UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD CIENCIAS QUÍMICAS

MODALIDAD:

INVESTIGACIÓN

TEMA:

ESTUDIO FARMACOGNÓSTICO Y FITOQUÍMICO PRELIMINAR DE Pimenta

racemosa (Mill) J.W. Moore

AUTORES:

EILEEN ALEJANDRA GUADALUPE NAVARRETE

ANDREA ELIZABETH MANCHENO URQUIZA

TUTORA:

Msc. KATHERINE BUSTAMANTE PESANTES

CO – TUTORA:

PhD MIGDALIA MIRANDA MARTÍNEZ

GUAYAQUIL – ECUADOR

2016

I

APROBACIÓN DEL TUTOR

En calidad de tutora del Trabajo de Titulación, Certifico: Que he asesorado, guiado y

revisado el trabajo de titulación en la modalidad de investigación, cuyo título es,

ESTUDIO FARMACOGNÓSTICO Y FITOQUÍMICO PRELIMINAR DE Pimenta

racemosa (Mill) J.W. Moore presentado por LA Srta. Andrea Elizabeth Mancheno

Urquiza, con cédula de ciudadanía N° 095051814-2, y la Srta. Eileen Alejandra

Guadalupe Navarrete con cédula de ciudadanía N° 093093698-4 previo a la

obtención del título de Química y Farmacéutica.

Este trabajo ha sido aprobado en su totalidad y se adjunta el informe de Antiplagio

del programa URKUND. Lo Certifico.-

Guayaquil, 7 de Febrero 2017

Q.F. KHATERINE BUSTAMANTE PhD. MIGDALIA MIRANDA TUTOR CO-TUTOR

II

INFORME ANTIPLAGIO DEL SISTEMA URKUND

El plagio encontrado en el proyecto de titulación cuyo tema es ESTUDIO

FARMACOGNÓSTICO Y FITOQUÍMICO PRELIMINAR DE Pimenta racemosa (Mill)

J.W. Moore, fue del 4% según lo certifica el sistema URKUND.

FIRMA DEL TUTOR DE TESIS FIRMA CO-TUTOR DE TESIS

Q.F. KHATERINE BUSTAMANTE PhD. MIGDALIA MIRANDA

III

CERTIFICADO DEL TRIBUNAL

El Tribunal de Sustentación del Trabajo de Titulación del/la Sr./ Srta.

_____________, después de ser examinado en su presentación, memoria científica

y defensa oral, da por aprobado el Trabajo de Titulación.

PRESIDENTE - MIEMBRO DEL TRIBUNAL

DOCENTE–MIEMBRO DEL TRIBUNAL DOCENTE–MIEMBRO DEL TRIBUNAL

ING. NANCY VIVAR CÁCERES SECRETARIA ENCARGADA

IV

CARTA DE AUTORIA DE TITULACIÓN

7 de febrero del 2017

Nosotras, MANCHENO URQUIZA ANDREA ELIZABETH y GUADALUPE

NAVARRETE EILEEN ALEJANDRA, autoras de este trabajo declaro ante las

autoridades de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Guayaquil,

que la responsabilidad del contenido de este TRABAJO DE TITULACIÓN, nos

corresponde a nosotras exclusivamente; y el patrimonio intelectual de la misma a la

Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Guayaquil. Declaramos

también es de nuestra autoría, que todo el material escrito, salvo el que está

debidamente referenciado en el texto. Además, ratificamos que este trabajo no ha

sido parcial ni totalmente presentado para la obtención de un título, ni en una

Universidad Nacional, ni una Extranjera.

MANCHENO URQUIZA ANDREA GUADALUPE NAVARRETE EILEEN

C.I.095051814-2 C.I. 093093698-4

V

AGRADECIMIENTO

Eileen Alejandra Guadalupe Navarrete

A Dios, por ser mi guía y concederme la dicha de poder terminar mis estudios.

A mi abuelito, por haber sido como un padre quien me ensenó a no desfallecer jamás y aunque ya no esté conmigo sus sabios consejos prevalecerán en mi memoria para siempre.

A mi madre, por brindarme el apoyo y la confianza demostrándome su amor corrigiendo mis faltas y guiándome hacia el camino correcto.

A mi tia Sonia, por ser mi segunda madre y estar conmigo durante toda mi vida gracias por siempre apoyarme y brindarme su amor sin condición.

A mi abuelita, por criarme, corregirme, amarme y por sobre todo mostrarme los caminos de Dios.

A mi tío Freddy, por darme ánimos cuando lo necesitaba y palabras de aliento para seguir adelante.

A mi hermano, por ser una bendición muy grande para mí-

A mi tutora, Dra. Katherine Bustamante y a mi cotutora Migdalia Miranda por el esfuerzo, valiosa dedicación y paciencia de cada una durante todo este proceso de titulación, que Dios las bendiga siempre.

A mi compañera de tesis, Andrea, porque juntas logramos vencer el último reto para poder tener nuestro título, por aconsejarme y ser una de mis mejores amigas. Te deseo muchos éxitos en tu vida Apple.

VI

AGRADECIMIENTO

Andrea Elizabeth Mancheno Urquiza

Antes que todo quisiera agradecer a Dios por permitirme llegar a cumplir una de mis metas, por ser mi guía espiritual y por bendecir cada paso que doy.

A mi Madre Rocío, que con su amor, paciencia y ternura ha sabido darme los mejores consejos y valores que guían mi vida, y me ha brindado el mejor de los ejemplo como mujer en el hogar y en la vida profesional, porque siempre está dispuesta para mí y nunca se rinde, gracias mujer luchadora.

A mi Padre René, que a pesar de la distancia cada minuto me hace sentir que está a mi lado, brindándome su apoyo, sus consejos y su amor, guiándome por el camino del bien y de Dios, por enseñarme a no rendirme jamás y perseguir mis sueños.

A mis hermanos David y Xavier, mis compañeros de día a día, han sido un gran apoyo en mi vida, llenándome siempre de sonrisas.

A mis abuelitos que me han apoyado y consentido desde muy pequeña, dándome el mejor ejemplo de amor verdadero, a pesar de que 3 de ellos están en el cielo, siempre tengo en mi mente y corazón sus consejos.

A mi tutora, Dra. Katherine Bustamante y a mi cotutora PhD. Migdalia Miranda, por el esfuerzo y dedicación de cada una, quienes con sus conocimientos, sus experiencias y paciencia han logrado en mí que pueda terminar mis estudios con éxito.

A mi compañera de tesis, Eileen, que ha sido mi apoyo durante 5 largos años de carrera entre sonrisas y sustos ha sido una grata experiencia tener a una verdadera amiga junto a mí, gracias por todo querida Apple, ahora si podremos decir.. We are the Champions my friend!

VII

ÍNDICE GENERAL

CONTENIDO Pág

INTRODUCCIÓN 1

PROBLEMA 3

HIPÓTESIS 3

OBJETIVO GENERAL 3

OBJETIVO ESPECÍFICO 3

CAPÍTULO I REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4

I.1. PLANTAS MEDICINALES 4

I.2. ACEITES ESENCIALES 6

I.2.1. Concepto y características 6

I.2.2. Características químicas de los aceites esenciales 7

I.2.3. Método de extracción de aceites esenciales 9

I.2.3.1 Métodos mecánicos 10

I.2.3.2 Extracción con disolventes orgánicos 10

I.2.3.3 Disolución en grasa (enfleurage) 11

I.2.3.4 Extracción con gases en condiciones supercríticas 11

I.2.3.5 Extracción por destilación 12

I.2.3.6 Hidrodestilación asistida por microondas 14

I.2.4. Rendimiento de los aceites esenciales 14

I.2.5. Usos 15

VIII

I.3. FAMILIA MIRTÁCEA 16

I.4. Pimenta racemosa (Mill) JW Moore 17

I.4.1. Características y Generalidades 17

I.4.2. Historia 17

I.4.3. Aceite Esencial 18

I.4.3.1. Composición química del aceite esencial 18

I.4.3.2. Propiedades 18

I.4.3.3. Usos 19

CAPITULO II. MATERIALES Y MÉTODOS 20

II.1. RECOLECCIÓN DE MATERIAL VEGETAL 20

II.2 EVALUACIÓN MACROSCÓPICA 20

II.3. EVALUACIÓN MICROMORFOLÓGICA 20

II.4. PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS 21

II.4.1 Humedad residual 21

II.4.2 Cenizas totales 22

II.4.3 Sustancias solubles 23

II.5 IDENTIFICACIÓN DE LOS METABOLITOS POR TAMIZAJE QUÍMICO

23

II.6 CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA 24

II.7 OBTENCIÓN DEL ACEITE ESENCIAL 24

II.8. ANÁLISIS DE LOS PARÁMETROS FISICOQUÍMICOS 24

IX

II.8.1. Determinación del índice de refracción 25

II.8.2. Determinación de densidad relativa 25

II.8.3. Solubilidad en alcohol 26

II.8.4. Análisis del residuo de evaporación 26

II.9 ANÁLISIS DEL ACEITE ESENCIAL POR EL SISTEMA ACOPLADO CROMATOGRAFÍA GASEOSA-ESPECTROMETRÍA DE MASAS (CG-EM).

