Métodos de Análsisi Microbiológicos Normas ISO

MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. NORMAS ISO, UNE...

Sara Cano Ruera. Consultora Analiza Calidad. Miércoles 5 de abril 2006.

ÍNDICE:

1. INTRODUCCIÓN

2. CULTIVO DE BACTERIAS

a. Medios de cultivo

b. Toma del inóculo

c. Transferencia

d. Aislamiento

3. PRINCIPALES MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMEN-

TOS

a. Microorganismos aerobios mesófilos

b. Mohos y levaduras

c. Enterobacterias

d. Coliformes totales

e. Escherichia coli

f. Staphylococcus aureus

g. Salmonella

MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGI-

CO. NORMAS ISO, UNE...


ANALIZA CALIDAD – Departamento de Formación

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Ante la diversidad de métodos y procedimientos analíticos que dificulta la comparación y armonización de los resultados obtenidos se hace necesario establecer unas normas que permitan dicha comparación entre los resultados que se obtienen en los distintos labora-torios.

La implantación de las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) y el Aseguramiento de la Calidad obliga a normalizar todas las operaciones que se realizan en el laboratorio. Por ello se han redactado una serie de procedimientos e instrucciones de trabajo con el fin de dar uniformidad y consistencia a los análisis de alimentos que se realizan en los laborato-rios de microbiología y reducir los riesgos de error por parte de las personas que realizan el ensayo.

Dado que la finalidad de trabajar con BPL es la obtención de resultados analíticos de ca-lidad y conseguir la aceptación mutua de estos resultados entre los diferentes países, hay que seguirlas escrupulosamente. La elaboración de estos documentos viene dada por la necesidad de tener un sistema unificado de funcionamiento y gestión de los laboratorios, ya que hace falta asegurar la calidad e integridad de los resultados y datos obtenidos en los análisis, y establecer esquemas de funcionamiento equivalentes entre laboratorios.

Así, se ha realizado una homogenización de los métodos de análisis de alimentos, unifi-cando sus características en base a las normas internacionales correspondientes (ISO: Internacional Standard Organisation; EN: European Norme; NF: Norme Française; AF-NOR: Association Française de Normalisation). Junto con ellos se han redactado los pro-cedimientos de preparación de medios cultivo y reactivos necesarios para realizar los ensayos, de manera que hay una explicación de cada uno de los aspectos de los proce-dimientos de análisis.

Los métodos ISO (2 placas por dilución, confirmación de 5 colonias) suelen utilizarse co-mo métodos de referencia; y los métodos NF (1 placa por dilución, confirmación de 3 co-lonias) se suelen emplear como métodos de rutina, siendo los dos métodos normaliza-dos.

Con el objetivo de uniformizar todos los procedimientos del laboratorio, se han redactado unos Procedimientos Normalizados de Trabajo (PNT) que dan las instrucciones para la realización de todos estos documentos, tanto de métodos de análisis de alimentos como los de preparación y control de calidad de los medios de cultivo y reactivos necesarios para ellos. Los Procedimientos Normalizados de Trabajo (PNT) son un conjunto de ins-trucciones escritas de obligado y riguroso cumplimiento que describen cómo deben reali-zarse determinados métodos de ensayo, como deben manejarse los equipos de análisis o cómo se debe proceder ante cualquier otra actividad del laboratorio.

Las normas ISO, EN, NF, AENOR (Asociación Española de Normalización) se van elabo-rando y revisando de forma continua. Como este proceso suele ser bastante largo, es aconsejable consultar las siguiente páginas web:

• ISO: www.iso.ch

• EN: www.cenorm.be

• AFNOR: www.afnor.fr

1. INTRODUCCIÓN



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• AENOR: www.aenor.es

Los esquemas que se presentan son un reflejo de los medios de cultivo y de todas las reacciones bioquímicas que en ellos se producen, al reflejar las características del medio y de las colonias que crecen en él. Así, se puede saber rápidamente si el medio que se ha de utilizar se necesita en frascos, en tubos (con o sin campana) o en placas, conocer su color original y observar los cambios que sufre en el proceso.



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A) MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros compo-nentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos.

a) Constituyentes habituales de un medio de cultivo:

- AGAR utilizado como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. - EXTRACTOS son concentrados en polvo, deshidratado, de parte de órganos o

tejidos animales o vegetales para confeccionar el medio adecuado. - PEPTONAS se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales

o vegetales. Son muy ricas en péptidos y aminoácidos. - FLUIDOS CORPORALES (sangre o plasma) Se añaden a los medios de cultivo

porque contienen factores de crecimiento que facilitan el crecimiento de algunos mi-croorganismos exigentes.

- SISTEMAS AMORTIGUADORES (fosfatos bisódicos y bipotásicos) se utilizan para mantener el pH del medio en un determinado valor.

- INDICADORES DE pH son indicadores ácido-base con el objeto de detectar varia-ciones de pH.

- AGENTES REDUCTORES se añaden para crear condiciones que permitan el de-sarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaerófilos.

- AGENTES SELECTIVOS son sustancias que se adicionan para convertir al medio de cultivo en selectivo.

b) Tipos de medios de cultivo:

1. Medios generales permiten el desarrollo de una gran variedad de microorga-nismos.

2. Medios de enriquecimiento favorecen el crecimiento de un determinado tipo de microorganismo, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto.

3. Medios selectivos permiten el crecimiento de un tipo de microorganismo de-terminado, inhibiendo el desarrollo del resto.

4. Medios diferenciales ponen de relieve propiedades (normalmente bioquímicas) que un determinado microorganismos posee y de esa forma se puede distinguir ese microorganismo de otros que también pueden crecer en ese medio.

5. Medios de transporte y mantenimiento se utilizan en la recogida, transporte y conservación de muestras microbiológicas. Son medios no nutrientes (los mi-croorganismos se mantienen pero no se multiplican), semisólidos, que inhiben las reacciones enzimáticas autodestructivas dentro de las células y evitan los efectos laterales de la oxidación.

c) Preparación de medios de cultivo:

En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se encuentran comercializados, normalmente como productos liofilizados que es necesario hidratar. En general la prepa-ración de un medio de cultivo consiste en pesar la cantidad necesaria del polvo liofilizado, disolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo las instruccio-nes del fabricante y esterilizar la disolución, previa comprobación y corrección del pH si es necesario. Antes de ser esterilizados en autoclave, los medios líquidos se distribuyen en los reci-pientes adecuados (tubos o matraces) y se tapan; en ningún caso la altura del líquido en

2. CULTIVO DE BACTERIAS



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el recipiente debe exceder un tercio del volumen total de éste. Si se trata de un medio que contenga agar (sólido o semisólido) suele ser preciso calentarlo (al baño María o al microondas) para fundir el agar antes de esterilizarlo en el autoclave. Una vez fundido se reparte, en caliente, en matraces o tubos (nunca en placas de Petri), se tapa y se esterili-za. Finalizada la esterilización en el autoclave: - los medios líquidos se dejan enfriar a temperatura ambiente. - los medios sólidos contenidos en tubo deben inclinarse para que al solidifarse, adop-

ten la forma de agar inclinado (slant), si tal es su finalidad. - la preparación de los medios sólidos en placa de Petri se realiza rellenando las placas

con el medio estéril fundido y atemperado a unos 50ºC en ambiente estéril. El am-biente estéril se consigue en la proximidad de un mechero Bunsen o en una campana de siembra adecuada.

