Entre las ciencias terica y tcnica existe una relacin dialctica. La teora busca el conocimiento de las leyes generales de la naturaleza a partir del estudio detallado de numerosos fenmenos, en tanto, la tcnica persigue el objetivo de convertir esos conocimientos en instrumentos prcticos vinculados directa o indirectamente a la produccin material.

Esta interaccin se ha hecho tan evidente en las ltimas dcadas, con la aparicin de la revolucin cientficotcnica, que ha llevado a formular la tesis de la conversin de la ciencia en una fuerza productiva; pero existe tambin la relacin inversa, o sea, los avances tecnolgicos tambin contribuyen, de forma considerable, al desarrollo de la ciencia terica con la produccin de instrumentos que alcanzan cada vez un grado ms elevado de perfeccin y que sirven para profundizar an ms en el conocimiento de la naturaleza. A esta situacin no escapan algunos campos, al parecer tan alejados, de la vida prctica como la gentica molecular.

Existen muchos ejemplos de como en los ltimos 40 aos, el desarrollo tecnolgico ha conducido a gigantescos pasos de avance en el conocimiento de la biologa molecular. La difraccin de rayos X permiti a los investigadores tener una visin detallada de la estmctura de las macromolculas, ascomo la tcnica de centrifugacin en gradientes de densidad de CsCl abri las puertas al conocimiento del mecanismo de replicacin del ADN. La adquisicin ms reciente lo constituye la tcnica para unir molculas de ADN in vitro,denominada tecnolw'a del ADN recombinante. Esta tcnica bsica y sus mltiples variantes han revolucionado el estudio de la gentica de los eucariontes y ha proporcionado fuentes de protenas especficas en cantidades consideradas anteriormente casi imposible.

En este captulo se estudiarn los procedimientos generales de esta tecnologa y algunas implicaciones de sus procedimientos, en especial aqullos que ms vinculados estn con la prctica mdica. No se pretende, ni mucho menos, hacer un anlisis pormenorizado de este tema,qne por lodems esten constante crecimiento,ni siquiera dar una descripcin de sus mltiples procedimientos. El objetivo principal es dar a los lectores una idea de cmo estos conocimientos del nivel molecular de la biologa pueden ser utiluados en la prctica.

Piocedimiento general Existen numerosos procedimientos para la manipulacin de los genes, de acuerdo con los objetivos que se persigan. Un procedimiento general para la

Obtencin de genes especficos El mayor impacto de esta tecnolg'a fue sobre los mecanismos de las clulas eucariotas,

por eso slo se har referencia a la obtencin de genes eucariontes en forma simplificada, pues en ocasiones, la complejidad del proceso rebasa los lmites de este texto.

El primer intentodeobtencin de ungen eucariontefue directamente de laclula; se extraan las molculas de ADN y seexponan a la accin de una enzima de restriccin; los fragmentos quese obtenan solanser muy grandes y eranecesario volver afragmentarlos medianteunaendonucleasa con especificidad diferente a la primera; esto poda repetke varias veces basta obtener fragmentos de tamao adecuado para su manipulacin. El estudio de los puntos de corte de varias enzimas sobre una molcula de ADN origina los h d o s m a p a s de restriccin, queconsisten en la representacin dela molcula de ADN, sealando los puntos donde es cortada por cada una de las endonucleasas ensayadas; cuando se tem'a el fragmento deseado se proceda a su insercin en un vector. Pero este procedimiento no dio los resultados esperados; a partir de experiencias de este tipo fue que quedaron establecidos el carcter disconnuo de los genes eucariontes y la existencia de los intrones; estas caractersticas entorpecan la expresin de los genes eucariontes en bacterias.

El segundo procedimiento consisti en aislar no al geu,sino al ARNm transcrito a partir de l, para ello generalmente se seleccionaba una clula especializada en la sntesis de determinada protena, de manera que la concentracin del ARNm fuera lo ms elevada posible, por ejemplo, los reticulocitos para el ARNm de la globina, las clulas P del pncreas para ARNm de insulina, etctera. Este proceder tiene la ventaja de que ya han sido eliminados los intrones. Para la obtencin del gen se incuban el ARNm con los 4 dNTP y una enzima que se obtiene de retrovirns, que es capaz de formar una molcula de ADN tomando como molde una de ARN, por lo cual se le ha denominado

ADN comolementario (ADNcL en el cual se conserva la informacin necesaria Dara la . ,

sntesis de protenas, pero se han eliminado los intrones y, por lo tanto, no se requiere del procesamiento del transerito primario.

El tercer procedimiento consiste en hacer la sntesis artificial del gen; en estos casos se parte de la kuencia de aminocidos del pptido, pues la sntesis de ADN muy largos no ha sido posible an, y se deduce la secuencia de bases del ADN mediante el cdigo gentico.

Esta secuencia no necesariamente es igual a la del gen natural debido al carcter degenerado del cdigo. Por procedimientos complicados de sntesis artificial se logra una copia del gen con la secuencia de bases especficas.