27

II.10 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 28

Capitulo III. RESULTADOS Y DISCUSIÒN 29

III.1. CARACTERIZACIÓN BOTÁNICA DE LA ESPECIE 29

III.1.1. Evaluación macromorfológica de las hojas 29

III.1.2. Evaluación micromorfológica 33

III.2. DETERMINACIÓN DE LOS PARAMETROS FISICOQUIMICOS 35

III.3 TAMIZAJE FITOQUIMICO 36

III.4 CROMATOGRAFÍAEN CAPA FINA 38

III.5 OBTENCION Y ANÁLISIS DEL ACEITE ESENCIAL 39

III.5.1 Rendimiento del aceite esencial 39

III.5.2 Constante físico químicos del aceite esencial 39

III.6 ANALISIS POR CG-EM 41

CONCLUSIÓN 46

RECOMENDACIÓN 47

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 48

X

ANEXOS 55

XI

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla I. Algunos terpenoides y no terpenoides presentes en los aceites esenciales

8

Tabla II. Análisis estadístico para las dimensiones de las hojas 30

Tabla III. Parámetros físico químicos determinados a las hojas de

Pimenta racemosa.

35

Tabla IV. Tamizaje fitoquímico de las hojas de Pimenta racemosa 37

Tabla V. Valores Rf de las machas obtenidas en cada extracto 39

Tabla VI. Parámetros físico-químicos del aceite esencial 40

Tabla VII. Constituyentes identificados en el aceite esencial de P.

racemosa. 43

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Representación esquemática del mecanismo de extracción 11

Figura 2. Esquema de un instrumento típico de extracción por fluido supercrítico de muestras sólidas

12

Figura 3. Dibujo de un equipo simplificado de destilación por vapor 13

Figura 4. Diagrama de flujo generalizado de los diferentes tipos de destilación con agua / vapor.

13

Figura 5. Esquema de la hidrodestilación asistida por microondas 14

Figura 6. Características macromorfológicas de las hojas 29

Figura 7. Histograma de frecuencia para el largo de las hojas 31

Figura 8. Gráfico de distribución para el largo de las hojas. 31

Figura 9. Histograma de frecuencia para el ancho de las hojas 32

Figura 10. Gráfico de distribución para el ancho de las hojas. 32

XII

Figura 11. Detalles micromorfológicos del nervio central de Pimenta

racemosa (Mill) J.W. Moore

33

Figura 12. Secciones ampliadas de los detalles micromorfológicos de Pimenta

34

Figura 13. Cromatografía en capa delgada de los extractos del tamizaje 38

Figura 14. Cromatograma gaseoso analítico del aceite esencial de 41

P. racemosa

XIII

RESUMEN

En el presente trabajo se aborda el estudio Farmacognóstico preliminar de P.

racemosa (Mill) J.W. Moore colectadas en la ciudad de Guayaquil, provincia del

Guayas (Ecuador) mediante el cual se pudieron establecer las características macro

morfológicas de la especie, las cuales coinciden con lo informado en la literatura. Se

informaron por primera vez, para la especie, las características micromorfológicas y

los parámetros de calidad. Para el aceite esencial obtenido mediante el método de

hidrodestilación se obtuvo un rendimiento de 1,3 ml el cual fue superior al informado

en la bibliografía. Se establecieron algunos parámetros de calidad para el aceite

esencial, los cuales se encuentran dentro del rango informado. El análisis de la

composición química del aceite esencial utilizando el sistema acoplado CG-EM,

permitió identificar al metil-eugenol (39,67%) y el estragol (37,60%), como los

componentes mayoritarios, seguidos del mirceno (9,27%), el 1,8-cineol (3,55%) y el

limoneno (2,13%). Los cuales se corresponden con lo informado para P. racemosa

var. racemosa

XIV

ABSTRACT

In the present work the preliminary pharmacological study comprised of P.

Racemosa (Mill) J.W. Moore collected in the city of Guayaquil, Guayas (Ecuador)

with which the macro morphological characteristics of the species were established,

the same that coincide with what is here stated, the micro morphological

characteristics and quality parameters of the species were announced for the first

time. There was a yield rate of 1.3 mL for the essential oil obtained through

hydrodistillation which is greater than that stated in the bibliography. A few quality

parameters were established for the essential oil, which are between the stated

ranges. The chemical composition analysis of the essential oil using the CG-EM

coupled system allowed the identification of methyleugenol (39.67%) and estragole

(37.60%), as main components followed by myrcene (9.27%), 1.8-ceneole (3.55%)

and limonene (2.13%); all these corresponding to what was informed about the P.

racemosa var. racemosa.

1

I. INTRODUCCIÓN

El Ecuador es una zona rica en recursos naturales y de abundante producción

de plantas aromáticas así como también es considerado en el mundo como uno de

los países más biodiversos; gracias a su privilegiada ubicación geográfica en el

neotrópico que influye para construir el escenario de las más diversas formas de

vida de flora y fauna (Bravo, 2013).

Existe una gran variedad de plantas aromáticas en el país con muy pocas

investigaciones publicadas y este ha sido la pauta para el inicio de este proyecto.

La especie Pimenta racemosa var. racemosa (Mill.) J.W. Moore, pertenece al

género Pimenta de la familia Mirtácea, es nativa de las Pequeñas Antillas, Puerto

Rico y Cuba, siendo ampliamente cultivada en los Trópicos Americanos. Se conoce

comúnmente como Bay-Rum Tree, Malagueta, Pepita de especie y Pimienta

(Aristiguieta, 1973; Landrum, 1986) y ha sido ampliamente estudiada debido al

contenido en sus hojas de aceites volátiles, que una vez destiladas, se usan en la

fabricación de cosméticos, principalmente en formulaciones de lociones para

después del afeitado, jabones, colonias y tratamientos para el cabello. (Weiss, 2002;

Boning, 2010).

El aceite esencial extraído de las hojas presenta propiedades desinfectantes y

astringentes; es moderadamente tóxico por vía oral debido a su alto porcentaje de

fenol, pero no da lugar a reacciones alérgicas en el hombre. Se utiliza en perfumería

en la fabricación de cremas, lociones, detergentes, o en los champuses. El aceite

esencial interviene en la fórmula patentada de una composición cosmética capilar

(Orenga, 2003).

2

Posee propiedades antiinflamatorias y analgésicos (Duke, 1986; Robineau,

1991). También se utiliza como febrífugo (Ayedoun et al., 1996). Las propiedades

biológicas más destacadas son los efectos antimicrobianos que se explican por el

alto porcentaje de fenoles.

Los estudios que se han realizado demostraron que el aceite esencial de tres

variedades de Pimenta racemosa poseía actividad antibacteriana contra

Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa y Mycobacterium-smegmatis y actividad antifúngica frente a cinco cepas

de los hongos Candida albicans, Aspergillus niger, Abisidia corymbifera, Penicillium

verrucosum y Cladosporium cladosporioides; las tres variedades "químicas"

enumerados son los quimiotipos con citral/metil chavicol-metil ugenol/ chavicol y

eugenol).

Burt y Reinders, (2003), señalaron para el aceite esencial una fuerte actividad

antibacteriana frente aEscherichia coli. Este aceite fue activo en las bacterias Gram

(+) y Gram (-) lo que indica potencialidades para su uso como agente desinfectante

(Saenz y col., 2004).

El aceite posee las actividades de fármacos anti-inflamatorios (Fernández

2001a, 2001b), una actividad nematicida (Park y col., 2005), y una actividad

insecticida (Noudogbessi ycol., 2008).

El objetivo principal es realizar el estudio farmagcognóstico y fitoquímico de

las hojas de Pimenta racemosa (Mill) J.W. Moore, planta que aunque proviene de

las Antillas y la Guyana francesa, se encuentra también en Ecuador.

3

PROBLEMA

¿Tendrá el Bay-Rumque crece en Ecuador componentes y propiedades

farmacológicas similares a la informada en la literatura de otros países?

HIPÓTESIS

Pimenta racemosa (Mill) J.W. Moore presenta componentes en sus hojas con

posible acción farmacológicas.

OBJETIVO GENERAL

Realizar el estudio farmacognóstico y fitoquímico de las hojas de Pimenta

racemosa. (Mill) J.W. Moore

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Determinar parámetros farmacognósticos de las hojas de Pimenta racemosa.

(Mill) J.W. Moore

• Extraer el aceite esencial y evaluar su rendimiento y características físico-

químicas.

• Analizar por el sistema acoplado Cromatografía gaseosa-Espectrometría de

Masas, el aceite esencial y las fracciones separadas por columna

cromatográfica.