B) DILUCIONES DECIMALES

Primero se prepara el “MACERADO INICIAL”. El procedimiento más frecuentemente em-pleado para este fin consiste en la utilización de un homogenizador de paletas tipo "sto-macher" en el cual se homogenizan diluyente y muestra y, de esta forma se prepara una suspensión más o menos homogénea de alimento y microorganismos que permite la pre-paración posterior de las oportunas diluciones que posteriormente serán utilizadas en los diversos métodos de recuento. Para ello se pesan asépticamente 10 g del alimento. La pesada suele realizarse en bolsa de plástico para stomacher. Se añaden a la bolsa 90 mL de diluyente estéril y se homogeniza el alimento con el diluyente en Stomacher durante 2 minutos. Así conseguimos el macerado inicial que es la dilución 1:10. Si es posible es mejor pesar 25 g de alimento. Añadir 225 mL de diluyente estéril y proceder como en el caso anterior homogenizando en Stomacher durante 2 minutos. Para preparar las “DILUCIONES DECIMALES”, añadir 1 mL de macerado inicial (también llamado dilución madre o dilución 1:10) a un tubo con 9 mL de diluyente, homogenizar usando un agitador excéntrico de tubos de ensayo durante 20 segundos o agitando ma-nualmente. De esta forma hemos preparado la dilución 1:100 ó 10 —2. Repetir la opera-ción anterior transfiriendo 9 mL de la dilución 1:100 a un tubo con 9 mL de diluyente para preparar la dilución 1:1000 ó 10 —3. Repetir la operación anterior tantas veces como sea necesario hasta conseguir el número de diluciones deseado. El número de diluciones que se necesita depende de lo contaminado que este el alimento. De un alimento del que se sospecha un número alto de microorganismos/g hay que hacer más diluciones que de uno poco contaminado. Para los métodos de ausencia / presencia no es necesario preparar las diluciones deci-males, éstas se utilizan para los métodos de contaje.

C) MÉTODOS DE SIEMBRA • Siembra en masa Se caracteriza porque durante la incubación las colonias crecen en el interior de la masa del agar.

1. Se deposita 1 mL de la muestra (si es líquida) o de cada dilución en placas estéri-les, vacías.

2. Se agrega a cada placa 15 a 20 mL del medio de cultivo a emplear, previamente fundido y mantenido a unos 47ºC.



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3. Se agita moviendo la placa tapada sobre la superficie de la mesa con movimien-tos circulares y de vaivén (siempre sin levantar la placa de la mesa). Con esto se consigue mezclar el inóculo con el agar.

4. Se deja solidificar el agar a temperatura ambiente (esperar al menos media hora) y se llevan las placas a incubar (la temperatura y el tiempo de incubación elegidos varía según el tipo de microorganismos).

5. Pasado el tiempo de incubación las colonias habrán crecido dentro del agar (en la masa del agar). Elegir de entre todas las placas las dos correspondientes a aque-lla dilución que presenten un número de entre 30 y 300 colonias /placa (esto pro-

porciona una precisión estadística suficiente y no es engorroso de hacer). Para realizar el contaje, se utiliza un cuenta-colonias; se pone la placa de Petri

con la base hacia arriba y, si es preciso, se divide en sectores marcando mediante un lápiz graso a lo largo de los diámetros. El número de unidades formadoras de

colonia o UFC/g (o mL en muestras líquidas) de la muestra original será:

Número de UFC/g = Número de colonias x factor de dilución 6.

• Siembra en superficie Se caracteriza porque durante la incubación las colonias crecen en la superficie del agar.

1. Se utilizan placas previamente preparadas que contienen el medio de cultivo soli-dificado (unos 15 mL/placa).

2. Se deposita en la superficie del agar 0,1 mL de la muestra o de cada dilución. 3. Luego de realizada la descarga de la muestra, se procede a extenderla sobre toda

la superficie de las placas, usando un asa de Drigalski estéril. 4. Esperar 2 ó 3 minutos a que se seque el inóculo. 5. Se llevan las placas a incubar y se procede de la misma manera que en el caso

anterior.

D) TOMA DEL INÓCULO Una vez que las colonias han crecido, puede ser necesario su confirmación. Si la muestra proviene de un medio líquido, el inóculo se toma agitando el suavemente el asa dentro del mismo, quedando la muestra adherida por tensión superficial en el extre-mo del filamento del asa de siembra. Si el medio es sólido y se encuentra en superficie la muestra a sembrar (placa Petri), to-me una pequeña porción de cultivo mediante un ligero roce con el asa de siembra. Si la muestra se encuentra en la profundidad del agar (tubo con agar en pico de flauta), hunda el filamento dentro del medio hasta tomar una pequeña porción de la misma. Fla-mee la boca del tubo antes de taparlo y colóquelo en el soporte necesario.



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E) TRANSFERENCIA

La técnica que se aplica depende de la consistencia de los medios de cultivo y del tipo de recipiente que los contiene. Se pueden presentar los siguientes casos:

- Siembra de medio líquido a medio líquido: El procedimiento se puede reali-zar con asa en anillo, aguja o pipeta y en tubos de ensayo, matraces o frascos.

- Siembra de medio sólido a medio líquido: El procedimiento se puede reali-zar con asa en anillo o aguja y en tubo de ensayo, matraces o frascos.

- Siembra de medio sólido a medio sólido: El procedimiento se puede reali-zar con asa o aguja y en tubo de ensayo, ya sea en superficie o en profundi-dad o en placa Petri, en superficie.

- Siembra de medio líquido a medio sólido: El procedimiento se puede reali-zar con asa en anillo, aguja o pipeta y en tubo de ensayo, ya sea en superficie o en profundidad o en placa Petri, ya sea en superficie o por homogeinización.

1. Técnica de transferencia en tubos de ensayo.

Técnica para medio líquido

Los dos tubos, el que contiene el medio de cultivo sin sembrar y el que contiene los mi-croorganismos a transferir, se toman con una mano, con las bocas colocadas a la misma altura. Se sostienen con los dedos índice, medio y anular apoyándolos en el dedo meñique, y se los sujeta con el dedo pulgar muy cerca de la base para permitir la visualización de toda la superficie del cultivo. Con los dedos pulgar e índice (como un lápiz) de la otra mano, se toma la pipeta estéril o el mango de Koll con su aguja o asa en anillo y se esteriliza. Se destapan los tubos con los dedos libres de la mano que sujeta el asa, de la siguiente manera: el tapón del tubo más alejado del operador (que es el que contiene la muestra) entre el dedo meñique y la palma de la mano; el tapón del tubo más cercano al operador (que contiene el medio de cultivo estéril) entre el meñique y el anular. Se flamean las bocas de los tubos, se toma el inóculo; se siembra; se flamean nueva-mente las bocas de los mismos y se tapan respetando las procedencias de los tapones y se quema el asa. Como el inóculo procede de un medio líquido, antes de realizar la transferencia se debe agitar el tubo para poner en suspensión a los microorganismos que pudieran estar depo-sitados. Si la siembra se realiza en medio líquido, se agita el tubo sembrado para distri-buir homogéneamente el inóculo. Para realizar la agitación se toma el tubo cerca del extremo superior con los dedos índice y pulgar y se golpea suavemente la base del mismo sobre el dedo índice de la otra mano con una amplitud de 5 cm. Otra forma consiste en hacer rotar los tubos entre las palmas de las manos.