Para el proceso de recombinacin Ni vitroson necesarias las enzimasde restriccin, que ya fueron estudiadas en el captulo 33. A los efectos de este procedimiento se tendrn en cuenta slo 2 tipos de enzimas, aqullas que al producir el corte sobre las 2 hebras del ADN lo hacen de forma que originan pequeos fragmentos monofbrilares, y las que cortan en el mismositio las2 hebras sin dejar en el producto este tipo de fragmento; esta distincin se hace porque, de acuerdo con el tipo de enzima empleada, el procedimiento que se debe seguir ser diferente.

En el primer caso se opera de la forma siguiente: se extrae el ADN de la clula y se digierecon una enzima de reshiccin,sea laEcoR1,deesta formase obtienen numemros fragmentos. El vector que se va a emplear se digiere igualmente con la misma enzima; se trata de que el vector empleado slo tenga un sitio sensible a la accin de la endonucleasaempleada; despnsse incuban juntas las 2mnestras de ADN para permitir su recombinacin y se aade ADN ligasa para sellar las brechas y dejar la molcula insertada en el vector (Fig. 35.2).

En el segundo caso se requiere de una enzima que es algo excepcional y que se obtiene de algunos tejidos animales, se trata de la nuclwtidil transferasa terminal, la cual es una ADN polimerasa que aiiadedesoxinucletidos (a partir de WTP) al exiremo 3 ' - 0 H de un fragmento de ADN de cadena simple, con el hecho sobresaliente de que no requiere un molde para su accin. Componentes celulares y Genetica moiacuiar 591

La recombinacin in vitrotambin ha permitido un modo relativamente fcil para la obtencin de genes. En ocasiones es ms sencillo trabajar con el genomacompleto que con un gen particular, sobre todo si este ltimo es desconocido; eso se logra de la forma siguiente: se extrae el ADN celular y se corta en fragmentos, utilizando enzimas de restriccin en fases sucesivas hasta que los fragmentos tengan un tamao de fcil manipulacin, estos fragmentos se aslan unos de otros y cada uno es recombinado con un ADN viral, generalmente de fagos. Las colonias de fagos bien identificadas se conservan, y pueden servir para la identificacin de genes especficos; a esta coleccin del genoma de una clulaen fragmentos guardados en vectores especficos, casi siempre en virus, se le da el nombre de genoteca.

Cmo buscar un gen en una genoteca? Existen varios procedimientos pero slo se har referencia a uno de ellos, un ejemplo hipottico ser ms ilustrativo. Suponga que un tipo de bacterias sintetizaunasustancia P& que es necesaria para so crecimiento y reproduccin, se obtiene un mutante de fenotipo Pq, que no sintetiza esa sustancia; si se tiene una genoteca de la bacteria Pq+ se puede aislar el gen mutado, para ello haga crecer las bacterias Pq-en varias colonias aadiendo al medio de cultivo la sustancia Pq, luego infecte cada una de las colonias con un virus de la genoteca portador de un fragmento del ADN. Si se elimina la sustancia Pq del medio de cultivo, slo podrn crecer aquellas bacterias que han incorporado de la genoteca el gen mutado. Como el fragmento est identificado puede fragmentarse con enzimas de restriccin y hacer una suhgenoteca, que vuelve a probarse en otros cultivos, y as sucesivamente hasta obtener el gen que se busca. Por un procedimiento similar a ste se pudo descubrir y aislar el oncogen ras.

Otros procedimientos de recombinacin in vitro no sern discutidos.

En el acpite anterior se him referencia a los vectores; se entiende por vector a una molcula de ADN que se emplea para introducir el gen deseado en una clula. Para que un vector sea til debe reunir las condiciones siguientes:

1. Debe ser cauaz de reolicarse. 2. Debe existir algn procedimiento para detectar su presencia. 3. Debe haber alguna forma de introducir el vector en una clula.

Los 3 tipos fundamentales de vectores empleados en estos procedimientos y que, por lo tanto, cumplen estos requisitos son los plsmidos, algunos virus- especialmente los hacterifagos- y los llamados cromosomas artificiales de levadura.

Los plsmidos son molculas circulares de ADN extracromosmico encontradas en muchas bacterias y en algunas especies de eucariontes. Muchos plsmidos contienen genes que son esenciales en determinados medios; por ejemplo, los plasmidos del tipo R contienen genes que aportan a la clula la resistencia a determinadosantibiticos, que pueden aparecer en el medio por accin humana o por la presencia de otros microorganismos que los producen. Los pIsmidos de ste y otros tipos son generalmente identificados por los genes que portan, sin embargo, en ocasiones, el plsmido es encontrado de manera accidental como una peqnea molcula circular de ADN presente en una muestra aislada de un extracto celular.

Los plsmidos tienen por lo regular una sola molculade ADN, cuyopesomolecular est entre lo6 para los menores y 108 para los mayores.