4

CAPÍTULO I REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

I.1. PLANTAS MEDICINALES

Las plantas medicinales son un recurso que la naturaleza nos brinda, su

utilización se remonta a miles de años en la historia de la humanidad y son

fundamentales en el desarrollo de la medicina moderna (Gonzalez y col., 2004).

Debido a las sustancias químicas que poseen tendrán acción preventiva y

curativa provocando efectos fisiológicos en el organismo. A estas sustancias se las

conoce como principios activos y, generalmente se originan del producto del

metabolismo secundario de la planta. Estos principios activos se caracterizan por

tener propiedades medicinales o preventivas, o funcionan incrementando el

bienestar;algunos actúan como antibióticos o antisépticos, otros son sedantes

o analgésicos, u operan como estimulantes actuando sobre el sistema nervioso ya

sea que tengan actividad neuromuscular o muscular, entre otros efectos(Gonzalez y

col., 2004).

Las plantas medicinales ayudan cada vez más al fortalecimiento de los

programas de salud y por supuesto a la economía de los países. Son muchas las

formas en las que se aprovechan las plantas, como materia prima, extracto

alcohólico o acuoso, en forma semipurificada, pura o semisintética. Desde el punto

de vista comercial se precisa que las plantas medicinales son patrimonio de cada

nación(Scrib, 2010).

Muchas comunidades existentes alrededor del mundo han empleado estas

plantas para curar enfermedades y/o romper maldiciones basándose en

conocimientos y supersticiones que heredaron de sus antepasados y que fueron

pasando de generaciónageneración hasta el día de hoy(Hierbas y Plantas

Medicinales, 2016)

5

Al estudio de todas las sustancias que son de origen natural y que tienen

virtud medicinal se lo conoce como farmacognosia, y el efecto que ocasionan esas

sustancias en el organismo se estudia en farmacología.Dentro de la fitoquímica se

podrá detectar y posteriormente identificar los principios activos responsables de las

propiedades atribuidas a las plantas (Hierbas y Plantas Medicinales, 2016).

Los químicos se encargan de investigar la presencia o ausencia de los

grandes grupos de sustancias activas, tales como alcaloides, glicósidos, quinonas,

etc., y posteriormente proceden a su aislamiento químico y caracterización. Luego

se encargan de preparar extractos para ensayar su actividad fisiológica y de los

prometedores separan y purifican las sustancias que los

constituyen(Domínguez,1976).

Muchos de los principios activos se han aislado y purificado, y se

ha dilucidado su estructura química. En algunos casos, esa estructura ha sido

copiada o duplicada de manera artificial, obteniéndose compuestos sintéticos,

muchos de los cuales constituyen la base de medicamentos comerciales

(Domínguez, 1976).

Es de vital importancia la detección e identificación de los principios activos

por diversas razones:

a. Permite corroborar o rechazar las propiedades atribuidas a las plantas.

b. Admite detectar posibles nuevas aplicaciones. La acción fisiológica de cada

sustancia depende de su estructura química, de tal manera que las de

estructura similar pueden actuar también de manera similar sobre el

organismo.

c. Permite una elección más racional de las especies a estudiar y facilita el

descubrimiento de nuevos productos medicinales.

6

Muchas plantas han sido estudiadas y validadas con holgura desde el punto

de vista biológico, químico y farmacológico (como la morfina, principio activo del

opio, aislada en 1805); sin embargo, todavía muy poco se conoce acerca de

ellas(Gonzalez y col., 2004).

.

I.2 ACEITES ESENCIALES

I.2.1. Concepto y características.

Los aceites esenciales son sustancias aromáticas que se encuentran en

diferentes plantas, se trata de productos químicos no grasos de aspecto oleoso,

volátiles por naturaleza y poco densos, son insolubles en agua, levemente solubles

en ácidos débiles y solubles en alcohol, grasas, ceras y aceites vegetales. Son muy

inestables, alterables con la luz y se oxidan al contacto con el aire. El aceite puede

ser extraído de diferentes partes de la planta tales como hojas, tallos, flores y raíces.

Para obtenerlo de la fuente natural se utiliza entre otras técnicas de extracción, la

destilación por arrastre con vapor de agua.(Lopez, 2004)

Se encuentran muy difundidos en el reino vegetal, de las 295 familias de

plantas, de 60 a 80 producen aceites esenciales. Las principales plantas que

contienen aceites esenciales, se encuentran en familias como: Compuestas,

Labiadas, Lauráceas, Mirtáceas, Rosáceas, Rutáceas, Umbelíferas,

Pináceas(Lopez, 2004).

Los aceites esenciales son fracciones líquidas que están formadas,en

ocasiones, por más de 100 componentes tales como compuestos alifáticos de bajo

peso molecular (alcanos, alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres y ácidos),

monoterpenos, sesquiterpenos y fenilpropanos; éstos se producen y se almacenan

en los canales secretores de las plantas y son los responsables de las fragancias y

aromas de las mismas. (Lopez, 2004)

7

I.2.2. Características químicas de los aceites esenciales

Los aceites esenciales poseen componentes que se clasifican en terpenoides

y no terpenoides. (Bruneton, 2001).

No terpenoides: En este grupo se encuentran las sustancias alifáticas de

cadena corta, sustancias aromáticas, sustancias con azufre y sustancias

nitrogenadas. No son tan importantes como los terpenoides en cuanto a sus usos y

aplicaciones (Bruneton, 2001).

Terpenoides: son los principales constituyentes de los aceites esenciales de

algunas plantas y flores, son los más importantes en cuanto a propiedades y su

comercialización.

El término terpeno se refiere a los hidrocarburos, mientras que los terpenoides

son los compuestos con una gran variabilidad de grupos funcionales, tales como

alcoholes, éteres, ésteres, ácidos, etc. Se halla en los aceites esenciales, resinas y

otras sustancias aromáticas de muchas plantas, como los pinos y muchos cítricos

(Miranda y Cuéllar, 2012).

Principalmente se encuentran en los aceites monoterpenos (C10), aunque

también son comunes los sesquiterpenos (C15) y los diterpenos (C20). Éstos pueden

seracíclicos y cíclicos de uno o más ciclos (Bruneton, 2001; Miranda y Cuéllar,

2012).

Algunos de éstos compuestos se presentan en la tabla I.

8

Tabla I. Algunos terpenoides y no terpenoides presentes en los aceites

esenciales

FUNCIÓN EJEMPLO PROPIEDADES

TERPENOIDE

Alcohol

Mentol (menta)

Antimicrobiano,

antiséptico, tonificante,

espasmolítico

Aldehído

Citral (limón) Espasmolítico, sedante,

antiviral

Cetona

Alcanfor (alcanfor) Mucolítico, regenerador

celular, neurotóxico

Éteres

1,8-Cineol (eucalipto) Espasmolítico, sedativo,

antifúngico

Hidrocarburo

α-pineno (pino) Expectorante, estimulante

9

Tabla I continuación

NO TERPENOIDE (FENIL PROPANOS)

Éter fenólico

Anetol (anís) Diurético, carminativo,

estomacal, expectorante

Fenol

Eugenol (clavo de olor) Antimicrobiano Irritante

Estimulante inmunológico

NO TERPENOIDE (DERIVADOS DE NITRÓGENO Y AZUFRE)

Azufrado

Alicina (ajo) Antibacteriano, antiviral,

antifúngico, hipotensor.

Aminado

Alilisotiocianato (mostaza)

Fuente: (Bruneton, 2001)

I.2.3. Métodos de extracción de aceites esenciales

Para la extracción de los aceites esenciales de las plantas, se pueden emplear

diferentes métodos (Miranda y Cuéllar, 2012):

10

I.2.3.1 Métodos mecánicos

Consiste en extraer de los tejidos vegetales, los principios activos disueltos en

los líquidos que impregnan dichos tejidos. Puede ser:Por incisión, Por expresión

Extracción por Incisión: Procedimiento empleado para extraer los zumos de

ciertos vegetales, realizando incisiones o cortes en los mismos. Se emplea para

extraer los aceites esenciales de las cortezas de los cítricos.

Extracción por Expresión: Consistente en presionar fuertemente la droga.

De esta forma se obtienen los zumos de los frutos.

I.2.3.2 Extracción con disolventes orgánicos

Que penetran en la materia vegetal y disuelven las sustancias, que son

evaporadas y concentradas a baja temperatura. Después, se elimina el disolvente,

obteniendo la fracción deseada. La selección del disolvente pretende que sea capaz

de disolver rápidamente todos los principios y la menor cantidad de materia inerte,

que tenga un punto de ebullición bajo y uniforme que permita eliminarlo

rápidamente, pero evitando pérdidas por evaporación, químicamente inerte, para no

reaccionar con los componentes de los aceites, no inflamable y barato. Este

disolvente ideal no existe, y los más empleados son el éter de petróleo, con punto

de ebullición de 30 a 70º C, benceno y alcohol. Se emplea cuando hay

componentes de peso molecular elevado que no son lo suficientemente volátiles

(Palma y col., 2013) (figura 1).