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Técnicas para medio sólido.

Cuando el medio de cultivo a sembrar es sólido, se puede sembrar en superficie, en pro-fundidad o en profundidad y superficie. 1) En superficie:

a) Por estría: Introducir el asa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado hasta el fondo diluyendo el inóculo en el agua de condensación que se acumula en esa parte, luego mover el asa suavemente sobre la superficie del agar con un movi-miento en zig-zag ascendiendo desde el fondo hasta la parte superior del medio.

b) Por trazo: Introducir el asa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado y trazar una línea de siembra desde la base del pico de flauta hasta el extremo superior, sin ejercer presión para que no se rompa el medio.

2) En profundidad:

a) Por punción: El medio de cultivo que se emplea está solidificado en tubo en for-ma vertical y la siembra se realiza con aguja, la que se introduce con el inóculo rápidamente en el seno del medio y se retira de la misma forma. La punción se realiza en el centro del medio o excéntricamente.

3) En profundidad y superficie:

Por punción y estría: Se utilizan para la siembra tubos con agar inclinado pero con mucho fondo. Se introduce la aguja en el tubo de agar inclinado, se punza el fondo, se retira y se realiza un trazo o estría en el pico de flauta.

Técnica de transferencia en placa Petri.

La siembra en placa Petri, puede hacerse: 1) En superficie:

a. Por estría central: Se levanta la tapa lo suficiente como para permitir la introduc-ción del asa con la carga de microorganismos, iniciándose la estría en el borde del medio más alejado del operador y se la extiende hasta llegar al centro de la placa, luego se gira ésta 180 º y se continúa realizando otra estría de la misma manera. Esta división evita el obstáculo del borde de la placa

b. Por estría en cuadrantes: Se divide la placa en cuatro sectores y se siembra en estría cada uno de ellos, partiendo del borde de la placa hacia el centro. El cua-drante a sembrar debe ser el más alejado del operador y el inóculo en cada caso



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puede ser el mismo (la misma especie) o distinto (diferente especie) para cada cuadrante.

c. Por diseminación con espátula de Drigalsky: Se deposita sobre el medio sólido

contenido en la placa, una asada o una gota con pipeta del material a sembrar, que luego se extenderá por toda la superficie del medio con una espátula de DRI-GALSKY.

*La espátula se introduce inmediatamente después de su uso en un recipiente para su esterilización en autoclave o en formaldehído al 5 %.

d. Por diseminación con hisopo: Se sumerge en el caldo de cultivo, se escurre el

exceso de líquido sobre la pared interior del tubo y se estrían ambas mitades de la placa de Petri, partiendo de los bordes hacia el centro, luego se gira 90º y se es-trían nuevamente ambas mitades, finalmente se gira 45º y se estrían ambas mita-des.

2) Por homogeneización:

a. Técnica de la siembra en tubo para volcar en placa: El inóculo se introduce con el asa o pipeta en un tubo con el medio de cultivo fundido y enfriado a 45 ºC en cantidad suficiente para cubrir la placa de Petri. Se homogeneiza por rotación y se vuelca en la placa previo flameado de la boca del tubo.

b. Técnica del agar volcado: Se deposita el inóculo con pipeta en el centro de la

placa Petri y luego se vuelca sobre el mismo el medio de cultivo fundido y enfriado a 45ºC. Se homogeneiza por rotación para lo cual se le imprime a la placa movi-mientos circulares, en sentido horario y en sentido antihorario y movimientos recti-líneos, horizontales y verticales.

Se debe tener en cuenta que de las placas Petri preparadas con medio de cultivo para sembrar, debe eliminarse el agua de sinéresis (condensación) antes de efectuar dicha operación. Para tal fin es aconsejable preparar las placas con 24 hs. De anticipación y dejarlas invertidas a temperatura ambiente.



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F) AISLAMIENTO El objeto es obtener cultivos en estado puro, operación imprescin-dible y previa al estudio e identificación de una especie bacte-riana. Se pueden realizar aislamientos por métodos generales y por métodos especiales. 1) Métodos generales de aislamiento. Estos métodos utilizan medios de cultivos sólidos en placa Petri:

a. Por diluciones sucesivas: En general, para preparar diluciones seriadas, se parte de una solución concentrada y se preparan series de diluciones al décimo (1:10) o al medio (1:2). De esta manera se obtiene una serie de soluciones relacionadas por ejemplo por un fac-tor de dilución 10 es decir 1/10; 1/100; 1/1000 y así sucesi-vamente. O la otra serie es 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32 etc. Por ejemplo: si partimos de una solución de 50mg/ml de una sustancia (Solución A):

- Dilución 1/10: 1ml de la solución A + 9 ml de agua= una solución de 5 mg/ml (dilución 1:10).

- Dilución 1/2: 5 ml de la solución A + 5 ml de agua= una solución de 25 mg /ml (dilución 1:2).

Se homogeneiza la muestra y se carga el asa por única vez. Luego se pasa el asa de un tubo a otro. Estos tubos contienen agar a 45 ºC. De esta manera el primer tubo contendrá mayor concentración de microorganismos que el último. Luego se pasa el contenido de los tubos a las placas Petri y de allí a los tubos con agar en pico de flauta (slant o tubo inclinado).

b. Por agotamiento en superficie en una placa: Es el método más utilizado. Se prepara una placa Petri con el medio de cultivo a la que se le elimina el exceso de humedad según se indicó anteriormente. Primero, se marca la parte exterior de la contratapa de acuerdo al esquema. Se carga el asa con la muestra, se depo-sita en un punto de la superficie del sector (I) cercano al borde, y se extiende en el mismo con estrías próximas y para-lelas. A continuación se quema el asa y se deja enfriar. Se gira la placa 90 º, se pasa el asa una vez sobre la última estría de la región ya inoculada y se arrastra al sector (II)



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efectuando sobre él la siembra sin superponer las estrías con las realizadas antes.