Los plsmidos slo pueden replicarse dentro de su propia clula, pero la forma en que lo hacen no es necesariamente igual a la que se utiliza en los cromosomas, incluso 2 plsmidos de una misma clula pueden tener formas distintas de replicacin. Se pueden distinguir 2 tipos de plsmidos de acuerdo con el control de su replicacin: los de control estricto y los de control relajado; los del primer tipo existen en muy pocas copias por clula y su replicacin se realiza junto con el ADN cromosmico, y al dividirse la clula se reparten de forma equitativa entre las 2 clulas hijas, y los del segundo tipo existen en un nmero mayor y su replicacin es independientede la del Componenees celulares y Gen6tica molecuiar 593

Fig. 35.4. Mecanismo de la penetracin de un virus. Los virus se fijan a la pared de las clulas bacterianas e inyectan su material gentico al interior de la clula. en tanto, las protenas que forman la cubierta de virus se quedan en el exterior; esta hace que los virus puedan ser utilizados dicientemente como veetores en las experiencias de ADN recombinante.

ADN cromosmico. Si se inhibe la sntesis de protenas, estos plsmidos se multiplican rpidamente y pueden llegar a haber cientos por clula por lo que son preferidos para ser empleados como vectores.

Muchos plsmidos pueden transferir una rplicade ellos desde una clula donante a una receptora; por ejemplo, si una sola clula de E. co que contiene el plsmidoF se aade a un cultivo de clulas tipo F- que no contengan el plsmido, despus de varias generaciones una gran proporcin de clulas contendr el plsmido F, o sea, se ha realizado la transferencia de una rplica del plsmido F, de una clula F' a una clula F-,sin que la clula inicial haya perdido el suyo. Como despus de la transferencia,F se replica, con cada transferencia aparecen ms clulas donantes y como el fenmeno ocurre 1 a 2 veces por generacin, el plsmido se propaga rpidamente en el cultivo. Estas caractersticas de los plsmidos, as como su posibilidad de conjugacin (captulo 31) hacen de ellos unos magnficos portadores de genes para la tecnologa del ADN recombinante.

Los dems vectores ms empleados son los virus, stos se encuentran formados por una molcula de ADN y una cubierta de protena$. Cuando un virus se aade a un cultivo bacteriano, ste se fija a la pared celular e inyecta su ADN al interior, en tanto, las protenas de la cubierta quedan fuera, como se muestra en la figura 35.4.

Dentro de la clula el virus utiliza el aparato metablico de sta para la replicacin de su ADN y la sntesis de las protenas virales, de manera que con un solo virus que penetre en una clula pueden obtenerse cientos de copias del ADN viral, que despus puede recuperarse con relativa facilidad.

Los cromosomas artificiales de levadura son grandes molculas de ADN, que se construyen con los centrmeros y los telmeros de cromosomas de levaduras y segmentos de ADN extrao; tambin contienen las secuencias necesarias para la replicacin. El criterio de seleccin del vector est determinado esencialmente por el tamao del gen deseado. Los plsmidos son capaces de acomodar los genes ms pequeos, en tanto los cromosomas artificiales de levadura acomodan los de gran tamao y los virus,los de tamao intermedio.

Una vez que el gen deseado ha quedado incorporado al vector, ste debe ser transferido al interior de unaclula, locual en el caso de los plsmidos puede hacerse mediante sales de calcio que aumenten la permeabilidad de las membranas de Las clulas hacterianas.

En el interior de la clula el ADN se replica muchas veces, por lo que se originan numerosas copias del gen deseado, o sea, el gen ha sido clonado.

Si el gen no es muy grande puede realizarse la clonacin in vitro mediante el procedimiento de la reaccin en cadena de la polimerasa; para ello es necesario contar con 2 pequeos oligonucletidos que sean complementarios a los extremos 5 ' del gen, los cuales tendrn la funcin de servir de iniciadores; se procede de la forma siguiente: el ADN se calienta a una temperatura de aproximadamente 94 T para provocar su desnaturalizacin, despus se aaden los oligonucletidos j se enfra lentamente hastaunas56 "C,para permitir la hibridacin de los oligonucletidos a los extremos 5 ' de las 2 hebras del ADN desnaturalizado; entonces se aade una A D S polimerasay la temperaturaseeleva a 72 'C para realizar la elongacin del iniciador.

En la actuadad todos los componentes del sistema, incluyendo los 4 desoxinuclesidos M&tad~se~Smiultneamente,pne~seublizalaenzimaTaq,e>madadel Temwph~~ aquaticus, que es resistente a los cambios de temperatura. Existen equipos que hacen todo el procedimiento de manera automtica. El primer ciclo demora casi 90 segundos, pero para los siguientes pueden utilizarse entre 50 y 60 segundos; se debe tener presente que en cada ciclo, el nmero de molculas de ADN presentes se duplica, por lo cual existe un crecimiento exponencial del tipo 2", donde n es el nmero de ciclos. Por este procedimiento pueden obtenerse numerosas copias del gen en escasos minutos.