11

Fuente: Costa y col., 2012

Figura 1. Representación esquemática del mecanismo de extracción

I.2.3.3 Extracción en grasa (Enfleurage)

Los aceites son solubles en grasas y alcoholes. Sobre una capa de vidrio se

coloca una fina película de grasa y sobre ella los pétalos de flores extendidas. La

esencia pasa a la grasa, así hasta saturación de la grasa. Posteriormente con

alcohol de 70º, se extrae el aceite esencial. Se emplea para flores con bajo

contenido en esencias pero muy preciadas (azahar, rosa, violeta, jazmín) (Alvarez y

col., 2004.)

I.2.3.4 Extracción con gases en condiciones supercríticas

Se emplean gases, principalmente CO2, a presión y temperatura superiores a

su punto crítico. En esas condiciones se obtienen buenos rendimientos y se evitan

alteraciones de los componentes de la esencia. La infraestructura necesaria es cara,

pero tiene sus ventajas, como la fácil y rápida eliminación del gas extractor por

descompresión, la ausencia de residuos de disolventes y que los gases no resultan

caros (Costa y col., 2004) (figura 2)

12

Fuente: Costa y col., 2012

Figura 2. Esquema de un instrumento típico de extracción por fluido

supercrítico de muestras sólidas

I.2.3.5 Extracción por destilación

Como método de extracción de aceites esenciales, el más empleado es la

destilación por corriente de vapor. No es aplicable a flores ni a materiales que se

apelmazan. En esta técnica se aprovecha la propiedad que tienen las moléculas de

agua en estado de vapor de asociarse con moléculas de aceite.

La extracción se efectúa cuando el vapor de agua entra en contacto con el

material vegetal y libera la esencia, para luego ser condensada. Con el fin de

asegurar una mayor superficie de contacto y exposición de las glándulas de aceite,

se requiere picar el material según su consistencia. (Palma y col., 2013) (figura 3).

13

Fuente: Costa y col., 2012

Figura 3. Dibujo de un equipo simplificado de destilación por vapor

La destilación por arrastre con vapor comprende variantes según el material

fresco o seco se altere o no por ebullición con agua, estos son (figura 4)

Con agua (planta seca que no se altera con el calor directo)

Con vapor de agua (planta fresca)

Con agua y vapor (planta seca que se altera con el calor directo)

Fuente: Costa y col., 2012

Figura 4. Diagrama de flujo generalizado de los diferentes tipos de destilación

con agua / vapor.

14

1.2.3.6 Hidrodestilación asistida por microndas

La hidrodestilación también se ha combinado a las microondas para aumentar

la eficiencia del proceso de extracción de productos naturales. En algunos casos,

hornos domésticos de microondas están adaptados para ayudar al proceso (figura

5). Este método puede proporcionar menor coste al tiempo que reduce el impacto

medioambiental del proceso yla producción de un producto similar a los obtenidos

por lahidrodestilación convencional.

Fuente: Golmakani and Rezaei, 2008

Figura 5. Esquema de la hidrodestilación asistida por microondas

I.2.4. Rendimiento de los aceites esenciales

El rendimiento en aceite esencial de la mayoría de plantas es de 0,01 a 10%.

La cantidad media en que se encuentran en la mayoría de las plantas aromáticas es

alrededor de 1 a 2%. Regularmente el contenido de aceites esenciales aumenta

después de la lluvia y alrededor del mediodía, cuando se ha eliminado el agua de

rocío depositada sobre la planta, y ha comenzado una deshidratación antes de la

humedad relativa alta de la noche; la excepción a este comportamiento se presenta

en la manzanilla que alcanza una mayor concentración de aceite esencial durante la

noche (Alvarez y col., 2004)

15

I.2.5. Usos

Los aceites esenciales son muy utilizados en diferentes industrias, tales como:

Industria Farmacéutica: Numerosos compuestos utilizados en la medicina

tradicional pueden ser aplicados en la industria farmacéutica, ya sea mediante

extracción o síntesis, o servir de “modelo” para la síntesis de nuevos medicamentos.

La síntesis de sustancias con estructura química muy similar a las ya conocidas

como medicinales, tiene por objeto encontrar sustancias con actividad análoga o

más eficaz sobre el organismo, con el fin de reducir la dependencia de productos

naturales.Se usan en cremas dentales (aceite de menta e hinojo), analgésicos e

inhalantes para descongestionar las vías respiratorias (eucalipto). El eugenol es

muy empleado en odontología. Son utilizados como saborizantes, para enmascarar

el sabor desagradable de algunos medicamentos (naranjas y menta, entre otros).

(Martinez, 2003)

Industria Alimentaria: Se emplean para condimentar carnes preparadas,

embutidos, sopas, helados, queso, etc. Los aceites más empleados por esta

industria son el Cilantro, Naranja y Menta, entre otros. También son utilizados en la

preparación de bebidas alcohólicas y no alcohólicas, especialmente refrescos. Con

respecto a esta utilidad podemos citar las esencias extraídas del naranjo, limón,

mentas e hinojo, entre otros. Estas esencias también se emplean en la producción

de caramelos, chocolates y otras golosinas (Martinez, 2003).

Industria de Cosméticos: En perfumería y cosmética los aceites esenciales

son utilizados ampliamente. El empleo en perfumería es muy importante debido, a

las cualidades olfativas de los aceites esenciales. Ello implica que sean

incorporados en un sinnúmero de composiciones: desde perfumes para aguas de

colonia hasta fragancias para detergentes de ropa. En cuanto a su empleo en

cosmética se basa en las funciones específicas que algunas esencias presentan

16

sobre la piel, además del uso como aromatizante en diferentes preparaciones

cosmética. En este campo se pueden citar lo aceites de geranio, lavanda, rosas y

pachouli (Martinez, 2003).

Industria de productos de uso veterinario: Esta industria emplea el aceite

esencial de Chenopodium ambrosoides muy apreciado por su contenido de

ascaridol, como vermífugo. También requiere limoneno y mentol como insecticidas.

(Martinez, 2003)

I.3 FAMILIA MIRTÁCEA

La familia Mirtácea se compone de un número grande de especies de las

cuales la mayoría de ellas se encuentran situadas en las zonas tropicales y

subtropicales. El género Pimenta se encuentra representado por 18 especies, dos

de ellas son plantas aromáticas muy usadas en América tropical y caribeña.

(Rodriguez, 1969)

Una de estas especies es Pimenta dioica llamada localmente “All spice”.

Según Rodríguezesta especie se origina en Jamaica y crece también en otros

países de Centro América (Rodriguez, 1969).

La otra es la Pimenta racemosa compuesta de dos variedades: Pimenta ozua

(Urban and Ekman) Burret y Pimenta racemosa var. racemosa (Miller) J. W. Moore.

De acuerdo a Landrum la variedad ozua es endémica de la isla Española

(Haití y la República Dominicana) donde se utiliza como una planta medicinal.

(Landrun, 1984)

La variedad racemosa es generalizada pudiendo ser encontradas en las islas

de las Antillas como Puerto Rico y también en regiones tropicales de centro y

América del sur (Landrun, 1984).

17

Según la clasificación encontrada la Pimenta racemosa var. racemosa es

descrita por los botánicos como una planta única, se lo conoce localmente como

árbol de la bahía. De hecho, las descripciones se aplican a tres tipos de

plantas, idénticas en su morfología externa. Sin embargo, pueden fácilmente ser

distinguido con el olor de la sus hojas. (Landrun, 1984)

I.4. Pimenta racemosa(Miller) J. W. Moore

I.4.1. Características y Generalidades

La malagueta o el bay-rum entre otros nombres que se le da a (Pimenta

racemosa) es un árbol de la familia Mirtácea de tamaño mediano oriundo de las

Antillas y Guayana, posee un tronco recto y su altura es aproximadamente de 4 a 8

metros y de copa frondosa. Sus hojas son de color verde oscuro, brillante por la haz,

sin brillo y pálido por el envés que esta finamente puntuado de glándulas de las

cuales emanan su olor aromático. Poseen flores de unos 10 mm, con cáliz de 5

sépalos y pétalos blancos con números estambres. Su fruto es una baya de

superficie granulada de color pardo oscuro. Es un árbol de crecimiento lento con

raíces profundas y su vida es bastante larga. Sus hojas contienen aceite aromático

que semeja al aceite de clavo de olor. Este aceite esencial se destila de las hojas y

se utiliza en perfumerías.(TopTropicals, 2015)

I.4.2. Historia

A principios del siglo XX por un método de destilación se extrajo el aceite

usando ron y agua para la realización de una colonia denominada 'Bay Rum" de ahí

el nombre común de la planta. La colonia tiene sus notas especiadas de la bahía y

sus tonos ahumados, arbolados del Ron envejecido en barricas. (TopTropicals,

2015)

18

I.4.3. Aceite Esencial

El aceite esencial de bay-rum tiene dos fracciones distintas en la destilación.