Se quema nuevamente el asa y de la misma manera se estría el sector (III). Luego de quemar el asa, en el sector (IV) se realizan estrías con el material que se arrastra de (III), más amplias y que terminan en el centro de la placa. Cualquiera sea el método empleado, si se realiza correctamen-te, podrán obtenerse colonias aislada. Estas pueden pertene-cer a distintas especies bacterianas, las que generalmente se diferencian macroscópicamente. En general cada colonia se considera formada a partir de una célula bacteriana, aunque esto no es del todo cierto pues puede darse el caso de que dos o más células den origen a una colonia. Si todas pertenecen a una misma especie, la colonia resultante será pura. Caso contrario, la finalidad del traba-jo no se habrá cumplido, no lográndose el aislamiento. Para comprobar la pureza de la colonia aislada se puede rea-lizar una coloración de Gram. Para ello se pica la colonia y se la identifica con una marca en el fondo de la placa con un número identificatorio. Se hace el extendido con una por-ción de la colonia y si todas las células observadas coinci-den morfológicamente, se repica el resto de la colonia en un tubo con agar en estría para obtener un cultivo puro. A veces la igualdad morfológica en la coloración de Gram re-sulta engañosa por existir bacterias de diferentes especies (pero iguales morfológicamente) presentes dentro de la colo-nia seleccionada pero en muy bajo número debido a su imposi-bilidad de desarrollar. Por consiguiente es necesario reali-zar siempre aislamiento para observar la uniformidad de las colonias.



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2) Métodos especiales de aislamiento. Métodos derivados de las propiedades de las bacterias: Consisten en hacer desarrollar la mezcla bacteriana, en un medio de cultivo especial, donde una especie puede dar lugar a colonias de un color que la identifiquen (ya sea por cambios de pH o por precipitación de elementos del medio). Un ejemplo, es el aisla-miento en el llamado agar- lactosa- verde-brillante- bilis, donde las bacterias coliformes dan colonias color rojo intenso en el centro con un halo rosado que destacan del fondo azul del medio.

a. Métodos biofísicos: Se basan en el empleo de condiciones fí-sicas determinadas que afectan a ciertos microorganismos y no a otros.

Empleo de temperaturas disgenésicas: La mayoría de las bacterias desarrollan bien a 37ªC. Sin embargo hay es-pecies que lo hacen hasta 40ºC -42ºC y aún más, otras por debajo de 35 ªC. Estas características se pueden usar para la separación de especies. Termorresistencia de las bacterias esporuladas: Los esporos de las bacterias son formas de resistencia que toleran temperaturas que resultan letales para las formas vegetativas. Este comportamiento se aprovecha para la separación de las especies que tienen la capa-cidad de esporular. Movilidad del microorganismo: Las bacterias móviles desarrollan en gran parte de la superficie del medio, mientras que las inmóviles lo hacen solo en el punto de siembra.

b. Métodos biológicos: Estos métodos utilizan la propiedad que

tienen ciertos animales de laboratorio de ser receptivos a algunos microorganismos.



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A. MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS El análisis de los alimentos y piensos para determinar la existencia, tipo y número de mi-croorganismos es básico para la microbiología de alimentos. Sin embargo ninguno de los métodos utilizados habitualmente permite determinar el número exacto de microorganis-mos que existe en un determinado alimento. Son cuatro los métodos básicos utilizados para investigar el número “total” de microorga-nismos: 1.- Recuento en placa (SPC) para la determinación del número de células viables 2.- Método del número más probable (NMP) de gérmenes como cálculo estadístico del número de células viables 3.- Técnicas de reducción de colorantes para el cálculo del número de células viables con capacidad reductora 4.- Recuento microscópico directo (DMC) tanto para células viables como para las no viables El recuento en placa es el método más utilizado para la determinación del número de células viables o unidades formadoras de colonias (u.f.c.) en un alimento. Los recuentos totales deben hacerse en función de uno de los siguientes factores: - método de muestreo utilizado - distribución de los microorganismos en la muestra - naturaleza de la microflora del alimento - naturaleza del alimento - antecedentes del alimento - adecuación nutricional del medio de cultivo - temperatura y medio de incubación - pH, aw, potencial de oxidación reducción del medio - tipo de diluyente utilizado - número relativo de microorganismos en la muestra Los recuentos de microorganismos viables se basan en el número de colonias que se desarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de alimento e incubadas en unas condiciones ambientales determinadas. Estos recuentos no pueden considerarse como recuentos totales ya que solo son susceptibles del contaje aquellos microorganismos capaces de crecer en las condiciones establecidas. Se puede conseguir una amplia gama de condiciones variando la temperatura, la atmósfera, la composición del medio y el tiempo de incubación. El intervalo de temperaturas en el que crecen los microorganismos es muy amplio: de – 34º C a > 90º C. En función de esto se encuadra a los microorganismos en tres grupos:

a) los que crecen bien a 7º C o por debajo de esta temperatura cuya tem-peratura: psicrótofos

3. PRINCIPALES MÉTODOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS



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b) los que crecen entre 20 – 30º C, con una temperatura óptima de creci-miento está entre 30 – 40º C: mesófilos

c) los que crecen por encima de los 45º C: termófilos Recuento de aerobios mesófilos En este grupo se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarro-llarse a 30º C en las condiciones establecidas. En este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos. Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación, las condi-ciones higiénicas de la materia prima. Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la ausencia de patóge-nos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presencia de flora patógena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentación, no son reco-mendables recuentos elevados. Un recuento elevado puede significar: - Excesiva contaminación de la materia prima - Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración - La posibilidad de que existan patógenos, pues estos son mesófilos - La inmediata alteración del producto

El recuento de mesófilos nos indica las condiciones de salubridad de algunos alimen-

tos. Métodos normalizados ISO 4833 Directiva general para el recuento de microorganismos. Método por re-cuento de colonias a 30º C Este método se basa en la siembra en profundidad en un medio de cultivo definido, verti-do en dos placas de Petri, con una cantidad determinada de muestra si el producto a examinar es líquido, o con una cantidad determinada de suspensión madre en el caso de otros productos. En las mismas condiciones, siembra de las diluciones decimales obtenidas de la muestra o de la suspensión madre. Incubación a 30º C, en aerobiosis durante 72 horas. A partir del número de colonias obtenidas en las placas de Petri, calcular el número de microor-ganismos por mililitro o por gramo de muestra. AF V 08-01 Método de rutina para el recuento de microorganismos. Método de recuen-to de las colonias a 30º C Este método se basa en la siembra en profundidad en un medio de cultivo definido, verti-do en una placa de Petri, con una cantidad determinada de muestra si el producto a exa-minar es líquido, o con una cantidad determinada de suspensión madre en el caso de otros productos. En las mismas condiciones, siembra de las diluciones decimales obteni-das de la muestra o de la suspensión madre. El recuento podrá ser realizado utilizando un sembrador espiral (NF V08-100) Incubación a 30º C, en aerobiosis durante 72 horas. A partir del número de colonias obtenidas en las placas de Petri escogidas, calcular el número de microorganismos por mililitro o por gramo de muestra.



