantidad de 2 a 3

cajas. Colócalas en la parte central y Envuélvelas según te indique tu profesor.:Se

toman los extremos de Papel y se unen , Se hace un nuevo doblez recargando

ligeramente en la caja para marcarlo, Los extremos se doblan en forma triangular .Ya

en forma triangular se doblan hacia atrás quedando listas para esterilizar.

B) PIPETAS

Introduce una pequeña porción de algodón en el cuello de la pipeta, procurando

que quede lo suficientemente apretada. Con tiras de papel de 3 cm de ancho

envuélvelas, comenzando por la punta y en forma de espiral gira hacia arriba hasta

el final de la pipeta.

C) TUBOS DE ENSAYE.

Se toma el tubo con la mano izquierda y con la derecha el tapón de algodón.

Coloca algodón en la boca del tubo a 1/5 parte de la longitud del mismo procurando

que quede bien apretado, deposítalos en recipientes adecuados, tápalos con papel

estraza y átalos.

D) MATRACES.

Tapa el cuello del matraz con algodón, lo suficientemente apretado para evitar que

se destape ( se tapa en la misma forma que el tubo). Como protección coloca un

gorrito de papel estraza y átalo con cinta.

II) ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

1.-Las normas de Procedimiento de la Institución establecerán las condiciones de trabajo

según la carga, volumen, peso, resistencia térmica del material. Es imprescindible

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respetar los parámetros obtenidos en la validación del procedimiento. La temperatura de

esterilización por Calor Seco deberá estar entre 160·C a 170 °C. y el tiempo de

aplicación será de una hora o más.

2.- El material a esterilizar se deberá cargar con el esterilizador frío, teniendo en cuenta

las siguientes recomendaciones: Cada unidad deberá quedar separada de las vecinas

Los materiales no deberán estar en contacto con las paredes, piso y techo del

esterilizador

La carga del esterilizador será homogénea y no deberá superar el 80% de la capacidad

total de la cámara

3.-Colocar el material dentro del Esterilizador. Encender el Esterilizador, Verificar que los

instrumentos de control de ciclo, tiempo ( l hora) y temperatura( 170·C) se encuentren en

la posición correcta. Esperar hasta que los instrumentos de medición alcancen la

temperatura seleccionada para el ciclo

4.- Cuando se alcance la temperatura seleccionada, se comenzará a descontar el tiempo

de esterilización. Cumplido el tiempo de exposición se apagará el Esterilizador

La descarga del Esterilizador se efectuará una vez que el material se haya enfriado.

5.-Durante el ciclo de Esterilización no deberá abrirse la puerta del Esterilizador

porque ello implicaría abortar el ciclo, debiendo en este caso recomenzarlo, además

de que el cambio de temperatura rompería la cristalería

CUESTIONARIO:

1.- Porqué antes de una esterilización es necesario lavar y desinfectar el material?

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2.- ¿Es necesario un secado del material en el horno antes del empacado con papel

estraza? ¿Porque?

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3.- Qué finalidad tiene el empacado antes de la esterilización?

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4.- Puede ser utilizado otro tipo de papel que el de estraza? ¿Por qué?

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5.- Qué finalidad tienen los tapones de algodón que se colocan en los extremos de las

pipetas y de los Matraces Erlen

Meyer___________________________________________________________________

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6.- Qué desventaja tiene el utilizar la esterilización por calor seco en este laboratorio?

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7.- Cómo actúa la esterilización por calor seco en los microorganismos?

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8.- A qué temperatura y cuánto tiempo tendrás que emplear para esterilizar por calor seco

el material de laboratorio para asegurar la destrucción de microorganismos patógenos y

esporas?

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OBSERVACIONES

Realiza los dibujos o imágenes correspondientes del procedimiento de empacado que

realizaste para cada tipo de material de laboratorio. Así mismo dibuja o coloca imágenes

del horno en donde realizaste la esterilización por calor seco.

CONCLUSIONES

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