Identicaein del gen pec0mbinado El plsmido ms empleado para la clonacin es el pBR322 de E. coli, que tiene un

peso molecular de 2,9 x lo6 y porta los genes para la resistencia a la tetraciclina (tet) y a la ampicilina (amp), por lo que las bacterias que contienen el plsmido pueden ser detectadas al ponerlas acrecer en un medio que contenga esos antibiticos. Adems, este plsmido presenta 7 sitios de restriccin para otro tanto nmero de enzimas.

El mtodo ms empleado para detectar el plsmido recombinante es el llamado inactivacin por insercin. Los sitios para las enzima. BamHI y Sal1 estn dentro del gen tet, luego si se produce la recombinacin utilizando cualquierade estaF enzimas, el plsmido se torna amp' y tet-, o sea, ha ocurrido una inactivacin del gen tet por la insercin del ADN que queremos donar.

El procedimiento en lneas generales es como sigue: el gen deseado se inserta en el gen tet del plsmido pBR322 y ste se aade a un cultivo de E. colique sea amp- tet. Despus de esperar un tiempo adecuado para permitir la penetracin del plsmido, las clulas se transfieren a un medio que contiene cicloserina y tetraciclina. La cicloserina mata a las clulas que crecen, se multiplican y que son resistentes a la tetraciclina. Las quecontienen el plsmido recombinado no pueden crecer por la presencia de tetraciclina en el medio; despus de un tiempo prudencial las clulas se lavan y se cambian a un medio que contiene ampbilina, antibitico al cual las clulas son resistentes.

Por este procedimiento sobreviven las clulas amp' tet-, que son precisamente las que contienen el plsmido recombinado (Fig. 35.5)

+ + amp tet

am; tet ?, m p - tet

+ * amp tet amp te1

+ amp tet

smp tct

Fig. 35.5. Ideiitiiiiarin del plsniido ~.ecombinado. Si empleamos un plsmido que tiene los genes ,>ara la resistencia a la tetraciclina (tet) y a la ampicilina (amp), o sea, es de tipo tet'amp; Y el D S de iiuestro inters se incorpora en la zona del gen tet, se origina un plsmido que es tet aiiip-. Si este plsmido rciombinndo sc introduce en una bacteria que sea te t amp, la Iiiirtci.ia re torna ter amp*. Estas baeteriasse exponen a la accinsimultneadela tetraciclina ! la cicloseriiia. Como las bacterias que sean tet* crecen y se multiplican, la cicloserina las iiiata. en tanto. las ter, como presentan una inhibicin de su crecimiento, na son afectadas por la cicloserina. Si despus las bacterias sobrevivientes se pasan a un medio que contiene ampicilina, slo quedarn aqullas que sean resistentes y, par lo tanto, sean ter amp*, que son las que han incorporado el plsmido recombinada.

Problemas en la produccin de protenas eucariontes La utilizacin de bacterias para la produccin de protenas de eucariontes origina

los problemas siguientes:

1. Las ARN polimerasas bacterianas no reconocen los promotores de eucariontes. 2. Los ARNm transcritos de genes eucariontes no contienen en el extremo conduc-

tor la secuencia rica en purinas, que permite a los ARNm de procariontes unirse especficamente al ribosoma.

3. Las protenas eucariontes sufren modificaciones postraduccionales especficas. 4. Las bacterias contienen proteasas que reconocen como extraas las protenas

eucariontes y las bidrolizan.

Los problemas 1 y 2 pueden eliminarse si el gen se une previamente a un promotor bacteriano, por ejemplo, el promotor del opern lac.

El procesamiento de las protenas en general se realiza in vitro. La proteccin contra las proteasas se logra en ocasiones por la obtencin de bacterias mutantes, que carecen de esa actividad especca, o por el empleo de inhibidores. Aun as, no es fcil lograr todas las condiciones requeridas para un caso especfico, de ah que el nmero de experiencias exitosas no sea aun muy elevado.

Expresin de genea donados

Para la expresin de los genes clonados es necesario que stos sean transcritos y traducidos, para eso debe constmirse el llamado vector de expresin.

Si el vector utilizado en la clonacin contiene un promotor cerca del sitio de insercin, este promotor puede ser usado, pero en muchos casos el vector carece del promotor adecuado, entonces es necesario reconstruirlo de forma que contenga, adems del gen deinte&,el promotor adecuado. En estos casos se trata de emplear un promotor fuerte para hacer mxima la transcripcin, o un promotor que presente alguna caracterstica especial.

El procedimiento comnmente ualizado es redisear un plsmido, de manera que contenga la regin promotor operador del opern lac y hasta un pequeo sector del gen de la p- galactosidasa seguido del gen deseado. En estas condiciones la adicin del inductor conectar el sistema que producir la protena deseada, y la adicin de glucosa desconectar el sistema al aumentar la concentracin intracelular del AMPc.

El trabajo ms difieil consiste en la purificacin de la protena producida, pues es una tarea muy labo-riosa que requiere una gran destreza y en la mayora de los casos no poca imaginacin.