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ESQUEMA:

AEROBIOS MESÓFILOS

ISO4833 AF V 08-051

10 g muestra +90 ml agua peptona

Diluciones decimales

10-2 10-3 10-4

��

��

��

��

Agar PCAIncubación30ºC / 72 h

Recuento de colonias

10-1

1ml

1ml 1ml 1ml

AEROBIOS MESÓFILOS

ISO4833 AF V 08-051



10-2 10-3 10-4

��

��

��

��

Agar PCAIncubación30ºC / 72 h

Recuento de colonias

10-1

1ml

1ml 1ml 1ml



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B. MOHOS Y LEVADURAS

Los hongos son organismos eucarióticos, cuya pared celular contiene quitina y β-glucanos. Son unicelulares o filamentosos, de reproducción sexual o asexual, saprófitos mutualistas o parásitos. En función de la temperatura de crecimiento se dividen en:

- termófilos: 20 – 50º C (40 – 50º C) - termolatentes: máximo 50º C, mínimo por debajo de 20º C - mesófilos: 10 – 40º C (20 – 35º C) - psicrófilos: por debajo de 10º C (por debajo de 20º C)

Los hongos engloban los mohos y las levaduras. Los mohos son multicelulares filamento-sos cuyo crecimiento en un alimento se reconoce por su aspecto aterciopelado. Las leva-duras crecen en agregados de células independientes, cuando crecen en los alimentos forman colonias características.

- Mohos habitualmente transmitidos por los alimentos:

División: Zygomyceta Clase: Zygomycetes Orden: Mucorales Familia: Mucoraceae Género: Mucor, Rhizopus, Thamnidium División: Ascomyceta Clase: Pleitomycetes Orden: Eurotiales Familia: Trichocomaceae Género: Byssochlamys, Eupnicillium, Emericella, Eurotium División: Deuteromyceta Clase: Coelomycetes Familia: Coelomycetaceae Género: Colletotrichum Clase:Hypomycetes Orden: Hypomycetales Familia: Moniliaceae Género: Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Fusarium, Penicillium,.....

- Levaduras habitualmente transmitidos por los alimentos:

División: Ascomycotina Familia: Saccharomycetaceae SubFamilia: Nadsonioideae Género: Hanseniaspora SubFamilia: Saccharomycotoideae Género: Debaryomyces, Issatchenkia, Kluyveromyces, Saccharomyces, ................



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SubFamilia: Schizosaccharomycotoideae Género: Schizosaccharomyces División: Deuteromycotina Familia: Crypteococcaceae Género: Brettanomyces, Candida, Crytococcus...............

El significado de la contaminación fúngica de los alimentos viene determinado por su ca-pacidad para deteriorar los alimentos, produciendo defectos en el aspecto modificaciones químicas, alterando el valor nutricional, variando sus características organolépticas y difi-cultando su conservación. Algunos mohos pueden producir infecciones en el hombre e incluso reacciones alérgicas. Además, muchos mohos producen gran número de toxinas a las que el hombre es susceptible. Las micotoxinas son un grupo de metabolitos tóxicos, producidos por ciertas cepas de mohos cuando crecen en unas condiciones determinadas, en una amplia variedad de alimentos. El estudio de los mohos productores de micotoxinas ha sido bastante completo debido a: - la ubicuidad de sus esporas - que pueden estar presentes en alimentos organolepticamente aceptables - que los alimentos constituyen un sustrato orgánico adecuado para su crecimiento.

Estos mohos producen micotoxinas que al ser ingeridas por los animales originan me-tabolitos tóxicos secundarios, que pasan a la leche, carne o huevos y son absorbidos indirectamente por el hombre

- al riesgo cancerígeno, sobre todo de las aflatoxinas Toxicológicamente nos interesan más las micotoxinas y los factores que puedan afectar la capacidad de su producción, que los mohos productores. En la mayoría de los casos las intoxicaciones son producto de la acción combinada de varias micotoxinas. Rara vez un alimento es contaminado por una sola especie y cada especie suele producir varias micotoxinas. Los alimentos que más fácilmente son contaminados por micotoxinas y las micotoxinas más frecuentes son:

1.- Semillas oleaginosas y alimentos derivados 2.- Aceites vegetales no refinados 3.- Cereales y alimentos derivados 4.- Frutos secos 5.- Zumos de frutas 6.- Legumbres 7.- Bebidas alcohólicas 8.- Leche y productos lácteos 9.- Carne y productos cárnicos

Para la prevención y control sanitario de las intoxicaciones por micotoxians es necesario: - conocer los factores que afectan al crecimientos de los mohos y a la producción de

las micotoxinas - conocer el periodo entre la germinación y la producción de micotoxinas, para estimar

el potencial tóxico del alimento - evitar la contaminación - evitar, durante la manipulación, las posibles lesiones de los granos y las frutas



17

- mantener unas condiciones de almacenamiento que eviten en lo posible el crecimien-to de los mohos

El recuento de mohos y levaduras es un índice de las condiciones higiénicas de una ma-teria prima y de las condiciones de manipulación. Su significado es similar al de los aero-bios mesófilos. Métodos normalizados

ISO 7954 Directiva general para el recuento de levaduras y mohos. Técnica de enu-meración de las colonias a 25º C Este método se basa en la siembra en profundidad en un medio de cultivo selectivo de-terminado, en dos placas de Petri, con una cantidad determinada de muestra si el produc-to a examinar es líquido, o con una cantidad determinada de suspensión madre en el caso de otros productos. En las mismas condiciones, siembra de las diluciones decimales obtenidas de la muestra o de la suspensión madre. Incubación de las placas en aerobio-sis a 25º C, durante 3, 4 ó 5 días. Cálculo del número de levaduras y mohos por mililitro o por gramo de muestra a partir del número de colonias obtenidas en las placas escogidas a los niveles de dilución que dan un resultado significativo. NF V 08-059 Método de rutina para el recuento de levaduras y mohos. Técnica de enu-meración de las colonias a 25º C Este método se basa en la siembra en superficie en un medio de cultivo definido, reparti-do en placas de Petri, con una cantidad definida de muestra por ensayo si el producto a examinar es líquido, o con una cantidad determinada de suspensión madre en el caso de otros productos. El recuento puede ser igualmente realizado en profundidad. Incubación de las placas en aerobiosis a 25º C, durante 3, 4 ó 5 días. En el caso de recuento de es-pecies de mohos supuestos conocidos la temperatura de incubación puede ser diferente de 25º C, buscando después el acuerdo entre las dos partes (20º C ó 22º C) e indicándo-lo en el informe del ensayo. A partir del número de colonias obtenidas en las placas de Petri retenidas, calcular el número de levaduras y mohos por mililitro o por gramo de muestra.