La primera fracción destila hacia fuera rápidamente y es un aceite de peso ligero

que flota en el agua. La segunda fracción destila más lentamente y es un aceite de

peso pesado que se hunde en el agua. (TopTropicals, 2015)

Los dos aceites son recombinados para hacer oleum pimentae foliorum o

aceite de hojas de pimenta. (TopTropicals, 2015)

I.4.3.1. Composición química del aceite esencial

Entre los componentes principales están el eugenol, chavicol, mirceno,

linalool, limoneno entre otros que se encuentran en pequeñas proporciones. Siendo

el eugenol y el chavicol encontrados en mayor cantidad. (Contreras y col., 2014)

I.4.3.2. Propiedades

Este aceite es estimulante, antiséptico, tónico, expectorante, analgésico,

anticonvulsivo, anti-neurálgico, anti-reumático y astringente (Naturisima, 2014).

Al momento de realizar la aromaterapia con este aceite esencial es

recomendable que se lo haga en cantidades pequeñas y en especial no se lo

recomienda para baños ni inhalaciones ya que esto podría causar irritaciones a la

membrana de la mucosa(Leyva y col., 2007).

El aceite esencial posee un aroma vivo especiado y fresco ideal para

personas que no les gustan los aromas muy dulzones, no es tóxico ni sensibilizante

(Leyva y col., 2007).

19

I.4.3.3. Usos

Al realizar masajes utilizando el aceite ayudara a las personas que poseen

depresión, apatía y en algunos casos falta de autoestima.Vigoriza el espíritu y

aporta coraje y energía necesaria para realizar algún tipo de acción.

Se informan los siguientes usos (Naturisima, 2014):

a) Sistema respiratorio: Su cualidad antiséptica es útil para bronquitis, resfriados y

gripe.

b) Piel y cabello: Es un buen tónico capilar y estimula el crecimiento del cabello y

también ayuda a eliminar la caspa.

c) Sistema Muscular:Gracias a sus propiedades analgésicas alivia dolores

musculares y también durante la gripe.

20

CAPÍTULO II MATERIALES Y MÉTODOS

II.1. RECOLECCIÓN DE MATERIAL VEGETAL

Las hojas frescas de la especie P. racemosa fueron recolectadas el 18 de

febrero de 2016, en horas de la mañana en el Jardín Botánico al norte de la ciudad

de Guayaquil, Ecuador. La identificación botánica fue realizada por el Herbario

GUAY, Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad de Guayaquil, Ecuador

(anexos 1 y 2).

II.2 EVALUACIÓN MACROSCÓPICA

Para el estudio macromorfológico se analizaron muestras de 50 hojas,

mediante el uso de un calibrador vernier digital, se determinóel largo y ancho de las

hojasy se calcularon los parámetros estadísticos.

Para las características macromorfológicas de las hojas, éstas fueron

observadas con una lupa para describir la forma de la hoja, base ápice, borde y

nerviaciones, también se tuvo en cuenta las características de las hojas por la haz y

el envés y la presencia del pecíolo. Se siguió para ello los aspectos planteados por

Miranda y Cuéllar (2000).

II.3. EVALUACIÓN MICROMORFOLÓGICA

Para el estudio micromorfológico, se llevó a cabo la inclusión en para fina,

para lo cual se empleó la metodología descrita por Miranda y Cuellar (2000).

21

Se realizaron cortes pequeños de las hojas, por el nervio medio de las

mismas. Los pequeños cortes se sometieron a deshidratación con etanol al 45%,

60%, 75%, 98% por 48 horas en cada uno a temperatura ambiente, finalmente se

depositó durante 48 horas en el reactivo intermediario (hexano). Una vez realizada

la deshidratación, las muestras se depositaron en parafina en la estufa Memmert, a

60° C durante 2 horas, posteriormente se prepararon las láminas de Leuchart, se

agregó la parafina en los moldes y se colocó la muestra, esperando su solidificación.

Para el análisis histológico se realizaron cortes trasversales. Los cortes se

efectuaron en un micrótomo, se desparafinaron y después fueron hidratados y

aclarados con hipoclorito de sodio. Los mismos se colorearon con safranina al 1

%, se fijaron con gelatina glicerinada, según los procedimientos descritos por

Gattuso y Gattuso (1999) y Khandelwal (2004)

Para visualizar los diferentes caracteres anatómicos internos del vegetal se

empleó un microscopio Nikon Alphaphot-2 con cámara de video a color TK-C1380

JVC modelo TK-C1380U.

II.4. PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS

Los ensayos se realizaron siguiendo la metodología descrita por Miranda y

Cuellar (2000).

II.4.1 Humedad residual

Se empleó el método azeotrópico, las mediciones se hicieron por triplicado a

partir de 10 g de muestra, se utilizó un equipo Dean-Starkacoplado a un balón de 1

L. Como disolvente se empleó tolueno (anexo 3)

22

Expresión de los resultados.

Vt - V1

MH = x 100

Dónde:

H = Humedad residual (%)

V1 = Volumen de agua inicial (mL)

Vt = Volumen de agua final (mL)

100 = Factor matemático.

Los resultados se aproximan hasta las décimas.

II.4.2 Cenizas totales

Para el análisis se empleó una mufla modelo MLW Eliktro Modelo: 245.3E por

2 horas, las pesadas se realizaron en una balanza analítica marca Kern Modelo:

ABS-220-4. Cada determinación fue realizada por triplicado a partir de 2 g de

muestra, se utilizó ácido nítrico hasta obtener cenizas blancas (anexo 4).

Expresión de los resultados.

C: M2−M

M1−M x 100

Dónde:

C: porcentaje de cenizas totales en base hidratada

M: masa del crisol vacío (g)

M1: masa de crisol con la porción de ensayo (g)

M2: masa del crisol con la ceniza (g)

100: factor matemático para calculo

23

II.4.3 Sustancias solubles

Este ensayo se determinó por triplicado, a partir de 5g de la droga. Los

disolventes utilizados fueron agua y alcohol al 98 % (anexo 5).

Expresión de los resultados.

Ss: R. 500 x 100

M(100 −H)

Dónde:

Ss: sustancias solubles (%)

H: humedad de la muestra (%)

500 y 100: factores matemáticos para los cálculos

R: residuo de la muestra (g)

M: masa de la muestra (g)

II.5 IDENTIFICACIÓN DE LOS METABOLITOS POR TAMIZAJE QUÍMICO

El tamizaje fitoquímico se realizó a las hojas secas, según procedimiento

descrito por Miranda y Cuellar (2000).

Se utilizó un sistema de extracción con disolventes de polaridad creciente, a

partir del mismo material vegetal. La droga seca se extrajo sucesivamente con éter

di etílico, etanol y agua por 48 horas para obtener los extractos etéreo, alcohólico y

acuoso, los cuales se sometieron a diferentes ensayos (anexos 6 y 7).

24

II.6 CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA

Se realizó a los extractos etéreo, alcohólico y acuoso obtenidos de la

extracción sucesiva de las hojas. Se empleó una placa de 10x50 cm de silica gel G,

sobre soporte de aluminio.

El desarrollo cromatográfico fue de forma ascendente y se utilizó como fase

móvil la mezcla de: Hexano-Cloroformo-Acetato de etilo-Metanol (10:5:5:2,5)

Como revelador se empleó luz ultravioleta con una longitud de onda de

254nm.

II.7 OBTENCIÓN DEL ACEITE ESENCIAL

La obtención del aceite se llevó a cabo en el Laboratorio de Productos

Naturales para Investigación Docente y Estudiantil de la Facultad de Ciencias

Químicas. Se utilizó el método de hidrodestilación, en un equipo Clevenger. Se

empleó un balón con capacidad de 1000ml y se colocó 100g de material vegetal

fresco finamente cortado por cada extracción. El proceso se repitió varias veces

hasta obtener la cantidad de aceite necesario para las determinaciones físico

químicas. El rendimiento de aceite se calculó V/M (%). El aceite se separó de la

capa acuosa por decantación y se secó con sulfato de sodio anhidro.

II.8. ANÁLISIS DE LOS PARÁMETROS FISICOQUÍMICOS

Para la realización de las determinaciones físico-químicas del aceite esencial

se siguieron los procedimientos informados por Miranda y Cuéllar (2000). Todas las

determinaciones se hicieron por triplicado

25

II.8.1 Determinación del índice de refracción

Se llevó a cabo en el laboratorio de Análisis Orgánico de la Facultad de

Ciencias Químicas. Se empleó un refractómetro ABBE, el cual se ajustó inicialmente

con agua. Las mediciones se realizaron a 25° C. Se hacen tres lecturas y se

calcula el promedio de las mismas. Dos o más lecturas no deben diferir en

más de 0.002. Los valores se aproximan hasta las milésimas.