A pesar de todos estos recursos no siempre se logra la expresin del gen; slo una de las 2 hebras del ADN es utilizada como molde en la transcripcin, y en el proceso de recombinacin artificial se introduce ADN de doble hebra. Como los 2 extremos son iguales, por la simetra dela secuencia,existe la posibilidad de que el apareamientose produzca de forma que coincida la cadena codificadora del promotor con la no codificadora del gen insertado, en este caso la expresin es imposible.

Basta quema o varias clulaslogren la incorporacindel gen enla forma adecuada, para que al cabo de algunas horas se tengan tantas copias como se quiera; la E. coli tiene un tiempo de duplicacin de slo 30 minutos.

Experiencia tpica

Una vez conocidos todos los elementos de trabajo, as como las dificultades que encierran estos experimentos, se describir una experiencia exitosa de sntesis de un producto eucarionte por medio del aparato metablico de la E. Coli, se trata de la

somatostatina, una hormona polipeptdica de 14 aminocidos que se sintetiza

normalmente en el hipotlamo y el pncreas.

Como el nmero de aminocidos es pequeo, se procedi a la sntesis artificial del gen que contiene51 pb, cuya secuencia en la banda codificadora sera:

T A C-( las 42 bases que codifican la somatostatina)-A C T A C T

la secuencia de bases en el ARNm sera

A U G-( las42 bases de lasomatostatina)-U G A U G A.

As, este ARNm tiene un codon para la metionina (que no se emplea en la iniciacin), la secuencia codificadora y 2 codones de terminacin consecutivos.

Se uoliz como vector un plsmido de E. d i q u e fue reconstruidocon un segmento del opern lac y que contena la zona del promotor operador, as como un pequeo sector del extremo N-terminal de la P galactosidasa. El vector fue cortado mediante una enzima de restriccin y recombinado con el ADN sintetizado.

Una vez lograda la incorporacin del pl&mido a la bacteria, stasfueron colocadas en un medio de cultivo carente de glucosa al que se adicion isopropiltiogalactsido (IFTG), un inductorgratuitodel opern lac.

Cuando se produce la induccin se obtiene una protena que contiene un segmento del extremo N-terminal de la p- galactosidasa, unido a la somatostatina mediante la metionina, y que termina gracias a la doble seal de terminacin del ADN sintetizado. Esta protena es purificada y tratada con bromuro de ciangeno, un agente que provoca la ruptura de enlaces peptdicos del lado carboxiico de la metionina,de esta forma la metionina ligante queda unida al extremo de la galactosidasa y se libera la somatostatina (Fig. 35.6).

H>N Met A l a -Gly X y s -Lys -AsN P h r -Phc , TI,,

O=C - Cys - Ser - TE - Phr - Tic - Lys ' HO'

Met H,N-Ala-Gly Ser-Cys-C=O 'OH

El uso de la metionina como ligante puede ser til en la sntesis de pptidos pequeiios, a menos que la metionina forme parte de la estructura del pptido.

En la actnalidad se han logradosintetizar otras protenas de eucariontesmediante procedimientos similares al descrito como son: la insnlina, hormona pancretica de gran importancia en el tratamiento de la diabetes mellitus, la ovoalbmina y especialmente el interfern humano, un potente agente antiviral y posiblemente antitumoral. Esta protena es producida actualmente en nuestro pas por diferentes

- -

prncedimientos como ingenie& gentica y fue utilizada en el tratamiento de la epidemia de dengue hemorrgico, introducida de manera criminal en Coba y que cost la vida a ms del00 personas entre ellas a muchos nios.

Fig. 35.6. Sntesis de la somatostatina. El plimiido hir ~ ~ o n s t n i i d o con el gcii de la somatostatina, sintetizado artificialmente, y el promotor del opedn lac El d o n pana la metioninn pemiitiqueal tratarel prndueto ron bromuro de iiangexio se liliernrn la sonratostatina del segniento de B.gdalact

En principio cualquier protena eucarionte puede ser producida mediante esta tecnologa con un sistema apropiado.

Fig. 35.7. Alelos que difieren en sus sitios de restriccin. Los genes A l y A2 son aleles que se difereiirian por- que en unos de ellos la iiiiitncin ha originatlo un nuew sitio de res- triccin. As, cuando el ADN es tratado con esa enzinia, el alelo Al originar un solo fragmento de restriccin de 20 kh, en tanto, que A2 origina un frazrnenta de 8 kb

Empleo diagnstico

La presencia de formas allicas de un gen en un individuo, que en algunos casos pudiera ser patolgica, es detectada habitualmente por electroforesis o mtodos antignicos de las variantes de protenas, aun cuando se sabe que ello se debe en ltima instancia a variaciones en la secuencia de bases del ADN en los loci cromosmicos correspondientes. Recientemente mtodos derivados de la tecnologa del ADN recombinante han permitido el anlisis directo de las secuencias del gen, as como determinar sus alteraciones especficas que provocan cambios estmctnrales de una protena particular. La utilidad de esta tcnica es que permite la distincin entre 2 copias de un locnsparticular del genoma humano.