18

ESQUEMA:

MOHOS Y LEVADURAS

ISO7954 AF V 08-059



10-2 10-3 10-4

��

��

��

��

Agar SaboureaudIncubación

25ºC / 5 días

Recuento de mohos y levaduras

10-1

1ml

1ml 1ml 1ml

MOHOS Y LEVADURAS

ISO7954 AF V 08-059



10-2 10-3 10-4

��

��

��

��

Agar SaboureaudIncubación

25ºC / 5 días

Recuento de mohos y levaduras

10-1

1ml

1ml 1ml 1ml



19

C. ENTEROBACTERIAS

Cada vez es más frecuente recurrir a la determinación de microorganismos indicadores para determinar la inocuidad de un alimento. Estos indicadores deben cumplir una serie de requisitos: - fácil y rápido de detectar - fácilmente diferenciable de otros representantes de la flora de un alimento - tener antecedentes de asociación con el patógeno del que es indicador - ser un microorganismos con cifras, que en teoría coincidan con las del patógeno a

indicar - tener condiciones y velocidad de crecimiento semejantes a las del patógeno - tener una tasa de muerte paralela a del patógeno y que persista algún tiempo más

que este - no existir en alimentos exentos del patógeno, salvo en cantidades mínimas Actualmente se reconocen 29 géneros de enterobacterias, que incluyen más de 100 es-pecies diferentes. El 99% de los aislamientos clínicos pertenecen únicamente a 23 espe-cies. Atendiendo a su poder patógeno se dividen en dos grupos:

- Enterobacterias patógenas: EScherichia coli enteropatógeno, Shigella, Salmone-lla, Yersinia

- Enterobacterias oportunistas: E. coli, Citrobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Hafnia, Edwardsiella, Providencia, Morganella

El recuento total de enterobacterias se utiliza como indicador de contaminación fecal, y como uno de los indicadores de Buenas Prácticas de Fabricación. Se utiliza como indica-dor de la calidad microbiológica de alimentos procesados, y recuentos elevados señalan una elaboración inadecuada o una contaminación posterior, o ambas cosas a la vez; siempre implica un riesgo higiénico-sanitario. Métodos normalizados ISO 7402 Directiva general para el recuento, sin revivificación, de las Enterobacteria-ceae. Técnica del NMP y método por recuento de colonias Esta directiva expone dos métodos para el recuento de enterobacterias. El primero de ellos se recomienda utilizar en muestras que se sospecha que presentan contaminación baja (1 – 100 por mililitro o gramo de muestra). Para ello se siembran en tres tubos de medio de doble concentración, una cantidad determinada de la muestra problema si la muestra es líquida o una cantidad determinada de la suspensión madre en el caso de los otros productos. Después y en las mismas condiciones, se siembran tres tubos con me-dio de concentración simple con la primera dilución decimal obtenida a partir de la mues-tra problema o de la suspensión madre. Los tubos se incuban a 35º C ó 37º C (según acuerdo) durante 24 horas. A partir del número de tubos positivos confirmados se calcula el número más probable de Enterobacteriaceae por mililitro o por gramo de muestra de ensayo mediante la tabla NMP. El segundo método se basa en la siembra en profundidad con el medio agar biliado cristal violeta glucosa, en placas de Petri, con una cantidad determinada de la muestra a exami-



20

nar, si el producto es líquido o una cantidad determinada de la suspensión madre en el caso de los otros productos. En las mismas condiciones siembra de diluciones decimales obtenidas a partir de la muestra problema o de la suspensión madre. Incubación de las placas a 35º C ó 37º C durante 24 horas +/- 2 horas. Cálculo del número de Enterobac-teiaceae por mililitro o por gramo de muestra, a partir del número de colonias característi-cas confirmadas obtenidas en las placas de Petri NF V 08-054 Método de rutina para la enumeración de Enterobacteriaceae mediante el recuento de colonias Este método se basa en la siembra en profundidad con el medio agar biliado cristal viole-ta glucosa, en una placa de Petri, con una cantidad determinada de la muestra a exami-nar, si el producto es líquido o una cantidad determinada de la suspensión madre en el caso de los otros productos. Se recubre la placa con una segunda capa del mismo medio. En las mismas condiciones siembra de diluciones decimales obtenidas a partir de la muestra problema o de la suspensión madre. Incubación de las placas a 30º C durante 24 horas +/- 2 horas. Cálculo del número de Enterobacteiaceae por mililitro o por gramo de muestra, a partir del número de colonias características confirmadas obtenidas en las placas de Petri.



21

ESQUEMA:

enterobacterias

ISO7402 AF V 08-054



10-2 10-3 10-4

��

��

��

��

Agar VRBG + 2ª capaIncubación

30ºC / 24 horas

10-1

1ml

1ml 1ml 1ml

Recuento. Colonias Rosas

enterobacterias

ISO7402 AF V 08-054



10-2 10-3 10-4

��

��

��

��

Agar VRBG + 2ª capaIncubación

30ºC / 24 horas

10-1

1ml

1ml 1ml 1ml

Recuento. Colonias Rosas



22

D. COLIFORMES TOTALES En conjunto los coliformes están representados por cuatro géneros de la familia Entero-bacteriaceae: Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, y Klebsiella. Todos ellos son fer-mentadores de la lactosa en 48 horas. Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, y también en el suelo, las plantas, etc. No son muy buenos como indicadores, pero se utilizan como indicadores de contaminación fecal y son buenos indicadores de un proceso o de un estado sanitario poco satisfactorio. En un recuento de coliformes es conveniente determinar la incidencia de E. coli dado que es la especie más indicativa de una contaminación fecal. Hay que destacar que el recuento de coliformes tiene sus limitaciones como indicador en ciertos alimentos: - Productos lácteos: reflejan el estado higiénico del establo y de la planta industrial, no

es indicador de contaminación fecal - Hortalizas congeladas blanqueadas: la presencia de E. coli puede ser indicativo de

que en el proceso existe algún problema. Los coliformes están habitualmente asocia-dos con la vegetación

- Derivados de aves de corral: los coliformes no son indicadores higiénicos apropiados, las aves pueden tener salmonella antes del sacrificio

A pesar de todo lo anterior, los coliformes tienen un valor acreditado como indicadorres de inocuidad. Su principal aplicación como integrantes de un programa para la determi-nación de la inocuidad de los alimentos la tienen dentro del sistema APPCC.

Pueden crecer en presencia de sales biliares, que inhiben el crecimiento de las bacterias Gram negativas. Son capaces de fermentar la lactosa con producción de gas, siendo esta característica suficiente para hacer determinaciones presuntivas. Su facilidad de cultivo y de diferenciación los hace casi ideales como indicadores. Métodos normalizados I SO 4831 Directiva general para el recuento de coliformes Esta directiva se basa en la siembra de tres tubos de medio de enriquecimiento selectivo de doble concentración con una cantidad determinada de la muestra si es líquida, o una cantidad determinada de la suspensión madre en el caso de otros productos. A continua-ción, se siembran tres tubos de medio de enriquecimiento selectivo de concentración simple con una cantidad determinada de la muestra si es líquida, o una cantidad determi-nada de la suspensión madre en el caso de otros productos. Después y en las mismas condiciones, se siembran tres tubos con medio de enriquecimiento selectivo de concen-tración simple con una cantidad determinada de la primera dilución decimal obtenida a partir de la muestra problema o de la suspensión madre. Los tubos se incuban a 30, 35 ó 37º C durante 24 horas para los de doble concentración, y 24 – 48 horas los de concen-tración simple. A partir de cada tubo incubado que presenta desprendimiento de gas en la campana se inocula con asa un tubo con medio de confirmación (BGBL). La reacción es positiva cuando se produce desprendimiento de gas recogido en la campana de Duirham,