II.8.2 Determinación de densidad relativa

Se pesa el picnómetro de 10 mL vacío y seco a 25º C en una balanza

analítica marca Kern Modelo: ABS-220-4 y se llenó con el aceite esencial,

manteniéndolo a la temperatura de 25º C (± 1º C) durante 15 min., se ajustó

el líquido al nivel empleado. Se pesó cuidadosamente el picnómetro con el

aceite esencial y se repitió la operación con el agua destilada a 25º C,

después de limpio el picnómetro.

Expresión de los resultados:

La densidad relativa a 25º C se calcula por la siguiente fórmula:

D25=M1 - MM2 - M

26

Dónde:

M1: peso del picnómetro con la muestra (g)

M2: peso del picnómetro con el agua (g)

M: peso el picnómetro vacío (g).

Los resultados se aproximan hasta la tercera cifra.

II.8.3 Solubilidad en alcohol

Se midió con pipeta 1 mL de aceite esencial previamente enfriado a 20o

C, el cual se llevóa una probeta de 25 mL. Por medio de una bureta se añade el

alcohol de la graduación a ensayar gota a gota al aceite esencial, agitando con

frecuencia. Cuando se obtiene una solución límpida, se registra el volumen

consumido.

Expresión de los resultados.

Se informa que el aceite esencial es soluble en N volúmenes de alcohol de la

graduación ensayada, con aproximación de los valores hasta las décimas.

II.8.4 Análisis del residuo de evaporación

5,0 mL del aceite esencial se llevan a una cápsula previamente

tarada a 105º C, se evapora sobre baño de agua hasta que el residuo esté

aparentemente seco. Se pasa entonces hacia una estufa y se deja hasta

peso constante (aproximadamente 3 h). Se retira la cápsula de la estufa y se

coloca en una desecadora hasta que alcance la temperatura ambiente.

27

Para obtener la masa constante entre una pesada y otra se

mantendrá un tiempo de secado de 60 minutos.

Expresión de los resultados.

El residuo de evaporación, expresado en %, se calcula por la siguiente

fórmula:

Dónde:

Pr= masa de la cápsula más el residuo (g)

P= masa de la cápsula vacía (g)

V= volumen de la porción de ensayo.

100=factor matemático para el cálculo.

II.9 ANÁLISIS DEL ACEITE ESENCIAL POR EL SISTEMA ACOPLADO

CROMATOGRAFÍA GASEOSA-ESPECTROMETRÍA DE MASAS (CG-EM).

El aceite esencial obtenido fue analizado en un cromatógrafo de gases

Agilent 6890 acoplado a espectrómetro de masas 5973N, las condiciones de trabajo

fueron: columna Ultra 2 de 12 m x 0,20 mm x 0,33 µm, temperatura inicial: 60° C por

3 minutos incrementando 10° C/ min hasta 300° C por 5 min. Tiempo de corrida: 32

min. Espectrómetro de masas operado a 70 eV en modo full scan desde 50 hasta

600 unidades de masa. Temperatura de la fuente 230° C, temperatura del cuádruplo

150° C. Temperatura del inyector: 280° C, volumen de inyección 2 µL con gas

portador helio a 1 mL/min.

R =Pr

v

Px 100

-

28

Los compuestos fueron identificados por comparación de sus espectros de

masas con los contenidos en la espectroteca Wiley 9th con NIST 2011 MS Library,

considerando solo aquellos con un grado de coincidencia no menor a un 95%.

II.10 ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los datos se procesaron estadísticamente con la ayuda del programa

estadístico MINITAB 17.

29

CAPÍTULO III- RESULTADOS Y DISCUSIÒN

III.1. CARACTERIZACIÓN BOTÁNICA DE LA ESPECIE

La caracterización botánica del material vegetal es el primer aspecto que se

debe analizar en un estudio farmacognóstico, con el objetivo de establecer las

características macro y micromorfológicas de la especie objeto de estudio.

IIl.1.1. Evaluación macromorfológica de las hojas

La lámina foliar de consistencia coriácea, presentó un color verde oscuro

brillante por la haz, con superficie lisa; el envés pubescente de color verde claro,

forma elíptica, palminervia, bordes enteros, peciolada sin presencia de tricomas, de

base obtusa y ápice obtuso: se observan por el envés puntos de glándulas de

aceite.(figura6). Las características están en correspondencia con lo informado por

Royal Botanic Gardens, (2016)

Figura 6. Características macromorfológicas de las hojas

Con respecto a las dimensiones de las hojas en la población estudiada,

éstas mostraron una variación dentro de en un rango de 4,8 a 13,7 cm para el largo

y de 3,4 a 6,8 cm para el ancho (tabla II).

30

Tabla II. Análisis estadístico para las dimensiones de las hojas

ESTADÍSTICO LARGO ANCHO

Media X cm 8,64 4,69

Desviación Estándar SD 1,90 0,88

Varianza 3,62 0,78

Usando la herramienta estadística MiniTab se hizo un resumen gráfico de los

datos del largo y el ancho de las hojas de Pimenta racemosa obteniendo así los

valores de curtosis y asimetría.

Para los datos obtenidos con respecto al largo de las hojas los valores de

curtosis y asimetría muestran que existe una concentración alta de datos debajo de

la curva de normalidad.(figura 7). Además se realiza la prueba Anderson-Darling

para normalidad con un 95% de confianza y un marco de error del 5%, los

resultados arrojados muestran que los datos dellargo de las hojas se comportan

como una distribución normal.(figura8)

31

Figura 7. Histograma de frecuencia para el largo de las hojas

Figura 8. Gráfico de distribución para el largo de las hojas.

Con respecto al ancho de las hojas los valores de curtosis y asimetría

muestran que existe una concentración mediabaja de datos debajo de la curva

1er cuartil 7,1500

Mediana 8,5000

3er cuartil 9,8500

Máximo 13,7000

8,1009 9,1831

7,8000 9,2328

1,5904 2,3725

A-cuadrado 0,25

Valor p 0,717

Media 8,6420

Desv.Est. 1,9039

Varianza 3,6249

Asimetría 0,395239

Curtosis -0,071335

N 50

Mínimo 4,8000

Prueba de normalidad de Anderson-Darling

Intervalo de confianza de 95% para la media

Intervalo de confianza de 95% para la mediana

Intervalo de confianza de 95% para la desviación estándar

14121086

Mediana

Media

9,28,88,48,0

Intervalos de confianza de 95%

Informe de resumen de Altura

15,012,510,07,55,0

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

Media 8,642

Desv.Est. 1,904

N 50

AD 0,254

Valor p 0,717

Altura

Porc

enta

je

Gráfica de probabilidad de AlturaNormal

32

(Figura 9). Además,en la prueba de Anderson-Darling para normalidad con un 95%

de confianza y un marco de error del 5%, los resultados mostraron que los

valorespara el ancho de la hoja no presentaban una distribución normal (Figura 10)

Figura 9. Histograma de frecuencia para el ancho de las hojas

Figura 10. Gráfico de distribución para el ancho de las hojas.

1er cuartil 3,9000

Mediana 4,7000

3er cuartil 5,1000

Máximo 6,8000

4,4408 4,9432

4,1000 4,9000

0,7385 1,1017

A-cuadrado 1,01

Valor p 0,011

Media 4,6920

Desv.Est. 0,8841

Varianza 0,7816

Asimetría 0,495012

Curtosis -0,508244

N 50

Mínimo 3,1000

Prueba de normalidad de Anderson-Darling

Intervalo de confianza de 95% para la media

Intervalo de confianza de 95% para la mediana

Intervalo de confianza de 95% para la desviación estándar

6,45,64,84,03,2

Mediana

Media

4,84,64,44,24,0

Intervalos de confianza de 95%

Informe de resumen de Ancho

76543

99

95

90

80

70

60

50

40

30

20

10

5

1

Media 4,692

Desv.Est. 0,8841

N 50

AD 1,009

Valor p 0,011

Ancho

Po

rcen

taje

Gráfica de probabilidad de AnchoNormal

33

Los resultados obtenidos concuerdan con lo informado en la literatura por

Blanco Fernández y col, (2010) y Royal Botanic Gardens, (2016), quienes señalan

un rango entre 4-10 cm para el largo y 2,5-6 cm para el ancho, encontrándose los

valores obtenidos en este trabajo (8.64 cm largo y 4.69 cm ancho), dentro de este

rango de valores.

IIl.1.2. Evaluación micromorfológica

En la anatomía foliar a nivel de un corte transversal del nervio central (figura

11) se pudo observar que la superficie abaxial es totalmente cóncava y la adaxial

ligeramente convexa. En la parte más interna del nervio central se pudo apreciar

que el mismo está ocupado por gran cantidad de haces conductores (HC) que

asemejan las formas de radios medulares en dirección dorsiventral, rodeados por un

periciclo de células parenquimatosas (Pa). Más próximo a la superficie inferior del

nervio se visualiza el colénquima (Co) y la epidermis abaxial (EAb).