El mtodo ms utilizado en la prctica para el estudio de las variaciones gnicas es el uso de las enzimas de restriccin; como estas enzimas realizan su accin en sitios especficos del ADN, un cambio en la secuencia puede conducir a la aparicin o desaparicin de un sitio particular y, por lo tanto, se altera el tamao de los fragmentos que se obtienen cuando el ADN es digeridoutilizando esa enzima; lo mismo ocurre si existen deleciones o inserciones.

La diferencia en los tamaos de los fragmentos de una regin determinada de cromosomas homlogos puede ser detectada, con lo que se determina la existencia de los alelos.

Suponga que un gen presenta 2 alelos Al y A2, en el Al existen 2 sitios reconncidos por una enzima de restriccin separados por una distancia de 20 kb; pero en A2, producto de las mutaciones, ha aparecido un nuevo sitio de restriccin para la misma enzima entre los 2 anteriores, de manera que la accin de la enzima dar lugar a 2 fragmentos de 8 kb y 12 kb, respectivamente (Fig. 35.7).

Si el ADN de una clula se extrae y fragmenta con la enzima de restriccin, se obtendrn numerosos fragmentos que deben ser sometidos a electroforesis en gel de agarosa para separarlos de acuerdo con su tamao.

-

Se prepara un polinucletido que contenga una secuencia de bases similar a la del fragmento con tamaode8 kh, utilizando dNTPmarcado con fsforo radiactivo, que recibe el nombre genrico de sonda.

Una vez terminada la electroforesis, la placa de agarosa se transfiere a un soporte slido embebido en una solucin que contiene la sonda y se da el tiempo suficiente para permitir la hibridacin entre la sonda y el ADN fragmentado. El soporte se separa delasolucin y se cubrecon una placa fotogrfica (autorradiografia) qne,al ser revelada, muestra la posicin de los fragmentos de inters. Como la sonda slo puede hibridarse en la zona del fragmento de 8 kb, aparecer unida tanto al alelo Al como al fragmento pequeo del alelo A2, que por ser de diferentes tamaos aparecen en sitios diferentes en la autorradiografia (Fig. 35.8).

Si una familia es portadora de una enfermedad gentica producida por genes de este tipo, puede hacerse el diagnstico prenatal mediante la obtencin de clulas del lquido amnitico y procesndolas de esta manera. En nuestro pas ha sido introducido, hace algunos aos, un procedimiento similar para el diagnstico prenatal de la sicklemia. Procedimientos de este tipo pueden ser utilizados en los departamentos de

realizar una caracterizacin ms profunda de la trasplante de rganos para compatibidad entre los donante y los receptores. Tambin este proc~dimiento puede ser utilizado en medicina legal, siempre que en un hecho delictivo queden como huellas clulas de los delincuentm, como en el caso de homicidios, violaciones, etctera.

Perspectivas

Muchos son los campos del quehacer humano donde la tecnologa del ADN recombinante puede dar grandes resultados. La introduccin de genes especficos en bacterias puede ser de gran utilidad, si estos organismos con su actividad provocan un mejoramiento del suelo, un incremento en la fijacin de nitrgeno u otras

Fig. 35.8. Identificacin de fragmentos de restriccin. El ADN genmieo de 3 individuos es fragmentado me- diante una enzima de restriccin. Los fragmentos se someten a una electroforeais en gel de agarosa que los separa de acuerdo con su lon- gitud. Se transfieren a un soporte slida y se embeben en una solu- cin que contiene la sonda radiactiva durante el tiempo ne- ce5arbpara permitir la hibridacin; despus se somete a un iiroceso de

se observa en las resultados, el su- jeto A es homocigtico para el alelo A l (de 20 kb), el sujeto C es homocigtico para el alelo A2 y el B es heterocigtiea, pues pre- senta tanto el alelo A l de 20 kb cona el A2 que origina el frag- mento de 8 kb. Componentes celulares y Genttica molecular sss

modificaciones que hagan que se obtengan cosechas ms productivas, tanto cualitativa como cuantitativamente.

La produccin de agentes biolgicos, que ayudan al hombre a combatir las enfer- medades en formas inocna y econmica, es tambin una de las posibilidades de estas tcnicas.

La produccin de microorganismos, que ayudan a combatir la contaminacin ambiental tanto de la atmsferacomo de los mares y nos, propiciara que el hombre pueda vivir en un planeta con ambiente menos agresivo; sta entre otras producciones constituyen posibilidades casi inmediatas de la tecnologa del ADN recombinante.

Aun cuando en estos momentos no se vislumbra. ouede. oue en un futuro no , & , .

lejano,esta tcnica sea capaz deenfrentar el hatamiento de enfermedades hereditarias, al producir rectificaciones de los genes alterados mediantesnsustitucio por los nor- males.

Se requieren muchos ;io?.de investigacin y trabajo para que la humanidad agote las posibilidades de esta nueva conquista de la ciencia.