23

como consecuencia de la fermentación de la lactosa en presencia de sales biliares. Se realizan las lecturas a las 24 – 48 horas. A partir del número de tubos positivos confirmados se calcula el número más probable de coliformes por mililitro o por gramo de muestra de ensayo. NF V 08-050 Método de rutina para la enumeración de coliformes mediante el recuento de colonias a 30º C. Se basa en la siembra en profundidad con el medio agar biliado cristal violeta lactosa, en una placa de Petri, con una cantidad determinada de la muestra si es líquida, o una can-tidad determinada de la suspensión madre en el caso de otros productos. Se recubre la placa con una segunda capa del mismo medio. En las mismas condiciones, siembra de diluciones decimales obtenidas a partir de la muestra o de la suspensión madre. Incuba-ción de las placas a 30º C 24 horas. Cálculo del número de coliformes por mililitro o por gramo de muestra, a partir del número de colonias características obtenidas en las placas de Petri.



24

ESQUEMA:

Coliformes totales ISO4831


Caldo lactosado (con campana Durham)

37ºC / 48 horas

Gas = +

10 ml

10 ml

1 ml

10-1

10-2

Confirmación



Caldo lactosado (con campana Durham)

37ºC / 48 horas

Gas = +

10 ml

10 ml

1 ml

10-1

10-2

Confirmación



25


Confirmación

Tubos positivos

Tubos con Caldo Verde brillante con campana Durham

Asa de siembra

45ºC / 24 horas

Gas = +


Confirmación

Tubos positivos

Tubos con Caldo Verde brillante con campana Durham

Asa de siembra

45ºC / 24 horas

Gas = +

COLIFORMES TOTALES



10-2 10-3 10-4

��

��

��

��

Agar VRBAIncubación

30ºC / 24 horas

10-1

1ml

1ml 1ml 1ml

NF V 08-050COLIFORMES TOTALES



10-2 10-3 10-4

��

��

��

��

Agar VRBAIncubación

30ºC / 24 horas

10-1

1ml

1ml 1ml 1ml

NF V 08-050



26

E. ESCHERICHIA COLI Escherichia coli es un coliforme fecal. Los coliformes fecales son un grupo de microorga-nismos seleccionados por incubación de los inóculos procedentes de un caldo de enri-quecimiento de coliformes a temperaturas superiores a las normales (44 +/-0,5º C) y son muy indicativos de una posible contaminación de origen fecal del alimento. Se definen por la producción de ácido y de gas en caldo EC a 44 – 46º C (44,5 – 45,5º C). Las cepas enterohemorrágicas de E. coli no crecen a 44,5º C en la formulación convencional de EC, pero lo hacen cuando el porcentaje de sales biliares se reduce del 0,15 al 0,112%. Sólo unas pocas cepas son patógenos verdaderos, enteropatógenos; o patógenos opor-tunistas. Es muy resistente en suelo y agua. Muere a 60º C en 15 minutos, y con 0,5 p.p.m. de cloro. Vive en el tracto intestinal del hombre y animales, por eso su presencia en un alimento indica contaminación directa o indirecta de origen fecal. Es indicador de posibles patóge-nos entéricos en el agua, moluscos, productos lácteos,..... Métodos normalizados ISO 7251 Directiva general para el recuento de Escherichia coli presuntivos. Técnica del NMP Esta directiva se basa en la siembra de tres tubos de enriquecimiento selectivo de doble concentración con una cantidad determinada de la muestra problema si es líquida o una cantidad determinada de la suspensión madre para otros productos. A continuación se siembran tres tubos de enriquecimiento selectivo de concentración simple con una canti-dad determinada de la muestra problema si es líquida o una cantidad determinada de la suspensión madre para otros productos. Después y en las mismas condiciones se siem-bran tres tubos de enriquecimiento selectivo de concentración simple con la primera dilu-ción decimal obtenida de la muestra problema o de la suspensión madre. Los tubos se incuban a 35 – 37º C según acuerdo durante 24 – 48 horas, y se realiza el examen en busca de tubos con gas. A partir de cada tubo que muestra desprendimiento de gas se inocula un tubo con medio selectivo líquido EC. La reacción es positiva cuando se produ-ce desprendimiento de gas recogido en la campana de Durham, como consecuencia de la fermentación de la lactosa en presencia de sales biliares a 45º C. Se hacen las lecturas a las 24 y 48 horas. A partir del número de tubos positivos en medio selectivo EC se siembra una nueva serie de tubos con agua de triptona. Incubación a 45º C, 24 – 48 horas y se examina la producción de indol. A partir de los tubos positivos a la producción de gas en medio selectivo y a la producción de indol en agua de triptona, se calcula el número más probable de E. coli por mililitro o gramo de muestra de ensayo. NF V 08-053 Método de rutina para el recuento de Escherichia coli β-glucuronidasa posi-tivos Este método se basa en la siembra en profundidad con el medio agar PTX o PTG, en una placa de Petri con una cantidad determinada de la muestra problema si es líquida o una cantidad determinada de la suspensión madre para otros productos. En las mismas con-diciones, siembra de diluciones decimales obtenidas de la muestra o de la suspensión madre. Incubación de las placas a 44º C durante 18 – 24 horas. Cálculo del número de Escherichia coli por mililitro o por gramo de muestra a partir del número de colonias ca-racterísticas obtenidas en las placas de Petri.



27

ESQUEMAS:


Lauril triptosa (con campana Durham)

37ºC / 48 horas

Gas = +

10 ml

10 ml

1 ml

10-1

10-2

Confirmación

Escherichia coli ISO7251


Lauril triptosa (con campana Durham)

37ºC / 48 horas

Gas = +

10 ml

10 ml

1 ml

10-1

10-2

Confirmación




28


Confirmación

Tubos positivos

Tubos con Caldo EC con campana

Asa de siembra

45ºC / 24 horas

Gas = +

Tubos positivos

Agua de triptona

Asa de siembra

37ºC / 24 horas

Prueba del indol

0,5 ml reactivoKovac´s

Amarillo -

Rojo +


Confirmación

Tubos positivos

Tubos con Caldo EC con campana

Asa de siembra

45ºC / 24 horas

Gas = +

Tubos positivos

Agua de triptona

Asa de siembra

37ºC / 24 horas

Prueba del indol

0,5 ml reactivoKovac´s

Amarillo -

Rojo +



29

Escherichia coli



10-2 10-3 10-4

��

��

��

��

Agar CROMOGÉNICOIncubación

44ºC / 24 horas

Colonias Violáceas

10-1

1ml

1ml 1ml 1ml

NF V 08-053Escherichia coli



10-2 10-3 10-4

��

��

��

��

Agar CROMOGÉNICOIncubación

44ºC / 24 horas

Colonias Violáceas

10-1

1ml

1ml 1ml 1ml

NF V 08-053



30

F. STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Staphylococcus aureus es un microorganismo de distribución en el medio ambiente muy amplia, se encuentra de forma natural en el hombre, los animales de granja, el polvo y diversos alimentos y otros productos en los que la contaminación se debe principalmente a los manipuladores. El principal problema a nivel de la microbiología de los alimentos es que S. aureus puede producir una enterotoxina termoestable, y otras toxinas. Estas toxinas actúan sobre receptores intestinales cuyo estímulos alcanzan el centro del vómito del cerebro, por lo que deberían considerarse como neurotoxinas. El mayor inconveniente de estas toxinas es su elevada resistencia a los tratamientos tér-micos habituales, soportando tratamientos de pateurización a 72º C / 13 segundos, e in-cluso 100º C / 30 minutos. Se inactivan a temperaturas de esterilización de 115º C, resis-ten la irradiación y las enzimas proteolíticas. Para la producción de toxinas en un alimento tienen que concurrir los siguientes requisi-tos: - contaminación del alimento por Staphylococccus aureus: en origen, por los manipula-