En la estructura de los brazos laterales (BL), se observó el tejido epidérmico

en su parte adaxial (EAd) conformado por un estrato de células. Seguidamente y por

debajo de esta epidermis se encuentra el tejido parénquima en empalizada (PE).

Figura 11. Detalles micromorfológicos del nervio central de Pimenta

racemosa(Mill) J.W. Moore

34

BL: brazos laterales; PE: parénquima en empalizada;EAd: epidermis adaxial;

Co: colénquima; HC: haces conductores; EAb; epidermis abaxial

En la figura 12 muestra varias secciones ampliadas de uno de los brazos laterales.

En la figura 12A la epidermis adaxial (EAd) conformada por un estrato de células

tabulares, a continuación, un tejido en empalizada (PE) de células columnares. En

la figura 12B el colénquima (Co) formado un conglomerado de células casi

redondeadas. También se aprecian glándulas, contenedoras de aceite esencial y

algunos cristales de oxalato de calcio (Glan) (figura 12C).

A B C

Figura 12. Secciones ampliadas de los detalles micromorfológicos de Pimenta

racemosa

A: porción de un brazo lateral; B: células del tejido colénquima;C: cristales de oxalato de

calcioEAd: epidermis adaxial; PE: parénquima en empalizada; Co: colénquima;Glan:

glándulas de aceite esencial.

Los resultados obtenidos para las características micromorfológicas, no se

encuentran descritos en la literatura consultada.

35

III.2. DETERMINACIÓN DELOS PARÁMETROS FÍSICO QUÍMICOS

Otro aspecto abordado en el estudio de la especie fue el establecimiento de

los parámetros físico-químicos de la droga vegetal. Los resultados se presentan en

la tabla III.

Tabla III. Parámetros físico químicos determinados a las hojas de

Pimenta racemosa.

PARÁMETRO

Valor

medio X DS CV

HUMEDAD RESIDUAL (%) 13,97 0,00 0,00

CENIZAS TOTALES (%) 8,33 0,21 2,50

SUSTANCIAS SOLUBLES EN ALCOHOL (%) 19,59 0,27 1,38

SUSTANCIAS SOLUBLES EN AGUA 18,21 0,69 3,78

El contenido de agua en la planta es uno de los aspectos críticos y resulta

ser un parámetro clave para la conservación de la droga.Se puede determinar por el

método azeotrópico o por el método gravimétrico, siendo el primer método usado

cuando existe presencia de sustancias volátiles, nombrándose también como

humedad residual. Para este parámetro las Normas y Farmacopeas establecen,

dependiendo del órgano vegetal, un contenido entre 8 y 14% (Claus, 1985, WHO,

1998).

En el análisis efectuado a las hojas de P. racemosa el resultado obtenido de

contenido de humedad fue 13,97% encontrándose dentro de los valores de

referencia en la literatura,pero se considera algo elevado, aunque por el hecho de

contener las hojas aceite esencial y haber utilizado el método de secado a

temperatura ambienteunido a las características coriáceas de las hojas, puede

haber influido en la baja eliminación de agua de las mismas.

En cuanto a las cenizas son las que indican la calidad del material con el que

se trabaja y es una base importante para poder juzgar la pureza y la identidad

36

dedicho material. Por otra parte brindan información sobre la posible adulteración

de la droga con materias inorgánicas o cuerpos extraños, aunque también esto

depende de la composición en minerales de los suelos (Miranda y Cuéllar, 2000).

Las Normas y farmacopeas establecen un índice de cenizas totales en frutas

y hortalizas que está comprendido entre 2 - 12%.(Lou Zhi-cen, 1980; WHO 1998).

El análisis realizado de cenizas totales al material vegetal dio como resultado

un porcentaje 8,34 % que se encuentra dentro del rango establecido, aunque se

señala que en los casos de valores elevados se deben realizar otros estudios para

descartar la presencia de metales pesados, lo cual no pudo realizarse en este

trabajo.Finalmente se realizó el análisis de las sustancias solubles en agua y etanol

al 98 % y los resultados indican que los porcentajes de sustancias solubles no

difirieron mucho, es decir que la planta contiene tantas sustancias solubles en agua

como en etanol.

lll.3 TAMIZAJE FITOQUÍMICO

En la tablaIV se muestran los resultados del tamizaje fitoquímico realizado a

los extractos etéreo, alcohólico y acuoso de las hojas de la planta, donde se

muestra la alta variabilidad de compuestos presentes en las hojas de Pimenta

racemosa, se destacan entre estos compuestos: aceites, grasas, triterpenos-

esteroides, lactonas, coumarinas, flavonoides, fenoles, taninos, catequinas,

quinonas, antocianidina, saponinas y compuestos reductores.

Al analizar los resultados obtenidos en el tamizaje fitoquímico realizado a

cada extracto se comprobó que están en concordancia con los obtenidos por

Contreras y col (2014), donde se reveló la abundante presencia de compuestos

fenólicos (taninos, flavonoides y quinonas), así como tambiénla presencia de

saponinas y ausencia de alcaloides.

37

Tabla IV. Tamizaje fitoquímico de las hojas de Pimenta racemosa

EXTRACTO ETÉREO

ENSAYO METABOLITO RESULTADOS

Sudán Aceites y grasas +

Dragendorft Alcaloides -

Baljet Lactonas y cumarinas -

Liebermann-Buchard Triterpenos-esteroides +

EXTRACTO ALCOHÓLICO

Baljet Lactonas y coumarinas +

Dragendorft Alcaloides -

Liebermann-Buchard Triterpenos-esteroides -

Fehling Compuestos reductores +

FeCl3 Fenoles y Taminos ++

Espuma Saponina -

Resina Resina -

Ninhidrina Aminoácidos -

Liebermann-Bouchard Triterpenos-esteroides -

Shinoda Flavonoides +

Catequina Catequinas +

Bontraguer Quinonas +

Antocianidinas Antocianidina +

EXTRACTO ACUOSO

Fehling Compuestos reductores +

Dragendorft Alcaloides -

FeCl3 Fenoles y taminos +

Espuma Saponina +

Shinoda Flavonoides +

Leyenda: El signo + representa una respuesta positiva para ese metabolito en el

extracto

38

III.4 CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

A los extractos analizados en el tamizaje fitoquímico se les realizó la

cromatografía en capa delgada. La determinación delos valores Rf depende de la

polaridad del compuesto la cual está determinada por el número y naturaleza de los

grupos funcionales presentes; también dependerá de la naturaleza del disolvente a

utilizar. Los resultados del Rf (tabla V) revelan que los compuestos químicos del

extracto acuoso son muy polares por esta razón se ven retenidos al inicio de la

corrida ya que se absorben más firmemente a los centros activos de la fase

estacionaria, por otro lado el extracto etéreo es muy poco polar se eluye con mayor

facilidad y su mancha se observa en el frente del disolvente, en el extracto

alcohólico se observan tres diferentes machas a diferentes valores Rf (Figura13)

Figura 13. Cromatografía en capa delgada de los extractos del tamizaje

39

Tabla V. Valores Rf de las machas obtenidas en cada extracto

EXTRACTO Rf

ETERO 0,9

ALCOHOLICO

0,03

0,1

0,97

ACUOSO 0,3

Es importante señalar que las manchas observadas sólo fueron aquellas que

revelaron a la luz UV, ya que no se contaba con las condiciones de revelar con

sulfúrico y calor.

lll.5OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DEL ACEITE ESENCIAL

III.5.1 Rendimiento de aceite esencial

Como resultado de 13 destilaciones por hidrodestilaciónse obtuvo un valor

promedio de rendimiento de 1,3 ml de aceite de cada 100 g en un tiempo de 2,5

horas. Estos resultados son ligeramente superior al obtenido por Calderón Gómez y

col (1969),quienes informaron un rendimiento de 1 ml del aceite.

III.5.2Constantes físico-químicas del aceite esencial

Los resultados obtenidos para los parámetros físico-químicos del aceite

esencial se presentan en la tabla VI.

40

Tabla VI.Parámetros físico-químicos del aceite esencial

PARÁMETROS X SD CV

ÍNDICE DE REFRACCIÓN 1,555 0,005 0,32

DENSIDAD RELATIVA d20 0,9436 0,001 0,105

RESÍDUO DE EVAPORACIÓN (g) 0,006 0,000 0,000

SOLUBILIDAD EN ETANOL

(v/v)

70% Insoluble en 10 ml

80% Soluble en 4 ml

Para el índice de refracción se obtuvo como resultado 1,555 que es cercano

a lo descrito por Calderón Gómez y col (1969), en el cual se indica que el índice de

refracción del aceite de Pimenta racemosa es de 1,539. Sin embargo para la

densidad relativa el valor obtenido 0,9436 no coincide con lo descrito por este autor,

quien reporta un valor de 1,659.