Es lamentable que la ingeniera geotica tambin puede ser utilizada en contra de los hombres. La creacin de organismos productores de enfermedades con elevada capacidad inefectiva, contra los cuales no existen tratamiento y la contaminacin del ambiente con productos residuales del metabolismo de bacterias alteradas son ejem- plos menores de cmo pueden utilizarse las manipulaciones genticas contra sus pro- pios descubridores.

Esto no debe Uevar a suspender las investigaciones en este campo, pues el empleo que se d a sus resultados no depende de los procedimientos empleados, sino de las concepciones tico-polticas de los gobernantes de los pases donde se desarrolle esta importante tecnologa.

La explosin de la bomha atmica en Hiroshima y Nagasaki, con toda su secuela de muerte s destruccin aue se extiende basta nuestros das. nor una narte. v las

. . ,"

grandes centrales tomo elctricas que existen en numerosos pases que han llevado la comodidad y el desarrollo a grandes ncleos de poblacin, por otra, ejemplifican de forma clara que el peligro no est en las fuerzas de la naturaleza que el hombre descn- bre, sino en el empleo que el propio hombre hace de ellas.

En todo caso nuestra posicin, desde el punto de vista tico, lleva a condenar el uso de estas -y de cualquier otra- conquistas de la ciencia como instrumento para provocar la destruccin de la humanidad, en vez de hacerlo parasu bienestar y desarro- llo.

Resumen

Uno de los xitos ms sobresaentes de la gentica moleeular ha sido la intm- ducei6n de la tecnologa del ADN reeombinante, que ha permitido obtener protef- nas eueariontes en cantidades antes insospechadas y al mismo tiempo un anlisis del gen al nivel molenilar.

El procedimiento general consiste en la obtenei6n de un gen particular, su incorporaci6n a un vector y su propagaci6n. Los genes pueden obtenerse por frag- mentari6ndelADN,por aislamiento del ARNm y slntesisdel een wr lamswi~tasa inversa o por sinte& artificial del gen. LO; vectorea & empleados son los plsmidos, los Virus y los mmosomas artieiales de levadura. La uni6n del gen al vector puede ocurrir de 2 formas, segn el tipo de enzima de resMed6n empleada en el proceso. Cuando la enzima no da fragmentos monofibrilares se requiere el c o n m de la nudeotidil t r a n s f e m terminal.

La producci6n de protenas eucariontes en bacterias presenta varias dificultades, pero basta con obtener algunas clulas recombinantes que, proporcionndoles el medio adecuado, en pocas horas se tendrn tantas como se quiera.

Mediante estos pmcedimientos se han obtenido nume- protenas, entre ellas la somatostatina, la insulina y el interfern, el eual se obtiene con xito en nuestro pas desde hace algunos dos.

La tecnologa del ADN recombinante puede ser 6oI en el anlisis del gennma y proporciona un pmcedimiento preciso para el diagn6soco prenatal de algunas enfermedades genticas; tambin puede ser utilizada en Jas departamentos de trasplante y en medicina le@

Amplias son las perspectivas de esta tecnologfa para la agricultura, el saneamiento ambiental y ia medieina No obstante, tambin puede ser empleada en perjuido del hombre, dependiendo de quienes sean los que la empleen y no de los pmcedimientos tcnicos. La humanidad debe condenar enrgicamente el empleo criminal de estos procedimientos.

Ejercicios 1. ;Cules cree usted que son las caractersticas que presentan los plsmidos que les

permite servir de vectores en los procedimientos del ADN recombinante? 2. Haga un diseode unexperimento para recombinar U> vitmun gen con un plsmido,

utilizando alguna de las enzimas de restriccin que aparecen relacionadas en el captulo 33. 3. ;Cul fue el principal inconveniente encontrado al utilizar directamente los genes eucariontes para la recombinacin in vitro? Cmo pueden eliminarse esos incon- venientes?

4. Por qu no siempre se logra la expresin de los genes an cuando han sido incorporados al vector y ste se multiplica en la clula receptora?

5. ;Qu ventaja representa la incorporacin del promotor lac en los vectores? 6. ;Cmo puede la tecnologa del ADN recombinante favorecer el desarrollo de un

departamento de trasplante de rganos? 7. ;El hecho de que los procedimientos del ADN recombinante puedan ser utilizados

para causar dao a la humanidad, debe indicarnos que hay que concluir las inves- tigaciones en este campo?

8. ;Qu perspectivas representa la tecnologa del ADN recombinante para los pases subdesarrouados?

Resumen de la seccin

Esta seccin se ha dedicado al estudio de los principales aspectos relacionados con la informacin gentica interpretndolos desde el punto de vista de la estructura, las propiedades y las funciones de las macromolculas.

La informacin gentica es una de las formas de expresin de la informacin molecnlar que puede ser de tipo secuencial y conformacional; por lo que no se trata de un nuevo tipo de informacin, que distinguirla cualitativamente slo pretende realzar su significado para la vida de las clulas. No obstante las diversidades de procesos y mecanismos, se pueden encontrar algunas generalidades que a manera de resumen general se exponen a continuacin.