dores o por falta de higiene en locales o utensilios - la multiplicación de una cepa enterotoxigénica del microorganismo en el alimento al-

canzando al menos 106 células por gramo. Staphylococcus auerus se multiplica en alimentos proteicos, soporta concentraciones normales de azúcar e incluso elevadas de sal y el tratamiento con nitritos. Métodos normalizados ISO 6888 Directiva general para el recuento de Staphylococcus aureus. Método me-

diante enumeración de colonias Este método se basa en la siembra en superficie en un medio de cultivo sólido, preparan-do dos series de placas, con una cantidad determinada de la muestra problema si es lí-quida o una cantidad determinada de la suspensión madre para otros productos. En las mismas condiciones, siembra de diluciones decimales obtenidas de la muestra o de la suspensión madre. Incubación de las placas a 35º C durante 24 – 48 horas. Cálculo del número de Staphylococcus aureus por mililitro o por gramo de muestra a partir del núme-ro de colonias características obtenidas en las placas escogidas a los niveles de dilución que dan un resultado significativo, y confirmadas mediante la prueba de la coagulasa. NF V 08-057-1 Método de rutina para la enumeración de estafilococos cuagulasa positi-vos mediante recuento de colonias a 37ºC. Técnica de confirmación de las colonias. Este método se basa en la siembra en superficie en un medio de cultivo sólido selectivo, repartido en placas de Petri, con una cantidad determinada de la muestra problema si es líquida o una cantidad determinada de la suspensión madre para otros productos. Incu-bación de las placas a 37º C durante 24 – 48 horas. Cálculo del número de estefilococos-cogulasa positivos por mililitro o por gramo de muestra a partir del número de colonias características y/o no características obtenidas en las placas escogidas a los órdenes de dilución que dan un resultado significativo, y confirmadas mediante la prueba de la coagu-lasa.



31

MÉTODOS:

Colonias Negras o Grises con zona parcialmente opaca

Staphylococcus aureus

10 g muestra + 90 ml agua peptona


10-2 10-3 10-4

Placas de Baird - Parker Incubación

37ºC / 48 horas

10-1

1ml

1ml 1ml 1ml

ISO6888 AF V 08-057 - 1

Asa de Dirglasky

Confirmación



32

Staphylococcus aureus

Confirmación

Caldo Cerebro Corazón

Asa de siembra

37ºC / 24 horas

Coagulación = +

0,5 ml caldo + 0,5 ml plasma conejo

Caldo RM -VP

37ºC / 24 horas

Prueba de la coagulasa

1 ml caldo + 0,3 ml A + 0,1 ml B

15 min

Rojo fresa = +

37ºC / 24 horas

Prueba de la acetoína



33

G. SALMONELLA

El género Salmonella pertenece a la familia de las enterobacterias y constituye un grupo muy complejo de microorganismos patógenos para el hombre, pudiendo afectar a diver-sos animales. Comprende dos especies:

- Salmonella enterica dividida en seis subespecies - Salmonella bongori

Todas ellas se pueden identificar por características fenotípicas fáciles de ver. Métodos normalizados ISO 6579 Directiva general concerniente a los métodos de investigación de Salmonella. Este método se basa en las investigación de Salmonella en cuatro etapas sucesivas: . Preenriquecimiento en medio no selectivo: Siembra de la muestra en agau de peptona tamponada e incubación a 37º C (35º C) durante 16 – 20 horas . Enriquecimiento en medios selectivos líquidos: Con el cultivo del preenriqueci-miento siembre en verde malaquita con cloruro de m,agnesio e incubación a 42º C 24 horas, y en caldo selenito cistina e incubación a 37º C 24 horas y 24 horas suplementa-rias. . Aislamiento e identificación: A partir de los cultivos anteriores se siembran dos medios sólidos, agar rojo fenol verde brillante y otro medio selectivo a elección. Ambos se incuban a 37º C 24 horas y si es necesario 48 horas. . Confirmación: Resiembra de las presuntas colonias de Salmonella y confirma-ción en los medios de ensayos bioquímicos y serológicos apropiados. V 08-052 Método de rutina para la investigación de Salmonella Este método se basa en las investigación de Salmonella en cuatro etapas sucesivas: . Preenriquecimiento en medio no selectivo: Siembra de la muestra en agua de peptona tamponada e incubación a 37º C durante 16 – 20 horas . Enriquecimiento en medios selectivos líquidos: Con el cultivo del preenriqueci-miento siembra en caldo verde malaquita con cloruro de magnesio e incubación a 42º C 24 horas, y en caldo selenito cistina e incubación a 37º C 18 – 24 horas. . Aislamiento e identificación: A partir de los cultivos anteriores se siembra en un medio sólido selectivo a elección. Se incuba a 37º C 24 horas y si es necesario 48 horas y se examinan las características de las colonias. . Confirmación: Resiembra de las presuntas colonias de Salmonella y confirma-ción en los medios de ensayos bioquímicos y serológicos apropiados.



34

ESQUEMAS:

salmonella


ISO6579 AF V 08-052

0,1ml 2 ml

Caldo Selenito - CistinaCaldo Rappaport

42ºC / 24 horas 37ºC / 24 horas

XLD

Hektoen

XLD

Hektoen

Colonias Negras

37ºC / 20 horas

salmonella


ISO6579 AF V 08-052

0,1ml 2 ml

Caldo Selenito - CistinaCaldo Rappaport

42ºC / 24 horas 37ºC / 24 horas

XLD

Hektoen

XLD

Hektoen

Colonias Negras

37ºC / 20 horas



35

salmonella

Colonias Negras

Confirmación

��

Agar nutritivo

37ºC / 24 horas

Tira API

Asa de siembra: siembra en estría por agotamiento

37ºC / 20 horas

salmonella

Colonias Negras

Confirmación

��

Agar nutritivo

37ºC / 24 horas

Tira API

Asa de siembra: siembra en estría por agotamiento

37ºC / 20 horas

Métodos de Análsisi Microbiológicos Normas ISO

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