En este sentido es importante recalcar que algunos autores han señalado

que el aceite esencial de P. racemosa está constituida por dos fracciones, una

menos densa y otra más densa que el agua. En este trabajo, la fracción más densa

no fue detectada y el valor de densidad encontrado responde al de un aceite

esencial menos denso que el agua.

El valor obtenido para el residuo de evaporación fue de 0,006 g (6 mg) pero

para este parámetro no se encontró información en la literatura consultada.

El aceite esencial resultó ser insoluble en 10 volúmenes de alcohol al 70%,

pero al realizar el ensayo con el alcohol al 80% 1 ml de éste resultó ser soluble en 4

volúmenes del alcohol. En este caso, los resultados también difieren de los

informados por Calderón Gómez y col (1969),el cual indica que 1ml de aceite se

disuelve en 1,8 ml de alcohol etílico al 70%.

41

Respecto a las propiedades físico-químicas del aceite esencial, no se

encontraron otras referencias en la literatura

III.6 ANÁLISIS POR CG-EM

En el cromatograma gaseoso analítico del aceite esencial de Pimenta

racemosa, se presenta en la figura 14.

Figura 14. Cromatograma gaseoso analítico del aceite esencial de P. racemosa

Se registraron un total de 33 picos cromatográficos de los cuales el pico

cromatográfico 19 con tiempo de retención de 11,60 min. y el 16 con tiempo de

retención de 7,71 min, fueron los de mayor intensidad, mientras que el pico

cromatográfico 4, con tiempo de retención 2,96 min., presentó una abundancia

relativa media.

2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

9000000

1e+07

1.1e+07

1.2e+07

1.3e+07

1.4e+07

1.5e+07

1.6e+07

1.7e+07

1.8e+07

Time-->

Abundance

TIC: PIMI.D

3332313029

2827262524

23222120

19

1817

16

15

14

13

12

11

10

9

8765

4

3

21

42

En la tabla VII, se reflejan los constituyentes identificados, sus tiempos de

retención y sus abundancias relativas.

Pudo observarse que de los 33 compuestos a los que se le asignó

estructuras por la base de datos del equipo, 10 corresponden a hidrocarburos

monoterpénicos, seis a hidrocarburos sesquiterpénicos y 12 a compuestos

oxigenados en su mayoría aromáticos.

Los componentes mayoritarios del aceite esencial fueron el metil-eugenol

con 39,67 % de abundancia relativa y el estragol con 37,60 %, ambos compuestos

aromáticos; el mirceno, hidrocarburo monoterpénico, presentó un 9,27 % de

abundancia y el 1,8-cineol, limoneno y linalol, fueron los otros tres compuestos con

abundancia relativa superior a uno (3,55; 2,13; y 1,98; respectivamente).

Para la especie P. racemosa, se han informado cinco variedades: racemosa,

grisea, hispanoliensis, ozua y terebenthina, las cuales son endémicas de algunas

áreas del Caribe Tucker et al, (1991). De ellas, la variedad racemosa ha sido la más

cultivada y su aceite esencial comercializado. Sin embargo, de acuerdo al origen

geográfico, la composición de este aceite esencial puede variar fundamentalmente

de los compuestos mayoritarios, señalándose los siguientes compuestos para

algunos aceites comerciales: eugenol + isoeugenol (33,8-56,2%), mirceno (13,9-

31,6) y chavicol (8,9-21,6%) (Bello et al., 1995; Bello et al., 1998; Jirovetz et al.,

2007; Huelvas y Mora, 2009), otros reportes de aceites comerciales señalan al

metil-eugenol, -cariofileno y α-humuleno como mayoritarios (Ayedoun et al., 1996;

Alitonou et al., 2012).

Para aceites esenciales no comerciales, estos mismos autores han

planteado que han sido variadas las composiciones informadas, pudiendo dominar

como mayoritarios el estragol y el metil- eugenol; el metil-eugenol (43,1%), estragol

43

(31,6%) y el mirceno (12,0%) y en otros se observó como componentes mayoritarios

el geraniol (53,2%) y el nerol (32,6%).

Leyva et al, (2007), señala sin embargo, otra composición para el aceite

esencial obtenido en Pinar del Río, Cuba, donde ya no son los compuestos

aromáticos los mayoritarios del aceite sino los terpenoides, informando una

composición donde son predominantes el terpinen-4 ol (20,7%), el 1,8-cineol

(β0,4%), el eugenol (10,7 %), el chavicol (10,1%) y el α-terpineol (10,0%).

Contreras-Moreno, (2014), para el aceite esencial obtenido de P. racemosa

que crece en Mérida, Venezuela encontró que los componentes mayoritarios eran

eugenol (48,7%), 1,8-cineol (12,7%) y limoneno (13,7%).

Tabla VII. Constituyentes identificados en el aceite esencial de P. racemosa.

Pico No TIEMPO

RETENCIÓN (min) COMPUESTO

% ABUNDANCIA

RELATIVA

1 2,079 α-felandreno 0,036

2 2,178 α-pineno 0,179

3 2,685 1-octen-3-ol 1,037

4 2,956 Mirceno 9,270

5 3,05 n-octanol 0,118

6 3,126 α-felandreno isom 0,234

7 3,316 α-terpineno 0,119

8 3,453 p-cimeno 0,272

9 3,576 Limoneno 2,134

10 3,627 1,8-cineol 3,550

11 3,837 Trans- -ocimeno 0,230

44

12 4,07 -terpineno 0,172

13 4,681 2-careno 0,231

14 4,948 Linalool 1,980

15 6,839 Terpinen-4-ol 0,755

16 7,714 Estragol 37,603

17 10,498 Eugenol 0,451

18 10,809 α-copaeno 0,058

Tabla VII. Cont…

Pico No TIEMPO

RETENCIÓN (min) COMPUESTO

% ABUNDANCIA

RELATIVA

19 11,602 Metil-eugenol 39,677

20 12,06 α-humuleno 0,100

21 12,426 Germacreno-D 0,266

22 12,725 α-farneseno 0,252

23 12,955 δ-cadineno 0,112

24 13,332 elemicina 0,062

25 13,487 ni 0,118

26 14,425 ni 0,164

27 14,574 Murulool 0,152

28 15,914 ni 0,222

29 17,7 ni 0,125

30 17,897 1-hexanone,1-(3-(4-metil-3-

pentenil)-3-ciclohexen-1-il) 0,073

31 18,036

(E,E)-7,11,15-trimetil-3-

metileno-hexadeca-

1,6,10,14-tetraeno

0,047

45

32 18,174 4-(4'-metil-3'-pentenil)-3-

ciclohexenil pentil cetona 0,177

33 19,998 ni 0,025

Estas observaciones demuestran la gran variabilidad que presenta en su

composición química el aceite esencial de P. racemosa, dependiendo de la zona

climática donde se ha realizado su estudio.

En este trabajo el metil-eugenol (39,67%) y el estragol (37,60%), fueron los

componentes mayoritarios, seguidos del mirceno (9,27%), el 1,8-cineol (3,55%) y el

limoneno (2,13%). Estos resultados son similares a los informados por Tucker et al,

(1991).

46

CONCLUSIONES

De acuerdo a los resultados obtenidos se pudo arribar a las siguientes

conclusiones:

• Mediante el análisis farmacognóstico realizado a las hojas de Pimenta

racemosa. (Mill) J.W. Moore, colectadas en la ciudad de Guayaquil, provincia

del Guayas (Ecuador) se pudieron establecer las características macro

morfológicas de la especie, las cuales coinciden con lo informado en la

literatura.

• Se informaron por primera vez, para la especie, las características

micromorfológicas y los parámetros de calidad de la especie Pimenta

racemosa.

• Para el aceite esencial obtenido mediante el método de hidrodestilación se

obtuvo un rendimiento de 1,3 ml el cual fue superior al informado en la

bibliografía. Se establecieron algunos parámetros de calidad para el aceite

esencial, los cuales se encuentran dentro del rango reportado.

• El análisis de la composición química del aceite esencial utilizando el

sistema acoplado CG-EM, permitió identificar al metil-eugenol (39,67%) y el

estragol (37,60%), como los componentes mayoritarios, seguidos del

mirceno (9,27%), el 1,8-cineol (3,55%) y el limoneno (2,13%). Los cuales se

corresponden con lo informado para P. racemosa var. racemosa

47

RECOMENDACIÓN

Profundizar en el estudio del aceite esencial analizando la influencia del

método de extracción en la composición química

48

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55

ANEXOS

ANEXO 1. FOTO DE LA RECOLECCIÓN

56

ANEXO 2. CARACTERIZACIÓN BOTÁNICA DEL HERBARIO GUAYAS

57

ANEXOS 3 EQUIPO Humedad Residual

ANEXO 4 CENIZAS

58

ANEXO 5 SUSTANCIAS SOLUBLES

59

ANEXO 6

DESTILACION POR ARRASTRE DE VAPOR

60

ANEXO 7 Y 8 ESQUEMAS DEL TAMIZAJE FITOQUÍMICO

61

62