Toda la informacin gentica que determina la identidad de cada organismo est codificada en la secuencia de bases nitrogenadas del ADN y por lo tanto es esencial- mente de tipo secuencial. Pero el ADN contiene adems en su estructura las inshuccio- nes para su lectura, dadas por las irregularidades estrnctnrales que surgen a lo largode la molcula, de acuerdo con la secuencia de bases en sectores especficos. Todo el proceso de surgimiento y transformacin de los seres vivos durante el perodo evolu- tivo alcanzan su ltima expresin en la lucha entre la estabilidad y la mutabilidad de esa secuencia de bases.

Conservar la informacin gentica de un organismo y garantizar que ste origine siempre descendientes iguales a s implica conservar inalterada la secuencia de bases desn ADN. Por el contrario, la aparicin de variedadesen la formao las funciones de los organismos significa la alteracin de la secuencia de bases de su ADN con respecto a lade sus progenitores. La existencia de secuencias no codificantes, de genes repeti- dos y los mecanismos de modificacin-restriccin por una parte y el complejo meca- nismo de replicacin del ADN, que implica una elevada fidelidad de copia, as como los de reparacin aseguran a la estabilidad del material gentico; mientras que las mutaciones y la recombinacin gentica contribuyen a la mutabilidad del mismo. Es evidente que aqu slo se hace referencia a lo que sucede en el organismo, pues las condiciones del medio influirn decisivamente en determinar cules sern los organis- mos que permanecern y cules no. De esta forma a la lucha entre la estabilidad y la mutabilidad del material gentico se suma la lncha permanente entre el genoma y el

ambiente; ambas han contribuido de forma decisiva al desarrollo histrico natural de losseres vivos, desde las formas ms simples hasta las ms complejas.

A pesar de lasdiferencias evidentes que existen entre todos los procesos de trans- ferencia de informacin gentica, hay en ellos una uniformidad fundamental. El meca- nismo bsico que se pone en juego en los diferentes fenmenos relacionados con la

informacin gentica es el apareamiento de bases que es muy estricto en el ADN y menos en el ARN. Este mecanismo es el que sirve de base a la replicacin, la transcrip- cin, la recombinacin y la reparacin, tambin est presente en la traduccin, pues la colocacin de los aminocidos en la cadena polipeptdica depende del apareamiento de bases entre el codon y el anticodon. Es por ello que en todos estos procesos siempre se utiliza una secuencia de bases que dirige el orden en que los diferentes componentes deben ser organizados.

La parte activa de todos los mecanismos la representan protenas, un grupo de stas tiene la caracterstica de reconocer secuencia de bases especficas y proceder de acuerdo con ellas. El origen de replicacin, el promotor, el operador, el terminador, las secuencias iniciales y finales de los intrones son algunos de estos ejemplos donde secuencias especficas de bases son reconocidas por proteinas especficas y ese reco- nocimiento es indispensable para su actividad. Otras tienen actividades enzimticas especiales que se ajustan perfectamente a las caractersticas estmcturales de los cidos

nucleicos y que no son posible encontrar en enzima que acten con otros sustratos. En casi todos los casos estas proteinas se asocian formando grandes complejos multiprotenicos que por sus diferentes actividades y su organizacin supramacromolecular constituyen verdaderos organitos subcelulares.

Por la importancia que tienen para la vida y por su elevado grado de complejidad, todos estos procesos necesariamente tienen que estar sometidos a finos mecanismos de regulacin que permitan que ellos se realicen en el momento y en el lugar adecuados; este control seejerce a varios niveles y responde a numerosas seales que forman vas de transferencia de informacin que van desde el entorno hasta el ncleo celular. Por los conocimientos actuales se sabe que esas vas forman verdaderas redes que conver- gen o divergen de nudos de acumnlacin de informacin y que muchas veces tienen carcter redundante. En estos momentos los mecanismos mejor conocidos son los de control transcripcional.

A pesar del avance alcanzado en los ltimos aos, el conocimiento actual que se tiene de estos fenmenos no permite arribar a otras conclusiones, pues en todos los mecanismos quedan an aspectos importantes por dilucidar, sobre todo en lo referente a las propiedades de las proteinas que participan en ellos y a sus mecanismos de regulacin.

Se espera que con la introduccin de los procedimientos de la tecnologa del ADN recombinante en los prximos aos, muchos de estos aspectos queden esclarecidos, aunque de seguro el carcter inagotable del conocimiento de la naturaleza plantear problemas que hoy son totalmente desconocidos.

Libro de Bioqumica Mdica Tomo IICaptulo 35. Tecnologa del ADN recombinanteProcedimiento generalObtencin de genes especficosRecombinacin in vitroVectoresIdentificacin del gen recombinadoProblemas en la produccin de protenas eucariontesExpresin de genes clonadosExperiencia tpicaEmpleo diagnsticoPerspectivasResumenEjerciciosResumen de la seccin